APLICACIN DE TECNICAS BASADAS EN BIOLOGIA MOLECULAR PARA EL DIAGNSTICO Y TIPIFICACIN DEL VIRUS DE GUMBORO (IBDV)

Blas ALI Snchez Peral, M Jos Rodrguez*. IN !NASA. Hermanos Garca Noblejas 41, 28037. Madrid. Spain. * orrespondin! a"#or$ mjrodri!"e%&in!enasa.es EL VIRUS DE GUMBORO El virus de la enfermedad de Gumboro ( IBDV), es un avibirnavirus, familia Birnaviridae, gnero Birnavirus, [1]el gnero comprende dos serotipos el serotipo 1 !ue afecta a aves de corral ["] # el

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serotipo " !ue es apatognico en este tipo de aves. $os miembros de esta familia presentan como material gentico %&' de doble banda segmentada. $a enfermedad de Gumboro es altamente contagiosa, afecta fundamentalmente a aves ()venes. Est* caracteri+ada por afectar al sistema inmune provocando necrosis # atrofia de la bolsa de ,abricio de estas aves, secundariamente produce una depleci)n de linfocitos en todos lo )rganos linfoides, lo !ue da lugar a una inmunodepresi)n severa [-] El cuadro cl.nico presenta diarrea, anore/ia, depresi)n, eri+amiento de las plumas # finalmente postraci)n En el mundo, se pueden encontrar dos formas diferentes de la enfermedad. $a forma subcl.nica producida por variantes antignicas # la forma cl.nica producida por cepas de alta virulencia. 0esde el punto de vista del diagn)stico la forma cl.nica de la enfermedad de Gumboro es la m*s interesante, se caracteri+a por presentar elevadas morbilidades (1112) # mortalidades (312) produciendo grandes prdidas en la industria av.cola $a forma cl.nica producida por cepas de alta virulencia es la responsable de los numerosos brotes !ue 4an aparecido en diversos pa.ses a lo largo de todo el mundo. BIOLOGIA MOLECULAR, TRASCENDENCIA $as tcnicas de Biolog.a 5olecular ocupan un papel cada ve+ m*s importante en lo referido al diagn)stico, a todos los niveles, desde la 6anidad 7umana en la comen+aron a utili+arse 4ace #a algunos a8os, 4asta la 6anidad %nimal en la !ue cada ve+ son m*s utili+adas como 4erramientas de diagn)stico complementarias a los ensa#os serol)gicos. Entre las m*s utili+adas se encuentran la reacci)n en cadena de la polimerasa o PCR # todas sus variantes, el en+imoinmunoensa#o o E$96% sobre amplificado, las tcnicas de caracteri+aci)n como la secuenciaci)n autom*tica, la restricci)n en+im*tica, etc. :or su rapide+, sencille+ # elevada sensibilidad # especificidad, la :;& es una de las tcnicas m*s populares, 4asta el punto de constituir un pilar central dentro de la ma#or.a de los protocolos en las pruebas de diagn)stico molecular conocidas. $a PCR es una tcnica !ue utili+a

fundamentalmente tres propiedades< por un lado, dos intr.nsecas a los *cidos nucleicos como son la complementariedad de bases # la desnaturali+aci)n=renaturali+aci)n de las cadenas de los *cidos nucleicos por efecto de la temperatura (temperatura de fusi)n o >m) # por otro, la capacidad polimeri+ante de las en+imas termoestables denominadas polimerasas capaces de sinteti+ar *cidos nucleicos en presencia de sus mon)meros espec.ficos, es decir nucle)tidos. $a tcnica de amplificaci)n mediante un suceso c.clico !ue consta de tres fases (desnaturali+aci)n, 4ibridaci)n # elongaci)n), puede amplificar espec.ficamente # con elevada sensibilidad secuencias cortas del *cido nucleico de inters. $a tcnica de amplificaci)n gnica por si sola o acoplada a otras #a mencionadas (E$96%, secuenciaci)n autom*tica, restricci)n en+im*tica), permite dise8ar ensa#os diagn)sticos fiables, r*pidos # de f*cil interpretaci)n dirigidos espec.ficamente para cada patolog.a, con el ob(etivo de identificar la presencia del pat)geno # si es posible, su posterior caracteri+aci)n. DIAGNSTICO MOLECULAR DE 9B0? El uso de tcnicas moleculares en estos @ltimos a8os para detecci)n de IBDV 4a sido mu# notable ([A]< [3]< [B]) la detecci)n del virus esta basada en una transcripci)n reversa acoplada a amplificaci)n por PCR o RT-PCR sobre la regi)n 4ipervariable del gen vp2 . $os amplificados resultantes son procesados por restricci)n en+im*tica [C]< [D]< [E]), o directamente por secuenciaci)n autom*tica ([11]) a partir de Bursa de ,abricio. En ambos casos es posible caracteri+ar el tipo de virus salva(e, salva(e mu# virulento o vacunal ([11]< [1"]< [1-]< [1A]) si bien, la secuenciaci)n ofrece m*s informaci)n !ue la restricci)n. En ocasiones, es necesario aumentar la sensibilidad de la tcnica, para ello se reali+a una nested o segunda :;& despus de la &>F:;& sobre el primer amplificado !ue da lugar a un fragmento de menor tama8o (o bien directamente una &>F:;&, Banda # ?illegas, "11-), el resultado se revela por gel de agarosa del mismo modo !ue en la RT-PCR. 5ediante restricci)n en+im*tica se puede determinar el grupo molecular al !ue pertenece. En el caso del primer amplificado !ue tiene CAApb, se utili+aban inicialmente " en+imas ([13]) pasando posteriormente a C en+imas o a una combinaci)n de varias en+imas [1B]< [1C, 1D]) lo !ue ofrece un patr)n m*s completo. $a diana 6sp 9 es en la ma#or.a de los casos, no en todos, un marcador de alta virulencia, aun!ue 4a# cepas altamente virulentas !ue no tienen la diana # cepas !ue tienen la diana 6sp 9 # no son de alta patogenicidad (encontradas en Georgia por el 0r. :. ?illegas). En el caso !ue se detecte IBDV mediante nested PCR o bien directamente una RTPCR, el fragmento es de "AD pb, en este caso se utili+an A o m*s en+imas para la tipificaci)n. En nuestro laboratorio se reali+a un protocolo mu# similar al descrito (ver es!uema de detecci)n = tipificaci)n), es decir, una RT-PCR sobre e/tra.do de Bursa de ,abricio con oligonucle)tidos espec.ficos para la regi)n 4ipervariable del gen vp"< si la muestra resulta positiva por un lado se secuencia el

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amplificado de CAApb # por otro se reali+a la restricci)n en+im*tica con C en+imas M"o I, Bs# NI,
Sac I, S#$ I, Nco I, Ss% I, &a' I ' con ello se obtiene toda la informaci)n posible sobre el tipo

de virus, dianas de virulencia (6sp 9), tipo de cepa, etc< valorando la correlaci)n del tipo de cepa # la presencia=ausencia de diana 6sp 9. 6i el resultado de la &>F:;& es negativo se reali+a una nested :;& sobre el primer amplificado de CAAbp dando lugar a un fragmento de "ADbp, con ello se descartan posibles falsos negativos. :ara este caso se procede del mismo modo, reali+ando secuenciaci)n (m*s limitada en cuanto a la informaci)n !ue en el caso anterior) # restricci)n en+im*tica con A en+imas
Sac I( &a' I (S#$ I( Ss% I.

En general, la determinaci)n de los grupos moleculares mediante restricci)n en+im*tica, en particular en 9'GE'%6% se reali+a teniendo en cuenta las publicaciones, los estudios # traba(os reali+ados por especialistas reconocidos tales como el 0r. :. ?illegas, el 0r. %. Banda, el 0r. 0. GacHwood, el 0r. %. :Iges, # la 0ra. '. 5a(), entre otros. :ara ello se utili+an una serie de tablas mu# accesibles, referidas a ambos segmentos (CAAbp, "ADbp) !ue clasifican las distintas cepas en B grupos moleculares, en cada caso el valor diagn)stico de la restricci)n en+im*tica viene determinado por la ausencia o presencia de las diferentes dianas indicadas en el es!uema as. el como del tama8o de los fragmentos originados en la regi)n 4ipervariable ?:", de esta forma se pueden valorar potencialmente no s)lo las cepas cl*sicas o vacunales (incluso multivalentes) tambin a!uellas de alta virulencia # variantes emergentes. $a informaci)n !ue ofrece la restricci)n en+im*tica es importante aun!ue limitada por las caracter.sticas propias de la tcnica, de a4. !ue e/ista la posibilidad adicional de secuenciar la muestra para conocer en detalle el tipo virus ([11]), es decir la cepa concreta, es actualmente el ensa#o de tipificaci)n m*s recomendable debido a la informaci)n !ue ofrece frente a la restricci)n en+im*tica. En nuestra e/periencia en el diagn)stico de 9B0? se anali+aron en el laboratorio un total de -3 bolsas de ,abricio representativas en este caso de diferentes lotes enviados con sintomatolog.a relacionada con IBDV, incluso en alg@n caso con estudios 4istol)gicos # anatomopatol)gicos, procedentes de pollos entre los "1 # 31 d.as de edad. El 3A2 (1E) de las cepas se identificaron como mu# virulentas ( vvIBDV, dentro del grupo molecular ?9), s)lo en un caso se encontr) una cepa vvIBDV sin diana 6sp 9. El "E2 (11) de las muestras positivas se identificaron como vacunales dentro de los grupos moleculares 9? (""DE, 0CD) # grupo ? (BursineF") adem*s de algunas cepas relacionadas con cepas cl*sicas tipo ?GF -11, ?GF"B", ?GF"1D. E$ 112 (A) de las muestras remitidas no se pudieron estudiar por ausencia de amplificaci)n. ,inalmente, el B2 (") de las muestras presentaron coinfecciones o al menos presencia de dos tipos de virus procedentes de diferentes grupos moleculares en concreto del grupo 9? # grupo ?9 (ver fotos del es!uema tipificaci)n en el fragmento de CAAbp). &especto del total de muestras anali+adas, en

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el A-2 se pudo estudiar el fragmento de CAAbp< dentro del 3C2 restante, el AB2 se anali+aron sobre el fragmento de "ADbp, en el resto no se pudo identificar la presencia de IBDV. Este dato nos pareci) mu# significativo, puesto !ue pone de manifiesto la importancia de la nested PCR en esta prueba en particular. 0e otro modo no 4ubieran sido consideradas como positivas la ma#or.a de las muestras.

&especto de los @ltimos estudios publicados por otros colegas, decir !ue se esta traba(ando en la misma l.nea descrita en cuanto al diagn)stico molecular se refiere. 6e 4an publicado recientemente traba(os sobre an*lisis molecular # de patogenicidad en pollos de 5alasia ([1E]) # Egipto (["1]), an*lisis de secuenciaci)n sobre la regi)n 4ipervariable ?p", caracteri+aci)n de cepas e/)ticas por restricci)n

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en+im*tica con Bmr 9 (["1]), amplificaci)n # diferenciaci)n de cepas mu# virulentas # vacunales por &>F PCR ([""]), detecci)n de IBDV mediante la nueva generaci)n de tcnicas de amplificaci)n a tiempo real, m*s eficientes # r*pidas !ue la :;& convencional, permiten incluso la cuantificaci)n del virus # la tipificaci)n de 9B0? mediante curvas de fusi)n de los amplificados, entre otras venta(as (["-]).

Deteccin y tipaje de IBDV mediante RFLP-RT PCR realizado en INGENASA

Bursa de )a"r*c*o
M#odo de e+#racc*,n de RNA
-ho/cz$ns0* $ Sacch*

ARN (rico
Protena Vp2

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R&(P-R )S*+ oli!os ,p2Actividad RT

Secuenc*ac*,n
ARN Amplificacin por PCR ADN

.NA (rico )744 bp-

R)LP
M"o I. Bs# NI. Sac /. S#0 /. Nco /. Ss% I. +a1 /

Nes#ed P-R )S*+ oli!os -

Secuenc*ac*,n

. N A ( r i c o ) 2 4 8 b p -

Grupo mo !"u #r IV (v#"u$#)

R)LP Sac /. +a1 / .S#0 /. Ss% I

Gpo mo !" VI (Bur)%$! *) Grupo mo !"u #r VI (vvIBDV)

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Co%$&!""%'$ Gpo mo !" IV(VI

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