23/05/2011

Curso a Distancia Sobre Probiticos

Educacin Mdica Continua

Curso a Distancia Sobre Probiticos Educacin Mdica Continua

Control Bioecolgico del tracto gastrointestinal: interacciones entre el husped y la flora. Mecanismos y posibilidades de los prebiticos y probiticos

Dra. Gabriela Perdign

Centro de Referencia para Lactobacilos (CERELA-CONICET) Universidad Nacional de Tucumn - Argentina

2011

23/05/2011

Microbiota normal
Ps. aeruginosa
Putrefaccin intestinal

Inhibicin del crecimiento de bacterias dainas y exgenas

Proteus sp. Candida sp. Reductores Sulfato Clostridium

Digestion/ absorpcin de alimentos, ingredientes y minerales Estimulacin de la funcin inmune Sntesis de vitamina

Produccin de carcinogenos

Enterococo E. coli Lactobacilos Streptococos Bifidobacterias Bacteroides

Diarrea, constipacin, infecciones, dao heptico, cncer, toxigenesis, encefalopata

De Fuller y Gibson, 1999

11

No./g heces (escala log)

Principales funciones fisiolgicas de la microbiota intestinal indgena

Modificacin del contenido intestinal
pH, potencial redox Produccin de metabolitos
(vitaminas, enzimas digestivas, etc.)

Modificacin anatmica del tracto digestivo volumen cecal

velocidad de renovacin de enterocitos morfometra de las vellosidades trnsito de cont. gstricos e intest. absorcin de componentes abiticos

Modificacin de la fisiologa digestiva

Mejor resistencia a infecciones intestinales

Efecto barrera Modulacin de la produccin de toxinas

Estimulacin de las funciones inmunes

Reproducido de Moreaud y Gaboriau-Routhiau. Probiotics 3, 2000

23/05/2011

Microbiota y maduracin del sistema inmune de mucosa intestinal

Ratones libres de grmene colonizados con la flora digestiva de
clulas plasmticas IgA+
nmero / vellosidad

Ratn convencional adulto Libre de grmenes Ratn convencional de 1 a 4 das de vida Ratn convencional de 7 a 23 das de vida Ratn convencional de 25 das de vida

41 1 4 0,5 15 2 23 1 43 1

Reproducido de Moreaud y Gaboriau-Routhiau. Probiotics 3, 2000

Qu funciones son atribuidos a la microbiota Gram (+)? Qu funciones son atribuidos a la microbiota Gram (-)? Qu mecanismos de activacin inmune inducen ?

23/05/2011

Efectos de bacterias Gram(+) indgenas

IgA
N clulas / 10 cpos. 200 150 100 50 0 Control control IN L f 2 das 5 das IN L a 7 das
*

*
* *

* * *
* * *

* *

TNF alpha
N clulas / 10 cpos.

N clulas / 10 cpos.

50 40 30 20 10 0 Control control IN L f 2 das 5 das IN L a 7 das

IFN gamma
80 60 40 20 0 Control control IN L f 2 das 5 das IN L a 7 das
**

* **

Reproducido de Dogi et al., 2005

Efectos de bacterias Gram(+) indgenas

N clulas / 10 cpos. 80 60 40 20 0 IN Lf control 2 das 5 das IN La 7 das

IL-10
*
**

* * *
* *

30 25 20 15 10 5 0 control

IL-17
30 25 20 15 10 5 0 N clulas / 10 cpos.

N clulas / 10 cpos.

MIP-1 alpha

IN Lf 2 das 5 das

IN La 7 das control

IN Lf 2 das 5 das

IN La 7 das

Reproducido de Dogi et al., 2005

23/05/2011

Efectos de bacterias Gram(-) indgenas

IgA IN E. coli
N clulas / 10 cpos. 200 * 150 100 50 0 control 2 das 5 das 7 das
*

TNF alpha IN E. coli

N clulas / 10 cpos. N clulas / 10 cpos. 50 40 30 20 10 0 control 2 das 5 das 7 das

50 40 30 20 10 0

IFN gamma IN E. coli

* *
*

*
*

control

2 das

5 das

7 das

Reproducido de Dogi et al., 2005

Efectos de bacterias Gram(-) indgenas

IL-10 IN E. coli
N clulas / 10 cpos. 50 40 30 20 10 0 control 2 das 5 das 7 das

IL-17 IN E. coli
35 30 25 20 15 10 5 0 control 2 das 5 das 7 das 30 25 20 15 10 5 0 control N clulas / 10 cpos. N clulas / 10 cpos.

MIP-1a IN E. coli

2 das

5 das

7 das

Reproducido de Dogi et al., 2005

23/05/2011

La microbiota Gram (+) y Gram(-) participan en la

activacin/regulacin del sistema inmune.

La microbiota Gram(-) estara ms involucrada en la regulacin mientras que la Gram(+) estara ms involucrada en la activacin.

La activacin inducida no afecta la homeostasis intestinal.

23/05/2011

Factores que afectan la microbiota intestinal y el funcionamiento del Sistema Inmune Mucoso
Nutricin/Malnutricin
(mucina, protenas intestinales, secreciones biliares)

Interacciones bacterianas Enfermedad Drogas Potencial redox Microbiota Intestinal

cidos Biliares Edad pH Anticuerpos Metabolitos Bacterianos

(SCFA, bacteriocinas) Reproducido de Mallett y Rowlan 1988

Probiticos
Suplementos alimentarios, de origen microbiano, vivos que afectan beneficiosamente al husped mejorando su balance intestinal (Fuller 1989) Una preparacin de o un producto que contiene microorganismos definidos viables, en nmero suficiente, los cuales afectan la microflora de un compartimiento del husped y ejercen efectos beneficiosos en la salud del mismo. (Schrezenenmeir y deVrese 2001)

Microorganismos vivos, que al ser administrados en dosis adecuadas, confieren un beneficio de salud al receptor". FAO 2001 (Organizacin de Alimentos y Agricultura)

23/05/2011

Prebiticos

Ingredientes no digeribles de los alimentos que afectan beneficiosamente al husped por una estimulacin selectiva del crecimiento y/o actividad de una o un limitado grupo de bacterias en el colon. Especialmente lactobacilos y bifidobacterias
Gibson y Robertfroid (1995)

Qu son alimentos funcionales?

Alimentos funcionales son aquellos que se consumen como parte de una dieta normal y que ms all de la nutricin bsica, ofrecen beneficios para la salud y reducen el riesgo de sufrir enfermedades. Contienen determinados minerales, vitaminas, cidos grasos, fibra o cultivos vivos de microorganismos probiticos.
Ashwell, M. (2001). Functional Foods

23/05/2011

Cal es efecto de los microorganismos probiticos presentes en los alimentos sobre el Sistema Inmune intestinal?

Los Probiticos interaccionan con la clula intestinal?

23/05/2011

Interaccin de L. casei con las microvellosidades del epitelio intestinal

L. casei CRL 431

L. casei DN114-001

Interaccin entre BAL y CEI

10

23/05/2011

Qu seales inducen en la clula epitelial?

Efecto de LFP sobre la clula epitelial

microvellosidades

Clula epitelial normal

Lisosoma de gran tamao luego de la administracin de la LFP 10.950x

11

23/05/2011

La activacin observada induce la expresin y liberacin de citoquinas como la IL-6?

Induccin de la sntesis de IL-6 en CEI por BAL In vitro

12

23/05/2011

La produccin de IL-6 es tambin inducida cuando la administracin del probitico est contenida en un producto fermentado?

Produccin de IL-6 por clulas epiteliales intestinales (ensayo ex-vivo)

LFP
* FB FS (H de C, DNA
bacteriano, pptidos)

450 400 350 Concentracin (pg/ml) 300 250 200 150 100 50 0 Control bioterio Actimel

LFP

IL-6

13

23/05/2011

Las bacterias probiticas toman contacto con las clulas inmunes?

Interaccin de bacterias probiticas con las clulas inmunes intestinales

Sitio inductor Sitio efector

Placa de Peyer

Lmina propia de las vellosidades

14

23/05/2011

Qu marcadores se expresan en clulas dendrticas y macrfagos como consecuencia de esa interaccin?

Expresin de antgenos
LFP
Clulas dendriticas (33D1)
35 30 25 20 15 10 5 0

L. casei
Clulas dendrticas (33 D1) N cl+ /10 cpos 80 60 40 20 0 Ms Lc / H s Lc Control Mc Lc / H c Lc L. casei *

N cel/10 cpos.

control

LFP 5d

Macrfagos (F4/80) Macrfagos (F4/80)

100 80 60 40 20 0

Macrfagos (F4/80) 70 60 50 40 30 20 10 0 Ms Control Lc / H s Lc * N cl+ /10 cpos

120
N cel/10 cpos.

control

LFP 5d

Mc L. Lccasei / H c Lc

15

23/05/2011

Lactobacillus casei
TLR-2
120 100 80 60 40 20 0
control control

Leche fermentada
TLR-4
Clulas TLR4+ N cel/10 campos
*
120 100 80 60 40 20 0

N cel/10 cpos.

2 2da days

5 da days

7da days 7

Control

LFP 5d

CD-206 CD 206
120

*
60 N cel/10 campos

Clulas CD-206+ CD-206

100 N ce/10 cpos 80 60 40 20 0 control control 22 days da 5 5days da * *

50 40 30 20 10 0 Control LFP 5d

7 7days da

2 da

7 da

Expresin de receptores CD-206 y TLR2 en clulas de PP Inducida por L casei

Control CD-206

CD-206 L. casei 7d

Control TLR2

TLR2 L. casei 7d

16

23/05/2011

Molculas co-estimuladoras
70
*

60 50
Porcentaje de clulas +

40 30 20
* * * * *

10 0 CD80 Control Lc CRL 431 PFM Lc DN CD86 La Homologo CD80/CD86 La Heterologo Control Salm

Los productos probiticos tienen efecto sobre clulas relacionadas con la respuesta inespecfica como clulas caliciformes productoras de mucus, el cual es una barrera protectora del epitelio intestinal?

17

23/05/2011

Efecto sobre clulas caliciformes

Control

LFP 5 das

Las clulas B IgA+ son activadas?

18

23/05/2011

Clulas IgA+

L. casei
160 140

LFP
*
N cel/10 cpos.

120 N cel/10 cpos. 100 80 60 40 20 0 control 2 das 5 das 7 das

das

Clulas IgA+ en lamina propia de las vellosidades

Control

Clulas IgA+ aumentadas

19

23/05/2011

Cal es el efecto sobre las clulas T ?

Clulas CD4+ y CD8+ luego de la administracin de L. casei

20

23/05/2011

Clulas CD4+ y CD8+ luego de la administracin de la LFP

La interaccin de las clulas inmunes induce activacin con produccin de citoquinas?

21

23/05/2011

Clulas productoras de citoquinas luego de la administracin de L. casei

L a c t o b a c illu s c a s e i v ia b le s
140 N c lu la ls/ 1 0 c p o s. 120 100 80 60 40 20 0 TNF IL 1 2 C o n tro l IF N 2 D a s IL 2 5 D a s IL 1 0 7 D a s IL 4 * * * * * * * *

Efecto de la LFP en la produccin de citoquinas

(por clulas T, clulas dendrticas o macrfagos activados)

Citoquinas proinflamatorias
TNFa IFNg
N cel/10 cpos.
*
*

N cel/10 cpos.

120 100 80 60 40 20 0

* * *

100 80 60 40 20 0 *
*

* *
*

* * *

Ctrol

2 d

5 d

7 d

10 d

14 d

Perodo de alimentacin
Control LFP

Periodo de alimentacin
Control LFP

22

23/05/2011

IL-10

IL-4

N cel/ 10 cpos.

N cel/ 10 cpos

120 100 80 60 40 20 0
Ctrol

* *

* *

120 100 80 60 40 20 0

* *

* *

Periodos de alimentacin (Das)

control LFP

10

Periodos de alimentacin (Das)

Control LFP

* IL-2

Ncel/ 10 cpos

80 60 40 20 0

*
* *
*

Periodos de alimentacin (Das)

Control LFP

La activacin de la clula inmune inducida por los probiticos favorece la expresin de los antgenos de histocompatibilidad (HLA-DR)?

23

23/05/2011

HLA-DR

70 60
Porcentaje de clulas+

50 40 30 20 10 0
Control

1 431 L. ca sei CRL

Lc DN

PFM

La expresin de receptores y citoquinas inducidas por probiticos est mediada por activacin de factores transcripcionales?

24

23/05/2011

Estudio de la expresin de la fosfatasa calcineurina

Porque la enzima fosfatasa calcineurina? a) Su activacin es una respuesta al incremento de los niveles de Ca++ citoplasmtico. b) Calcineurina regula al factor nuclear NF-AT, responsable de la transcripcin de IL-2 y TNF

Calcineurina-NFAT
25
45

TLR-9
* * * *

*
20

40 35 30

N cells/10 fields

N cells/10 fields

15

25 20 15 10 5

10

0 control Lc CRL 431 La CRL 1462 La A9 PFM

0 control L c CRL 431 La CRL 1462 La A9 PFM

25

23/05/2011

Activacin del factor transcripcional NF-Kb

Activacin del factor transcripcional NF-Kb

IL-6 clulas epiteliales intestinales IL-6 clulas epiteliales intestinales

26

23/05/2011

Seales inducidas por L. casei CRL 431

TL

TLR-9

Efecto de L. casei CRL431 en el sitio inductor

M
CPA

LT LB

LB

LT LT LB LT LB

Via NFkB

TNFa
CD

IL-6 IL-10

MQ

IgM LB

IL-4 TGFb

IgA LB

Ciclo de la IgA

No hay presentacin antignica

LT

Ndulo linf. mesentrico

HLA II CD80

Sitios mucosos distantes Circulacin Homing

Bronquios Glndulas mamarias

Conducto torxico
No hay modificacion

CD86

27

23/05/2011

Seales inducidas por L. casei CRL 431 y LFP con L. casei DN 114001
IgA CEI
MQ

Lamina propria

CD Placas de Peyer Bacteria probiotic a MQ TLR-9

TNFa IFNg

Via NFkB
LT LT

IL6 Partculas antignicas CM

F4/80
LT LT

calcineurina

calcineurina
IgA LB IgA LB TLR-9 IgA LB IgA LB IL6 IgA CP IgM LBL HLA II CD80 CD86 in L casei IL-10 IL-4 LB homing TLR-9 TLR-2 D206 citoquinas IgA IgA CP 33D1 DC
LT LT MQ LT LT CD

Via NFkB
MQ TNFa IFNg Sitios mucosos distantes

33D1 in Lc F4/80 en ambos

MLN

Conducto torxico

Circulacion

PROBIOTICO CONCLUSIONES
Efecto sobre huesped inmunocompetente
La administracin de probiticos:

No induce efectos adversos como la expresin de HLA-DR o de 33D1 en clulas dendrticas. Induce autorregulacin por produccin de citoquinas reguladoras IL-10, sin modificacin de la homeostasis intestinal

Los probiticos y la LFP inducen un claro efecto sobre las clulas epiteliales intestinales y clulas inmunes asociadas, favoreciendo la expresin de genes relacionados con la activacin inmune, como receptores de sealizacin, depuracin y la produccin de citoquinas.

28

23/05/2011

Como influencian los prebiticos el Sistema Inmune Mucoso ?

Efecto Prebiotico del Yacn en la microbiota intestinal y el sistema inmune mucoso.

29

23/05/2011

YACN
SMALLANTHUS SONCHIFOLIUS

Yacn (Smallanthus sonchifolius {Poepp. & Endl.} H. Robinson, =

Polymnia sonchifolia es un cultivo andino poco conocido hasta hace algunos aos, sus races se consumen tradicionalmente como fruta por su sabor dulce.
La raz del yacn contiene 84% de agua y 13.9% de

los fructooligosacridos (FOS), que representan el 50-70% de su peso seco, y en menor medida, sin azcares, protenas y minerales (Asami et al. 1991, Hermann et al. 1999).
El efecto prebitico de yacn se puede explicar debido a

su contenido de FOS. .

30

23/05/2011

Investigamos el efecto, de una administracin oral continua y prolongada de Yacn en la inmunidad de mucosa intestinal y sobre la microbiota.

35 30 25 20 15 10 5 15 30

Peso corporal

0,2 0,15 gramos 0,1 0,05 0

Peso bazo

gramos

45 das control

60 yacn

75

15

30 control

45 das yacn

60

75

Peso hgado 1,5 gramos 1 0,5 0 15 30 45 das control 60 yacn 75

31

23/05/2011

Enterobacteria
6 5 4 3 2 0 15 30 45 60 75 90 T iem p o (das) Das co n t ro l y ac n

log ufc/g Log CFU/g

Bifidobacteria
ufc/g Loglog CFU/g 7 6 5 4 3 2 0 15 30 45 60 75 90 TDas iempo (das) yacn

control

32

23/05/2011

Lactobacilli
10 9 8 7 6 5 4 0 15 30 45 60 75 90 T iem po (das) Das yacn

logCFU/g ufc/g Log

cont rol

Celulas IgA+ en intestino delgado

180

NN+ +cells/10 cells/10 fields cpos

160 140 120 100 80 60 40 20 0 Cont r ol 15 30

45

60

75

Das

d a s

33

23/05/2011

Celulas IgA + en ID

CONTROL

60 days sample

Linfocitos CD4+ y CD8+ en ID

40 30 20 10 0

Ncl+ /10 cpos N +celulas/10 campos

15

30

45

60

Co nt ro l

CD4+

CD8+

75

34

23/05/2011

Intestino Delgado 70 60

Intestino Delgado

N +celulas/10 campos N de cel + / 10 cam pos

50 40 30 20 10 0 Control

Das 15 das

Das 30 das
IL12 IL10 IL4

Das 45 das
IFN

Das 60 das

Das 75 das

Estudiamos si el aumento inducido sobre los niveles de IgA protegan frente a una infeccin con Salmonella enterica El estudio se realiz infectando a los animales tratados por 15, 30y 45 das de administracin continua de yacon Esos perodos corresponden a un mayor aumento de celulas IgA +

35

23/05/2011

Da Colonizacin Ensayo 5 y 7 despus del desafo

Colonizacin en Bazo
8,00 7,00 6,00 8,00 7,00 6,00

Colonizacion en hgado

Log CFU/g

Log CFU/g

5,00 4,00 3,00 2,00 1,00 0,00 15 das 30 das 45 das

5,00 4,00 3,00 2,00 1,00 0,00 15 das 30 das 45 das

Ctrol 5dPD

YN 5dPD

Ctrol 7dPD

YN 7dPD

Ctrol 5dPD

YN 5dPD

Ctrol 7dPD

YN 7dPD

A los 15 das de administracin de Yacn hay una prevencin parcial frente S. Typhimurium 30 das de la administracin tuvo un efecto de proteccin total. 45 das de suplementacin no fue protectivo

Influencia del Yacn en IgA-s total y especfica

Total S-IgA in fluid from SI
60,00

Yacn indujo una mayor liberacin de IgA-s total en los animales que recibieron el tratamiento y la posterior infeccin a los 30 das.

50,00

Concentration (ug/ml)

40,00 30,00 20,00 10,00 0,00 15d-5PC 15 d-7PC 30 d-5PC 30 d-7PC 45 d-5PC 45 d-7PC

Infection control
Specfic S-IgA from SI fluid
1,40 1,20

Treated Group

Yacn no tuvo influencia en la produccin de IgA especifica en ninguno de los perodos estudiados.

Absorbance(450 nm)

1,00 0,80 0,60 0,40 0,20 0,00 15d-5PC 15 d-7PC 30 d-5PC 30 d-7PC 45 d-5PC 45 d-7PC

Infection control

Treated Group

36

23/05/2011

PREBIOTICO CONCLUSIONES

Yacn tuvo efecto sobre la inmunidad de mucosa mediada principalmente por un aumento en el total de IgA-s. Contra una infeccin, promueve el aumento de la barrera intestinal mediada por el aumento en los niveles de IgA secretoria.

Conclusiones
Los probiticos y prebiticos influencian la microbiota intestinal Los probiticos activan todas las clulas asociadas al SIM Los prebiticos tienen un efecto mas limitado incrementando la respuesta a IgA-s

37

23/05/2011

Agradecimientos
Colaboradores
Dra. Carolina Maldonado Dra. Alejandra de Moreno Dra. Mara Eugenia Bibas Bonet Dr. Oscar Mesn Bioqca. Natalia Castillo Lic. Ivanna Novotny Lic.Eva Velez Dra. Cecilia Dogi Dr. Gabriel Vinderola Dra. Beatriz Winik Dr. Esteban Carmuega Ing. Ricardo Weill Dr. Alfredo Grau

Muchas Gracias

Capilla de Villa Nougus situada en el cerro San Javier (Tucumn) Argentina

38