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Phase pr-analytique des analyses de microbiologie mdicale

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Plan du chapitre Prescription mdicale Lexcution du prlvement Dlai de transport et conservation des chantillons Scurit Erreurs Liste des circonstances justiciables dun refus danalyse par le laboratoire 7 Conclusion

Les principaux objectifs des analyses microbiologiques sont d'isoler et d'identifier les micro-organismes pathognes et de mesurer leur sensibilit aux antibiotiques. Les analyses sont dfinies par le Guide de Bonne Excution des Analyses comme un ensemble d'tapes successives, allant du prlvement de l'chantillon biologique jusqu' la remise des rsultats. La qualit des rsultats microbiologiques dpend aussi de celle des phases pr-analytique et analytique, ainsi que de la validation des rsultats. La phase pr-analytique comprend plusieurs tapes, dont la squence et la coordination doivent tre sans faille. Il s'agit en effet d'une phase critique pour laquelle le choix de lchantillon et de ses modalits de prlvement, de transport et de conservation doivent tre de qualit optimale. Dans le cas contraire, les rsultats des analyses risquent de n'avoir aucune utilit clinique. La traabilit, dans le respect de la confidentialit, est une des garanties des dmarches effectues par plusieurs professionnels mdicaux et para-mdicaux. Le prlvement est effectu par le prescripteur, ou par un biologiste, ou par une personne dlgue (infirmier, technicien, interne), selon la rglementation en vigueur. Le prescripteur est celui qui juge de l'indication des analyses et en attend des rsultats contribuant au diagnostic et la thrapeutique. Qu'il soit ou non le prleveur, ses objectifs et ses constatations mdicales doivent garantir la qualit et la scurit des prlvements. La scurit concerne le malade, lorsque les prlvement sont invasifs, ainsi que les personnes qui effectuent le prlvement, le transport ou les analyses microbiologiques. Les biologistes sont tenus de s'assurer de l'organisation des diffrentes tapes de la phase pr-analytique. Ils doivent instruire toutes les personnes concernes pour effectuer les prlvements et assu-

rer le minimum de risques au malade et l'entourage. Lorsque le prlvement est effectu au laboratoire, ces tapes sont sous la responsabilit immdiate du biologiste. Dans certains cas, un chantillon ncessite un pr-traitement, notamment lorsqu'une partie doit tre transfre dans un autre laboratoire d'analyses. Cette manipulation doit tre effectue avec les mmes prcautions de scurit et de sauvegarde de l'chantillon que celles prises lors du prlvement. En rsum, le prescripteur porte la responsabilit de l'indication de l'analyse microbiologique. Le biologiste assume rglementairement la responsabilit du prlvement et du transport bien que cette disposition soit peu raliste en pratique. Son rle ensuite est de choisir les mthodes analytiques qu'il conduira et dont il interprtera les rsultats. Lorsque ces mthodes impliquent des procdures particulires durant la phase pr-analytique, elles doivent tre connues la fois du prescripteur et du prleveur. Un certain nombre de rgles gnrales peuvent tre donnes pour les diffrentes tapes de la phase pranalytique afin d'assurer la qualit et d'viter certaines erreurs prjudiciables la validation du rsultat. Des rgles complmentaires s'appliquent certaines indications, notamment en cas d'urgence, et de particularits des micro-organismes ou des techniques d'analyses.

1 Prescription mdicale
L'analyse est habituellement demande dans le but d'tablir le diagnostic et de concourir au traitement d'une maladie infectieuse. Le biologiste cherchera mettre en vidence et cultiver les agents pathognes capables de provoquer des manifestations infectieuses particulires. Dans certains cas, l'analyse a pour but de dtecter la persistance ou le portage de micro-organismes particuliers en vue de prvenir ou de mesurer leur dissmination d'autres sujets rceptifs. Telles sont, par exemple, la recherche d'un portage maternel de Streptococcus agalactiae dans la prvention d'une infection nonatale, et la dtection de bactries multi-rsistantes aux antibiotiques risque pidmique. Une modification de la flore microbienne commensale peut tre parfois tudie l'occasion de protocoles pidmiologiques bien dtermins.

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1- L'ordonnance

L'analyse microbiologique doit tre prescrite explicitement sur l'ordonnance, selon la nomenclature des actes de biologie mdicale. Le prescripteur, son nom, sa qualit, et la manire de le contacter doivent tre clairement identifis. Il doit mentionner l' identit du malade (nom, prnom, sexe, date de naissance). ventuellement son numro d'identification, une date d'hospitalisation ou de transfert d'un tablissement de soins un autre doivent tre prciss, ainsi que tous les renseignements utiles la qualit de l'analyse et la validation des rsultats. Ces renseignements concernent notamment le but de l'analyse : diagnostic tiologique d'une infection, choix ou poursuite d'une thrapeutique, suivi sous traitement, contrle aprs traitement, ou recherche d'une modification de la flore commensale implique dans la prise en charge du malade ou comportant un risque pour son entourage. Le prescripteur doit prciser la recherche de micro-organismes particuliers. Il doit mentionner galement la nature des manifestations pathologiques, le site des lsions infectieuses, et leur date d'apparition. Il doit prciser ventuellement l'tat physiologique du malade et l'existence d'affections associes , telles que l'intolrance aux produits utiliss pour le prlvement, une allergie aux antibiotiques, une immunodpression. Sont utiles prciser : l'ventualit d'un sjour en pays d'endmie et le risque d'infection ou de colonisation par un agent potentiellement pidmique ou rsistant aux agents thrapeutiques : tuberculose, mningococcmie, brucellose, shigellose, hpatite viraleCes renseignements contribuent au choix des techniques de prlvement et d'analyse, la prvention des incidents lis la nature du prlvement, ainsi qu' la limitation des risques de dissmination. Les traitements qui peuvent interfrer avec le choix des techniques de prlvement (traitement anticoagulant) ou d'analyse (traitement antibiotique) doivent tre mentionns. L'interprtation des rsultats tiendra compte des antibiotiques pris avant ou au moment du prlvement. Le degr d'urgence de l'excution du prlvement avant de dbuter un traitement antibiotique est prcis lorsque les rsultats vont modifier la conduite du diagnostic ou de la thrapeutique. Toutefois, une analyse prvue pour un suivi thrapeutique est gnralement diffre, et dans ce cas la date laquelle le prlvement doit tre effectu doit tre prcise.

2- La prescription dtaille (ou une fiche de liaison)

Elle est utile pour coordonner les dmarches du prescripteur, du prleveur et du biologiste. Elle peut comporter les rubriques mentionnes plus haut et de la place pour indiquer des situations non envisages. En effet le choix des techniques microbiologiques les mieux adaptes ncessite que le prescripteur informe le biologiste de la situation du malade et des particularits de chaque prlvement. Ces lments sont pris en compte par le biologiste lors de l'interprtation des rsultats. La fiche de liaison doit tre simple et adapte aux circonstances rencontres en pratique quotidienne. Elle doit tre confidentielle. Son esprit est celui d'une collaboration troite et efficace entre les diffrents acteurs de l'analyse microbiologique. Cependant, pour viter la multiplication des "crits" et la redondance des informations, et pour s'aider des outils informatiques, un (ou plusieurs) modle(s) de prescription d'analyse microbiologique pourrai(en)t tre propos(s). En l'absence de prcisions utiles, le biologiste appliquera les techniques correspondant la recherche systmatique des bactries les plus souvent pathognes dans un contexte clinique par "dfaut".

2 L'excution du prlvement
Le prlvement d'un produit pathologique est un acte cl de la phase pr-analytique. Il existe un trs grand nombre de mthodes de prlvements. Lorsque les lsions infectieuses sont profondes et que leur pronostic est svre, le prlvement invasif le plus proche du foyer infectieux et comportant peu de risque de contamination sera le plus appropri. Il pourra tre associ des prlvements au niveau des portes d'entre probables et des voies d'excrtion, ainsi qu' des hmocultures et des recherches de mtastases septiques permettant d'apprcier la dissmination de l'infection. Lorsque l'tiologie infectieuse peut tre facilement dtermine sur un chantillon prlev par une mthode non invasive, celle-ci sera privilgie. Ainsi l'examen cyto-bactriologique des urines est habituellement effectu sur un chantillon du milieu du jet, plutt que sur le produit d'un prlvement invasif. Dans tous les cas la mthode de prlvement doit tre signale, si elle ne correspond pas la technique usuelle.
1- Le prleveur

Le prleveur habilit doit tre clairement identifi. Il respecte les rgles de soins et dhygine, notamment

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en ce qui concerne le port de gants, blouses, et dans certains cas de masques ou lunettes de protection. Il est inform des circonstances particulires par l'ordonnance ou la fiche de liaison. Lui-mme doit transmettre les indications techniques du prlvement sur une fiche de renseignements jointe aux chantillons destins au laboratoire. En cas d'incident survenu lors du prlvement ou de difficult prjudiciable la validit des rsultats, le biologiste doit en tre inform.
2- Le moment du prlvement

contenant un petit nombre de micro-organismes qui risquent de ne pas tre dtects l'examen microscopique d'un frottis, ni mme rcuprs en culture. Des volumes insuffisants peuvent donc donner lieu des rsultats faussement ngatifs. Comme les chantillons de sang, les produits de ponction ou de biopsie contenant une faible quantit de bactries peuvent tre ensemencs directement dans un milieu de culture liquide. Il faut alors rduire au maximum les risques de contamination par des bactries se multipliant plus rapidement que l'agent pathogne.
5- Les mthodes de prlvement

Un prlvement vise tiologique doit tre effectu ds le dbut du processus infectieux. Dans le cas frquent des infections aigus communautaires, les chantillons doivent tre prlevs avant l'administration d'agents antimicrobiens. En cas d'chec d'un traitement prventif ou curatif institu sans analyse microbiologique pralable, celui-ci doit tre interrompu. Si la svrit de l'volution ne permet pas l'arrt des antibiotiques pendant plus de quelques heures ou sil existe un risque d'infections opportunistes plurimicrobiennes ou successives chez un malade neutropnique ou immunodprim, l'antibiothrapie en cours reste justifie et des modalits techniques particulires peuvent tre proposes. L'ensemencement pourra par exemple tre pratiqu dans des milieux liquides permettant de diluer les antibiotiques de l'chantillon, ou dans des milieux contenant des inhibiteurs d'antibiotiques.
3- Le site du prlvement

Les sites anatomiques appropris sont gnralement les plus proches du foyer infectieux initial et des localisations secondaires, ou ceux qui constituent la porte d'entre, les voies d'excrtion ou d'vacuation de l'infection (fistule, drainage). Il ne convient pas cependant de prlever les liquides de drainage recueillis dans les collecteurs. En effet les souches isoles seraient alors reprsentatives des espces les plus aptes se multiplier secondairement ex vivo et non celles des micro-organismes prsents dans les lsions profondes.
4- Une quantit suffisante de matriel est ncessaire pour une analyse complte.

Une trop petite quantit de matriel ne permet pas au laboratoire de raliser les frottis et les cultures appropris. Le microbiologiste privilgie alors les techniques permettant la reconnaissance des bactries les plus souvent en cause. Ceci est particulirement problmatique pour les lsions chroniques

Elles dpendent des micro-organismes capables d'infecter diffrents organes ou tissus. Elles dpendent galement du type de lsion et de l'enjeu du diagnostic tiologique, en limitant les indications des prlvements invasifs selon le bnfice escompt et les risques iatrognes. Dans tous les cas, les prlvements seront raliss avec du matriel strile usage unique, selon les rgles dhygine et dasepsie appropries. Le procd d'analyse de l'chantillon dpend du type de prlvement et la valeur des rsultats est tributaire de la qualit de l'chantillon. Ainsi l'couvillonnage est proscrire cause du faible volume d'chantillon recueilli et des risques de dessiccation et de contamination. Son usage est limit aux prlvements des tguments ou des muqueuses. Il est alors recommand de prlever deux chantillons, afin que l'un soit utilis pour l'examen microscopique direct et l'autre pour les cultures. Ces chantillons ne peuvent cependant pas remplacer les prlvements obtenus par ponction, aspiration, biopsie ou chirurgie. Les bactries intracellulaires doivent tre rcoltes par "grattage" des muqueuses l'intrieur desquelles elles se sont dveloppes. Une erreur frquente est de transmettre au laboratoire de microbiologie uniquement un couvillon, partir duquel il sera difficile de pratiquer un nombre suffisant de frottis et de cultures, alors que la totalit du matriel de biopsie ou d'excision chirurgicale a t recueillie dans un fixateur, comme le formol, rserv l'examen histo-pathologique. La ponction, le cathtrisme, ou l'abord chirurgical sont indiqus pour les suppurations d'une sreuse, d'un organe creux, d'un tissu ou d'une cavit abcde. Il est utile de prciser si d'autres chantillons ont t rservs pour des examens cytologiques, histo-pathologiques, immunologiques et biochimiques, ou si la rpartition doit tre faite au labo-

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ratoire. Des constatations morphologiques et histopathologiques, qui contribuent au diagnostic d'une infection, peuvent permettre au microbiologiste de complter son analyse par des techniques particulires. Lorsqu'il existe un risque de dissmination et un enjeu vital isoler la bactrie en cause et ajuster le traitement, ces prlvements sont complts par des hmocultures.
6- Contamination des prlvements

rcipient doit tre identifi parune tiquette comportant le nom, le prnom et la date de naissance du malade, ainsi que la date, l'heure, la nature et le site du prlvement. Le prleveur doit tre identifi par son nom ou ses initiales. Le rcipient est transport dans un sac en plastique tanche et ferm hermtiquement, comportant un compartiment pour les papiers et la prescription.

Des prcautions particulires doivent tre prises pour viter la contamination des prlvements par les bactries de l'environnement et par une grande varit de micro-organismes commensaux. Ces bactries ou levures peuvent inhiber la multiplication in vitro des bactries pathognes et tre prises tort pour des pathognes opportunistes. Ceci concerne en particulier les infections dont le site est respiratoire, ORL, oculaire, intestinal, gnito-urinaire, cutan ou souscutan, ainsi que les prlvements de sang pour hmoculture. Il existe, notamment pour les prlvements respiratoires profonds, ainsi que pour les prlvements intra-utrins, des brosses ou cathters tlescopiques qui permettent d'atteindre les sites profonds en vitant le contact avec les muqueuses colonises par la flore endogne. Le risque de contamination existe pour tous les chantillons prlevs la surface des tguments ou des muqueuses. Ainsi le matriel recueilli par couvillonnage de l'orifice d'une fistule a plus de chance de contenir des bactries commensales non pathognes que le matriel prlev en profondeur, par aspiration, curetage ou biopsie. L'aspiration peut tre faite au moyen d'un dispositif strile (cathter, pipette) introduit dans la fistule ou le long du dispositif de drainage, aprs dcontamination de l'orifice ou de la plaie de surface. Les procds de dcontamination de surface comportent soit le simple rinage avec du srum physiologique strile (recueil d'une expectoration, prlvement de plaie, d'escarre ou de brlure), soit l'utilisation sur la peau ou mme sur une muqueuse d'une solution antiseptique. L'antiseptique doit tre limin avec du srum physiologique strile, afin de ne pas inhiber la culture des bactries pathognes. Les ponctions et l'abord chirurgical sont les meilleurs procds de prlvement pour viter les contaminations.
7- Rcipients contenant les chantillons

3 Dlai de transport et conservation des chantillons

En rgle gnrale, les bactries ne rsistent pas la dessiccation et au froid, en particulier lorsque de petits volumes d'chantillons sont prlevs. Les petits chantillons et les biopsies doivent tre achemins en 15 30 mn au laboratoire, les autres en moins de 2 heures, afin de prserver la survie des micro-organismes les plus fragiles et d'viter qu'ils soient inhibs par des bactries plus rsistantes l'environnement extrieur. Les bactries qui ne supportent pas de dlai peuvent tre prserves dans des milieux de transport. Ceux-ci sont couramment utiliss pour des dlais de transport de plus de 2 heures.
1- Conservation des chantillons

Pour viter la dessiccation des chantillons de faible volume, notamment sur couvillon, ceux-ci peuvent tre placs dans des tubes contenant des milieux de transport. La conservation + 4C inhibant la multiplication bactrienne est recommande pour prserver les proportions relatives des diffrentes espces quand des cultures semi-quantitatives sont ncessaires l'interprtation des rsultats. Cette mesure est bien adapte aux urines et aux selles, cependant les shigelles sont trs sensibles au froid et ncessitent un ensemencement immdiat. En revanche elle est controverse pour les chantillons d'origine pulmonaire qui peuvent contenir des bactries pathognes fragiles comme Haemophilus influenzae. D'autres espces bactriennes comme Neisseria meningitidis et N. gonorrhoeae sont particulirement sensibles au froid. Les chantillons gnitaux, oculaires, respiratoires, ou cphalo-rachidiens destins la culture des bactries ne doivent pas tre conservs 4C.
2- Milieux de transport

Des rcipients striles usage unique et tanches sont utiliss pour contenir les chantillons. Chaque

Ces milieux sont destins la conservation de certains types de micro-organismes et l'inhibition d'autres organismes de croissance plus rapide. Les

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milieux de type Stuart conviennent pour la plupart des bactries, y compris les anarobies strictes. D'autres milieux sont ncessaires pour la recherche de certaines bactries, comme les Chlamydia. L'inclusion d'un chantillon dans un milieu de transport empche l'examen microscopique et l'apprciation de la morphologie des cellules et des bactries. Si la quantit d'chantillon est suffisante, une partie peut tre place en milieu de transport et une partie conserve dans un tube strile, contenant ou non un faible volume (0,5 2 ml) de srum physiologique strile ou de bouillon de culture. Les conditions d'inoculation et de transport de ces milieux doivent tre respectes. Mme dans les conditions recommandes, la prolongation du dlai entre prlvement et analyse, ainsi que les variations de temprature, peuvent tre prjudiciables la survie des microorganismes. La plupart des chantillons sont transports la temprature ambiante, d'autres ncessitent d'tre rfrigrs. La responsabilit frquente des bactries anarobies dans les processus infectieux ncessite que les chantillons biologiques soient placs dans des conditions maintenant les bactries anarobies en survie pendant plusieurs heures.
3- Transferts d'chantillons

Les principales rgles de scurit peuvent tre ainsi rappeles La fermeture des rcipients doit tre hermtique, pour ne pas contaminer l'extrieur des flacons ou des tubes. Les procdures de dsinfection adaptes chaque type de contamination doivent tre connues. Le rcipient dont la surface externe a t contamine peut tre plac dans un deuxime rcipient ou dans un sac en plastique ferm hermtiquement. La prescription accompagnant le prlvement doit tre alors place l'extrieur de cet emballage supplmentaire. Lorsquun rcipient fuit, il est prfrable de ne pas le manipuler. Lorsquil ne peut tre plac dans un autre rcipient tanche, il faut viter de le transporter. Il doit tre autoclav et un autre chantillon clinique doit tre transmis au laboratoire. Il ne faut pas transporter une seringue avec son aiguille; celle-ci doit tre retire avec un dispositif de scurit et la seringue purge d'air recapuchonne, puis place dans un sac en plastique ferm hermtiquement.

5 Risques derreurs
Diffrents types de dfauts ou d'erreurs lis aux circonstances mmes du prlvement ou aux modalits utilises peuvent interfrer avec la reconnaissance ou l'isolement du micro-organisme responsable de l'infection. Les exemples comprennent le traitement antibiotique au moment du prlvement, l'application locale de produits anesthsiques sur les lsions avant le prlvement, l'utilisation d'un solut contenant un antiseptique pour recueillir l'chantillon, le transport ou le stockage impropre des chantillons, ainsi que le choix d'un milieu de transport inappropri. D'autres facteurs peuvent gner la recherche de l'agent tiologique ou empcher d'tablir la cause d'une infection. Ce sont notamment : - les difficults de prlvement qui peuvent rendre impossible l'obtention d'un chantillon reprsentatif du processus infectieux; - la contamination habituelle par la flore endogne de certains sites de prlvement; - la difficult de distinguer une simple colonisation d'une vritable infection due des bactries opportunistes. C'est pourquoi plus les prlvements auront t effectus avec prcaution, plus grand sera le niveau de confiance attribu aux rsultats de la culture.

Certaines techniques sont difficiles matriser ou trop coteuses lorsqu'elles ne sont pas pratiques quotidiennement. Elles mritent la mise en place d'une organisation permettant l'acheminement rapide des chantillons ou des cultures vers des laboratoires de rfrence. L'empaquetage, la signalisation et le transport des chantillons de matriel infectieux doivent tre effectus selon des procdures lgales nationales et internationales permettant d'assurer la scurit des personnes et le maintien de la viabilit des micro-organismes cultiver.

4 Scurit
Les prcautions dites "universelles" doivent tre prises pour tous les prlvements. Tout produit pathologique doit tre considr l'heure actuelle comme potentiellement infectieux. Toute prcaution doit tre prise lors des prlvements et de la manipulation des chantillons pour la protection du personnel, en particulier lorsque le risque infectieux est accru, comme dans le cas d'un micro-organisme trs virulent risque pidmique, ou bien particulirement rsistant aux chimiothrapies anti-infectieuses.

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6 Liste des circonstances justifiant un refus d'analyse par le laboratoire

Elles concernent des conditions de prlvement, de transport et de conservation prjudiciables la scurit de l'analyse et la validit des rsultats. L'analyse d'chantillons qui risquent de ne pas tre reprsentatifs du processus infectieux peut donner des rsultats donnant lieu des erreurs de diagnostic et des traitements inappropris. Il est particulirement important d'viter, par un tiquetage correct des chantillons, les erreurs d'identification du malade et d'analyse effectuer. Les situations mentionnes dans le tableau ci-dessous justifient le refus d'un chantillon par le personnel du laboratoire. Le refus doit tre immdiatement signal au prescripteur et au prleveur, afin qu'un autre chantillon soit adress au laboratoire.
Echantillons qui ne peuvent tre accepts pour analyse microbiologique chantillons non tiquets ou improprement tiquets* chantillons reus dans des rcipients endommags et non tanches chantillons visiblement contamins chantillons reus plus de 2 heures aprs leur prlvement, sans avoir t conservs dans les conditions recommandes chantillons inappropris aux analyses prescrites mme type d'chantillon qu'un chantillon reu le mme jour (except hmoculture, LCR) et nouveau prlvement justifi par l'aggravation de la situation clinique

7 Conclusion
Ces principes et recommandations seront complts pour chaque type d'analyse bactriologique dans les chapitres correspondants. Dans le cas particulier de maladies infectieuses inhabituelles ou d'une situation pidmique, la liaison entre prescripteur et biologiste s'impose avant tout prlvement afin d'optimiser les chances d'obtenir des rsultats fiables sur des indications bien poses et sur l'utilisation de moyens de prlvement, de transport et d'analyse les mieux appropris la situation clinique.

Bibliographie FRENEY J., RENAUD F., HANSEN W., BOLLET C. Manuel de Bactriologie Clinique. 2me d. Elsevier. Paris 1994. Guide de bonne excution des analyses de biologie mdicale. Arrt du 2 novembre 1994. JO du 7 dcembre 1994, 17193-17201. MILLER J.M., HOLMES H.T. Specimen collection, transport and storage. In Manual of clinical microbiology. Murray P.R. Baron E.J., Pfaller M.A., Tenover F.C., Yolken R.H. eds. 6th ed. Washington D.C.: American Society for Microbiology, 1995, pp. 19-32. WILSON M.L. General principles of specimen collection and transport. 1995. Clinical Infectious Diseases. 22: 767-777. WOODS G.L., WASHINGTON J.A. The clinician and the microbiology laboratory. In Principles and practice in infectious diseases. Mandell G.L., Bennett J.E., Dolin R., eds. 4th ed. New York: Churchill Livingston, 1995, Vol 1. pp. 169-199.

* S'il s'agit d'un prlvement invasif, l'analyse de l'chantillon peut ventuellement tre faite aprs entretien avec le mdecin qui peut identifier l'chantillon qu'il a luimme prlev, et condition d'indiquer avec le rsultat la rserve due cette procdure.

Lanalyse dans la mme journe d'un mme type de prlvement est inutile, en dehors du sang pour hmoculture ou par exemple d'un liquide cphalorachidien reprlev du fait de l'volution d'un syndrome mning. Si l'analyse d'un chantillon ne donne pas le bnficie escompt, mieux vaut revoir les possibilits d'obtenir un diagnostic et envisager quels moyens peuvent augmenter les chances d'aboutir : modalits diffrentes de prlvement, ou autre site, ou technique d'analyse diffrente. Le laboratoire recevant un duplicata d'un premier chantillon peut le conserver dans les meilleures conditions et appeler le prescripteur pour envisager avec lui qu'elle peut tre une meilleure stratgie pour tayer un diagnostic difficile.