Microarrays

Basado en presentacin de Humberto Daz

Antecedentes

Secuenciacin del Genoma Humano (2001). Busqueda de genes y patrones de expresin. Instrumentos y tcnicas.

Antecedentes
1800 1600

N de Publicaciones

1400 1200 1000 800 600 400 200 0 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002

Aos
Microarrays Affymetrix

Evolucin de las tcnicas

Conceptos Generales

Biochip Dispositivos de pequeo tamao que contienen material biolgico y que se emplean para la obtencin de informacin gentica.

Clasificacin de Biochips

Microarray cDNA

Ventajas del uso de Microarrays

Flexible

- Arreglos a medida.
- Permite realizar ensayos simultneos utilizando muestras diferentes o realizar varios ensayos utilizando una nica muestra.

Exhaustivo

- Alta capacidad: Genomas completos.

Fcil

- Ensayos reproducibles y transportables.

Ventajas del uso de Microarrays

Rpido

- Alto rendimiento: anlisis de miles de genes en pocas semanas.

Barato

- No se precisa un elevado costo de reactivos. - No se precisa el manejo de radiactividad. - No se precisa disponer de un plan especial para la gestin de residuos.

Desventajas del uso de Microarrays

Costo

- Elevado costo de inversin en la adquisicin del equipamiento necesario para el acceso a la tecnologa. - Controles apropiados y replicas. - Incompatatibilidades entre los equipamientos.

Control

- Artefactos con anlisis de imgenes y de datos.

ETAPAS EN LA EXPERIMENTACIN

ETAPAS

Etapa 1

- Diseo del Biochip - Fabricacin

Etapa 2

- Preparacin de la Muestra. - Hibridacin y Lavado. - Revelado: Anlisis de la Imagen.

Etapa 3

- Almacenamiento y anlisis de los resultados

Etapa 1

Diseo del tipo y cantidad de material biologico a inmovilizar Tipo de Experimento. Bases de Datos LIMS Laboratory Information Management System - Organismos, Cepa, Fuente Celular - Condiciones del tratamiento - Protocolos de extraccin del RNA - Protocolos de hibridizacin, etc. Densidad de integracin Mtodo de fabricacin. Seleccin de estndares internos Housekeeping y controles negativos.

Ejemplos

OncoChip: identifica las mutaciones de 6.514 genes cuya actividad se relaciona con distintos tipos de cncer (CNIO)

ToxiChip: Contiene cerca de 12.000 genes humanos (respuesta a HAP/Dioxinas, P40s, oncogenes y genes supresores de tumor, etc.) (NIEHS: National Institut of Environmental Health Sciences). YeastChip: contiene 4.824 genes de la levadura.

Tecnologas de fabricacin
Tecnologa de fabricacin
Qumica fotolitogrfica Qumica digito ptica Litografa fotoresistente Pin & Ring Inyectores piezoelctricos

Permite sntesis in situ

Capacidad de miniaturizacin

Densidad Mx. (Ptos/matriz)

<10 m

>106

20 m

2x106

S No

0.5-100 m 100 m

>106 x 1.000

20-80 m

x 1.000

Microimpresin hmeda Inmovilizacin en gel XNA on gold

50 m

x 1.000

No No

10-100 m ----

x 1.000 96

Fotolitografa: Sntesis in-situ

Robots Piezoelctricos (Spotted Arrays)

Robots Piezoelctricos (Spotted Arrays)

Preparacin (coated) de Slides (Spotted Arrays)

Activacin de la superficie y las sondas.

Preparacin para formar una capa uniforme de grupos reactivos qumicamente estables, para evitar uniones no especficas de las sondas en el soporte.

Fuentes de variabilidad

Fabricacin:

Sntesis de oligos Oligos truncados Salto de nucletidos Diferente concentracin de oligos o productos de PCR Secuencia de cidos nucleicos Estructura secundaria Contenidos de G+C Hibridizacin cruzada Impresin Variacin de los pin Orden de la impresin en los Slide Plataforma de Array Curvatura de los Glass-slide

Artefactos que producen variabilidad en los puntos (Spot)

Punto negro

Punto fuera del centro

Punto donut

Punto saturado

Etapa 2: Preparacin de la Muestra.

Extraccin y Purificacin del Material a Analizar (ADN, ARN o protenas). Amplificacin (material gentico). Marcaje de la Muestra (Variable).

Mtodos directos: ej. Fluorocromos: fluorforos (Cy3 y Cy5). Mtodos indirectos: ej. Qumicos: biotina.

Marcaje de la muestra (Affymetrix)

Marcaje de la muestra

(Spotted Arrays)

Etapa 2: Hibridizacin y Lavado.

A partir de este paso el procedimiento de trabajo es prcticamente

igual para los chips comerciales y personalizados Hibridizador Lavado

Centrfuga

Etapa 2: Revelado

Deteccin de marcadores fluorescentes: cmaras ccd (couple charge device, dispositivo multiplicador de carga) o escner lser.

Revelado: visualizacin de los datos

FORMA NUMRICA APOYO DE SOFTWARE INFORMTICO IMGEN DE 16 BITS

Revelado: visualizacin de los datos

condicin 1 (chip 1) condicin 2 (chip 2) condicin m (chip m)

gen 1 gen 2 ...

gen n

Fuentes de variabilidad

Manipulacin de los Array en el laboratorio

Tratamiento de las clulas

Polvo, huellas, etc.

Extraccin de la muestra

Variabilidad tcnica Variabilidad tcnica Variabiliadad mtodo de extraccin Incorporacin y deteccin del marcador Degradacin del marcador durante el almacenamiento Distribucin no uniforme de las muestras Temperatura no uniforme de la cmara de hibridizacin Foco del escner Fijacin de la intensidad del lser

Marcaje

Hibridizacin

Escaner Hibridizacin

Etapa 3: Anlisis de los resultados

Extraer las intensidades de las sondas o los radios de cada uno de los puntos de hibridacin (blancos - cDNA), para obtener informacin que sea fcil de interpretar.

Anlisis de imagen
Objetivo: Obtener un valor representativo para cada sonda.

Pasos para el anlisis de imagen

Establecimiento de la malla conformada por los puntos inmovilizados hibridizacin positiva, centros y coordenadas. - Manual o automtica.

Deteccin y eliminacin del ruido de fondo de las seales (tipo de biochip y tipo de marcaje). Limitacin del tamao de los puntos detectados. Asignacin de las intensidades de cada punto relacin entre intensidades de c/fluorforo

Transformacin logartmica de los datos

Transformacin logartmica de los datos

log rojo/verde: log ratio 1 = sobre-expresado por un factor de 21 = 2 -1 = sub-expresado por un factor de 2-1 =1/2

Interpretacin de los datos

COLOR NEGRO: La razon del control/cDNA experimental es igual a 1. COLOR ROJO: Aumento en la abundancia de mRNA. COLOR VERDE: Disminucin de la abundancia de mRNA de la muestra experimental respecto a la control. COLOR GRIS: Ausencia de datos o datos de baja calidad.

Anlisis de Datos de Microarray

condicin 1 (chip 1) condicin 2 (chip 2) condicin m (chip m) gen 1 gen 2 ...
1.2 1.0 0.3 1.1 1.1 0.4 1.3 1.1 0.3 1.0 1.2 0.5 1.2 1.0 1.0 1.2 1.1 1.1 1.3 0.5 1.3 1.8 0.2 1.2 2.2 0.3 1.1 3.5 0.4 1.0

0 0

0 0

0 0

0 0

0 0

0 0

0 0

0 0

1 -1

1 -1

gen n

Normalizacin de los datos

La normalizacin trata de corregir el sesgo sistemtico de los datos. Minimiza la variacin no biolgica entre arrays, permitiendo comparar datos de un array a otro. Existen distintos mtodos de normalizacin. - Intensidad total. - Tcnicas de regresin. - Housekeeping genes

Comparacin de los datos de expresin: representaciones

Clusters. PCA: Principal Component Analysis. Mtodos Supervisados: SVM (Super Vector Machine).

Aplicaciones de los Microarray

Expresin diferencial de genes: cuantificacin simultnea de nmero elevado de genes y aproximacin cualititativa de patrn de expresin. Deteccin de mutaciones y polimorfismos (SNP). Diagnstico clnico gentico: teleconsulta mediante biochips. Screening y toxicologa de frmacos. Seguimiento de terapia (identificacin de la mejor terapia). Medicina preventiva.

Ejemplo 1: Cncer
Qu genes estn involucrados en diferentes tipos de cncer? Se utilizaron 6.817 genes para distinguir entre la leucemia linfoide aguda (ALL) y la leucemia mieloide aguda (AML). Independiente de los resultados histolgicos o histoqumicos, fue posible clasificar 36 de los 38 casos desconocidos Comparacin = cnceri x cncerj (N2)
Ref: Golub et al., 1999
Leucemia linfoide aguda Leucemia mieloide aguda

Ejemplo 2: Estados de Desarrollo

Qu genes estn presentes solamente en estados diferentes de desarrollo normal?

Comparicin = estadoi x estadoi+1 (N) Qu genes se expresan diferencialmente en el desarrollo de cepas knock-out? Comparacin = estadoWTi x estadoKOi (N)

Resultados a Largo Plazo: Atlas del desarrollo de invertebrados

Ref: Brivanlou et al, 2001

Ejemplo 3: Comparacin de Tejidos

Qu genes caracterizan nicamente a un tipo de tejido?

Comparacin = tejido X tejido (N2) Resultados a Largo Plazo: Atlas del cerebro del ratn
Ref: Barlow et al., 2001

Ejemplo 4: Comparacin de clulas de levadura con y sin plasmidio

Qu genes se expresan en forma diferencial?

SOD

Ref: Laboratorio CIBYB

Bases de datos de biochips

Categora Nombre del Programa PEDB - Prostate Expression Database. Univ. of Washington - Seattle Array Express - EBI cDNA microarray database - NCI - CIT ExpressDB y BIGED - Harvard MAT - AECOM GENEX - NCGR - Silicon Genetics Stanford BASES DE DATOS DE EXPRESIN GNICA Y/U OBTENIDOS CON BIOCHIPS Genelogic - Gene Express2.000 GXD - Gene expression database - Jackson Lab HuGeIndex CBIL - Genexpress DDBJ RZPD RAD - Univ. Pennsilvania ChipDB - Whitehead Inst. MIT Glaxo-Wellcome HESI - ILSI & S.B. GEO - Gene expression omnibus - NCBI ArrayDB . NHGRI www.informatics.jax.org/menus/expression/m enu.shtml http://www.geneindex.org http://genex.sigenetics.com http://arep.med.harvard.edu/ExpressDB/ Fuente http://chroma.mbt.washington.edu/PEDB/ http://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/

http://genomewww4.stanford.edu/MicroArray/MDEV/

Herramientas Disponibles

Almacenamiento, clustering, visualizacin

Iobions GeneTraffic Manchesters maxD NIH NCI TIGR Multiexperiment viewer

www.iobion.com www.bioinf.man.ac.uk/microarray/maxd www.lecb.ncicrf.gov/MAExplorer www.tigr.org/software

Preparacin de datos, normalizacin, limpieza, anlisis estadstico

Iobions GeneTraffic Terry Speed, Berkeley dCHIP, Harvard

www.iobion.com www.bioconductor.org
biosun1.harvard.edu/complab/dchip/manual.html

Bases de Datos Stanford Microarray DB GEO at NCBI

genome-www5.stanford.edu/MicroArray/MDEV

www.ncbi.nlm.nih.gov

Sitios para Investigar On-line

Y.F.Leung, Terry Speed, Berkeley

ihome.cuhk.edu.uk/~b400559/arraysoft.html www.stat.berkeley.edu/users/terry/zarray/Html/

Harry Mangalam, UCSF gweb1.ucsf.edu.labs/genome/AnalysisTools.html Rockefeller Gene Array Facility www.rockefeller.edu/genearray/links.php www.rockefeller.edu/genearray/software.php MGED (Microarray Gene Expression Data standards group) www.mged.org (check out MIAME & MAGE)