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Microscopa Electrnica
Apuntes de Clases IV Ao PROF. ENCARGADO: T. M. Nancy Olea Rosson PROF. COORDINADOR: T. M. Nancy Olea Rosson AYUDANTE T. PRCTICOS: T. M. Marta Gacita
2003
Del Microcosmos al Macrocosmos: Una Visin de la Microscopa Electrnica y su Contribucin al Conocimiento del Universo.
Prof. Gabriel Rodrguez IDIEM Martes 30 de Septiembre de 2003
La sed de conocimiento del ser humano le ha llevado a indagar la composicin de su entorno y de s mismo, para as descubrir de qu forma lo existente se interrelaciona. Esta infinita necesidad de aprender lo ha llevado a observar desde su medio ms inmediato hasta el plano de lo nfimo o ms bien pequeo (el subuniverso microscpico) y de lo abismantemente enorme y/o lejano (el subuniverso macroscpico), comenzando a entender con ello la gran variedad de estructuras, formas, diseos y entidades existentes en el Universo. Al iniciar este curso de Microscopa Electrnica, haremos una breve pero didctica revisin de cmo el ser humano ve y los medios de apoyo que ha desarrollado para la visin y observacin de su mundo. Nuestro entorno lo vemos con nuestros sentidos, y particularmente con el sentido de la vista. El ser humano puede ver medidas limitadas en torno a l; de hecho el metro fue creado como medida de referencia considerando la estatura del ser humano, y sobre esta base se crearon subunidades y amplificaciones de la unidad referencial (micrometros, milmetros, centmetros, decmetros, kilmetros, etc.). El ser humano puede ver, en trminos inferiores a la unidad, objetos de milmetros de dimetro, y por debajo de 0.2 mm le es difcil ver a simple vista, en tanto que en dimensiones grandes, a distancias mayores de 1 km le resulta poco claro distinguir objetos grandes. Cuando los objetos son muy grandes, debemos alejarnos para poder contemplarlos. Por ejemplo, hasta el siglo XV el ser humano no se percat de la redondez de la Tierra, pues se pensaba que era plana y si bien existan hiptesis sobre la posibilidad de su redondez, no exista la certeza fehaciente de ello, pues no existan medios de transporte y observacin que permitieran verla desde lejos. Entonces se deba rehacer poco a poco la geografa para entender cmo era su forma. Afortunadamente hay objetos ms lejanos que podemos visualizar, pero que por su distancia debemos acercarlos a la vista, lo mismo que cuando queremos ver objetos muy pequeos. Dada la capacidad de la vista de ver slo puntos distantes entre s a un mximo de 0.2 mm (lmite de resolucin, mnima distancia a la que 2 objetos separados entre s pueden ser distinguidos como 2 entidades diferentes). Este lmite de resolucin se da porque uno ve realmente el ngulo bajo el cual esos 2 puntos se observan (lo que est dado por la distancia a la que los fotorreceptores estn separados entre s).
Del Microcosmos al Macrocosmos: Una Visin de la Microscopa Electrnica y su Contribucin al Conocimiento del Universo.
Prof. Gabriel Rodrguez IDIEM Martes 30 de Septiembre de 2003
2003. Alumnos de la Mencin Morfofisiopatologa y Citodiagnstico. Escuela de Tecnologa Mdica. Facultad de Medicina. Universidad de Chile. Prohibida su reproduccin total o parcial, y su publicacin con fines acadmicos sin mencin a los autores. Su utilizacin debe ser solicitada expresamente a los autores
LAS DIMENSIONES DEL UNIVERSO Gabriel Rodrguez J. (socio 41) El Universo, desde el micro al macrocosmo, tiene dimensiones que la mente humana difcilmente llega a comprender. Por un lado estn las partculas subatmicas, infinitamente chicas, que rayan en la nada misma. Por otro lado estn los espacios intergalcticos que son tan grandes que cuesta entender que la luz, que viaja a la pasmosa velocidad de 300 mil kilmetros por segundo, demore miles de millones de aos en recorrerle. Pero as es. El problema de imaginar ms o menos correctamente esas dimensiones pasa por nuestra limitacin mental de comprender cabalmente los grandes nmeros. Estamos familiarizados con las unidades comunes, milmetros, metros y kilmetros, tiles en el diario vivir, los que comprendemos correctamente porque los usamos a menudo, pero raras veces nos codeamos con dimensiones de millones de millones de kilmetros o, en el otro extremo, millonsimas de millonsimas de milmetro. Entonces, cuando nos enfrentamos a tales cantidades, perdemos la nocin de lo que ellas representan verdaderamente. Muchas veces manejamos grandes cantidades con demasiada liviandad, hablamos por ejemplo de una riqueza de mil millones de pesos o de un trabajo que demand un milln de horashombre o de un vehculo que tiene un milln de kilmetros recorridos o que la poblacin mundial llega a 6 mil millones de habitantes, etc. Se ha detenido Ud a pensar realmente lo qu significan esas cifras? Sabe Ud. que si contramos a razn de un nmero por segundo sin descansar da y noche, demoraramos once das y medio en contar un milln? Otro ejemplo, si todos los habitantes del mundo actual se pusieran en fila india y pasaran frente a alguien que los contabilizara a razn de una persona por segundo, ese alguien demorara 190 aos en contarlos! En el intertanto la poblacin mundial crecera y, como lo hace duplicndose cada 30 aos aproximadamente, significa que ese alguien estara eternamente contando, sin poder nunca acabar su tarea. Otro caso: cuntos segundos cree Ud. que han transcurrido desde que Cristbal Coln descubri Amrica, hace algo ms de 500 aos? A primera vista se creera que es un nmero gigantesco, casi inexpresable. No es tanto. La respuesta es aproximadamente 15 mil millones de segundos(producto de multiplicar 500 aos por 365 das por 24 hora por 60 minutos y por 60 segundos). Curiosamente esta cifra es la edad del Universo desde su nacimiento hasta ahora, si cada segundo equivaliese a un ao! Cun lejos est la Luna? Si consideramos nuestra conocida unidad de distancia llamada kilmetro (equivalente a 1000 metros) entonces la distancia Tierra-Luna es algo menos de medio milln de kilmetros (exactamente 384.500 km). Esta es una enorme distancia que en nuestro diario vivir casi no se usa. Pero todo es relativo porque si en vez de usar el kilmetro como unidad usamos la distancia de la Tierra al Sol (llamada por los astrnomos unidad astronmica, que equivale a 150 millones de kilmetros!), entonces la distancia Tierra-Luna resulta ridculamente chica, algo as como 3 milsimas partes de esa
2003. Alumnos de la Mencin Morfofisiopatologa y Citodiagnstico. Escuela de Tecnologa Mdica. Facultad de Medicina. Universidad de Chile. Prohibida su reproduccin total o parcial, y su publicacin con fines acadmicos sin mencin a los autores. Su utilizacin debe ser solicitada expresamente a los autores
distancia. Es decir que si el Sol y la Tierra fuesen dos puntos que estuviesen a 100 metros de distancia la Luna estara a menos de 30 cm de la Tierra. Cun cerca est la Luna y qu lejos est el Sol! Sin embargo, en nuestra vida comn, consideramos que la Luna est muy lejos, tan lejos que los astronautas que viajaron a ella, demoraron ms de tres das en llegar a su destino aun cuando se desplazaban a velocidades de unos 30.000 kilmetros por hora aunque haciendo un recorrido en espiral. Estas comparaciones muestran que a nuestra mente le cuesta bastante darse cuenta lo que significan los grandes nmeros que, por decirlo crudamente, usamos tan sueltos de cuerpo. En otras palabras, las unidades corrientes, por ejemplo metros, resultan ridculamente chicas si las usamos para medir la distancia a las galaxias y ridculamente grandes si la usamos para medir cosas pequeas, tales como microbios o partculas atmicas. Veamos algo ms del macrocosmos. La estrella ms cercana a nosotros se llama Prxima Centauro y est a 4,3 ao-luz1, vale decir que se encuentra a unas 270.000 veces la distancia Tierra-Sol, repito 270.000 veces la distancia de la Tierra al Sol que, a su vez, es de 150 millones de kilmetros! Es algo casi inimaginable verdad?y esto es slo el principio de las distancias astronmicas pues se han podido fotografiar galaxias que estn a ms de 10 mil millones de aos luz de nosotros. Una manera didctica de representar estas cantidades es hacer saltos de 10 en 10, es decir crecer (o decrecer) en factores de diez. Me explico, es posible hacer una escala (similar a una regla graduada en centmetros) en que cada mdulo sea 10 veces superior al anterior (los matemticos la llaman escala logartmica). Para ejemplarizar hagamos en un papel una escala logartmica. Tracemos una recta y hagamos una marca cada centmetro de modo que cada una valga 10 veces la anterior, del siguiente modo: primera marca representa 1 metro, segunda marca representa 10 m, tercera marca 100 m, cuarta marca 1000 m, quinta marca 10.000 m, sexta marca 100.000 m y as sucesivamente. (Para evitar tener que escribir tantos ceros, puede emplearse el mtodo que usan los matemticos, es decir colocar un exponente junto al nmero 10 que represente el nmero de ceros que tendra la cantidad que se quiere representar, por ejemplo, el valor cien, que tiene dos ceros, se representa como 102 ; mil, que tiene tres ceros, se escribe 103 ; un milln, que tiene seis ceros, como 106 , y as sucesivamente. Como la distancia Tierra-Sol es de 150 millones de km, se representa abreviadamente como 150 x 106 kilmetros o bien en nuestra escala logartmica en metros sera 150 x 109 metros. Pues bien, para representar el tamao del Universo2 en metros es necesario hacer 26 marcas en la regla en que cada una valdra 10 veces la anterior. En una tal regla podramos
Un ao-luz es la distancia que la luz recorre en un ao a la velocidad de 300.000 km/seg. Equivale a multiplicar los 365 das por 24 horas por 60 minutos por 60 segundos y por 300.000 = 9.5000.000.000.000 km, lo que se puede escribir abreviadamente 9,5 x 1012 km (se lee 9,5 billones de kilmetros). Para expresar esta cantidad en metros hay que multiplicar por mil, vale decir que se llega a 9,5 x 1015 metros. 2 El tamao del Universo puede calcularse multiplicando su edad por los metros que la luz recorre en un ao . Como la actual estimacin de la edad del Universo desde que ocurri el Big Bang o gran explosin primogenia es del orden de 15 mil millones de aos y, puesto que la luz inicial viene viajando desde
2003. Alumnos de la Mencin Morfofisiopatologa y Citodiagnstico. Escuela de Tecnologa Mdica. Facultad de Medicina. Universidad de Chile. Prohibida su reproduccin total o parcial, y su publicacin con fines acadmicos sin mencin a los autores. Su utilizacin debe ser solicitada expresamente a los autores
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representar cualquier distancia aproximada, por ejemplo, la altura de una casa de 10 metros (101 ) o la altura de una torre de 100 metros ( 102 ), o la distancia Tierra-Sol que como se dijo es de 150 mil millones de metros (150 x 109 ), etc. En la Tabla final se muestran estas y otras distancias hasta llegar a cubrir el tamao total del Universo. Similarmente se pueden representar cantidades pequeas. Por ejemplo, un dcimo de metro puede escribirse en forma decimal 0,1 m. Un milsimo de metro (llamado milmetro, mm) se escribe 0,001 m. Para llevarlo a nuestra escala se escribe en forma exponencial similar a como se hizo anteriormente con los grandes nmeros, colocando como exponente de 10 el nmero de ceros que contiene el decimal y anteponiendo un signo menos (-) para sealar que es fraccionario. As los nmeros decimales sealados anteriormente como ejemplo, se escriben del siguiente modo: 0,1 m se escribe 10 1 m, y 1 mm que equivalente a 0,001 m se escribe 10 3 m y as sucesivamente. En este mbito, una hormiga de 2 mm puede escribirse como 2 x 10 3 m ; un microbio de un milsimo de mm se puede escribir 10 6 m ; el tomo de hidrgeno tiene un tamao de 10 12 m y un protn 10 18 m. Como se dijo el radio del Universo mide 10 26 m y un protn mide 10 18 m lo que significa que desde el microcosmos al macrocosmos hay una relacin de 10 18 hasta 10 +26 = 10 44 . Es decir el Universo es 10 44 veces ms grande que un protn, cifra que de no disponerse de una escritura abreviada habra que escribirla del siguiente modo: 100000000000000000000000000000000000000000000 En la pgina siguiente se muestra una tabla en escala logartmica donde se sealan los tamaos del macrocosmos.
entonces, el radio total del Universo ser de 9,5 x 1015 metros multiplicado por la edad 15.000.000.000 de aos lo que da muy aproximadamente la bonita cifra de 1,4 x 10 26 m.
2003. Alumnos de la Mencin Morfofisiopatologa y Citodiagnstico. Escuela de Tecnologa Mdica. Facultad de Medicina. Universidad de Chile. Prohibida su reproduccin total o parcial, y su publicacin con fines acadmicos sin mencin a los autores. Su utilizacin debe ser solicitada expresamente a los autores
ESCALA (LOGARTMICA) PARA REPRESENTAR EL TAMAO DE OBJETOS Objeto Tamao metros Altura de un nio 1 m 10 0 Altura de una casa de 3 pisos 10 m 10 1 Altura Torre Entel 100 m 10 2 Longitud de 1 kilmetro 1.000 m 10 3 Distancia Santiago-Lo Espejo 10 km 10 4 Distancia Santiago-Valparaso 100 km 10 5 Distancia Santiago-Puerto Montt 1.000 km 10 6 Distancia Polo-Ecuador 10 mil km 10 7 2,5 vueltas a la Tierra 100 mil km 10 8 2/3 del dimetro del Sol 1 milln km 10 9 26 veces la distancia a la Luna 10 millones km 10 10 2/3 distancia Tierra-Sol 100 10 11 Distancia Sol-Saturno (1 hora-luz)1 mil 10 12 10 h-l dimetro Sistema Solar 10 10 13 100 h-l, espacio vaco 100 10 14 1000 h-l 1 billn km 10 15 1 ao-luz (a-l), zona de cometas 10 10 16 10 a-l , zona con algunas estrellas 100 10 17 100 a-l estrellas, nebulosas, etc. V.Lctea 1000 10 18 1000 10000 10 19 10.000 100000 10 20 100.000 dimetro Va Lctea 1 milln de billones km 10 21 1.000.000 espacio vaco, Andrmeda 10 milln de billones km 10 22 10.000.000 galaxias, Grupo Local 100 10 23 100.000.000 galaxias 1000 10 24 1.000.000.000 10000 10 25 15.000.000.000 radio del Universo 100000 10 26 En resumen, el macrocosmo est compuesto en su tamao por 6 niveles: Primer nivel. Nuestro mundo cotidiano, mensurable en metros o kilmetros. Segundo nivel. Nuestro Sistema Solar mensurable en millones de km. Tercer nivel. Grupo de estrellas cercanas al Sol mensurable en aos-luz. Cuarto nivel. Nuestra Va Lctea mensurable en miles de aos-luz. Quinto nivel. Grupos de galaxias mensurable en millones de aos-luz. Sexto nivel. Universo mensurable en miles de millones de aos luz
2003. Alumnos de la Mencin Morfofisiopatologa y Citodiagnstico. Escuela de Tecnologa Mdica. Facultad de Medicina. Universidad de Chile. Prohibida su reproduccin total o parcial, y su publicacin con fines acadmicos sin mencin a los autores. Su utilizacin debe ser solicitada expresamente a los autores
se ha instituido desde su creacin en los aos 30 en una herramienta de apoyo fundamental para el entendimiento de la ultraestructura de entidades biolgicas y no biolgicas. En esta presentacin haremos una revisin prctica orientada a aspectos tcnicos del funcionamiento del microscopio electrnico. Aquellos que hemos trabajado con microscopios pticos hemos logrado obtener aumentos prcticos de 1000 veces, pero sabemos que cambiando la fuente de luz o radiacin (por ejemplo empleando radiaciones UV), puede variarse el aumento de un microscopio. Esto se basa en la limitacin que pone la longitud de onda utilizada en el poder o lmite de resolucin de un microscopio. En la medida que la longitud de onda empleada es menor, la resolucin (distancia mnima a la que 2 cuerpos cercanos deben estar separados para ser distinguibles como entidades distintas) aumenta. Si consideramos que el ojo humano tiene una limitada capacidad de visin, que slo comprende las radiaciones ubicadas entre los 350 y 700 nm (violeta a rojo, rango visible del espectro de longitudes de onda), y que no percibe ni las longitudes de onda inferiores a 350 nm (UV, radiacin X, , , , rayos csmicos) ni aquellas superiores a 700 nm (IR, microondas, ondas de radio, TV), nos encontramos con la sorpresa de tener una pobre percepcin de nuestro entorno (Figura 1). Nuestro lmite inferior llega a niveles de longitudes de onda que cumplen con las condiciones exigidas a la luz, es decir, reflejadas, focalizadas y colimadas (concentradas), pero no deflectadas, salvo que sufran efecto de masas tal como lo explica la teora de la relatividad de Einstein.
2002. Alumnos de la Mencin Morfofisiopatologa y Citodiagnstico. Escuela de Tecnologa Mdica. Facultad de Medicina. Universidad de Chile. Prohibida su reproduccin total o parcial, y su publicacin con fines acadmicos sin mencin a los autores. Su utilizacin debe ser solicitada expresamente a los autores
El manejo de las longitudes de onda nos permite determinar los lmites de ampliacin de las imgenes. En la microscopa de luz empleamos fotones, en tanto que en microscopa electrnica la muestra es iluminada por electrones. stos son de un manejo relativamente fcil. Se ilumina puntualmente, con un menor lmite de resolucin. Puede tomarse una seal y trasladarla al espectro visible. Sin embargo, tienen una baja penetracin pese a la alta aceleracin que se les puede imprimir, por lo que es necesario que las muestras sean muy finas. Dependiendo del espesor y el peso atmico (P.A.) de la masa en observacin, ser la penetracin que tengamos. A mayor peso atmico, menor penetracin. Generalmente, el material observado en biologa es de PA bajo. El MET empleado en biologa se caracteriza por tener bajas aceleraciones de electrones, entre 40 y 100 kV. Al aumentar la energa de los electrones por mayor kV aplicados, se les imprime mayor velocidad, pudiendo pasar desde el estado esttico a la velocidad de la luz.
Componentes del Microscopio Electrnico de Transmisin: En el esquema que sigue, se presentan de manera simplificada los diferentes componentes del MET:
(i). Sistema de iluminacin: Constituido por un can de electrones, encargado de emitir el haz electrnico que incidir sobre la muestra, y por un sistema de lentes condensadoras que coliman o pulen el haz, mantenindolo recto.
2002. Alumnos de la Mencin Morfofisiopatologa y Citodiagnstico. Escuela de Tecnologa Mdica. Facultad de Medicina. Universidad de Chile. Prohibida su reproduccin total o parcial, y su publicacin con fines acadmicos sin mencin a los autores. Su utilizacin debe ser solicitada expresamente a los autores
(ii). Sistema ptico o de magnificacin: Constituido por una lente objetivo, lentes intermedias y una lente de proyeccin, que amplifican la imagen del espcimen. (iii). Pantalla: Encargada de convertir la seal del haz de electrones que traspas la muestra, en luz visible, permitiendo que se vea el espcimen. (iv). Sistema de grabacin: Consistente en placas fotogrficas, sistema de video o sistema de captura digital, que permite el almacenamiento de la informacin ptica de la muestra, lo que es necesario para el anlisis de las muestras.
a. Can: El can es la fuente de electrones que incidirn en la muestra. Se comporta como una fuente electromagntica (FEM), aportando aceleracin a los electrones. El can est constituido por un sistema de transmisin termoinica, que se comporta como un conductor (que tiene electrones libres; diferente es el caso de los aislante, cuya cantidad de electrones libres es nfima o nula) en que al calentar el conductor aumenta la cantidad de electrones libres en el material conductor, por fuerzas que producen una nube electrnica en torno a este material. Estos electrones libres, al ser estimulados con una energa mayor a aquella que los mantiene unidos al tomo del que forman parte, son expulsados del orbital en que se encuentran y pueden viajar por el vaco hasta que encuentren un objeto en su camino.
Cuando se pone una placa positiva (+) respecto del elemento, sta atrae los electrones libres que se mueven por el espacio; debemos recordar que esta libertad de movimiento est condicionada a que no exista algn elemento que interfiera en el trayecto de estos electrones. Para que los electrones se desplacen libremente el camino a seguir por ellos debe estar completamente libre, por lo que es necesario proporcionar vaco extrayendo gases de la columna.
2002. Alumnos de la Mencin Morfofisiopatologa y Citodiagnstico. Escuela de Tecnologa Mdica. Facultad de Medicina. Universidad de Chile. Prohibida su reproduccin total o parcial, y su publicacin con fines acadmicos sin mencin a los autores. Su utilizacin debe ser solicitada expresamente a los autores
El aire que respiramos tiene una densidad de 1kg por m3; cuando lo calentamos se aumenta el volumen por aumento de la energa cintica de los tomos que lo componen. Por cada kg de aire, cuando es calentado, aumenta en la carga que ste puede elevar. Por ejemplo, para elevar a una persona de 100 kg se requieren 200 m3. Los electrones que se encuentran en el aire tienen poca masa comparados con los de algunos metales, principalmente aquellos empleados en microscopa electrnica. Uno de ellos es el oro, cuya densidad es 20 kg/l; el aire por contrapartida tiene una densidad y peso equivalente a 20000 veces menos. Cuando existe una perforacin en la pantalla, la mayora de los electrones quedan detenidos en el nodo, pero aquellos que pasan a travs de la perforacin viajan por el vaco en direccin al infinito con una baja eficiencia. El nodo mide de 4 a 5 mm2, en tanto la perforacin mide 3 mm de dimetro. El filamento generador de electrones tiene forma de punta en V y est conectado a la FEM. Cuando alcanza la temperatura de 1000 C este filamento incandesce, generando trabajo y potencia.
El filamento es un pequeo alambre de 1 cm por lado; no importa la polaridad pues la FEM se encarga de calentar el filamento aumentando con ello la energa cintica de los electrones de la punta del filamento. En el otro extremo del circuito hay un nodo, que es un elemento circular con una perforacin central, cuyo potencial es (+). Dado que los electrones se repelen entre s por similitud de cargas, estos se dirigen hacia el nodo.
2002. Alumnos de la Mencin Morfofisiopatologa y Citodiagnstico. Escuela de Tecnologa Mdica. Facultad de Medicina. Universidad de Chile. Prohibida su reproduccin total o parcial, y su publicacin con fines acadmicos sin mencin a los autores. Su utilizacin debe ser solicitada expresamente a los autores
Protegiendo al filamento se encuentra un componente denominado Cilindro de Wehnelt, que focaliza el haz de electrones. A travs de la apertura central de este cilindro se produce el cruce de electrones, formndose un embudo de electrones, de los que la gran mayora pasan a travs de la perforacin. La fuente del filamento genera una tensin de 6 a 12 V, en el cilindro de Wehnelt se produce una tensin de 100 V, y en la FEM de 400 a 250 kV. Algunos microscopios, particularmente los de alta aceleracin, emplean FEM de 2 MV. Los kV aplicados al filamento dan energa a los electrones para acelerar y ser liberados desde el filamento al vaco. En la fuente del filamento, la intensidad o corriente final define la cantidad de electrones que fluyen en el haz. Al aumentar la cantidad de energa, se incrementa el kV, y al elevarse la cantidad de electrones, tambin la Vf. Un concepto importante es la corriente de saturacin, que corresponde al mximo contraste o brillo a obtener. Para que todos los electrones tengan la misma energa el voltaje debe ser estable. En caso de haber fluctuaciones en el voltaje, las diferencias de energa de los electrones se traducir en la alteracin de las imgenes obtenidas. Lo mismo ocurre con el flujo o corriente de electrones. La medicin de la estabilidad del sistema se hace en ppm.
b. Lentes: El haz de electrones tiene un comportamiento similar a la luz con los lentes pticos, es decir, iluminan el sector a observar. La iluminacin debe ser uniforme. c. Portamuestra: Permite mover la muestra en los planos X e Y, as como en direccin oblicua (ngulo Till). Cuando se estudia material cristalino, se produce una imagen de difraccin de electrones al mover el portamuestra. Las imgenes obtenidas pueden ser transparentes (por transparencia del objeto), u opacas (obtenidas por reflexin de la imagen del objeto). En el MET las imgenes se obtienen por transmisin. Cuando se estudia material cristalino, por difraccin de electrones se configuran puntos que permiten al especialista en cristales analizar las estructuras. Retomando el anlisis del sistema de lentes, mencionaremos las componentes y posteriormente cmo se forman las imgenes. (i). Lente Objetivo: Es el que realiza el aumento, focalizando la imagen en la pantalla. Aumenta en aproximadamente 20 veces (20x) el objeto. (ii). Lentes Intermedia y Proyectiva: Aportan la potencia ptica al microscopio, contribuyendo a un aumento ms alto. La lente proyectiva, que da una alta magnificacin, es una pieza polar intercambiable (anloga a los objetivos de los microscopios), dando un aumento de unas 5000 veces (5000x). por su parte, la lente intermedia da un aumento de 100x. (iii). Pantalla: Compuesta por una lmina metlica cubierta por un polvo de Fsforo, Carbono o Cadmio, convierte la energa elctrica en luz. Los elementos antes mencionados emiten fotones siguen una onda dentro del espectro visible, al ser bombardeados por electrones. Se emplea tambin cristales que convierten electrones en fotones.
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En la pantalla, las imgenes se forman con tonos de grises, presentando una gran resolucin de elementos pequeos. Habitualmente, se asocia a la pantalla un sistema de grabacin o almacenamiento de imgenes, como cmaras fotogrficas convencionales o digitales, fotomultiplicadores, sensores, u otros que puedan conectarse a computadores, que capturan las imgenes a una resolucin que es deseable para su interpretacin. Forma y funcin de los lentes: En un conductor, la velocidad de los electrones que fluyen por l depende de la cantidad de electrones excitados. El valor de la velocidad puede alcanzar la velocidad de la luz. La formacin de las imgenes se relaciona con el tiempo de demora de la ampolleta en encenderse. La velocidad de los electrones, comparada con la de la luz, es lenta. Considerando que cada lente tiene una distancia focal fija (distancia entre el lente y la muestra), uno tiende a pensar que slo cambiando la forma de ste puede obtenerse una distancia focal (Df) diferente. Al pasar los electrones por los condensadores y los lentes (que en el esquema de la figura 2 son representados con forma de cajn), son focalizados en un punto. La distancia focal es ajustable. En el caso de la luz, sta puede ser focalizada y reflejada, pero no reflectada con campos visuales. En el caso del LASER este se basa en un sistema de reflexin resistente a espejos. Los electrones, por su parte, pueden ser generados (por el can de electrones), focalizados, colimados (condensados y enfocados, en ambos casos por las lentes electromagnticas y el sistema de apertura) y deflectados (por campos elctricos E, y electromagnticos B). En el universo, la luz es reflectada por efecto de la masa, tal como ocurre con la luz de los astros al pasar cerca de algn planeta.
El flujo de electrones sucede a travs de material magntico, formando un campo en el aire. Cuando el electrn se mueve en el sentido del campo magntico no existe fuerza sobre l. F=B x vsen En la frmula, el valor de la fuerza ejercida sobre el electrn aparece cuando el ngulo formado entre su direccin y el campo magntico es mayor que 0.
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Las lneas de fuerza, como vemos en la figura, forman un ngulo igual a 0. El electrn, al moverse en forma espiralada, genera una vuelta. Todos los electrones pasan por un punto. El electrn puede salir en cierto ngulo con un giro. Ahora bien, el punto de focalizacin depender de la geometra y de la corriente que pasa por el lente. La capacidad de focalizacin desde el infinito por el punto focal mximo, cuando con 0 se produce en infinito. La variacin del poder cambiando. La calidad del MET est en ntima relacin con la perfeccin de la pieza polar, aumentando el umbral de calidad al microscopio. La mecnica debe ser muy precisa. Todos estos factores cambian las funciones de cada lente. Algunas lentes proyectivas tienen piezas intercambiables, por lo que la pieza polar de la lente le otorga la capacidad de cambio. Como puede deducirse de lo antes dicho, el volumen y la forma de la lente cambian entre las diferentes lentes, pero la constante transferi no. J= Ri2 La frmula anterior es la sntesis de la ley de Joule. La generacin de calor ocurre por un cambio en la geometra de los cuerpos. Las lentes, dentro de la columna del microscopio electrnico se calientan siguiendo esta ley; debido a ello, es necesario un sistema de enfriamiento formado por una camisa fra por la que circule agua u otro lquido fro, que ayude a mantener la temperatura de la columna interior estable, y que adems evite un sobrecalentamiento.
Sistema de formacin de imgenes: La columna del microscopio requiere vaco en su interior para la obtencin de imgenes debido a ciertos inconvenientes intrnsecos: los electrones, por la longitud de onda que tienen, presentan un bajo poder de penetracin, siendo necesario vaco para que transiten libremente; cuando existe aire, puede formarse un arco voltaico entre el nodo y el ctodo (en este caso el filamento), que pudiera causar perjuicio al microscopio al producirse la oxidacin del filamento que se quemara, y adems en el aire que pudiera haber, se encuentra agua, que puede tambin deteriorar el funcionamiento del microscopio. Siempre debe considerarse la presin atmosfrica del lugar geogrfico donde se encuentre el microscopio electrnico de transmisin. Por convencin, se considera que la presin
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atmosfrica normal es de 760 mm de Hg a 25 C a 0 metros sobre el nivel del mar (msnm). La presin interna en el ME va desde un mnimo de 10-4 mm de Hg hasta el nivel ptimo de 10-6 mm de Hg. El vaco se hace de forma anloga al secado de un balde lleno de agua: 1. 2. Se saca la mayor parte del aire con una bomba Se extrae el aire residual con bombas de alta presin de vaco, para extraer al mximo.
Habitualmente, queda una presin de aire inferior a 1 mm de Hg, en forma de humedad. Con una bomba mecnica o rotatoria se logra un vaco de 10-1 a 10-2 mm de Hg, en tanto que con una bomba de alto vaco se extraen diferenciad de presin de 10-2 a 10-4 mm de Hg. Con la bomba gruesa, se saca la fraccin mayor de aire (10-1 a10-2 mm de Hg), mientras la diferencia menor es succionada con una bomba de alto vaco, como se muestra en el esquema.
La bomba de alto vaco puede ser de tipo difusora de aceite, una de las ms econmicas y de fcil mantencin; puede tambin ser turbo molecular, o bien inica. En el caso de la bomba rotatoria, la pared se sella con aceite.
2002. Alumnos de la Mencin Morfofisiopatologa y Citodiagnstico. Escuela de Tecnologa Mdica. Facultad de Medicina. Universidad de Chile. Prohibida su reproduccin total o parcial, y su publicacin con fines acadmicos sin mencin a los autores. Su utilizacin debe ser solicitada expresamente a los autores
El aceite de la bomba de vaco pasa del estado slido a gaseoso saturando el medio; para que exista un flujo debe existir una diferencia de presin (P) que en este caso es de 10-3 a 10-4 mm de Hg. Como condicin de preoperacin, debe existir un prevaco producido por saturacin de gas, optimizando la bomba con faldas. En la prctica, se intercalan vlvulas para ayudar a vaciar gradualmente la columna. La bomba difusora requiere de un precalentamiento de aproximadamente hora. Cuando se abren por ejemplo V1 y V3, se saca aire con la bomba rotatoria, se hace andar el sistema de calefaccin de la bomba difusora, y luego se cierran estas vlvulas. Entonces se hace el prevaco abriendo V2, que luego se cierra para abrir V1 y V3. Para inyectar aire, se cierran V1 y V2, abrindose V4 (que no aparece en la figura). Las llaves del sistema se abren. Algunos cambios en la configuracin bsica se relacionan especialmente con la medicin de vaco. Por ejemplo, se emplean sistemas de prdida de calor o de ionizacin de gas. Si se entrega calor a un cuerpo, ste eleva su temperatura hasta que se estabiliza, dependiendo de la cantidad de electrones y de aire en contacto. En el vaco puede aumentar la temperatura de un cuerpo. Este aumento de temperatura puede medirse con una termocupla, que consiste de un filamento de cobre y fierro conectado a un circuito alimentado por una fuente electromagntica; este sistema est conectado a un medidor de voltaje que muestra una variacin de voltaje, manifestacin de un cambio de tensin en funcin de la temperatura. Habitualmente la termocupla est conectada a un sistema de prevaco por prdida de calor.
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A travs de la termocupla circula corriente, que calienta un cuerpo, generando mV. En el caso de un sistema de vaco cambia la temperatura al vaco. La termocupla, como cualquier otro instrumento, puede ser calibrado para obtener mejores mediciones.
Otro sistema empleado para generar vaco es el de autovaco, que consiste en un sistema de ionizacin en que un fusible o botella con 2 electrodos conectados a un sistema de alto vaco y a un microampermetro alimentados por una FEM. En condiciones normales de presin atmosfrica el gas no se ioniza (es decir, no es conductor) y la temperatura es igual a 0. al extraer el aire, la presin disminuye ionizndose el gas (circula corriente). No existen elementos de ionizacin en forma normal, pero al hacer vaco se ionizan. Los componentes fundamentales a considerar para la ionizacin o paso de corriente son la existencia de iones, electrones y bloques de masa.
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Deben considerarse condiciones de doble ionizacin, electrones. Al sacar aire hasta lmites cercanos a 0, se produce un vaco mximo, dando una parbola que muestra una condicin similar a la de un sistema lleno de aire.
Dado el calentamiento del microscopio electrnico de transmisin, debe contar con un sistema de enfriamiento, idealmente cerrado. Uno de estos es el de pared fra, que capta el calor del microscopio, enfra el aire y elimina el calor por un radiador. Este tipo de refrigerador emplea un circuito de caera cerrada en que circula agua por un serpentn que mejora el enfriamiento. Este enfriador debe ser tratado para extraer las sales calcreas que se acumulan en las caeras. A su vez, debe controlarse la temperatura, y usarse controles de calidad de oxidacin y de pH adecuado (que no sea destructivo). El sistema de enfriamiento debe mantener baja la temperatura de las lentes. Estas lentes se caracterizan por tener bobinas de bronce y piezas magnticas. Existen cmaras que sirven para enfriamiento. El aumento de temperatura por volumen se mide en caloras. 1 caloras equivale a la elevacin de 1 cc de agua en 1 C de temperatura. Para el caso del aceite, la elevacin de la temperatura en 1 C requiere de 4 caloras. Como ancdota, debemos tener en cuenta que 1 gota de aceite caliente causa menos dao que una de agua. Sin embargo, dado que el agua tiene una capacidad de transporte de calor equivalente a 1.6 veces la del aceite, la posibilidad de enfriar el sistema por parte del agua (la reduccin de la temperatura interna), es mejor respecto del aceite.
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Los sistemas de refrigeracin emplean compresin y enfriamiento. habitual de uso es 15 C. Debido a esto, es necesario un enfriamiento forzado.
La temperatura
Para redondear lo antes expresado, veremos a continuacin los criterios de eleccin de un microscopio electrnico. Primero, debemos considerar el propsito de utilizacin; debe reunirse al personal que lo emplear; cotizar con antecedentes y utilidades proporcionadas por los diferentes fabricantes. La disponibilidad del servicio tcnico. Analizar el costo, el buen funcionamiento del campo, la informacin tcnica de repuestos e insumos, el compromiso de aporte del representante, la informacin disponible, la capacitacin del personal a cargo. Establecer un protocolo de entrega: montaje del microscopio, supervisin de cada etapa y de la forma de montaje, verificar las condiciones. Revisar las especificaciones, las condiciones de iluminacin, verificar si cuenta con proteccin contra ruido y antissmica. Para evitar vibraciones, debe ser puesto en un lugar que tenga suelo firme y adems lejos de reas de vibracin (en un zcalo o patio, alejado de la calle). Crear fundaciones slidas assmicas de concreto armado, aislado de la tierra. Las vibraciones de menos de 1 ciclo son perjudiciales para el microscopio; lo mismo ocurre con los movimientos ssmicos, que son vibraciones de ms de un ciclo. Las vibraciones entre 0.1 y 1 ciclo, son de baja audibilidad. El equipo de microscopa electrnica debe traer aislamiento de tierra y vibraciones. Deben evitarse tambin los cambios electromagnticos de baja frecuencia que son nocivos. Debe prevenirse la presencia de ductos y lneas de potencia, que han de aislarse. Ha de protegerse adems el espacio fsico. En Chile, la frecuencia de la corriente es de 50 Hz. Para proteger al microscopio de las diferencias de frecuencias se emplea una celda Fahrenheit para radiofrecuencias. Debe comprobarse adems la calidad de la lnea elegida (en relacin con la calidad de la imagen).
2002. Alumnos de la Mencin Morfofisiopatologa y Citodiagnstico. Escuela de Tecnologa Mdica. Facultad de Medicina. Universidad de Chile. Prohibida su reproduccin total o parcial, y su publicacin con fines acadmicos sin mencin a los autores. Su utilizacin debe ser solicitada expresamente a los autores
Hay que revisar la alta tensin diferente de la lnea, que debe regularse sin conexin a motores (debe ser estable, no conectarla a generadores o grupos electrgenos). No deben haber alfombras (generan esttica y pelusas que contaminan el microscopio), el piso debe ser antiesttico, de ser posible el cuarto de microscopa debe tener diferencia de presin y doble puerta, el piso debe ser totalmente pulido, sin rayaduras posibles.
ADOLFO ROS-ALCORTA
2002. Alumnos de la Mencin Morfofisiopatologa y Citodiagnstico. Escuela de Tecnologa Mdica. Facultad de Medicina. Universidad de Chile. Prohibida su reproduccin total o parcial, y su publicacin con fines acadmicos sin mencin a los autores. Su utilizacin debe ser solicitada expresamente a los autores
ampollas de 1 ml, que una vez abiertas pueden ser reselladas en ampollas con atmsfera de N; se usa en poca cantidad o bien se resella con parafilm a -20 C. Al pasar el tiempo el contenido de las ampollas se modifica. A pH 4.5 el glutaraldehdo es ms estable por existir ms cantidad de H+. El carbanin se estabiliza saliendo H+ al medio para compensar la formacin de carbonio. La forma lineal del glutaraldehdo es la requerida para la fijacin. Las propiedades de uso del glutaraldehdo se basan en el entrecruzamiento. Es as que 2 grupos vecinos dentro de una misma protena o entre 2 protenas, o bien lejos entre protenas o en una misma protena, pueden formar puentes metilnicos con el glutaraldehdo. La forma de interaccin vara la estabilidad molecular, y modifica la conformacin proteica. Estas interacciones permiten conservar grupos reactivos para ser identificados con diferentes metodologas.
Por ejemplo, para inmunocitoqumica, el glutaraldehdo se usa muy diluido en conjunto con otros aldehdos como el paraformaldehdo. La fijacin se hace por un tiempo mnimo con el fin de mantener reactivos la mayora de los grupos. Como mecanismos propuestos, se sugiere la adicin nucleoflica, en que grupos con afinidad por cargas positivas interactan. Un ejemplo de ello son los grupos amino, que tienen 2 electrones libre, sin compartir, que pueden ser cedidos a grupos deficientes en electrones o electrfilos. En las protenas existen grupos sulfhidrilo (cistena), amino, hidroxilo (tirosina). Los grupos ms importanten son los amino, que abundan ms que los otros y tienen mejor capacidad nucleoflica. Los grupos amino forman enlaces metilnicos con el glutaraldehdo. Los aldehdos modifican la estructura terciaria, en tanto las estructuras primaria y secundaria son poco modificadas, lo que explicara que algunas enzimas conserven su actividad; adems permiten medir las caractersticas osmticas pues la mantienen en las clulas (por ejemplo el transporte de membrana). Conserva adems los dominios intramembrana por mantener la -hlice.
2. Tetrxido de Osmio (OsO4): Este fijador estabiliza los lpidos. El osmio tiene nmeros de oxidacin 2, 4, 6 y 8. fue introducido como fijador aproximadamente en 1936 por Criege. El tetrxido de osmio es un fijador de tipo oxidante, de larga data (antigedad) de uso, lo mismo que el permanganato de potasio (oxidante ms enrgico).
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Un ejemplo de utilizacin de tetrxido de osmio es el de fijacin de bacterias, que presentan entre sus estructuras un mesosoma, que corresponde a una invaginacin de la membrana plasmtica con presuntas funciones REDOX. Este organelo se ha observado adems en hongos como Neurospora crassa. Cuando las bacterias son fijadas con permanganato de potasio, esta estructura se observa estirada, en tanto que con tetrxido de osmio se ven espiralazas, enrolladas. A partir de esto sera interesante determinar mediante criofractura cul es la real forma del mesosoma in vivo, pues no se usa fijacin qumica.
Los lpidos, compuestos de glicerol, cidos grasos y aminoalcoholes, pueden formar interacciones con estos fijadores oxidantes, y particularmente con tetrxido de osmio, el que acta a nivel de los dobles enlaces de las molculas de lpidos. Los oxgenos con carga negativa de la molcula de tetrxido de osmio van a reaccionar deslocalizando electrones en el doble enlace, esto lleva a la formacin de un intermediario 1,2-glicol (grupos OH vecinos) o 1,2-diol. Esto hace que OsO4 se reduzca a OsO2, que se observa como un precipitado negro y en caso de continuar la oxidacin forma nuevos grupos 1,2-glicol. Los monosteres de osmio, al reaccionar con 1,2-glicol forman alcoholes. Esta reaccin se traduce en entrecruzamientos entre 2 fosfolpidos, que corresponde a un punto de transicin. Por esta razn no es conveniente utilizarlo en ICQ. Los cidos grasos puros extraen todos los tipos de disteres de osmio formados. La forma de presentacin del osmio es lquida, transparente, ligeramente amarillento cuando est concentrado (+8) y negro profundo cuando su estado de oxidacin es (+2). Este fijador se prepara en solucin acuosa; el osmio es voltil, tiene una presin de vapor muy alta, por lo que produce una rpida fijacin. Los trozos a fijar, sin embargo, deben ser muy pequeos por su baja velocidad de penetracin, pues de ser grande la muestra slo fija las caras de contacto y el centro de la muestra quedara crudo, sin fijar. La velocidad de difusin del osmio depende de la densidad de trama del tejido, la periferia se fija antes que el interior y esto da una mayor rigidez. El tetrxido de osmio es empleado por 1 hora a temperatura ambiente para fijar, tiene una penetracin homognea. Slo se fija con la cantidad necesaria, pues el tejido podra fragilizarse y quebrarse.
Adolfo Ros-Alcorta
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Medios de Inclusin
Prof. Cecilia Leyton Mircoles 8 de Octubre de 2003
La mayora de los preparados que se ven en ME son artefactos. Cada preparado pasa por un proceso
que se inicia con la fijacin, para M.E. se fija con dos fijadores, primero con glutaraldehdo y luego una postfijacin con tetrxido de osmio. Cada fijador tiene un efecto sobre las estructuras celulares, por tanto no se ven las clulas tal cul son, sino que se ve un artefacto de tcnica repetitivo consecuencia del uso de esos fijadores o consecuencia del uso de los deshidratantes si es que se utiliza un medio hidrfobo. Posteriormente, a las protenas, que estn constituyendo las estructuras celulares, se les da un contraste con colorantes electrnicos que son metales pesados que se van a adherir a las protenas de una manera ms o menos selectiva. Entonces, cuando se obtienen preparados, las estructuras celulares que se ven representan artefactos de tcnica, pero cuando los artefactos de tcnica son repetitivos, en cuanto a las condiciones en que se trata un determinado tipo celular, pasa a constituir la normalidad para ese determinado tejido. El procesamiento de los tejidos para ME es similar al que se realiza para M ptica con la diferencia del uso de algunos reactivos y que se va a tratar el tejido de una manera distinta especialmente porque el tamao de las muestras es muy pequeo (2 mm), importando sobre todo el grosor de las muestras. Entonces, en el procesamiento de las muestras hay que tratar de minimizar al mximo los artefactos de tcnica. Cuando se comienza a tratar un tejido nuevo se debe estandarizar la tcnica para ese tejido hasta conseguir lo que se pretende en las mejores condiciones de morfologa que se requiere. Los tipos de medios de inclusin son: - resinas acrlicas: hidrfobas: metacrilatos hidroflicas. - resinas epoxy: hidrfobas: epn 812, araldita, spurr (baja viscosidad) hidroflicas: LR white, LR gold, lowicryl. - resinas polister. Dependiendo del objetivo del estudio, las resinas incluso se pueden mezclar. Supongamos que interesa preservar estructuras celulares que son solubles en el deshidratante y por las cualidades de corte, se desea incluir en una buena resina epoxy hidrfoba (epn 812),resistente al haz de electrones y permeable a los colorantes electrnicos. En este caso, lo que se puede hacer es despus de pasar por los lavados del fijador, pasar por una resina hidroflica en concentraciones crecientes, como el durcupan, que adems es miscible con epn, lo que permite realizar despus una impregnacin con epn en concentraciones crecientes para finalmente incluir la muestra manteniendo la estructura soluble porque se elimina la deshidratacin. La mayora de las resinas epoxy son mezclas de resina, acelerados, plastificante y endurecedor. Las resinas de ltima generacin tienen la ventaja que se usan tal como vienen, no es necesario prepararlas. Pero, cuando se prepara la resina de impregnacin se enriquece el preparado porque cada uno maneja cuan dura es la mezcla final, cuan blanda, cuan plastificada porque se pueden variar los componentes de acuerdo a los objetivos del estudio. Si consideramos una resina hidrfoba como el epn, los pasos que se deben seguir son: - fijacin: glutaraldehdo. - lavado: en el mismo buffer en que se prepar el fijador. - postfijacin: tetrxido de osmio. - lavado: en el mismo buffer en que se prepar el fijador o en agua.
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- deshidratacin: etanol, acetona, alcohol isoproplico, cloroformo. El ms usado es el etanol en escala ascendente para extraer el agua del tejido. - lquido intermediario: Como el etanol no es miscible con las resinas (epn, araldita, spurr), luego de la deshidratacin hay que pasar por un lquido orgnico que se llama aclarante, que tiene la ventaja de ser miscible con el etanol y con el medio de impregnacin. - impregnacin: con el mismo medio en que se va a realizar la inclusin, se hacen baos en concentracin creciente para reemplazar el aclarante por la resina hasta llegar a resina pura en la que se incluye el tejido. lquido aclarante 3 1 1 0 resina 1 1 3 resina pura
La proporcin y tiempo de la impregnacin depende del protocolo establecido, pero siempre el ltimo bao es de resina sola. La resina de inclusin debe ser recin preparada y sin agitacin para evitar la formacin de burbujas. Esto es en trminos generales, lo que se hace siempre que se utiliza un medio de inclusin hidrfobo. Todo este proceso puede ser a temperatura ambiente o a 4C, dependiendo del trabajo que se realice. Una vez realizada la inclusin con su nmero de identificacin correspondiente, se lleva el molde a una estufa con una temperatura entre 70-80C para que polimerice. Esta estufa debe estar destinada exclusivamente para este fin, no puede ser en la que se seca el material de vidrio porque no pueden haber vapores de agua. Otras resinas para que polimericen hay que exponerlas a luz UV o a luz de cuarzo. Se dejan polimerizando entre 2-5 das. El procesamiento de una muestra para ME es largo, razn por la cual es necesario cuidar los detalles para obtener un buen preparado, porque slo se va a evidenciar un mal procesamiento al momento de realizar el corte. Si el bloque est blando quiere decir que no polimeriz bien porque le qued lquido aclarante, entonces se va a romper. Si el bloque est muy duro va a ser difcil cortarlo. Otras veces no va a costar cortar el bloque y se va a poder teir los cortes, pero una vez en el microscopio, si se prepar mal la mezcla de epn las cualidades de resistencia del plstico, que va a ser expuesto al bombardeo del haz de electrones, no se va a mantener y se va a disgregar junto con el tejido. Entonces es necesario tener una buena mezcla de inclusin y una buena impregnacin de la resina en el tejido. Deshidratantes Como deshidratantes se utilizan lquidos anhdros como alcohol etlico, metlico, butlico, isoproplico, cloroformo y acetona. Cuando se usa acetona se puede eliminar el paso por el lquido intermediario porque es miscible con algunas resinas, por ejemplo con el vestopal. Pero, al comparar la acetona con el alcohol etlico, la acetona es un deshidratante mucho ms fuerte, provocando mayor retraccin al tejido. Entonces hay que equilibrar el costo-beneficio. Puede ser muy bueno eliminar el paso por el aclarante, que es el xido de propileno, pero por evitarlo se produce una gran alteracin al tejido. Igual que para la MO, la deshidratacin se hace en una escala ascendente de alcoholes, pero para la ME es conveniente, por lo delicado del trabajo y porque cualquier salida brusca de agua va a provocar distorsin de las membranas, va a arrastrar componentes celulares, etc, comenzar con una graduacin de alcoholes mucho ms baja que para la MO. El tiempo de deshidratacin va a depender del tipo de tejido, del grosor de la muestra y del medio deshidratante a emplear, si se usa acetona los tiempos son ms cortos que con etanol, en general no son
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tiempos largos, pero en el caso de tejidos ms densos aumentan al igual que en el caso de tejidos que cuesta sacarles el agua como los tejidos vegetales. La mayora de los deshidratantes son solventes orgnicos enrgicos, que provocan retraccin de los tejidos y extraccin de constituyentes celulares. Hay que tener cuidado con el tiempo de deshidratacin porque si se deja mucho tiempo se puede extraer los lpidos, especialmente los de membrana aun cuando se haya realizado una postfijacin en tetrxido de osmio. Algunos investigadores como Milloning (1996), aconsejan para evitar los artefactos de retraccin en la salida brusca de agua, agregar a los baos de deshidratacin cuando se usa etanol, NaCl 0.5%. Otro autor afirma que se obtienen mejores resultados al usar metanol en comparacin al uso de etanol. En el caso de la acetona, aconsejan usarla a 4C; otros dicen que provoca menos retraccin que el etanol cuando se usa por poco tiempo; no reacciona con el tetrxido de osmio, mientras que el etanol s lo hace, precipita, si no se lava bien el tejido luego de la postfijacin y se ve al microscopio como un fino precipitado negro; no reacciona qumicamente con algunos monmeros epoxy, lo que permite evitar el paso por el aclarante; extrae menos los fosfolpidos que el etanol; algunos autores prefieren comenzar la deshidratacin a temperatura ambiente y luego seguirla en fro, con lo cual se minimizara la extraccin de lpidos. En el caso que se tenga que dejar la muestra por fuerza en etanol, se recomienda dejar en etanol de 70 a 4C. Lquidos Intermediarios Los lquidos intermediarios o aclarantes ms usados son la acetona y el xido de propileno, que es un epoxipropano, introducido en MET por Left (1961). El xido de propileno se caracteriza por tener una viscosidad relativamente baja, infiltra rpidamente el tejido y reduce la viscosidad de las resinas, que mientras menos viscosas sean van a infiltrar ms rpidamente el tejido, entonces es una buena caracterstica el hecho que reduzca la viscosidad de las resinas, especialmente de algunas que son muy viscosas. Es un compuesto muy reactivo que puede combinarse con algunos grupos reactivos de las clulas y afectar algunas reaccin histoqumicas e inmunohistoqumicas. Cuando se va a hacer un estudio ICQ para MET hay que tener mucho cuidado con el uso del xido de propileno, probablemente se va a tener que evitar. Esto se puede evitar usando acetona o un medio de inclusin hidrfobo. El ltimo bao de impregnacin, que es el ms largo, dura 1 da para tratar de extraer del tejido todo el xido de propileno que pudiera quedar porque va a influir en la calidad del bloque de inclusin. Si quedan trazas de xido de propileno en los tejidos, este va a reaccionar con los grupos epoxy de algunas resinas inhibiendo o alterando la polimerizacin, lo que se va a reflejar en la dureza del bloque de inclusin, se va a obtener un bloque muy blando. Se recomienda usar en tiempos muy cortos, 5-10 min, como mximo.
RESINAS
Caractersticas generales de los medios de inclusin: - poca extraccin de los componentes celulares. - en su forma monomrica, que es la forma comercial, deben ser de fcil solubilidad en los solventes usados. - penetrar los tejidos en forma fcil y rpida. - termoestabilidad alta durante el bombardeo electrnico. - baja viscosidad, los que son muy viscosos demoran ms en infiltrar el tejido. - buenas cualidades de bloque de inclusin: que sea homogneo en cuanto a su dureza. - que tenga una dureza suficiente para hacer cortes ultrafinos (nm). - que tenga una plasticidad y una elasticidad suficientes, no se necesitan bloques duros y rgidos, tienen que tener cierta plasticidad y para eso se les agrega ciertos monmeros que dan esa caracterstica, los llamados plastificantes. - polimerizacin uniforme.
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- que preserve las estructuras, es decir, que no extraiga los constituyentes celulares. - que permitan la penetracin de los medios contrastantes que son metales pesados. - que sean miscibles con otros medios de inclusin, lo que permite hacer mezclas. Los mayores inconvenientes que se pueden presentar para lograr un buen bloque de inclusin para ME son: - no conseguir una buena infiltracin del medio de inclusin porque el tejido no qued bien deshidratado ni bien aclarado. - no conseguir un bloque de inclusin con la dureza apropiada para poder hacer cortes ultrafinos, debe ser ni muy duro ni muy blando. Generalidades de los medios de inclusin: - se venden como compuestos semifluidos, de una viscosidad diferencial entre unos y otros, y de composicin qumica monomrica. - tienen un tamao molecular, viscosidad y un ndice de polimerizacin variable para cada resina. - por accin de reactivos activadores, endurecedores, plastificantes, aceleradores, luz UV o del calor pasan de monmeros lquidos a polmeros slidos. - los polmeros se clasifican en polmeros inestables o reversibles o en polmeros irreversibles. Para MET interesa obtener los irreversibles, porque los reversibles bajo ciertas condiciones recuperan su estado lquido, lo que no servira porque entre los componentes de las mezclas se establecen enlaces dbiles, en cambio en los polmeros irreversibles, al asociarse los monmeros de las mezclas se forman nuevos grupos qumicos que forman uniones covalentes o electroestticas, lo que va a permitir mayor estabilidad de los componentes al momento de recibir el haz de electrones. - de acuerdo a la forma de asociacin de los monmeros en estos polmeros, se van a clasificar en polmeros de distinta estructura, por ejemplo los metacrilatos, que fueron las primeras resinas que se usaron en la MET se dejaron de usar porque formaban polmeros lineales. Los metacrilatos estn formados por N-metil metacrilato y N-butil metacrilato y a eso se le agrega un acelerador, cuando comienzan a polimerizar, las molculas se asocian en forma lineal, lo que no es estable por no ser termoestable. Entonces al colocar los cortes en metacrilatos con polimerizacin lineal, con el bombardeo del haz de electrones la resina se rompe y adems al romperse se subliman contaminando la columna del microscopio. Otro tipo de polmeros son los polmeros cclicos, formados por la adicin de monmeros que presentan anillos de cuatro o ms tomos de carbono, no son muy usados. Los mejores para MET son los polmeros cruzados, se forman polmeros lineales o cclicos que presentan grupos reactivos que interaccionan formando redes tridimensionales muy estables, los grupos reactivos presentes en los monmeros de las mezclas de resinas establecen puentes que pueden ser teres y eso le da estabilidad a la molcula, porque este tipo de puentes son resistentes al calor y a los solventes orgnicos. Los grupos epoxy, caractersticos de las resinas epoxy, pueden interaccionar con otros grupos epoxy presentes en otros monmeros de la mezcla o pueden interaccionar con grupos hidroxilos presentes tambin en la molcula de la resina epoxy, o bien pueden interaccionar con anhdridos cidos que estn presentes en los agentes endurecedores, que tambin estn como monmeros. Entonces, si hay interaccin entre dos o ms grupos epoxy, entre grupos epoxy-hidroxilo y entre grupos epoxy-anhdridos cidos, obviamente que la red de interacciones que se constituye en el polmero es mucho ms estable y da cualidades de inclusin mejores que otras resinas. Caractersticas generales de algunas resinas: resina vestopal araldita viscosidad densidad 900 2500 1170 1081
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1400 565
1158 1121
La viscosidad de las resinas tambin tiene que ver con el tamao de cada molcula, hay monmeros que son mucho ms grandes, la araldita, por ejemplo, al compararla con el epn es mucho ms grande, siendo las dos resinas epoxy y eso se refleja en su viscosidad. Si se trabaja con araldita se obtiene una solucin de impregnacin y de inclusin mucho ms densa y por lo tanto, los tiempos van a tener que ser mayores que los que en el caso del epn o cuando se trabaje con otra resina de menor viscosidad. Otra cualidad importante en trminos generales es la cantidad de retraccin que se obtengan con estas resinas. El spurr es un monoepxido y presenta la menor viscosidad entre las resinas epoxy y tiene adems muy buenas cualidades de inclusin. Resinas Epoxy Hidrfobas: Hidrfilas: epn, spurr, araldita, maraglas. durcupn, acun.
- Son resinas sintticas, caracterizadas por la presencia de uno o ms grupos epxidos terminales y grupos hidrxilos esparcidos a lo largo de la molcula. De color amarillo claro o miel, viscosos y termoestables. - Son los medios de inclusin ms utilizados en los laboratorios, aun cuando son ms difciles de cortar y menos elsticos que las resinas acrlicas. - Polimerizan uniformemente. - Los cortes que se obtienen de los bloques de inclusin son estables al haz de electrones y pueden ser montados sobre grillas descubiertas o desnudas. En algunos casos se opta por poner una membrana sobre las grillas, que puede ser formvar, parlodin o colodin, para dar ms estabilidad a los cortes, a este tipo de grillas se les llama cubiertas. - El medio de inclusin es una mezcla cuidadosamente balanceada, constituida por: resina epoxy uno o dos tipos de endurecedor o curador acelerador o catalizador plastificante o modificador Los componentes de la mezcla se guardan separados para evitar que polimericen y a 4C porque al ser monmeros, a temperatura ambiente son inestables y menos fluidos. La mezcla se prepara en un mismo vaso plstico midiendo los componentes o en un vaso plstico pesando los componentes, para esto hay que calcular cuanto pesa cada cantidad de componente a una temperatura determinada. Lo ltimo que se hace es agregar el acelerador porque activa la polimerizacin. Los restos de resina que sobran se dejan polimerizar y una vez slidos se eliminan. - Cada uno de los componentes de la mezcla tiene diferentes viscosidades, por lo tanto penetran en el tejido a diferentes velocidades (si no se ha tenido l precaucin de realizar una mezcla homognea). - La velocidad a la que la mezcla de trabajo infiltra el tejido depende no slo de la densidad del tejido, tambin del tamao de la molcula infiltrante, la viscosidad de la mezcla, etc. Esta ltima se puede modificar variando las cantidades de los endurecedores. Ej. araldita, por el tamao de su molcula infiltra lentamente; el epn tiene una viscosidad menor e infiltra ms rpido y el spurr (ciclohexeno-dixido) presenta una muy baja viscosidad e infiltra muy rpido. - La mezcla de trabajo polimeriza formando enlaces cruzados muy estables, por efecto del calor y/o de la luz UV.
2002. Alumnos de la Mencin Morfofisiopatologa y Citodiagnstico. Escuela de Tecnologa Mdica. Facultad de Medicina. Universidad de Chile. Prohibida su reproduccin total o parcial, y su publicacin con fines acadmicos sin mencin a los autores. Su utilizacin debe ser solicitada expresamente a los autores
Desventajas del uso de resinas epoxy: - Los grupos epxido y anhdridos pueden reaccionar con las protenas. - Lo anterior puede reducir la antigenicidad y provocar sensibilizacin en los operadores que trabajan en los laboratorios, quienes absorben estos compuestos por la piel o los inhalan (se recomienda el uso de campanas y guantes). - Los componentes de las resinas epoxy son txicos y el VCD (vinilciclohexano) es un conocido carcingeno. Endurecedores o curadores Participan directamente en la reaccin de polimerizacin. La mayora son cidos dicarboxlicos o anhdridos cidos que reaccionan con los grupos hidroxilos y epoxy formando enlaces esteres. Ejemplos: DDSA: anhdrido dodecil succinico NSA: anhdrido monenil succinico NMA: anhdrido metil ndico Aceleradores o catalizadores Aumentan la reactividad del proceso de polimerizacin, promoviendo las reacciones entre los grupos epoxyepoxy y epoxy- hidroxilo. Ejemplos: BDMA: bencildimetil amino DMAB: dimetilaminoetanol DMP-30: amina terciaria: 2,4,6- tridimetil amino metilfenol La mayora de ellos son aminas .Es el componente que va en menor proporcin en la mezcla.
Plastificantes
Son opcionales, pero mejoran las cualidades de la mezcla porque aumentan la extensibilidad de los bloques de inclusin. Confieren suavidad y flexibilidad a la mezcla de resina epoxy-endurecedor ( que suelen ser extremadamente rgidas). Ejemplos: Dibutilftalato DER736: diglicil ter de propilen glicol ( recomendada spurr por su baja viscosidad ) Proceso de infiltracin o impregnacin en el medio de inclusin Previo a la infiltracin, el operador deber preocuparse de preparar adecuadamente la mezcla de resina con la que infiltrar los tejidos. - Componentes a temperatura ambiente ( si la infiltracin se realizara a esta temperatura ) - Obtener una mezcla con las proporciones exactas de componentes, mezclados en forma homognea y completa. - Recordar que los reactivos que componen la mezcla de impregnacin son molculas de distintos tamaos, con diferente viscosidad y diferentes ndices de polimerizacin. Ejemplo: DDSA (endurecedor) es ms rgido y menos viscoso que la araldita, de tal manera que si no se mezclan bien, el DDSA penetrara primero el tejido y desplazara a la araldita.
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- El proceso de infiltracin depende de la resina utilizada para incluir la muestra. - Si los tejidos no son adecuadamente infiltrados se obtendrn bloques de inclusin con una polimerizacin de muy baja calidad. - Los parmetros que hay que cuidar para tener una buena impregnacin son: Viscosidad: va a constituir un ndice de penetracin del medio de inclusin, varia inversamente con el tamao de la molcula y con su viscosidad. Un aumento de la temperatura disminuye la viscosidad ( la mayora de las infiltraciones se realizan a temperatura ambiente) Vaco: se recomienda durante todo el tiempo de infiltracin del tejido en las resinas. La presin recomendada es de 0.5 atmsferas, presiones mas altas tienden a provocar desagregacin de las clulas. El vaco remueve y elimina las burbujas de aire que pudieran producirse durante la infiltracin. Se recomienda especialmente para la infiltracin de tejidos vegetales. Agitacin: se recomienda para hacer mas rpidas y homogneas las infiltraciones. Los movimientos deben ser suaves para no daar los tejidos (circulares-rotacionales son mas recomendados que los de sacudidas) Tiempo de infiltracin: el tiempo de infiltracin para cada tejido debe ser determinado por mtodo de ensayo y error. El tiempo a utilizar depende directamente del tipo de tejido, de la densidad del tejido, del tamao de la muestra (grosor) y del medio del inclusin que se utilice. No debe prolongarse innecesariamente la infiltracin para evitar la extraccin de los constituyentes celulares. Lo mismo que en la deshidratacin y en el paso por el lquido intermediario. Los polmeros cruzados se forman entre grupos presentes en la resina epoxy, hidroxilos de alcohol secundario ms el anhdrido presente en el endurecedor, formando puentes monosteres que pueden interaccionar con los grupos epoxy de las resinas formando puentes diesteres que son parte de los polmeros cruzados. Esa es parte de la reaccin. Tambin podran establecerse interacciones directamente entre los grupos hidrxilos presentes en la resina epoxy ms los grupos epoxy de la propia resina y generarse estos puentes esteres. Los dos tipos de reacciones pueden ocurrir. La inclusin final se hace en pequeos moldes que se llenan con resina sola y en los que se ponen la muestra y el nmero de identificacin. Una vez que est listo, se pueden hacer dos cosas: llevar el molde a una estufa a 45C por 2 horas o llevarlo directamente a una estufa a 70-80C para la polimerizacin. La ventaja de llevar los moldes primero a una estufa a 45C es que por la polimerizacin lenta se puede reorientar la muestra en caso de que se haya movido y eliminar burbujas que pueden haber quedado. Caractersticas fsicas de un buen bloque de inclusin: - suficiente dureza. - adecuada elasticidad. - adecuada plasticidad. - suficiente resistencia al bombardeo al haz de electrones. - homogeneidad. Para realizar los cortes se utilizan ultramicrtomos que son micrtomos similares a los rotatorios tipo Minot, los cuales tienen adicionados un par de lupas para observar los cortes, un carro portamuestras, una lmpara que ilumina los cortes y la navaja, que va en una carro porta navajas y una manivela. Estos micrtomos pueden ser de avance mecnico o de avance trmico (se han dejado de usar). Los primeros cortes que se hacen son cortes gruesos (para ME) de 1m, que se tien con azul de toluidina a pH alto, pero el problema es que las resinas son difcilmente penetradas por los colorantes comunes (hematoxilina, eosina, azul de toluidina, etc), pero esto se resuelve utilizando pH altos, a los que las resinas son penetradas rpidamente. Este corte grueso sirve para hacer un anlisis general del tejido y en que zonas estn las estructuras que interesan para sacar en los cortes ultrafinos y as saber que parte del bloque hay que retallar.
2002. Alumnos de la Mencin Morfofisiopatologa y Citodiagnstico. Escuela de Tecnologa Mdica. Facultad de Medicina. Universidad de Chile. Prohibida su reproduccin total o parcial, y su publicacin con fines acadmicos sin mencin a los autores. Su utilizacin debe ser solicitada expresamente a los autores
Cuchillos Los cuchillos que se utilizan en ME son de dos tipos: vidrio o diamante. En el caso de los cuchillos de vidrio, se deben confeccionar en el mismo laboratorio y para eso nosotros compramos el material a la LKB que es material de importacin. Se compran barras de vidrio de una cierta dimensin, es ms bien un cristal de muy buena calidad, y de esas barras que se lavan y secan muy bien para que no tengan pelusas se cortan cuadraditos que tienen una cierta dimensin. Una vez que tengo los cuadraditos con un diamante hago una lnea diagonal y posteriormente hago presin con unas tenazas en esa lnea y el cuadrado de vidrio se va a escindir en dos y de cada cuadrado voy a obtener dos cuchillos de vidrio. Esto se hace con una mquina que permite que la presin que se ejerce sea ms homognea de modo que el rendimiento en la obtencin de cuchillos sea mejor. Los cuchillos de vidrio fueron introducidos en el ao 1950 y los de diamante en el ao 1953. Tienen una gran ventaja los cuchillos de diamante que es su gran duracin, pero su gran desventaja es su alto costo, pero para la gente que trabaja en forma rutinaria en microscopa electrnica son necesarios y no hay laboratorio que no tenga uno o dos cuchillos de diamante. Los cuchillos de vidrio son fabricados por el operador, se utilizan barras de vidrio destensado? y se obtienen cuadrados de vidrios de 2 a 2,5 cm de lado. Estos cuadrados se pueden obtener por un sistema artesanal o con mquinas y de cada uno de los cuadrados se obtiene dos cuchillos. La arista de uno de los ngulos del cuadrado es la que se utiliza como borde cortante y la longitud del borde cortante va a depender del grosor del vidrio que utilicen para fabricar el cuchillo. Los sistemas de fabricacin son por fractura trmica o por fractura mecnica, esta ltima puede ser utilizando una mquina que se llama Messer Sunkay. Es importante evaluar el filo del cuchillo y adems hay que agregarles un bao a los cuchillos que es donde van a ir cayendo los cortes. Este bao se puede hacer de cinta adhesiva plstica, cinta adhesiva de aluminio o de cinta aisladora y deben ser sellados con barniz para uas, cera dental lquida o parafina. Una vez que los cuchillos han sido seleccionados deben ser guardados en una caja protegidas del polvo y la humedad, porque cualquier cosa que tenga el filo del cuchillo va a ir en desmedro de la calidad de su corte. La evaluacin de los cuchillos se hace bajo un microscopio de luz. El filo del cuchillo posee un ngulo muy agudo que se llama pico de destruccin? y bajo esa zona una serie de rayas, toda esta zona no es til para utilizarla como filo. Tambin podemos ver una arruga que se llama arruga de fractura. La zona ms til que puede usarse como filo es la que est un poco ms all de la arruga de fractura y antes del pico de deflexin. Una vez que tenemos hecho nuestro segundo tallado tenemos que cambiar el cuchillo. En el bao es posible poner un poco de acetona par que los cortes se estiren al caer. Si se utiliza slo agua yo puedo con un palito de naranjo al que el he puesto un algo don con cloroformo, acercarlo a los cortes sin tocarlos y de ese modo se estiran. Una vez que estn estirado tengo que evaluar si los cortes son del grosor que yo necesito a pesar de que yo he puesto un grosor en el micrtomo. Luego con una pinza que en su extremo tiene una grilla yo me acerco con la pinza a los cortes que estn estirados y son del tamao adecuado y puede pasar dos cosas, o que los cortes se adhieran a la grilla al ponerla encima, o bien podemos sumergir la pinza y que los cortes se atrapen por debajo. Pueden ser grillas desnudas o cubiertas dependiendo de lo que hayamos decidido. Cuando son cortes seriados no podemos perder ningn corte y en ese caso se utilizan grillas con un hoyo que pueden estar cubiertas o no. Para evaluar el grosor del corte utilizamos los colores de interferencia. Cuando los cortes estn flotando sobre la superficie del agua del bao los vamos a ver coloreados y los colores van entre gris claro que es lo mejor, a color violeta que para los efectos de nuestro trabajo es lo peor en cuanto al grosor porque son los ms gruesos. Los colores de interferencia reflejan el grosor del corte.
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Color
grosor ()
gris claro 150-200 Gris 200-250 plata mate 250-400 plata brillante 500-700 oro plido 700-900 oro mate 900-1100 Violeta 1100-1500 Lo ms comn es plata brillante. Mientras ms delgada sea la muestra ms dbil va a ser al bombardeo electrnico, y tambin hay que considerar que si usamos grillas cubiertas el corte no puede ser muy grueso porque la cobertura de la grilla va a influir. Todo esto hay que tenerlo en cuenta porque va a influir en la observacin que vamos a hacer. Las grillas son de varios modelos. Se llaman grillas o rejillas y son el medio soportante de los tejidos ultrafinos, o de las suspensiones que sern observadas al microscopio electrnico de transmisin, tienen la caracterstica de disipar el calor y las cargas elctricas producidas por el haz de electrones. En general, son discos de metal de 2,3 a 3,05nm de dimetro y 0,10 a 0,20mm de espesor, con un rea central que presenta perforaciones de distinta forma y dimetro y un borde que es perifrico, slido y liso. Estn hechas de cobre, nquel, oro, platino, oro-paladio, acero inoxidable, etc., y va a depender de la metodologa que vamos a aplicar que se elige el material de la grilla. Las ms comunes son las de cobre, pero a veces las de cobre no sirven; las de platino sirven cuando sobre los cortes se hacen tratamientos con cidos. Tambin pueden ocuparse grillas de nylon, tefln o slice cuando es necesario contar con un aislante electrnico. La trama se refiere al nmero de barras por pulgada, y a eso se le llama unidades MESH. A mayor nmero de barras, menor es el rea descubierta de la grilla. Hay grillas de 70 mesh, 100 mesh, 200 mesh, etc. hay grillas con agujeros de diferentes formas, con un agujero o con varios, descubiertas o cubiertas con un film o membrana soportante (que puede ser fabricada por el operador). Si necesitramos incluir una suspensin de clulas que necesitamos cortar lo podemos hacer utilizando un medio soportante como la agarosa 4% despus de haberlas fijado, y despus esto puede ser tratado como si fuera un tejido cualquiera. Las membranas soportantes son delgadas films, fabricados por el operador, que se colocan sobre las grillas con el fin de sostener los cortes ultrafinos o suspensiones que van a ser puestos en las grillas para ser observados al M.E., son fabricadas de diferentes materiales y la eleccin del material con que se fabrican va a depender del tipo de trabajo a realizar y el tipo de grilla a emplear. Las caractersticas que pretendemos de las membranas soportantes son: ser de lata resistencia mecnica; ser de baja absorcin electrnica especfica; y que no cambien de dimensin al ser bombardeadas por el haz electrnico. Comnmente se usa para fabricarlas soluciones diluidas de diferentes plsticos como fomvar (polivinilformol), colodin o parlodin (nitrocelulosa), etc. las concentraciones son de 0,5 a 1,0 %. Se puede utilizar materiales evaporados al vaco como carbn, berilio, monxido de silicn, berilio+aluminio, xido de aluminio. las ms utilizadas son las de carbn y de fomvar. Las de formvar y colodin son las ms utilizadas porque se obtienen grosores de 20 a 200nm. Las de colodin son menos resistente que las de formvar, pero son ms fciles de fabricar. Con las de carbn tambin se obtienen membranas de bajo grosor pero son utilizadas para trabajos muy especializados. Los plsticos y sus solventes son: Formvar dicloruro de etileno, cloroformo o dioxan
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Colodin acetona, acetato de etilo o acetato de amilo Perspex cloroformo. Poliestireno bencina Polivinilalcohol agua destilada Una forma de preparar las membranas es por evaporacin del solvente de una solucin diluida (ej, formvar 0,2 0,5 o 1,0%). Se hecha una gotita de la solucin en un recipiente con agua y se deja evaporar el solvente y debera quedar una pelcula. Otra forma es sumergir rpidamente un portaobjeto muy limpio en la solucin de plstico, rpidamente para que la membrana quede homognea, delgada y sin arrugas. Luego este portaobjeto se deja secar en una campana de modo que se evapore el solvente. Cuando est seco se corta con una navaja de afeitar y se sumerge en una fuente con agua y se va levantando la pelcula, hasta que toda queda flotando en el agua. Ahora sobre esta superficie voy colocando con una pinza las grillas sobre la lmina hasta que quede llena de grillas. Para recoger la pelcula ocupo papel filtro o parafilm y se deja en una placa petri para posteriormente utilizarlo. Esto hay que hacerlo antes de ponerse a cortar.
Un tejido que fue incluido en parafina se puede reincluir para obtener una muestra para ME, y una muestra que ha quedado mal incluida tambin se puede reincluir.
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Medios de Inclusin
Prof. Cecilia Leyton Mircoles, 8 de Octubre de 2003
La mayora de los preparados que se ven en ME son artefactos. Cada preparado pasa por un proceso
que se inicia con la fijacin, para M.E. se fija con dos fijadores, primero con glutaraldehdo y luego una postfijacin con tetrxido de osmio. Cada fijador tiene un efecto sobre las estructuras celulares, por tanto no se ven las clulas tal cul son, sino que se ve un artefacto de tcnica repetitivo consecuencia del uso de esos fijadores o consecuencia del uso de los deshidratantes si es que se utiliza un medio hidrfobo. Posteriormente, a las protenas, que estn constituyendo las estructuras celulares, se les da un contraste con colorantes electrnicos que son metales pesados que se van a adherir a las protenas de una manera ms o menos selectiva. Entonces, cuando se obtienen preparados, las estructuras celulares que se ven representan artefactos de tcnica, pero cuando los artefacto de tcnica son repetitivos, en cuanto a las condiciones en que se trata un determinado tipo celular, pasa a constituir la normalidad para ese determinado tejido. El procesamiento de los tejidos para ME es similar al que se realiza para M ptica con la diferencia del uso de algunos reactivos y que se va a tratar el tejido de una manera distinta especialmente porque el tamao de las muestras es muy pequeo (2 mm), importando sobre todo el grosor de las muestras. Entonces, en el procesamiento de las muestras hay que tratar de minimizar al mximo los artefactos de tcnica. Cuando se comienza a tratar un tejido nuevo se debe estandarizar la tcnica para ese tejido hasta conseguir lo que se pretende en las mejores condiciones de morfologa que se requiere. Los tipos de medios de inclusin son: - resinas acrlicas: hidrfobas: metacrilatos hidroflicas. - resinas epoxy: hidrfobas: epn 812, araldita, spurr (baja viscosidad) hidroflicas: LR white, LR gold, lowicryl. - resinas polister. Dependiendo del objetivo del estudio, las resinas incluso se pueden mezclar. Supongamos que interesa preservar estructuras celulares que son solubles en el deshidratante y por las cualidades de corte, se desea incluir en una buena resina epoxy hidrfoba (epn 812),resistente al haz de electrones y permeable a los colorantes electrnicos. En este caso, lo que se puede hacer es despus de pasar por los lavados del fijador, pasar por una resina hidroflica en concentraciones crecientes, como el durcupan, que adems es miscible con epn, lo que permite realizar despus una impregnacin con epn en concentraciones crecientes para finalmente incluir la muestra manteniendo la estructura soluble porque se elimina la deshidratacin. La mayora de las resinas epoxy son mezclas de resina, acelerados, plastificante y endurecedor. Las resinas de ltima generacin tienen la ventaja que se usan tal como vienen, no es necesario prepararlas. Pero, cuando se prepara la resina de impregnacin se enriquece el preparado porque cada uno maneja cuan dura es la mezcla final, cuan blanda, cuan plastificada porque se pueden variar los componentes de acuerdo a los objetivos del estudio. Si consideramos una resina hidrfoba como el epn, los pasos que se deben seguir son: - fijacin: glutaraldehdo. - lavado: en el mismo buffer en que se prepar el fijador. - postfijacin: tetrxido de osmio. - lavado: en el mismo buffer en que se prepar el fijador o en agua.
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- deshidratacin: etanol, acetona, alcohol isoproplico, cloroformo. El ms usado es el etanol en escala ascendente para extraer el agua del tejido. - lquido intermediario: Como el etanol no es miscible con las resinas (epn, araldita, spurr), luego de la deshidratacin hay que pasar por un lquido orgnico que se llama aclarante, que tiene la ventaja de ser miscible con el etanol y con el medio de impregnacin. - impregnacin: con el mismo medio en que se va a realizar la inclusin, se hacen baos en concentracin creciente para reemplazar el aclarante por la resina hasta llegar a resina pura en la que se incluye el tejido. lquido aclarante 3 1 1 0 resina 1 1 3 resina pura
La proporcin y tiempo de la impregnacin depende del protocolo establecido, pero siempre el ltimo bao es de resina sola. La resina de inclusin debe ser recin preparada y sin agitacin para evitar la formacin de burbujas. Esto es en trminos generales, lo que se hace siempre que se utiliza un medio de inclusin hidrfobo. Todo este proceso puede ser a temperatura ambiente o a 4C, dependiendo del trabajo que se realice. Una vez realizada la inclusin con su nmero de identificacin correspondiente, se lleva el molde a una estufa con una temperatura entre 70-80C para que polimerice. Esta estufa debe estar destinada exclusivamente para este fin, no puede ser en la que se seca el material de vidrio porque no pueden haber vapores de agua. Otras resinas para que polimericen hay que exponerlas a luz UV o a luz de cuarzo. Se dejan polimerizando entre 2-5 das. El procesamiento de una muestra para ME es largo, razn por la cual es necesario cuidar los detalles para obtener un buen preparado, porque slo se va a evidenciar un mal procesamiento al momento de realizar el corte. Si el bloque est blando quiere decir que no polimeriz bien porque le qued lquido aclarante, entonces se va a romper. Si el bloque est muy duro va a ser difcil cortarlo. Otras veces no va a costar cortar el bloque y se va a poder teir los cortes, pero una vez en el microscopio, si se prepar mal la mezcla de epn las cualidades de resistencia del plstico, que va a ser expuesto al bombardeo del haz de electrones, no se va a mantener y se va a disgregar junto con el tejido. Entonces es necesario tener una buena mezcla de inclusin y una buena impregnacin de la resina en el tejido. Deshidratantes Como deshidratantes se utilizan lquidos anhdros como alcohol etlico, metlico, butlico, isoproplico, cloroformo y acetona. Cuando se usa acetona se puede eliminar el paso por el lquido intermediario porque es miscible con algunas resinas, por ejemplo con el vestopal. Pero, al comparar la acetona con el alcohol etlico, la acetona es un deshidratante mucho ms fuerte, provocando mayor retraccin al tejido. Entonces hay que equilibrar el costo-beneficio. Puede ser muy bueno eliminar el paso por el aclarante, que es el xido de propileno, pero por evitarlo se produce una gran alteracin al tejido. Igual que para la MO, la deshidratacin se hace en una escala ascendente de alcoholes, pero para la ME es conveniente, por lo delicado del trabajo y porque cualquier salida brusca de agua va a provocar distorsin de las membranas, va a arrastrar componentes celulares, etc, comenzar con una graduacin de alcoholes mucho ms baja que para la MO. El tiempo de deshidratacin va a depender del tipo de tejido, del grosor de la muestra y del medio deshidratante a emplear, si se usa acetona los tiempos son ms cortos que con etanol, en general no son
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tiempos largos, pero en el caso de tejidos ms densos aumentan al igual que en el caso de tejidos que cuesta sacarles el agua como los tejidos vegetales. La mayora de los deshidratantes son solventes orgnicos enrgicos, que provocan retraccin de los tejidos y extraccin de constituyentes celulares. Hay que tener cuidado con el tiempo de deshidratacin porque si se deja mucho tiempo se puede extraer los lpidos, especialmente los de membrana aun cuando se haya realizado una postfijacin en tetrxido de osmio. Algunos investigadores como Milloning (1996), aconsejan para evitar los artefactos de retraccin en la salida brusca de agua, agregar a los baos de deshidratacin cuando se usa etanol, NaCl 0.5%. Otro autor afirma que se obtienen mejores resultados al usar metanol en comparacin al uso de etanol. En el caso de la acetona, aconsejan usarla a 4C; otros dicen que provoca menos retraccin que el etanol cuando se usa por poco tiempo; no reacciona con el tetrxido de osmio, mientras que el etanol s lo hace, precipita, si no se lava bien el tejido luego de la postfijacin y se ve al microscopio como un fino precipitado negro; no reacciona qumicamente con algunos monmeros epoxy, lo que permite evitar el paso por el aclarante; extrae menos los fosfolpidos que el etanol; algunos autores prefieren comenzar la deshidratacin a temperatura ambiente y luego seguirla en fro, con lo cual se minimizara la extraccin de lpidos. En el caso que se tenga que dejar la muestra por fuerza en etanol, se recomienda dejar en etanol de 70 a 4C. Lquidos Intermediarios Los lquidos intermediarios o aclarantes ms usados son la acetona y el xido de propileno, que es un epoxipropano, introducido en MET por Left (1961). El xido de propileno se caracteriza por tener una viscosidad relativamente baja, infiltra rpidamente el tejido y reduce la viscosidad de las resinas, que mientras menos viscosas sean van a infiltrar ms rpidamente el tejido, entonces es una buena caracterstica el hecho que reduzca la viscosidad de las resinas, especialmente de algunas que son muy viscosas. Es un compuesto muy reactivo que puede combinarse con algunos grupos reactivos de las clulas y afectar algunas reaccin histoqumicas e inmunohistoqumicas. Cuando se va a hacer un estudio ICQ para MET hay que tener mucho cuidado con el uso del xido de propileno, probablemente se va a tener que evitar. Esto se puede evitar usando acetona o un medio de inclusin hidrfobo. El ltimo bao de impregnacin, que es el ms largo, dura 1 da para tratar de extraer del tejido todo el xido de propileno que pudiera quedar porque va a influir en la calidad del bloque de inclusin. Si quedan trazas de xido de propileno en los tejidos, este va a reaccionar con los grupos epoxy de algunas resinas inhibiendo o alterando la polimerizacin, lo que se va a reflejar en la dureza del bloque de inclusin, se va a obtener un bloque muy blando. Se recomienda usar en tiempos muy cortos, 5-10 min, como mximo.
RESINAS
Caractersticas generales de los medios de inclusin: - poca extraccin de los componentes celulares. - en su forma monomrica, que es la forma comercial, deben ser de fcil solubilidad en los solventes usados. - penetrar los tejidos en forma fcil y rpida. - termoestabilidad alta durante el bombardeo electrnico. - baja viscosidad, los que son muy viscosos demoran ms en infiltrar el tejido. - buenas cualidades de bloque de inclusin: que sea homogneo en cuanto a su dureza. - que tenga una dureza suficiente para hacer cortes ultrafinos (nm). - que tenga una plasticidad y una elasticidad suficientes, no se necesitan bloques duros y rgidos, tienen que tener cierta plasticidad y para eso se les agrega ciertos monmeros que dan esa caracterstica, los llamados plastificantes. - polimerizacin uniforme.
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- que preserve las estructuras, es decir, que no extraiga los constituyentes celulares. - que permitan la penetracin de los medios contrastantes que son metales pesados. - que sean miscibles con otros medios de inclusin, lo que permite hacer mezclas. Los mayores inconvenientes que se pueden presentar para lograr un buen bloque de inclusin para ME son: - no conseguir una buena infiltracin del medio de inclusin porque el tejido no qued bien deshidratado ni bien aclarado. - no conseguir un bloque de inclusin con la dureza apropiada para poder hacer cortes ultrafinos, debe ser ni muy duro ni muy blando. Generalidades de los medios de inclusin: - se venden como compuestos semifluidos, de una viscosidad diferencial entre unos y otros, y de composicin qumica monomrica. - tienen un tamao molecular, viscosidad y un ndice de polimerizacin variable para cada resina. - por accin de reactivos activadores, endurecedores, plastificantes, aceleradores, luz UV o del calor pasan de monmeros lquidos a polmeros slidos. - los polmeros se clasifican en polmeros inestables o reversibles o en polmeros irreversibles. Para MET interesa obtener los irreversibles, porque los reversibles bajo ciertas condiciones recuperan su estado lquido, lo que no servira porque entre los componentes de las mezclas se establecen enlaces dbiles, en cambio en los polmeros irreversibles, al asociarse los monmeros de las mezclas se forman nuevos grupos qumicos que forman uniones covalentes o electroestticas, lo que va a permitir mayor estabilidad de los componentes al momento de recibir el haz de electrones. - de acuerdo a la forma de asociacin de los monmeros en estos polmeros, se van a clasificar en polmeros de distinta estructura, por ejemplo los metacrilatos, que fueron las primeras resinas que se usaron en la MET se dejaron de usar porque formaban polmeros lineales. Los metacrilatos estn formados por N-metil metacrilato y N-butil metacrilato y a eso se le agrega un acelerador, cuando comienzan a polimerizar, las molculas se asocian en forma lineal, lo que no es estable por no ser termoestable. Entonces al colocar los cortes en metacrilatos con polimerizacin lineal, con el bombardeo del haz de electrones la resina se rompe y adems al romperse se subliman contaminando la columna del microscopio. Otro tipo de polmeros son los polmeros cclicos, formados por la adicin de monmeros que presentan anillos de cuatro o ms tomos de carbono, no son muy usados. Los mejores para MET son los polmeros cruzados, se forman polmeros lineales o cclicos que presentan grupos reactivos que interaccionan formando redes tridimensionales muy estables, los grupos reactivos presentes en los monmeros de las mezclas de resinas establecen puentes que pueden ser teres y eso le da estabilidad a la molcula, porque este tipo de puentes son resistentes al calor y a los solventes orgnicos. Los grupos epoxy, caractersticos de las resinas epoxy, pueden interaccionar con otros grupos epoxy presentes en otros monmeros de la mezcla o pueden interaccionar con grupos hidroxilos presentes tambin en la molcula de la resina epoxy, o bien pueden interaccionar con anhdridos cidos que estn presentes en los agentes endurecedores, que tambin estn como monmeros. Entonces, si hay interaccin entre dos o ms grupos epoxy, entre grupos epoxy-hidroxilo y entre grupos epoxy-anhdridos cidos, obviamente que la red de interacciones que se constituye en el polmero es mucho ms estable y da cualidades de inclusin mejores que otras resinas. Caractersticas generales de algunas resinas: resina vestopal araldita viscosidad densidad 900 2500 1170 1081
2002. Alumnos de la Mencin Morfofisiopatologa y Citodiagnstico. Escuela de Tecnologa Mdica. Facultad de Medicina. Universidad de Chile. Prohibida su reproduccin total o parcial, y su publicacin con fines acadmicos sin mencin a los autores. Su utilizacin debe ser solicitada expresamente a los autores
1400 565
1158 1121
La viscosidad de las resinas tambin tiene que ver con el tamao de cada molcula, hay monmeros que son mucho ms grandes, la araldita, por ejemplo, al compararla con el epn es mucho ms grande, siendo las dos resinas epoxy y eso se refleja en su viscosidad. Si se trabaja con araldita se obtiene una solucin de impregnacin y de inclusin mucho ms densa y por lo tanto, los tiempos van a tener que ser mayores que los que en el caso del epn o cuando se trabaje con otra resina de menor viscosidad. Otra cualidad importante en trminos generales es la cantidad de retraccin que se obtengan con estas resinas. El spurr es un monoepxido y presenta la menor viscosidad entre las resinas epoxy y tiene adems muy buenas cualidades de inclusin. Resinas Epoxy Hidrfobas: Hidrfilas: epn, spurr, araldita, maraglas. durcupn, acun.
- Son resinas sintticas, caracterizadas por la presencia de uno o ms grupos epxidos terminales y grupos hidrxilos esparcidos a lo largo de la molcula. De color amarillo claro o miel, viscosos y termoestables. - Son los medios de inclusin ms utilizados en los laboratorios, aun cuando son ms difciles de cortar y menos elsticos que las resinas acrlicas. - Polimerizan uniformemente. - Los cortes que se obtienen de los bloques de inclusin son estables al haz de electrones y pueden ser montados sobre grillas descubiertas o desnudas. En algunos casos se opta por poner una membrana sobre las grillas, que puede ser formvar, parlodin o colodin, para dar ms estabilidad a los cortes, a este tipo de grillas se les llama cubiertas. - El medio de inclusin es una mezcla cuidadosamente balanceada, constituida por: resina epoxy uno o dos tipos de endurecedor o curador acelerador o catalizador plastificante o modificador Los componentes de la mezcla se guardan separados para evitar que polimericen y a 4C porque al ser monmeros, a temperatura ambiente son inestables y menos fluidos. La mezcla se prepara en un mismo vaso plstico midiendo los componentes o en un vaso plstico pesando los componentes, para esto hay que calcular cuanto pesa cada cantidad de componente a una temperatura determinada. Lo ltimo que se hace es agregar el acelerador porque activa la polimerizacin. Los restos de resina que sobran se dejan polimerizar y una vez slidos se eliminan. - Cada uno de los componentes de la mezcla tiene diferentes viscosidades, por lo tanto penetran en el tejido a diferentes velocidades (si no se ha tenido l precaucin de realizar una mezcla homognea). - La velocidad a la que la mezcla de trabajo infiltra el tejido depende no slo de la densidad del tejido, tambin del tamao de la molcula infiltrante, la viscosidad de la mezcla, etc. Esta ltima se puede modificar variando las cantidades de los endurecedores. Ej. araldita, por el tamao de su molcula infiltra lentamente; el epn tiene una viscosidad menor e infiltra ms rpido y el spurr (ciclohexeno-dixido) presenta una muy baja viscosidad e infiltra muy rpido. - La mezcla de trabajo polimeriza formando enlaces cruzados muy estables, por efecto del calor y/o de la luz UV.
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Desventajas del uso de resinas epoxy: - Los grupos epxido y anhdridos pueden reaccionar con las protenas. - Lo anterior puede reducir la antigenicidad y provocar sensibilizacin en los operadores que trabajan en los laboratorios, quienes absorben estos compuestos por la piel o los inhalan (se recomienda el uso de campanas y guantes). - Los componentes de las resinas epoxy son txicos y el VCD (vinilciclohexano) es un conocido carcingeno. Endurecedores o curadores Participan directamente en la reaccin de polimerizacin. La mayora son cidos dicarboxlicos o anhdridos cidos que reaccionan con los grupos hidroxilos y epoxy formando enlaces esteres. Ejemplos: DDSA: anhdrido dodecil succinico NSA: anhdrido monenil succinico NMA: anhdrido metil ndico Aceleradores o catalizadores Aumentan la reactividad del proceso de polimerizacin, promoviendo las reacciones entre los grupos epoxyepoxy y epoxy- hidroxilo. Ejemplos: BDMA: bencildimetil amino DMAB: dimetilaminoetanol DMP-30: amina terciaria: 2,4,6- tridimetil amino metilfenol La mayora de ellos son aminas .Es el componente que va en menor proporcin en la mezcla. Plastificantes Son opcionales, pero mejoran las cualidades de la mezcla porque aumentan la extensibilidad de los bloques de inclusin. Confieren suavidad y flexibilidad a la mezcla de resina epoxy-endurecedor ( que suelen ser extremadamente rgidas). Ejemplos: Dibutilftalato DER736: diglicil ter de propilen glicol ( recomendada spurr por su baja viscosidad )
Resinas acrlicas - Son productos de condensacin de cidos dicarboxlicos con dihidroxialcoholes. - Polimerizan formando polmeros lineales, fcilmente atacados por los solventes orgnicos y por el calor. Los bloques de inclusin presentan excelentes condiciones de corte. - Se han usado el butil metacrilato, metil metacrilato (polimetilmetacrilato) y el glicol metacrilato (poli 2hidroxietilmetacrilato). - El butil y etil metacrilato, provocan alteraciones del tejido durante la polimerizacin. Se producen grandes retracciones, lo que da al tejido una caracterstica apariencia vacuolada y se subliman fcilmente con el
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bombardeo del haz de electrones (se despolimerizan a altas temperaturas), provocando contaminacin en el microscopio. - En los inicios de la MET se utilizaron mezclas de metil metacrilato (confera dureza) y butil metacrilato que proporcionaba la plasticidad de los bloques de inclusin. Variando las proporciones de los componentes se variaba la dureza de los bloques de inclusin. - Como catalizador se usa Luperco CDB (perxido de 2,4-diclorobenzoilo con 50% de butilftalato). - Por accin del catalizador, el calor o la radiacin UV se logra la polimerizacin del bloque de inclusin. - El glicol metacrilato es soluble en agua y se ha empleado para estudios citoqumicos. Se recomienda con mejores resultados el uso de mezclas: glicol, n-butil y metil metacrilato, las que son ms estables que los metacrilatos tradicionales, pero los cortes deben montarse sobre grillas cubiertas con un film de soporte. - Butil, metil y glicol metacrilato se usan con xito en microscopa de luz de alta resolucin (cortes de 1 a 2 m). Son fciles de cortar y se pueden obtener bloques de inclusin de diferente dureza. - Metil metacrilato, por su dureza, es muy utilizado para incluir hueso no descalcificado u otros tejidos duros, para cortes en microscopa de luz.
Cmo evitar la polimerizacin prematura de los metacrilatos? - Evitar el calor y la luz directa sobre los envases. - Ambos factores producen espontneamente radicales libres que interaccionan con los dobles enlaces presentes en la resina y se forman, prematuramente, largas cadenas alifticas. - Como prevencin a la polimerizacin prematura las resinas acrlicas comerciales se expenden en frascos color ambar y contienen un cierto porcentaje (unas pocas partes por milln) de quinona (hidroquinona) que inhibe la polimerizacin espontnea. Por esta razn, previo a su uso en los laboratorios, es necesario purificarlos. Se elimina la hidroquinona mediante un tratamiento de destilacin. Cmo obtener polimerizaciones lentas? - Infiltrar a baja temperatura (ej: -20C). - Controlar la adicin de acelerador (perxido de benzoilo). Nueva generacin de resinas acrlicas hidroflicas (1980): - Polimerizan por puentes cruzados, lo que previene la sublimacin al ser expuestas al haz de electrones y se observa una disminucin del grado de retraccin de los tejidos durante la infiltracin. - Se clasifican en dos grupos: 1.- Resinas LR, dimetacrlicas-polihidroxiaromticas (son monmeros aromticos). Ejemplos: LR- White y LR-Gold. 2.- Resinas Lowicryl (son monmeros alifticos) Ejemplos: Lowicryl K4M y HM20 (son steres de acrilato y metacrilato). K4M: resina hidroflica polar (se usa a 35C) HM20: resina hidrofbica apolar (se usa a 35C) K11M: resina hidroflica apolar (se usa a 60C) HM23: resina hidroflica apolar (se usa a 70C) Ambos tipos de resinas (LR y Lowicryl) se han usado con xito para estudios citoqumicos e inmunohistoqumicos (el uso de baja temperatura inhibe la denaturacin de protenas). Ventajas del empleo de estas resinas:
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- Son solubles en agua (resinas hidroflicas, puede realizarse la impregnacin de los tejidos desde el agua o despus de etanol de 70). - Son estables al haz de electrones. - Son usados para microscopa de luz de alta resolucin y para MET. - Son de baja viscosidad, por lo que requieren tiempos de impregnacin cortos. - Son de baja toxicidad. - No requieren mezclas. Cmo se logra el endurecimiento (polimerizacin) de los bloques de inclusin? - LR-White: 24 hrs a 60C uso de temperatura ambiente (agregando, opcionalmente, un acelerador) - LR-Gold: polimerizacin fotoqumica a 25C se usa luz azul proveniente de una lmpara de cuarzo - Cmo mtodo de rutina cuando se usa LR-Gold la infiltracin se realiza a 25C. - Los Lowicryl polimerizan fotoqumicamente usando radiacin UV. Proceso de infiltracin o impregnacin en el medio de inclusin Previo a la infiltracin, el operador deber preocuparse de preparar adecuadamente la mezcla de resina con la que infiltrar los tejidos. - Componentes a temperatura ambiente ( si la infiltracin se realizara a esta temperatura ) - Obtener una mezcla con las proporciones exactas de componentes, mezclados en forma homognea y completa. - Recordar que los reactivos que componen la mezcla de impregnacin son molculas de distintos tamaos, con diferente viscosidad y diferentes ndices de polimerizacin. Ejemplo: DDSA (endurecedor) es ms rgido y menos viscoso que la araldita, de tal manera que si no se mezclan bien, el DDSA penetrara primero el tejido y desplazara a la araldita. - El proceso de infiltracin depende de la resina utilizada para incluir la muestra. - Si los tejidos no son adecuadamente infiltrados se obtendrn bloques de inclusin con una polimerizacin de muy baja calidad. - Los parmetros que hay que cuidar para tener una buena impregnacin son: Viscosidad: va a constituir un ndice de penetracin del medio de inclusin, varia inversamente con el tamao de la molcula y con su viscosidad. Un aumento de la temperatura disminuye la viscosidad ( la mayora de las infiltraciones se realizan a temperatura ambiente) Vaco: se recomienda durante todo el tiempo de infiltracin del tejido en las resinas. La presin recomendada es de 0.5 atmsferas, presiones mas altas tienden a provocar desagregacin de las clulas. El vaco remueve y elimina las burbujas de aire que pudieran producirse durante la infiltracin. Se recomienda especialmente para la infiltracin de tejidos vegetales. Agitacin: se recomienda para hacer mas rpidas y homogneas las infiltraciones. Los movimientos deben ser suaves para no daar los tejidos (circulares-rotacionales son mas recomendados que los de sacudidas) Tiempo de infiltracin: el tiempo de infiltracin para cada tejido debe ser determinado por mtodo de ensayo y error. El tiempo a utilizar depende directamente del tipo de tejido, de la densidad del tejido, del tamao de la muestra (grosor) y del medio del inclusin que se utilice. No debe prolongarse innecesariamente la infiltracin para evitar la extraccin de los constituyentes celulares. Lo mismo que en la deshidratacin y en el paso por el lquido intermediario. Los polmeros cruzados se forman entre grupos presentes en la resina epoxy, hidroxilos de alcohol secundario ms el anhdrido presente en el endurecedor, formando puentes monosteres que pueden interaccionar con los grupos epoxy de las resinas formando puentes diesteres que son parte de los polmeros
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cruzados. Esa es parte de la reaccin. Tambin podran establecerse interacciones directamente entre los grupos hidrxilos presentes en la resina epoxy ms los grupos epoxy de la propia resina y generarse estos puentes esteres. Los dos tipos de reacciones pueden ocurrir. La inclusin final se hace en pequeos moldes que se llenan con resina sola y en los que se ponen la muestra y el nmero de identificacin. Una vez que est listo, se pueden hacer dos cosas: llevar el molde a una estufa a 45C por 2 horas o llevarlo directamente a una estufa a 70-80C para la polimerizacin. La ventaja de llevar los moldes primero a una estufa a 45C es que por la polimerizacin lenta se puede reorientar la muestra en caso de que se haya movido y eliminar burbujas que pueden haber quedado. Caractersticas fsicas de un buen bloque de inclusin: - suficiente dureza. - adecuada elasticidad. - adecuada plasticidad. - suficiente resistencia al bombardeo al haz de electrones. - homogeneidad. Para realizar los cortes se utilizan ultramicrtomos que son micrtomos similares a los rotatorios tipo Minot, los cuales tienen adicionados un par de lupas para observar los cortes, un carro portamuestras, una lmpara que ilumina los cortes y la navaja, que va en una carro porta navajas y una manivela. Estos micrtomos pueden ser de avance mecnico o de avance trmico (se han dejado de usar). Los primeros cortes que se hacen son cortes gruesos (para ME) de 1m, que se tien con azul de toluidina a pH alto, pero el problema es que las resinas son difcilmente penetradas por los colorantes comunes (hematoxilina, eosina, azul de toluidina, etc), pero esto se resuelve utilizando pH altos, a los que las resinas son penetradas rpidamente. Este corte grueso sirve para hacer un anlisis general del tejido y en que zonas estn las estructuras que interesan para sacar en los cortes ultrafinos y as saber que parte del bloque hay que retallar. Cuchillos Los cuchillos que se utilizan en ME son de dos tipos: vidrio o diamante. En el caso de los cuchillos de vidrio, se deben confeccionar en el mismo laboratorio y para eso nosotros compramos el material a la LKB que es material de importacin. Se compran barras de vidrio de una cierta dimensin, es ms bien un cristal de muy buena calidad, y de esas barras que se lavan y secan muy bien para que no tengan pelusas se cortan cuadraditos que tienen una cierta dimensin. Una vez que tengo los cuadraditos con un diamante hago una lnea diagonal y posteriormente hago presin con unas tenazas en esa lnea y el cuadrado de vidrio se va a escindir en dos y de cada cuadrado voy a obtener dos cuchillos de vidrio. Esto se hace con una mquina que permite que la presin que se ejerce sea ms homognea de modo que el rendimiento en la obtencin de cuchillos sea mejor. Los cuchillos de vidrio fueron introducidos en el ao 1950 y los de diamante en el ao 1953. Tienen una gran ventaja los cuchillos de diamante que es su gran duracin, pero su gran desventaja es su alto costo, pero para la gente que trabaja en forma rutinaria en microscopa electrnica son necesarios y no hay laboratorio que no tenga uno o dos cuchillos de diamante. Los cuchillos de vidrio son fabricados por el operador, se utilizan barras de vidrio destensado? y se obtienen cuadrados de vidrios de 2 a 2,5 cm de lado. Estos cuadrados se pueden obtener por un sistema artesanal o con mquinas y de cada uno de los cuadrados se obtiene dos cuchillos. La arista de uno de los ngulos del cuadrado es la que se utiliza como borde cortante y la longitud del borde cortante va a depender del grosor del vidrio que utilicen para fabricar el cuchillo.
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Los sistemas de fabricacin son por fractura trmica o por fractura mecnica, esta ltima puede ser utilizando una mquina que se llama Messer Sunkay. Es importante evaluar el filo del cuchillo y adems hay que agregarles un bao a los cuchillos que es donde van a ir cayendo los cortes. Este bao se puede hacer de cinta adhesiva plstica, cinta adhesiva de aluminio o de cinta aisladora y deben ser sellados con barniz para uas, cera dental lquida o parafina. Una vez que los cuchillos han sido seleccionados deben ser guardados en una caja protegidas del polvo y la humedad, porque cualquier cosa que tenga el filo del cuchillo va a ir en desmedro de la calidad de su corte. La evaluacin de los cuchillos se hace bajo un microscopio de luz. El filo del cuchillo posee un ngulo muy agudo que se llama pico de destruccin? y bajo esa zona una serie de rayas, toda esta zona no es til para utilizarla como filo. Tambin podemos ver una arruga que se llama arruga de fractura. La zona ms til que puede usarse como filo es la que est un poco ms all de la arruga de fractura y antes del pico de deflexin. Una vez que tenemos hecho nuestro segundo tallado tenemos que cambiar el cuchillo. En el bao es posible poner un poco de acetona par que los cortes se estiren al caer. Si se utiliza slo agua yo puedo con un palito de naranjo al que el he puesto un algo don con cloroformo, acercarlo a los cortes sin tocarlos y de ese modo se estiran. Una vez que estn estirado tengo que evaluar si los cortes son del grosor que yo necesito a pesar de que yo he puesto un grosor en el micrtomo. Luego con una pinza que en su extremo tiene una grilla yo me acerco con la pinza a los cortes que estn estirados y son del tamao adecuado y puede pasar dos cosas, o que los cortes se adhieran a la grilla al ponerla encima, o bien podemos sumergir la pinza y que los cortes se atrapen por debajo. Pueden ser grillas desnudas o cubiertas dependiendo de lo que hayamos decidido. Cuando son cortes seriados no podemos perder ningn corte y en ese caso se utilizan grillas con un hoyo que pueden estar cubiertas o no. Para evaluar el grosor del corte utilizamos los colores de interferencia. Cuando los cortes estn flotando sobre la superficie del agua del bao los vamos a ver coloreados y los colores van entre gris claro que es lo mejor, a color violeta que para los efectos de nuestro trabajo es lo peor en cuanto al grosor porque son los ms gruesos. Los colores de interferencia reflejan el grosor del corte. color grosor ()
gris claro 150-200 gris 200-250 plata mate 250-400 plata brillante 500-700 oro plido 700-900 oro mate 900-1100 violeta 1100-1500 Lo ms comn es plata brillante. Mientras ms delgada sea la muestra ms dbil va a ser al bombardeo electrnico, y tambin hay que considerar que si usamos grillas cubiertas el corte no puede ser muy grueso porque la cobertura de la grilla va a influir. Todo esto hay que tenerlo en cuenta porque va a influir en la observacin que vamos a hacer. Las grillas son de varios modelos. Se llaman grillas o rejillas y son el medio soportante de los tejidos ultrafinos, o de las suspensiones que sern observadas al microscopio electrnico de transmisin, tienen la caracterstica de disipar el calor y las cargas elctricas producidas por el haz de electrones. En general, son discos de metal de 2,3 a 3,05nm de dimetro y 0,10 a 0,20mm de espesor, con un rea central que presenta perforaciones de distinta forma y dimetro y un borde que es perifrico, slido y liso. Estn hechas de cobre,
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nquel, oro, platino, oro-paladio, acero inoxidable, etc., y va a depender de la metodologa que vamos a aplicar que se elige el material de la grilla. Las ms comunes son las de cobre, pero a veces las de cobre no sirven; las de platino sirven cuando sobre los cortes se hacen tratamientos con cidos. Tambin pueden ocuparse grillas de nylon, tefln o slice cuando es necesario contar con un aislante electrnico. La trama se refiere al nmero de barras por pulgada, y a eso se le llama unidades MESH. A mayor nmero de barras, menor es el rea descubierta de la grilla. Hay grillas de 70 mesh, 100 mesh, 200 mesh, etc. hay grillas con agujeros de diferentes formas, con un agujero o con varios, descubiertas o cubiertas con un film o membrana soportante (que puede ser fabricada por el operador). Si necesitramos incluir una suspensin de clulas que necesitamos cortar lo podemos hacer utilizando un medio soportante como la agarosa 4% despus de haberlas fijado, y despus esto puede ser tratado como si fuera un tejido cualquiera. Las membranas soportantes son delgadas films, fabricados por el operador, que se colocan sobre las grillas con el fin de sostener los cortes ultrafinos o suspensiones que van a ser puestos en las grillas para ser observados al M.E., son fabricadas de diferentes materiales y la eleccin del material con que se fabrican va a depender del tipo de trabajo a realizar y el tipo de grilla a emplear. Las caractersticas que pretendemos de las membranas soportantes son: ser de lata resistencia mecnica; ser de baja absorcin electrnica especfica; y que no cambien de dimensin al ser bombardeadas por el haz electrnico. Comnmente se usa para fabricarlas soluciones diluidas de diferentes plsticos como fomvar (polivinilformol), colodin o parlodin (nitrocelulosa), etc. las concentraciones son de 0,5 a 1,0 %. Se puede utilizar materiales evaporados al vaco como carbn, berilio, monxido de silicn, berilio+aluminio, xido de aluminio. las ms utilizadas son las de carbn y de fomvar. Las de formvar y colodin son las ms utilizadas porque se obtienen grosores de 20 a 200nm. Las de colodin son menos resistente que las de formvar, pero son ms fciles de fabricar. Con las de carbn tambin se obtienen membranas de bajo grosor pero son utilizadas para trabajos muy especializados. Los plsticos y sus solventes son: Formvar dicloruro de etileno, cloroformo o dioxan Colodin acetona, acetato de etilo o acetato de amilo Perspex cloroformo. Poliestireno bencina Polivinilalcohol agua destilada Una forma de preparar las membranas es por evaporacin del solvente de una solucin diluida (ej, formvar 0,2 0,5 o 1,0%). Se hecha una gotita de la solucin en un recipiente con agua y se deja evaporar el solvente y debera quedar una pelcula. Otra forma es sumergir rpidamente un portaobjeto muy limpio en la solucin de plstico, rpidamente para que la membrana quede homognea, delgada y sin arrugas. Luego este portaobjeto se deja secar en una campana de modo que se evapore el solvente. Cuando est seco se corta con una navaja de afeitar y se sumerge en una fuente con agua y se va levantando la pelcula, hasta que toda queda flotando en el agua. Ahora sobre esta superficie voy colocando con una pinza las grillas sobre la lmina hasta que quede llena de grillas. Para recoger la pelcula ocupo papel filtro o parafilm y se deja en una placa petri para posteriormente utilizarlo. Esto hay que hacerlo antes de ponerse a cortar. Un tejido que fue incluido en parafina se puede reincluir para obtener una muestra para ME, y una muestra que ha quedado mal incluida tambin se puede reincluir. Daniela Araya Caldern
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Contraste En MET
Nancy Olea 14 de octubre de 2003
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elementos de peso atmico alto, este electrn es enviado en ngulo tan grande que sale del campo de formacin de la imagen, generando una mancha oscura. Esto se llama contraste de amplitud, y es la base fsica del contraste. Hay electrones que interactan con los orbitales de los tomos pesados pero pierden un mnimo de energa, mantenindose aun en la imagen. Estos electrones sirven para hacer focalizacin en contraste de fase, el resto solamente molesta, porque en los cortes delgados crean un halo alrededor de las estructuras y en los cortes gruesos se produce la aberracin esfrica (electrones que experimentan dispersin inelstica). Los electrones secundarios son de muy baja energa, sirven para estudiar topografa. En MEB, los electrones retrodifundidos dan imgenes de contraste de acuerdo a la composicin del material y los electrones Auger nos dan informacin de elementos de muy bajo peso atmico. El hecho de que produzcan aberracin esfrica los electrones dispersados inelsticamente se debe a que, como perdieron un poco de energa, esta prdida de energa se manifiesta como una prdida de velocidad, por lo tanto la focalizacin es diferente a la del haz de electrones, forman distintos focos. Los electrones secundarios los capta un detector que los atrae, porque son de muy baja energa (10-50 Ev) y despus son transformados en seales de luz, que con un tubo fotomultiplicador forma en una pantalla la imagen topogrfica del espcimen. El contraste, adems de los factores que ya mencionamos, depende de factores propios del instrumento que utilizamos: el kilovoltaje (Kv, aceleracin del elctrn) la aberracin esfrica, el uso de diafragma que elimina los electrones que no estn colimados. El uso de cortes ms gruesos requiere de aberturas de menor tamao. Lo ideal es trabajar con una preparacin biolgica de 600 A de espesor bien contrastada y con un Kv de 100 y una abertura de tamao regular. Dentro de un mismo corte puede haber zonas de distinto espesor, adems las estructuras pueden variar segn el plano de corte. Por ejemplo, para ver un microtbulo como realmente es hay que cortarlo transversalmente. El ME tiene un sistema llamado.. que permite orientar la grilla de tal manera que las estructuras se vean tal cual son. Otra variable es la longitud de onda de los electrones para distintos Kv; al aumentar el potencial de los electrones, aumenta la velocidad de estos, y como consecuencia la longitud de onda va a disminuir (mientras mas chica la longitud de onda, mejor la resolucin). Nosotros trabajamos cerca de los 80 Kv con una longitud de onda de 0.042 nm. Para cada microscopio electrnico hay un lmite terico de resolucin que lo da el fabricante. Actualmente se ha llegado a un poder de resolucin de 2-3 A. Tambien existen los microscopios de alto voltaje, que usan 3 MegaV (3000 Kv), con el cual los electrones pueden atravesar una lmina de aluminio de 10 um. Si metemos una clula en este tipo de microscopio, simplemente no la vemos, los electrones pasan de largo. Clasificacin de los medios de contraste 1. Medio directo 2. Medios indirectos
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3. Mtodos especiales
a) Medios directos: Plomo y uranilo. Es un contraste general e inespecfico. Funcionan con una unin directa del ligando al metal pesado. b) Medios indirectos. Son contrastes localizados especficamente, semicuantificables, pueden ser particulados o no particulados. Por ejemplo en la deteccin de enzimas, hay que acoplar al producto de reaccin un metal pesado, por ejemplo el formazan, que es electrondenso. Lo mismo ocurre con el cerio. El plomo se acopla al producto de reaccin. El mtodo ICQ, donde partculas de oro coloidal estn conjugadas con el anticuerpo; el mtodo autorradiogrfico, donde el filamento de plata reducido que se va a depositar justo en el sitio emisor de la radioactividad que nosotros dimos al tejido previamente; el mtodo de hibridizacin in situ donde fabricamos una sonda con un antisentido marcado con digoxigenina y luego a esta le acoplamos bolitas de oro coloidal y asi luego el reconocimiento en la clula. - Mtodos especiales: - tinciones negativas: hay depsitos de material denso (medio de contraste) y las estructuras destacan plidas - sombreo metlico de material in toto: cmo ver una estructura electrnlcida?, bombardeando el material en un aparato que rota. Ejemplo: hebras de DNA - criofracturas o criograbados (revisin de rplicas). Aqu no estamos mirando el material, lo que estamos viendo es una rplica, una copia del material Mtodos directos: El acetato de uranilo es uno de los colorantes ms usados. Cmo funciona?, simplemente por diferencias de cargas (unin electrosttica; el mecanismo exacto no se conoce, pero se sabe que reacciona con los grupos sulfatos, con los amino de las cidos nucleicos (tie protenas) y forma compuestos quelados, los que se caracterizan por ser estables. El uranilo es muy reactivo, puede compartir fcilmente sus electrones. Se puede teir antes de incluir, hacer los cortes, tomar el taco y tirarlo dentro de un vaso con uranilo y lo dejan 1 da. Otra manera es sacar el corte, poner una gota de uranilo encima (esta es la forma ms habitual). Viene en solucin acuosa, en metanol, en alcohol. La que nosotros usamos es al 4% en metanol durante 1 minuto. Precipita, hay que cuidarlo mucho, es muy inestable a la luz (fotolbil), es txico, viene con un cierto grado de radioactividad pero atenuada, si la solucin se pone turbia o le sube el Ph hay que botarla (en una botella destinada para esto, despus se manda a Bioseguridad). Si se tie por tiempos muy prolongados, aumentan los precipitados. Conviene siempre centrifugar el colorante a 5000 g ms de 5 minutos y luego se filtra para teir. Hay metales que coordinan mejor con el oxgeno o con el nitrgeno, por ejemplo el lantano, torio, fierro, plomo, berilio, bismuto, tienen una tendencia a coordinar mejor con el oxgeno y por lo tanto se usan para teir
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cidos nucleicos. El niquel, cadmio, oro, plata, zinc, cobre tienen tendencia a coordinar mejor con el nitrgeno, se usan para teir protenas. Plomo: tie las membranas que estn tratadas con tetrxido de osmio, tie el glicgeno ( se ve como en rosetas). Tambin forma compuestos quelados (compuestos polibutanos). se usa despus del uranilo, porque ambos conjugan bien, intensificando la tincin. Reynolds estudi la combinacin del CO2 del aire con el plomo, se forman carbonatos de plomo que precipitan. Estos carbonatos no se disuelven con nada y se depositan sobre el tejido en forma polibutanos o en granitos como pimienta. Reynolds pens en una solucin estequiomtrica entre el nitrato de plomo y el citrato de sodio, de manera que todo el plomo reaccionara con el citrato y as no quedara plomo libre que se combinara con el CO2, a Ph 2 (favorece el estado catinico bivalente del plomo). Para preparar el plomo hay que hervir el agua, porque con el burbujeo sale el CO2 del agua, o bien, autoclavarla. A veces funciona tratar los precipitados con cido oxlico. Cmo se tie?, hay que hacer una cmara de tincin con una placa de petri con parafilm y las gotas de uranilo sobre el parafilm. Sobre la gota se pone la grilla con el corte hacia abajo, se tapa durante 1 minuto, se lava la grilla en tres vasos de metanol 25-30 veces sumergiendo la grilla en cada vaso, secar la pinza y despus teir con el plomo. El plomo que nosotros usamos es ms fcil de preparar que el de Reynolds: 0,04 g de plomo y luego NaOH 10N (un par de gotas). Se tie 5 minutos con el plomo en la cmara que adems debe tener unas lentejitas de NaOH, porque capta el CO2 del ambiente. Despus se lava con agua o con una solucin de KOH 0,01 N. El lantano se usa para delinear espacios intercelulares. Cmo incrementar una tincin?, usando concentraciones relativamente bajas, controlando el tiempo de tincin, controlando la fijacin (por ejemplo en las reacciones de inmuno no se usa el osmio, tampoco para las reacciones enzimticas), modificando el Ph del colorante, empleando controles (por ejemplo, para teir cidos nucleicos se utilan las muestras y con eso se van las protenas). En el caso de querer contrastar slo DNA, se hace una hidrlisis alcalina que saca el RNA y luego se trabaja con el corte. Mtodo de Bernard: tratamiento con EDTA, compite con las sales de uranio, permite detectar solo RNA. Una solucin colorante ideal rene todas estas condiciones: - estable al haz de electrones - alto peso atmico - densidad electrnica ms alta que el medio de inclusin - no reacciona con el metal de la grilla - estable en solucin - no produce artefacto - fcil de preparar Los medios de contraste adems de contrastar, deben estabilizar el material de manera que no se rompa la muestra con el haz de electrones.
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Mtodos especiales: Las tinciones negativas sirven para estudios de virus principalmente, permiten hacer un examen rpido del material. Est basado en el principio de la no reaccin. Ventajas: es un mtodo simple, rpido, resultados inmediatos. Desventajas: muestras requieren una purificacin y concentracin adecuada, porque el material en estudio (p. Ej. Virus) es muy pequeo. Las variaciones morfolgicas que produce el haz por desecacin a veces puede hacer que los resultados varen. Mtodo de sombreado: se gotea en una grilla con un film de carbn y despus uno puede medir el tamao de las partculas. Con esta frmula () se puede calcular la altura de la partcula que produce el metalizado, a partir de la tangente del ngulo de sombreo, por el largo de la sombra que proyecta (rea que queda desprovista de metal). Esta sirve para calcular tamao. en qu se sombrea? En un sistema que tiene una bandeja rotatoria, un vaporizador, etc. Generalmente, el metal usado es el platino, estn en un ngulo de 45. Con un filamento de tungsteno que se calienta mucho, los metales pueden evaporarse y sombrear el espcimen. Tambin se `puede evaporar carbn para preparar una membrana para una grilla. cmo calcular cunto carbn debe caerle a la muestra?, se pone una plaquita de porcelana con una gota de aceite, entonces se ve la diferencia de colores entre ambas. El carbn se bombardea en un ngulo de 90, y el metal, en 45. Despus se trata con cido toda la parte orgnica, se lava y las rplicas quedan flotando, se toman con una grilla. Mtodo del esparcido de DNA/RNA: sirve para purificar DNA o RNA, se suspenden en una solucin que contiene acetato de amoniaco y EDTA, entre otros. Esta solucin se deja caer con un portaobjetos super limpio, entonces cae el DNA; ahora se usa una solucin super bsica, entonces el DNA se expande. Cmo verificar antes?, uno usa talco: si se expande el DNA va a quedar un rea clara.
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Cuantificacin del contraste: Los estudios de los microscopistas electrnicos interesados en cuantificar el contraste producido por sales de metales pesados en los tejidos biolgicos se ven obstaculizados por la consideracin de muchas variables:
Empleo de fijadores y medios de inclusin que introducen cambios conformacionales capaces de alterar los sitios de unin al colorante, aumentando o disminuyendo la tincin
Disminucin de la coloracin por falta de penetracin debido a la resina de inclusin. La tincin observada se debera slo a grupos activos superficiales
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En tejidos como los epitelios, las clulas que los componen es posible que a travs de molculas
expresadas en la superficie celular, puedan reconocer otras molculas que forman parte de la matriz extracelular; es importante entonces recordar la organizacin de sta para comprender el modo de trabajo en microscopa electrnica. La superficie celular (cualquiera sea el tipo de clula de entre todas las que nos constituyen), incluso en tejidos constituidos por un mismo tipo celular; este es el caso del hgado, que a microscopa ptica nos parece similar. Sin embargo, los anlisis bioqumicos y ultraestructurales demuestran que hay una gradiente de composicin caracterstica dentro del lobulillo heptico. Adems, la composicin y funcin cambia entre cada hepatocito. Las superficies del hepatocito tienen diferentes receptores, azcares y otros componentes, que lo hacen ser particular. Si bien podemos observar clulas que parecen equivalentes en forma y funcin, cuando indagamos en forma ms profunda comprobamos que no es as. Esto es fundamental tenerlo presente para los propsitos de investigacin, pues incluso en cultivos celulares ninguna clula es igual a otra, pese a que tengan un mismo patrn. Adicionalmente, debe considerarse el nivel de complejidad existente, relacionado con la diversidad de tipos de molcula de membrana, o de los dominios. Por ejemplo, una clula plasmtica no equivale a una clula epitelial, pues esta ltima se relaciona con clulas vecinas, un lumen y una matriz extracelular, mostrando una complejidad diferencial en su superficie dependiendo de las relaciones establecidas. La membrana plasmtica se observar como una estructura de 2 zonas densas separadas por una zona clara formando una unidad de membrana (segn Robertson). Sin embargo, al comparar las unidades de membrana de diferentes clulas observadas al microscopio electrnico de transmisin, no es posible sealar que sus funciones y composicin son equivalentes. Ms an cuando se estudian procesos de transporte, se esquematizan procesos como el transporte, los dibujos muestran un grado de confusin, pues da una visin simplista de la funcin de las molculas. El caso tpico es el de los canales de potasio, que en modelos 3D, con sus diferentes dominios, estn formados por 2 subunidades que en parte miran al extra y al intracelular, y que son complejas. El modelo de membrana de mosaico fluido de Robertson, planteado en 1962 y que sigue emplendose hasta hoy, ha tenido pocas modificaciones. Este modelo propone que las membranas estn formadas por una bicapa altamente fluida y lquida a la temperatura fisiolgica de los organismos, y que las protenas se insertaban en toda ella, hacia un lado u otro de la bicapa, y que la bicapa era mvil, con cierto grado de libertad de movimiento de lpidos transversalmente en el plano de la membrana. Por 40 aos se ha trabajado con este modelo. Haba bicapas ms ricas en c. grasos saturados, insaturados, y dependiendo del punto de fusin de stos iba a estar en estado ms o menos lquido, pero se supona que las membranas tenan un mismo grado de fluidez en ambos lados. Por otra parte, se pensaba que una misma molcula (fosfolpidos) tena 2 centros diferenciales: las colas hidrofbicas de cidos grasos, y un extremo amino alcohol. Una membrana puede tener una cantidad de fosfolpidos no equivalente a la otra. En M.E. puede observarse esta unidad de membrana de bolsa equivalente, pero no mirndola como si tuviese los mismos constituyentes. A qu nos lleva esto? Dependiendo de las alternativas de tener un mismo tipo de cido graso pero con diferente rotacin y que cambie solamente el amino alcohol, tendremos un enorme nmero de posibilidades de fosfolpidos diferentes que dan asimetra a la membrana, ubicndose algunos hacia la cara extracelular y otros hacia el citosol. Aquellos fosfolpidos de la cara extracelular no podrn estar hacia el citosol, y viceversa, salvo que medien procesos como la
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apoptosis, que tendrn un flip-flop de algunos de ellos, que puede usarse como marcador de dao celular temprano.
En la ltima dcada ha surgido nueva informacin que aporta elementos nuevos de conocimiento sobre las membranas. Las membranas no solamente son una interfase formada por fosfolpidos y otros lpidos como el colesterol, libremente desplazables, sino adems existen unidades con composicin diferencial respecto de las dems, que estn constituidas por esfingolpidos y colesterol en altas concentraciones, presentes en la cara exoplsmica de la bicapa. Estos sectores denominados dominios raft o balsa , se caracterizan por ser resistentes a la solubilizacin en detergente, mostrando un cambio en el concepto del modelo clsico de mosaico fluido de membrana, en que todos los componentes eran solubles en detergentes inicos y no inicos, y que a 4 C hay una baja densidad de flotacin en una gradiente de sacarosa. Operacionalmente, desde el punto de vista fsico, la membrana dej de ser una entidad contnua, concepcin inicial, hasta hace unos 5 aos atrs. Los esfingolpidos ms participativos son los ganglisidos (sustituidos por monosacridos o subunidades mayores) y cerebrsidos. Existen familias de ganglisidos, que aportan a los dominios diversidad y especificidad de funcin para cada membrana que tenga este tipo de molculas. Tambin debemos considerar el colesterol, especfico de todas las membranas, pero concentrado en la monocapa externa de los dominios raft. Una clula, tiene una difusin alternada entre los dominios Raft y no Raft, sin separacin fsica. Al microscopio electrnico se ven iguales, slo si esos dominios Raft, adems de su composicin lipdica forman cavolas, se puede discriminar morfolgicamente entre dominios Raft y postcavola; y la cavola tendr la composicin de lpidos Raft y protenas como caveolinas, que le permiten quebrarse e invaginarse. Es decir, requerir la presencia de una maquinaria mecnica que le haga perder su continuidad e invaginarse. Estos dominios no se forman en la propia membrana, sino que se forman en Golgi. Es la ltima cisterna del trans Golgi que destina vesculas, sea de composicin Raft o no, pues la destinacin viene del intracelular. En la hoja exoplsmica hay protenas unidas por tallos de lpidos GPI (glicosil fosfatidil inositol), asociados a transporte, transcitosis, adems se han estudiado en su relacin con la transduccin de seales. Los dominios Raft al verlos en 2 tipos de clulas epiteliales, como el epitelio intestinal y en hepatocitos veremos lo siguiente: en hepatocitos estn discretamente distribuidos en forman ms o menos homognea en todas su superficies (canalicular, sinusoidal, intermembrana). Cada una de sus caras forma interacciones diferentes. En el caso del intestino, existe una superficie luminal, una basolateral, y una cara que da hacia la matriz extracelular. Las clulas se contactan entre ellas por interacciones o uniones estrechas, por el lado basal interacta a travs de receptores de adhesin con componentes de la matriz extracelular. Comparando la distribucin con los dominios de estas clulas, los dominios Raft estn distribuidos mayoritariamente en la superficie apical. Cada tipo celular tendr una distribucin asimtrica, pero no en el plano de la bicapa, sino en el de los dominios de membrana (apical y basolateral); esto no solo es vlido para lpidos, sino tambin para protenas. En la membrana hay protenas integrales de membrana, de transmembrana que atraviesan una o varias veces sta, protenas asociadas con cidos grasos, perifricas asociadas a protenas integrales. Cmo se distribuyen las protenas dentro de una clula con un gradiente de polaridad, como las que forman epitelios (presentan un dominio apical, uno basal y uno lateral, generalmente la regin apical mirando hacia un lumen y la basal hacia la matriz extracelular). Cmo se distribuyen las protenas en una misma superficie? En una clula epitelial, un nutriente como la glucosa no ingresa si no est acoplada funcionalmente a 4 tipos de receptores o canales; por ejemplo ingresa por la cara luminal a travs de un transportador de tipo bomba sodio potasio ATPasa, otro que corresponde a un canal de potasio; para que la glucosa llegue a la sangre deben funcionar 4 tipos de protenas que medien el transporte de la glucosa, ubicadas en diferentes dominios. El citoplasma servir de reservorio, que dependiendo de la concentracin de glucosa o sodio activar otras molculas para que el proceso ocurra. Hay un acoplamiento qumico funcional y un dominio separado fsicamente por barreras de tipo uniones estrechas que impiden la deslocalizacin de
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los componentes proteicos sea de la cara basal o la apical. Es importante al identificar molculas a nivel de superficie, saber que an sin conocer la ubicacin de estos sistemas, debe mantenerse la integridad fsica que impida el reordenamiento de componentes de una superficie a otra.
Por ejemplo al desconocer la ubicacin de un transportador, se disocian las clulas para hacer un cultivo de clulas primarias, es probable que se distribuya en toda la clula; por ende, es fundamental mantener las uniones estrechas entre las clulas, para dar as polaridad de dominios que permitan identificar mejor la ubicacin del transportador en estudio, en caso de no poder hacer la identificacin en tejido. Existen anticuerpos que no pueden ser utilizados en tejido ni en material fijado incluido posteriormente en resinas. Entonces debe hacerse la inmunodeteccin en tejido sin fijar, permeabilizando los extendidos, porque sera necesario tener los dominios mirando hacia el extracelular. Es muy importante entonces tener presente que las molculas deben ubicarse en el extracelular, adoptar precauciones, y tener claro la ubicacin del epitelio. Las cavolas, analizadas en la dcada del 50 por Palade, han sido retomadas para el estudio. Se defina antes como una unidad invaginada de membrana plasmtica de 50 a 100 nm; Disanti, en la actualidad, agrega que adems de invaginaciones pueden haber estructuraciones en vesculas, estructuras aplanadas, racimos; todas estas formas pueden ser momentos o estados de la invaginacin. Estas invaginaciones tienen distribucin diferencial en las diferentes superficies celulares. Cuando se da un tratamiento a las clulas para extraer las bicapas y dejar el componente proteico, se observan ovillos que son diferentes entre s. Todas estas protenas forman cubiertas a estas estructuras. Existen isoformas de una protena denominada caveolina, que forman una cubierta a la cavola, y podran ayudar a explicar las diferencias en las formas de stas. Cuando la cavola adopta una forma hexagonal o pentagonal, su cubierta est formada por clatrina. Dependiendo del tipo celular las cavolas pueden ser transitorias y cumplir funciones de endocitosis y fusionarse con la membrana plasmtica basal celular y transitar compuestos a travs de la clula. En un corte de MET de un capilar sanguneo, cuya principal funcin es la de transporte, en que se ven clulas endoteliales cortadas a diferente plano, se ven una serie de vesculas hacia basal. A mayor aumento, las vesculas corresponden a cavolas (segn Disanti seran con forma de racimo, interconectadas, y que llegaran a la superficie basal), se ven vesculas abiertas que han vaciado su contenido a la matriz extracelular, otras prontas a fusionarse, surge la pregunta: si realmente en estos sistemas, y dada la alta eficiencia operativa del transporte en los vasos sanguneos, es necesario esto? En otros tejidos como el intestino, rin, hepatocito u otras clulas, esta organizacin no se encuentra. Entonces la organizacin es particular del tipo celular estudiado. No esperaremos que las cavolas de un tipo celular se presenten de la misma forma en otro tipo. Se ha postulado un modelo contnuo que conecta el extra e intracelular a travs de este racimo de estructuras que van a fusionarse con el intracelular; otro punto que no puede desconocerse al hacer estudio de membranas es el movimiento de protenas y lpidos en la membrana celular. La temperatura del organismo est sobre el punto de fusin de los cidos grasos; con mayor razn a 37 C. En los 70 Singer y Nicholson se basaron en el experimento de Frye y Edwin para postular el modelo de mosaico fluido. Con linfocitos y Ac contra una protena de membrana unido a un fluorocromo, se incub y al tiempo cero se vi que la protena estaba localizada en forma localizada, y a los 30 minutos se observ una redistribucin de la marca. Si bien inicialmente se ubicaba en un polo de la clula; cuando se mira con otros marcadores, puede determinarse la polaridad de stos. Las clulas, pese a ser libres, tiene una distribucin de sus componentes de superficie no equivalentes en su longitud, porque de alguna forma fueron destinados para producir la endocitosis y la degradacin de los componentes. En el caso de componentes como el glicoclix, formado por azcares unidos covalentemente unidos a protenas y lpidos, no debe perderse de vista su procedencia; la glicosilacin de protenas y
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lpidos de membrana ocurre en el Golgi. En el caso de las protenas empieza en retculo y se modifica en Golgi, en tanto en el caso de los lpidos se inicia en el Golgi; despus, con seales apropiadas, y por un proceso de secrecin constitutiva (recambio de componentes de membrana) cambian en forma particular el componente degradado y se ubica as en la superficie extracelular. Es un proceso complejo. Como sealamos las protenas inician su modificacin en retculo, y una vez que se sintetiza el pptido se le agregan oligosacridos caracterizados por tener 2 grupos de N-acetilglucosaminas, 9 manosas y 3 glucosas, que corresponden a los precursores de los oligosacridos de las glicoprotenas.
Algunos grupos se procesan en retculo y otros en Golgi. En un ejemplo se muestra un residuo de asparragina que es glicosilado y el resto corresponde a los azcares ya mencionados. En el Golgi la protena sigue su procesamiento, por lo que en los distintos compartimientos deben haber enzimas que agreguen, saquen y transfieran azcares: glicosidasas y transferasas. El trmino de la glicosilacin ocurre a este nivel. Pueden originarse 3 tipos de producto, 3 grandes grupos de azcares: un tipo rico en manosas (6 tipos de manosa), otro que pierde manosa y se agregan otros azcares en Golgi (Nacetilglucosamina, galactosa en posicin subterminal y cido silico (NANA) en posicin terminal. A partir de estas enzimas pueden generarse 3 tipos diferentes de azcares: rico en manosa, hbrido (contiene menos manosa que el rico en manosa pero ms que el que las ha sustituido totalmente por otros 2 oligosacridos agragados en el Golgi), y un tipo complejo. Cuando hay mutaciones gnicas en clulas de Sacaromycces cerevisiae que carecen de la enzima GlcNac no puede agregar galactosa y cido silico, y por ende las glicoprotenas no son funcionales pese a tener una destinacin correcta. Mediante tcnicas metodolgicas se ha podido estudiar los azcares y su participacin en el metabolismo. Debe definirse previamente la molcula a identificar. Por ejemplo, en el caso del cido silico, que tiene cargas negativas, se ocupan diversas tcnicas, que identifican las caractersticas aninicas del cido silico, o bien permiten reconocer el residuo de cido silico como tal. En este caso est en juego el grado de especificidad. Por ejemplo, empleando rojo rutenio, colorante de baja especificidad que permite teir la superficie celular, se hace un control negativo tratando con enzimas otros tejidos para determinar cunto disminuye y cunto aporta el grupo COOH a identificar los sitios aninicos. Para la identificacin de residuos completos, por ejemplo de cido silico, se emplean unas protenas que antiguamente se pensaba que slo estaban en vegetales, pero que hoy se conoce su participacin en animales tambin, las lectinas. stas se caracterizan por tener un sitio de unin especficos para ciertos residuos, por ejemplo algunas lectinas como la LPA slo reconocen cido silico; la WGA (aglutinina de germen de trigo) reconoce N-acetilglucosamina y tambin cido silico, pero la constante de afinidad favorece el reconocimiento de cido silico. Otra lectina, la concanavalina A (Con A), que induce la proliferacin celular, reconoce residuos de manosa, fucosa y glucosa. Pero los azcares de superficie no tienen glucosa, pues se encuentra en retculo. Entonces no habr problema en la identificacin de los residuos glucosa. Debe discriminarse entre fucosa y manosa, para lo que se usa manosidasa o fucosidasa que la extraigan para as determinar cual es el residuo que est siendo reconocido. Estas tcnicas se complementan con el control de unin de tratamiento con enzima. Luego se emplean anticuerpos para determinar un tipo o grupo de azcares, con un nivel mayor de especificidad. Por ejemplo con anticuerpos policlonales se reconocen por ejemplo otros epitopos. Todos estos sistemas de reconocimiento, con excepcin del rojo rutenio que da un color electrondenso a la microscopa electrnica, son protenas, por lo que no pueden ser observadas directamente al microscopio, y requieren entonces de un marcador, que pueden ser enzimas (unidas covalentemente a lectina o anticuerpo) como la peroxidasa y las fosfatasas, o bien marcadores particulados, como la ferritina (protena que tiene un sitio o ncleo con una alta cantidad de Fe+3
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electrondenso al haz de electrones), la hemocianina (de tamao muy grande, presenta problemas de identificacin), y la ms empleada actualmente que es el oro coloidal. ste permite una mejor resolucin y pueden fabricarse diferentes tamaos de partculas desde 5 nm hacia arriba, lo que permite hacer colocalizacin de ms de una molcula de azcar o eptopo de una protena, en forma simultnea.
Hace 20 aos se usaba ferritina principalmente, ahora se emplea ms oro coloidal. En un podocito de glomrulo renal se hizo identificacin utilizando una lectina unida a enzima, lo que se hace despus que la lectina se ha unido, es incubar con un sustrato que sea electrondenso, adems insoluble para que no sea extrable con los lavados. Dependiendo del tiempo de incubacin (si tengo una enzima activa y con suficiente cantidad de sustrato), tanto sustrato se convierte a producto como sustrato exista. Si se desea hacer una localizacin exacta y no se sabe cunto de lo que se est identificando hay, se parte con una determinacin de este tipo; si bien no es cuantitativa dar por el manejo experimental hecho o por lo grosera de la reaccin, en caso de dar negativa la reaccin, se comprueba que no existe la molcula que se busca. Dando diferentes tiempos de incubacin, si se obtiene una cantidad de precipitado, se seala que hay una cantidad determinada. Para hacer ms cuantitativo el anlisis, si los mismos podocitos estudiados con la misma lectina, unida a ferritina, se ven unos pequeos grnulos correspondientes a la lectina unida al residuo, en este caso a cido silico, al extraer las glicoprotenas de membrana por fraccionamiento subcelular, se obtiene una nica protena rica en silico. Existe una patologa en que cuando hay alteraciones de la glicosilacin no se produce transformacin proteica en los podocitos y da alteraciones a nivel proteico. Es importante tener la visin de una misma estructura observada con 2 metodologas diferentes para discernir cul conviene ms emplear y la cantidad de sustrato a utilizar. En otro caso, en endotelio se observan partculas de oro que se depositan sobre la superficie, que se endocitan, hay reaccin. Este caso muestra una albmina glicosilada de diabtico. Cuando se identifica en estas tcnicas de estudio de ligandos a nivel de membrana y superficie, se necesita una molcula que reconozca al ligando y un marcador, que puede ser particulada o difusa, y controles. En una reaccin de verificacin de azcares se puede usar enzimas (control ms especfico), y uso de inhibidores competitivos. Se incuba en este caso las lectinas con haptenos, azcares similares a las estudiadas y modificadas qumicamente para tener mayor afinidad por la lectina, el hapteno se une a lectina en incubacin previa de 30 minutos. Luego la clula es incubada con las lectinas y luego se desarrolla la reaccin, debiendo en teora haber escasa o nula marca. Existen problemas de cncer asociados a glicosilacin, que pueden ser pesquisados por seguimiento de enzimas y glicoprotenas para determinar cul producto est aumentado o disminuido. Debe tenerse cuidado con el anlisis de estas molculas. Existen, como en todo tipo de estudio, limitantes, que al igual que las ventajas que tenga, deben ser conocidas, pues ellas pueden incidir en resultados negativos o en falsos positivos. Hay limitaciones en la identificacin, en la localizacin y la cuantificacin. 1. Identificacin: uniones altamente especficas, no encontrar marcador si existe endocitosis o difusin del componente en estudio (se sugiere para evitar esto bajar las temperaturas, el movimiento de membranas haciendo la incubacin a 4 C), cambios de exposicin del receptor (enmascaramiento). 2. Localizacin: adems de los anteriores problemas, existencia de movimiento inducido, activo de la molcula en identificacin, movimiento pasivo, uso de marcadores no particulados en la
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localizacin (la distribucin pudiera ser homognea en toda la superficie o bien en parches, o localizada puntualmente en un dominio de la membrana); es importante definir el tipo de marcador a utilizar.
3. Cuantificacin: a los anteriores se suman la afinidad y avidez (interaccin apropiada del ligando con el marcador) de unin, la razn entre ligando y marcador (estequiometra de los elementos que participan), tamao de la molcula ligando, del marcador, del nmero de valencia del ligando (ms de un sitio de unin), la exposicin de los sitios de unin, pptidos y azcares.
El ideal es que una glicoprotena en superficie tenga expuestos todos sus sitios con residuos azcares y pptidos. Por ejemplo la identificacin de cido silico, todos los sitios estn expuestos, pero teniendo un ligando muy grande que ocupa el sitio de un residuo vecino, pudiera impedir ver ambos como entidades separadas, no estando disponibles estas azcares para la unin ligando-receptor. Un problema de discriminacin de vecindad se presenta frecuentemente con el uso de concanavalina A que tiene 4 sitios de reaccin. Otra posibilidad es que haya reaccin en una zona de convergencia lo que impide tambin el reconocimiento de residuos diferentes. Lo mismo cuando se usan partculas o molculas grandes como la hemocianina, que no permiten saber a cuntos residuos se unen. Pueden haber reordenamientos inducidos por ligando, de tipo activo o pasivo. En caso de contabilizarse las partculas no se puede discriminar cunto realmente est marcndose. Pudiera haber incluso enmascaramiento de partculas, que altera claramente los resultados.
No puse los ejemplos que dio en clase de los acinos glandulares, porque lo esencial de la materia ya fue expuesto. Adolfo Ros-Alcorta
2002. Alumnos de la Mencin Morfofisiopatologa y Citodiagnstico. Escuela de Tecnologa Mdica. Facultad de Medicina. Universidad de Chile. Prohibida su reproduccin total o parcial, y su publicacin con fines acadmicos sin mencin a los autores. Su utilizacin debe ser solicitada expresamente a los autores
En tejidos como los epitelios, las clulas que los componen es posible que a travs de molculas
expresadas en la superficie celular, puedan reconocer otras molculas que forman parte de la matriz extracelular; es importante entonces recordar la organizacin de sta para comprender el modo de trabajo en microscopa electrnica. La superficie celular (cualquiera sea el tipo de clula de entre todas las que nos constituyen), incluso en tejidos constituidos por un mismo tipo celular; este es el caso del hgado, que a microscopa ptica nos parece similar. Sin embargo, los anlisis bioqumicos y ultraestructurales demuestran que hay una gradiente de composicin caracterstica dentro del lobulillo heptico. Adems, la composicin y funcin cambia entre cada hepatocito. Las superficies del hepatocito tienen diferentes receptores, azcares y otros componentes, que lo hacen ser particular. Si bien podemos observar clulas que parecen equivalentes en forma y funcin, cuando indagamos en forma ms profunda comprobamos que no es as. Esto es fundamental tenerlo presente para los propsitos de investigacin, pues incluso en cultivos celulares ninguna clula es igual a otra, pese a que tengan un mismo patrn. Adicionalmente, debe considerarse el nivel de complejidad existente, relacionado con la diversidad de tipos de molcula de membrana, o de los dominios. Por ejemplo, una clula plasmtica no equivale a una clula epitelial, pues esta ltima se relaciona con clulas vecinas, un lumen y una matriz extracelular, mostrando una complejidad diferencial en su superficie dependiendo de las relaciones establecidas. La membrana plasmtica se observar como una estructura de 2 zonas densas separadas por una zona clara formando una unidad de membrana (segn Robertson). Sin embargo, al comparar las unidades de membrana de diferentes clulas observadas al microscopio electrnico de transmisin, no es posible sealar que sus funciones y composicin son equivalentes. Ms an cuando se estudian procesos de transporte, se esquematizan procesos como el transporte, los dibujos muestran un grado de confusin, pues da una visin simplista de la funcin de las molculas. El caso tpico es el de los canales de potasio, que en modelos 3D, con sus diferentes dominios, estn formados por 2 subunidades que en parte miran al extra y al intracelular, y que son complejas. El modelo de membrana de mosaico fluido de Robertson, planteado en 1962 y que sigue emplendose hasta hoy, ha tenido pocas modificaciones. Este modelo propone que las membranas estn formadas por una bicapa altamente fluida y lquida a la temperatura fisiolgica de los organismos, y que las protenas se insertaban en toda ella, hacia un lado u otro de la bicapa, y que la bicapa era mvil, con cierto grado de libertad de movimiento de lpidos transversalmente en el plano de la membrana. Por 40 aos se ha trabajado con este modelo. Haba bicapas ms ricas en c. grasos saturados, insaturados, y dependiendo del punto de fusin de stos iba a estar en estado ms o menos lquido, pero se supona que las membranas tenan un mismo grado de fluidez en ambos lados. Por otra parte, se pensaba que una misma molcula (fosfolpidos) tena 2 centros diferenciales: las colas hidrofbicas de cidos grasos, y un extremo amino alcohol. Una membrana puede tener una cantidad de fosfolpidos no equivalente a la otra. En M.E. puede observarse esta unidad de membrana de bolsa equivalente, pero no mirndola como si tuviese los mismos constituyentes. A qu nos lleva esto? Dependiendo de las alternativas de tener un mismo tipo de cido graso pero con diferente rotacin y que cambie solamente el amino alcohol, tendremos un enorme nmero de posibilidades de fosfolpidos diferentes que dan asimetra a la membrana, ubicndose algunos hacia la cara extracelular y otros hacia el citosol. Aquellos fosfolpidos de la cara extracelular no podrn estar hacia el citosol, y viceversa, salvo que medien procesos como la
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apoptosis, que tendrn un flip-flop de algunos de ellos, que puede usarse como marcador de dao celular temprano.
En la ltima dcada ha surgido nueva informacin que aporta elementos nuevos de conocimiento sobre las membranas. Las membranas no solamente son una interfase formada por fosfolpidos y otros lpidos como el colesterol, libremente desplazables, sino adems existen unidades con composicin diferencial respecto de las dems, que estn constituidas por esfingolpidos y colesterol en altas concentraciones, presentes en la cara exoplsmica de la bicapa. Estos sectores denominados dominios raft o balsa , se caracterizan por ser resistentes a la solubilizacin en detergente, mostrando un cambio en el concepto del modelo clsico de mosaico fluido de membrana, en que todos los componentes eran solubles en detergentes inicos y no inicos, y que a 4 C hay una baja densidad de flotacin en una gradiente de sacarosa. Operacionalmente, desde el punto de vista fsico, la membrana dej de ser una entidad contnua, concepcin inicial, hasta hace unos 5 aos atrs. Los esfingolpidos ms participativos son los ganglisidos (sustituidos por monosacridos o subunidades mayores) y cerebrsidos. Existen familias de ganglisidos, que aportan a los dominios diversidad y especificidad de funcin para cada membrana que tenga este tipo de molculas. Tambin debemos considerar el colesterol, especfico de todas las membranas, pero concentrado en la monocapa externa de los dominios raft. Una clula, tiene una difusin alternada entre los dominios Raft y no Raft, sin separacin fsica. Al microscopio electrnico se ven iguales, slo si esos dominios Raft, adems de su composicin lipdica forman cavolas, se puede discriminar morfolgicamente entre dominios Raft y postcavola; y la cavola tendr la composicin de lpidos Raft y protenas como caveolinas, que le permiten quebrarse e invaginarse. Es decir, requerir la presencia de una maquinaria mecnica que le haga perder su continuidad e invaginarse. Estos dominios no se forman en la propia membrana, sino que se forman en Golgi. Es la ltima cisterna del trans Golgi que destina vesculas, sea de composicin Raft o no, pues la destinacin viene del intracelular. En la hoja exoplsmica hay protenas unidas por tallos de lpidos GPI (glicosil fosfatidil inositol), asociados a transporte, transcitosis, adems se han estudiado en su relacin con la transduccin de seales. Los dominios Raft al verlos en 2 tipos de clulas epiteliales, como el epitelio intestinal y en hepatocitos veremos lo siguiente: en hepatocitos estn discretamente distribuidos en forman ms o menos homognea en todas su superficies (canalicular, sinusoidal, intermembrana). Cada una de sus caras forma interacciones diferentes. En el caso del intestino, existe una superficie luminal, una basolateral, y una cara que da hacia la matriz extracelular. Las clulas se contactan entre ellas por interacciones o uniones estrechas, por el lado basal interacta a travs de receptores de adhesin con componentes de la matriz extracelular. Comparando la distribucin con los dominios de estas clulas, los dominios Raft estn distribuidos mayoritariamente en la superficie apical. Cada tipo celular tendr una distribucin asimtrica, pero no en el plano de la bicapa, sino en el de los dominios de membrana (apical y basolateral); esto no solo es vlido para lpidos, sino tambin para protenas. En la membrana hay protenas integrales de membrana, de transmembrana que atraviesan una o varias veces sta, protenas asociadas con cidos grasos, perifricas asociadas a protenas integrales. Cmo se distribuyen las protenas dentro de una clula con un gradiente de polaridad, como las que forman epitelios (presentan un dominio apical, uno basal y uno lateral, generalmente la regin apical mirando hacia un lumen y la basal hacia la matriz extracelular). Cmo se distribuyen las protenas en una misma superficie? En una clula epitelial, un nutriente como la glucosa no ingresa si no est acoplada funcionalmente a 4 tipos de receptores o canales; por ejemplo ingresa por la cara luminal a travs de un transportador de tipo bomba sodio potasio ATPasa, otro que corresponde a un canal de potasio; para que la glucosa llegue a la sangre deben funcionar 4 tipos de protenas que medien el transporte de la glucosa, ubicadas en diferentes dominios. El citoplasma servir de reservorio, que dependiendo de la concentracin de glucosa o sodio activar otras molculas para que el proceso ocurra. Hay un acoplamiento qumico funcional y un dominio separado fsicamente por barreras de tipo uniones estrechas que impiden la deslocalizacin de
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los componentes proteicos sea de la cara basal o la apical. Es importante al identificar molculas a nivel de superficie, saber que an sin conocer la ubicacin de estos sistemas, debe mantenerse la integridad fsica que impida el reordenamiento de componentes de una superficie a otra.
Por ejemplo al desconocer la ubicacin de un transportador, se disocian las clulas para hacer un cultivo de clulas primarias, es probable que se distribuya en toda la clula; por ende, es fundamental mantener las uniones estrechas entre las clulas, para dar as polaridad de dominios que permitan identificar mejor la ubicacin del transportador en estudio, en caso de no poder hacer la identificacin en tejido. Existen anticuerpos que no pueden ser utilizados en tejido ni en material fijado incluido posteriormente en resinas. Entonces debe hacerse la inmunodeteccin en tejido sin fijar, permeabilizando los extendidos, porque sera necesario tener los dominios mirando hacia el extracelular. Es muy importante entonces tener presente que las molculas deben ubicarse en el extracelular, adoptar precauciones, y tener claro la ubicacin del epitelio. Las cavolas, analizadas en la dcada del 50 por Palade, han sido retomadas para el estudio. Se defina antes como una unidad invaginada de membrana plasmtica de 50 a 100 nm; Disanti, en la actualidad, agrega que adems de invaginaciones pueden haber estructuraciones en vesculas, estructuras aplanadas, racimos; todas estas formas pueden ser momentos o estados de la invaginacin. Estas invaginaciones tienen distribucin diferencial en las diferentes superficies celulares. Cuando se da un tratamiento a las clulas para extraer las bicapas y dejar el componente proteico, se observan ovillos que son diferentes entre s. Todas estas protenas forman cubiertas a estas estructuras. Existen isoformas de una protena denominada caveolina, que forman una cubierta a la cavola, y podran ayudar a explicar las diferencias en las formas de stas. Cuando la cavola adopta una forma hexagonal o pentagonal, su cubierta est formada por clatrina. Dependiendo del tipo celular las cavolas pueden ser transitorias y cumplir funciones de endocitosis y fusionarse con la membrana plasmtica basal celular y transitar compuestos a travs de la clula. En un corte de MET de un capilar sanguneo, cuya principal funcin es la de transporte, en que se ven clulas endoteliales cortadas a diferente plano, se ven una serie de vesculas hacia basal. A mayor aumento, las vesculas corresponden a cavolas (segn Disanti seran con forma de racimo, interconectadas, y que llegaran a la superficie basal), se ven vesculas abiertas que han vaciado su contenido a la matriz extracelular, otras prontas a fusionarse, surge la pregunta: si realmente en estos sistemas, y dada la alta eficiencia operativa del transporte en los vasos sanguneos, es necesario esto? En otros tejidos como el intestino, rin, hepatocito u otras clulas, esta organizacin no se encuentra. Entonces la organizacin es particular del tipo celular estudiado. No esperaremos que las cavolas de un tipo celular se presenten de la misma forma en otro tipo. Se ha postulado un modelo contnuo que conecta el extra e intracelular a travs de este racimo de estructuras que van a fusionarse con el intracelular; otro punto que no puede desconocerse al hacer estudio de membranas es el movimiento de protenas y lpidos en la membrana celular. La temperatura del organismo est sobre el punto de fusin de los cidos grasos; con mayor razn a 37 C. En los 70 Singer y Nicholson se basaron en el experimento de Frye y Edwin para postular el modelo de mosaico fluido. Con linfocitos y Ac contra una protena de membrana unido a un fluorocromo, se incub y al tiempo cero se vi que la protena estaba localizada en forma localizada, y a los 30 minutos se observ una redistribucin de la marca. Si bien inicialmente se ubicaba en un polo de la clula; cuando se mira con otros marcadores, puede determinarse la polaridad de stos. Las clulas, pese a ser libres, tiene una distribucin de sus componentes de superficie no equivalentes en su longitud, porque de alguna forma fueron destinados para producir la endocitosis y la degradacin de los componentes. En el caso de componentes como el glicoclix, formado por azcares unidos covalentemente unidos a protenas y lpidos, no debe perderse de vista su procedencia; la glicosilacin de protenas y
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lpidos de membrana ocurre en el Golgi. En el caso de las protenas empieza en retculo y se modifica en Golgi, en tanto en el caso de los lpidos se inicia en el Golgi; despus, con seales apropiadas, y por un proceso de secrecin constitutiva (recambio de componentes de membrana) cambian en forma particular el componente degradado y se ubica as en la superficie extracelular. Es un proceso complejo. Como sealamos las protenas inician su modificacin en retculo, y una vez que se sintetiza el pptido se le agregan oligosacridos caracterizados por tener 2 grupos de N-acetilglucosaminas, 9 manosas y 3 glucosas, que corresponden a los precursores de los oligosacridos de las glicoprotenas.
Algunos grupos se procesan en retculo y otros en Golgi. En un ejemplo se muestra un residuo de asparragina que es glicosilado y el resto corresponde a los azcares ya mencionados. En el Golgi la protena sigue su procesamiento, por lo que en los distintos compartimientos deben haber enzimas que agreguen, saquen y transfieran azcares: glicosidasas y transferasas. El trmino de la glicosilacin ocurre a este nivel. Pueden originarse 3 tipos de producto, 3 grandes grupos de azcares: un tipo rico en manosas (6 tipos de manosa), otro que pierde manosa y se agregan otros azcares en Golgi (Nacetilglucosamina, galactosa en posicin subterminal y cido silico (NANA) en posicin terminal. A partir de estas enzimas pueden generarse 3 tipos diferentes de azcares: rico en manosa, hbrido (contiene menos manosa que el rico en manosa pero ms que el que las ha sustituido totalmente por otros 2 oligosacridos agragados en el Golgi), y un tipo complejo. Cuando hay mutaciones gnicas en clulas de Sacaromycces cerevisiae que carecen de la enzima GlcNac no puede agregar galactosa y cido silico, y por ende las glicoprotenas no son funcionales pese a tener una destinacin correcta. Mediante tcnicas metodolgicas se ha podido estudiar los azcares y su participacin en el metabolismo. Debe definirse previamente la molcula a identificar. Por ejemplo, en el caso del cido silico, que tiene cargas negativas, se ocupan diversas tcnicas, que identifican las caractersticas aninicas del cido silico, o bien permiten reconocer el residuo de cido silico como tal. En este caso est en juego el grado de especificidad. Por ejemplo, empleando rojo rutenio, colorante de baja especificidad que permite teir la superficie celular, se hace un control negativo tratando con enzimas otros tejidos para determinar cunto disminuye y cunto aporta el grupo COOH a identificar los sitios aninicos. Para la identificacin de residuos completos, por ejemplo de cido silico, se emplean unas protenas que antiguamente se pensaba que slo estaban en vegetales, pero que hoy se conoce su participacin en animales tambin, las lectinas. stas se caracterizan por tener un sitio de unin especficos para ciertos residuos, por ejemplo algunas lectinas como la LPA slo reconocen cido silico; la WGA (aglutinina de germen de trigo) reconoce N-acetilglucosamina y tambin cido silico, pero la constante de afinidad favorece el reconocimiento de cido silico. Otra lectina, la concanavalina A (Con A), que induce la proliferacin celular, reconoce residuos de manosa, fucosa y glucosa. Pero los azcares de superficie no tienen glucosa, pues se encuentra en retculo. Entonces no habr problema en la identificacin de los residuos glucosa. Debe discriminarse entre fucosa y manosa, para lo que se usa manosidasa o fucosidasa que la extraigan para as determinar cual es el residuo que est siendo reconocido. Estas tcnicas se complementan con el control de unin de tratamiento con enzima. Luego se emplean anticuerpos para determinar un tipo o grupo de azcares, con un nivel mayor de especificidad. Por ejemplo con anticuerpos policlonales se reconocen por ejemplo otros epitopos. Todos estos sistemas de reconocimiento, con excepcin del rojo rutenio que da un color electrondenso a la microscopa electrnica, son protenas, por lo que no pueden ser observadas directamente al microscopio, y requieren entonces de un marcador, que pueden ser enzimas (unidas covalentemente a lectina o anticuerpo) como la peroxidasa y las fosfatasas, o bien marcadores particulados, como la ferritina (protena que tiene un sitio o ncleo con una alta cantidad de Fe+3
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electrondenso al haz de electrones), la hemocianina (de tamao muy grande, presenta problemas de identificacin), y la ms empleada actualmente que es el oro coloidal. ste permite una mejor resolucin y pueden fabricarse diferentes tamaos de partculas desde 5 nm hacia arriba, lo que permite hacer colocalizacin de ms de una molcula de azcar o eptopo de una protena, en forma simultnea.
Hace 20 aos se usaba ferritina principalmente, ahora se emplea ms oro coloidal. En un podocito de glomrulo renal se hizo identificacin utilizando una lectina unida a enzima, lo que se hace despus que la lectina se ha unido, es incubar con un sustrato que sea electrondenso, adems insoluble para que no sea extrable con los lavados. Dependiendo del tiempo de incubacin (si tengo una enzima activa y con suficiente cantidad de sustrato), tanto sustrato se convierte a producto como sustrato exista. Si se desea hacer una localizacin exacta y no se sabe cunto de lo que se est identificando hay, se parte con una determinacin de este tipo; si bien no es cuantitativa dar por el manejo experimental hecho o por lo grosera de la reaccin, en caso de dar negativa la reaccin, se comprueba que no existe la molcula que se busca. Dando diferentes tiempos de incubacin, si se obtiene una cantidad de precipitado, se seala que hay una cantidad determinada. Para hacer ms cuantitativo el anlisis, si los mismos podocitos estudiados con la misma lectina, unida a ferritina, se ven unos pequeos grnulos correspondientes a la lectina unida al residuo, en este caso a cido silico, al extraer las glicoprotenas de membrana por fraccionamiento subcelular, se obtiene una nica protena rica en silico. Existe una patologa en que cuando hay alteraciones de la glicosilacin no se produce transformacin proteica en los podocitos y da alteraciones a nivel proteico. Es importante tener la visin de una misma estructura observada con 2 metodologas diferentes para discernir cul conviene ms emplear y la cantidad de sustrato a utilizar. En otro caso, en endotelio se observan partculas de oro que se depositan sobre la superficie, que se endocitan, hay reaccin. Este caso muestra una albmina glicosilada de diabtico. Cuando se identifica en estas tcnicas de estudio de ligandos a nivel de membrana y superficie, se necesita una molcula que reconozca al ligando y un marcador, que puede ser particulada o difusa, y controles. En una reaccin de verificacin de azcares se puede usar enzimas (control ms especfico), y uso de inhibidores competitivos. Se incuba en este caso las lectinas con haptenos, azcares similares a las estudiadas y modificadas qumicamente para tener mayor afinidad por la lectina, el hapteno se une a lectina en incubacin previa de 30 minutos. Luego la clula es incubada con las lectinas y luego se desarrolla la reaccin, debiendo en teora haber escasa o nula marca. Existen problemas de cncer asociados a glicosilacin, que pueden ser pesquisados por seguimiento de enzimas y glicoprotenas para determinar cul producto est aumentado o disminuido. Debe tenerse cuidado con el anlisis de estas molculas. Existen, como en todo tipo de estudio, limitantes, que al igual que las ventajas que tenga, deben ser conocidas, pues ellas pueden incidir en resultados negativos o en falsos positivos. Hay limitaciones en la identificacin, en la localizacin y la cuantificacin. 1. Identificacin: Uniones altamente especficas, no encontrar marcador si existe endocitosis o difusin del componente en estudio (se sugiere para evitar esto bajar las temperaturas, el movimiento de membranas haciendo la incubacin a 4 C), cambios de exposicin del receptor (enmascaramiento).
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2. Localizacin: Adems de los anteriores problemas, existencia de movimiento la molcula en identificacin, movimiento pasivo, uso de marcadores no localizacin (la distribucin pudiera ser homognea en toda la superficie o localizada puntualmente en un dominio de la membrana); es importante marcador a utilizar.
3. Cuantificacin: A los anteriores se suman la afinidad y avidez (interaccin apropiada del ligando con el marcador) de unin, la razn entre ligando y marcador (estequiometra de los elementos que participan), tamao de la molcula ligando, del marcador, del nmero de valencia del ligando (ms de un sitio de unin), la exposicin de los sitios de unin, pptidos y azcares.
El ideal es que una glicoprotena en superficie tenga expuestos todos sus sitios con residuos azcares y pptidos. Por ejemplo la identificacin de cido silico, todos los sitios estn expuestos, pero teniendo un ligando muy grande que ocupa el sitio de un residuo vecino, pudiera impedir ver ambos como entidades separadas, no estando disponibles estas azcares para la unin ligando-receptor. Un problema de discriminacin de vecindad se presenta frecuentemente con el uso de concanavalina A que tiene 4 sitios de reaccin. Otra posibilidad es que haya reaccin en una zona de convergencia lo que impide tambin el reconocimiento de residuos diferentes. Lo mismo cuando se usan partculas o molculas grandes como la hemocianina, que no permiten saber a cuntos residuos se unen. Pueden haber reordenamientos inducidos por ligando, de tipo activo o pasivo. En caso de contabilizarse las partculas no se puede discriminar cunto realmente est marcndose. Pudiera haber incluso enmascaramiento de partculas, que altera claramente los resultados.
Adolfo Ros-Alcorta
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