Gentica microbiana III

6.1 Transferencia de la informacin gentica en procariotes y eucariotes. El genoma bacteriano. Plsmidos y funciones que codifican. Transposones. 6.2 Transferencia horizontal de genes entre los microorganismos, elementos mviles involucrados y su implicacin. 6.3 Mutagnesis y sistemas de reparacin. Regulacin de la expresin gentica. Operones en bacterias. 6.4 Aspectos genticos de la resistencia microbiana a metales pesados, antibiticos y otras sustancias txicas. 6.5 Modificacin gentica de los microorganismos. Implicaciones ticas.

Replicacin de un plsmido
En los sistemas bacterianos, el DNA intecelular est organizado en unidades de replicacin (cromosomas, episomas) denominados como replicones. La duplicacin de los replicones ocurre en tres etapas: 1. Iniciacin, en el cual se reconoce el punto de inicio de replicacin y un replisoma multicomponente se organiza (protenas-DNA). Elongacin, caracterizada por la progresin de la horquilla de replicacin y Terminacin, en el cual la horquilla de replicacin es desetabilizada y se generan dos hebras hijas completas.

2. 3.

La replicacin se regula en la iniciacin que ocurre en un sitio especfico denominado como origen de replicacin de DNA (ori). La iniciacin es un proceso complejo que forma la horquilla de replicacin y consiste (de acuerdo a diversas evidencias) en el reconocimiento del ori por varias protenas iniciadoras de replicacin (Rep) que se unen a secuencias de DNA repetidas llamadas iterones.

Microbial Physiology. Albert G. Moat, John W. Foster and Michael P. Spector Copyright 2002 by Wiley-Liss, Inc. ISBN: 0-471-39483-1 BACTERIAL GENETICS

Estructura del iteron containing plasmids (ICP)

1. Las protenas Rep reconocen el origen de replicacin (ori) E inducen un cambio conformacional en el plsmido

3. Unin de la helicasa y primasa, desenrrollando el DNA y sintetizando sRNA (primers para la replicacin)

2. Las protenas Rep favorecen la separacin del DNA en la regin rica en A+T (en presencia o no de protenas IHF/Hu, DnaA

4. Sntesis de DNA por DNA polimerasa.

Tomado de : Plasmid Biology Edited by Barbara E. Funnel and Gregory J. Phillips 2004. ASM Press.

Replicacin de un plsmido
Tres mecanismos generales propuestos: 1. 2. 3. Tipo theta (): Crculo rodante Desplazamiento de hebra

Figure 7-2Plasmid DNA replication

The parental strands are shown in blue, and newly synthesized daughter strands are shown in red. The short segments represent the AT and GC base pairs connecting the complementary strands. Once DNA replication is initiated at the origin (ORI), it continues in both directions around the circular molecule until the advancing growing forks merge and two daughter molecules are produced. The origin is the only specific nucleotide sequence required for replication of the entire circular DNA molecule. From: Section 7.1, DNA Cloning with Plasmid Vectors http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK21498/figure/A1587/?report=objectonly

Replicacin de un plsmido
Crculo rodante (RC)

Tomado de : Plasmid Biology Edited by Barbara E. Funnel and Gregory J. Phillips 2004. ASM Press. Animacin http://highered.mcgraw-hill.com/sites/0072556781/student_view0/chapter13/animation_quiz_6.html

Transferencia horizontal de genes: recombinacin gentica (RG)

La RG es la produccin de nuevas combinaciones de genes (recombinantes) derivados de dos clulas parentales. Procesos en procariontes: conjugacin, transformacin y transduccin La conjugacin requiere del contacto fsico entre dos organismos con caractersticas distintas, resultando en la transferencia de DNA de una cepa (donadora) a otra (receptora) Transformacin: Transferencia del DNA libre

Transduccin: Proceso mediado por fagos

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Thomas C and Nielsen K. 2005. Mechanisms of and barriers to horizontal gene transfers betwwen bacteria. Nature Reviews Microbiology. 2005. Vol 3: 711-721

Conjugacin
Proceso especializado relacionado con la adqusicin de plsmidos.
Proceso mediado por la unin clula-clula y la formacin de un poro a travs del cual el DNA pasa de una clula a otra .

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Formacin del pili: De los 25 genes de transferencia, 14 estn involucrados en su formacin (traA, -L,-E,-K,-B,-V ,-W,-C,-U,-F,-H,-G, Q, X). TraA : protena subunidad de F-pilina Resto: involucrados en su ensamblado. Unin con clula receptora: El extremo del pili (TraN y TraG) se une de forma estable con OmpA (porina) de la clula receptora. TraD froma un poro y esto genera una unin citoplasmtica entre ambas clulas. Cada clula posee de 1 a 3 pilis

Formacin del nick en oriT: Seal TraD TraM y a TraY (une a oriT). TraY y IHF (protena de unin a DNA) cambian la arquitectura de oriT y se une TraI (endonucleasa/helicasa) nick. Se ensambla el transferosoma o relaxosoma.

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Transferencia de DNA: En el nick el extremo 5 del DNA se une a TraI y se desplaza a a travs del poro (TraD) y la cadena se transfiere a la clula receptora por replicacin RC. Tra I desenrolla el plsmido (1000 bp/s), bombeando una hebra a la clula receptora. DNA pol III sintetiza una nueva hebra en la cepa donadora. Una vez que el DNA entra a la clula receptora, se replica despus de circularizarse.

Degradacin de pili. La clula receptora F+ y es capaz de transferir el plsmido F a otra clula F-.

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Transformacin
No todas las bacterias posee la capacidad de conjugacin, sin embargo han desarrollado otras estrategias de intercambiar material gentico. La transformacin no requiere de contacto clula-clula y fue demostrada por primera vez por Griffith en 1928 en sus investigaciones con Streptococcus pneumoniae:

No fue hasta 1948 cuando Avery y Macleod, demostraron que el DNA es el responsable de ste fenmeno.

Transformacin
Presente en muchas bacterias Haemophilus, Neisseria, Xanthomonas, Rhizobium, Bacillus, y Staphylococcus. Se requiere de un estado de competencia para poder ser transformada una bacteria: Estado fisiolgico que permite a una clula tomar DNA transformante y que puede ser genticamente modificad por l. Proceso en el cual intervienen de 20 a 50 protenas Se pueden establecer dos grupos basados en el desarrollo de el estado de competencia: Competencia transiente : fase exponencial tarda p.e. Streptococcus pneumoniae. Siempre competentes: Neisseria

 Capacidad detectada en Archeas, Bacterias Gram-positivas, cianobacterias, Thermus spp., Deinococcus spp., bacterias verdes sulfurosas, y muchas otras bacterias Gram-negativas. Patgenos de humanos: Campylobacter ,Haemophilus ,Helicobacter ,Neisseria, Pseudomonas, Staphylococcus y Streptococcus (naturalmente transformables) Prerequisistos: Liberacin y persistencia de DNA extracelular en el ambiente Desarrollo de competencia Capacidad del DNA traslocado de integrarse al genoma o recircularizarse en plsmidos

CSF Transformasoma o Translocasoma

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EndA ComD ComD

ComE ComE

HexA

CSP

CSP: Competence Stimulating Protein

Electrotransformacin
La electroporacin es un mtodo eficiente de transformar macromolculas como el DNA a bacterias y levaduras. Es un proceso en el que se aplican pulsos elctricos con voltaje elevados (2500 V) de duracin corta para crear orificios temporales (poros) en la membrana, con tamao suficiente para permitir la entrada de DNA.

Despus de la aplicacin del pulso elctrico y un perodo de recuperacin, los poros se cierran y el DNA es transcrito y replicado por la clula. Produce resultados equivalentes/superiores a la transformacin qumica.
Requiere de clulas electrocompetentes y DNA a transformar: plsmido, lineal.

http://mvz.berkeley.edu/egl/resources/manuals/Electroporator.pdf

Transduccin

Transferencia de marcadores genticos bacterianos (genes) de una clula a otra mediada por un bacteriofago. Transduccin generalizada: Transferencia del una porcin del del genoma de una clula donadora a una segunda clula (receptora) mediada por un fago. El DNA bacteriano transducido solamente posee DNA bacteriano y no DNA del fago. Fago P1 (E. coli) y P22 (Salmonella). Cotransduccin: Es la transferencoa simultnea de de dos o ms caractersticas (genes) durante el mismo evento de tranduccin, lo cual permite mapear genes cercanos en el cromosoma ya que son empacados en la misma cabeza del fago. Transduccin abortiva: El DNA de la clula donadora transferido a la clula receptora no es integrado a su genoma.

Transduccin especializada: Es mediada por un bacteriofago que se integra (lisogeniza) en un sitio especfico (att) de una cromosoma bacteriano lmita la trannsferencia de material gentico del hospedero a regiones en la vecindad de este sitio: El fago lambda ().

Transposones
Secuencias de DNA con la habilidad de moverse de un sitio a otro en el genoma de un organismo: codifican funciones que catalizan el movimiento (translocacin) del elemento transponible de un sitio en el DNA a otro sitio (blanco). En E. coli hay tres tipos de elementos transponibles Secuencias de insercin (IS): solo codifica los elementos requeridos para la transposicin (transposasa) flanqueda por secuencias repetidas inversas. La transposasa reconoce estas secuencias. Transposones, poseen material gentico adicional a la transposasa no asociado a la transpocisin (resistencia antibiticos)
a.

b.

Transposones clase I (Tn10): Dos secuencias de insercin flanquea una secuenia que codifica para alguna funcin. Transposones clase II (Tn3):

Bacteriofago Mu: un bacteriofago lisognico que emplea la transposicin en su ciclo de propagacin.

Microbial Physiology. Albert G. Moat, John W. Foster and Michael P. Spector Copyright 2002 by Wiley-Liss, Inc. ISBN: 0-471-39483-1 Chapter 3. BACTERIAL GENETICS: DNA EXCHANGE, RECOMBINATION,MUTAGENESIS, AND REPAIR

Transposones
Transposasa, enzima responsable del movimiento del transposn y codificada en el DNA del transposn y que resulta en un cambio de posicin en el genoma o en un genoma diferente (genoma genoma, plsmido genoma, plsmidoplsmido, genoma-plsmido). Dos tipos de transposicin: Replicativa: Involucra tanto la replicacin y recombinacin con una copia del elemento original en el sitio original y una nueva en otro sitio. Conservativa: No involucra conservacin.

Cuando ocurre la transposicin en un gene blanco mutaciones insercionales, delesiones , inversiones y formacin de cointegrantes en donde dos replicones (p.e plsmido) se une (fusin replicativa). Insercin aleatoria o en la misma posicin La secuencia blanco es duplicada y el transposn se ubica en medio de ambas secuencias

Replicacin (algunos): 1 copia en la posicin original y 1 copia en nueva posicin.

Microbial Physiology. Albert G. Moat, John W. Foster and Michael P. Spector Copyright 2002 by Wiley-Liss, Inc. ISBN: 0-471-39483-1 Chapter 3. BACTERIAL GENETICS: DNA EXCHANGE, RECOMBINATION,MUTAGENESIS, AND REPAIR