INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLGICAS

SEPARACIN Y EVALUACIN DEL EFECTO ANTIINFLAMATORIO Y ANTIOXIDANTE DE LOS FLAVONOIDES DE Eysenhardtia polystachya (Ort.) Sarg.

TESIS QUE PARA OBTENER EL GRADO DE

MAESTRO EN CIENCIAS QUIMICOBIOLGICAS

P R E S E N T A:

QFI. SAUDY SARET PABLO PREZ

Asesora: Dra. Mara Estela Melndez Camargo

Mxico, D.F. diciembre de 2011

l presente trabajo se realiz bajo la direccin y asesora de la Dra. Mara Estela Melndez Camargo, en los laboratorios de Farmacologa y Toxicologa Renal y Heptica,

Fitoqumica del departamento de Farmacia y en el laboratorio de Embriologa del departamento de Morfologa de la Escuela Nacional de Ciencias Biolgicas del Instituto Politcnico Nacional, como parte de los siguientes proyectos SIP: Evaluacin farmacolgica y toxicolgica de principios activos de origen vegetal o por sntesis de inters farmacutico III y Estudio fitoqumico, farmacolgico y toxicolgico de principios activos de origen vegetal o por sntesis de inters farmacutico, con claves 20100495 y 20110339 , respectivamente. Los resultados de este trabajo fueron presentados parcialmente en la modalidad de pster en la XV Reunin Nacional de Estudiantes de Farmacia y XIX Congreso de Educacin Qumica Farmacutica Biolgica celebrada en Gmez Palacio, Durango del 21 al 23 de octubre de 2010, y en el XX Congreso de Educacin Qumica Farmacutica Biolgica y XVI Reunin Nacional de Estudiantes de Farmacia realizada en el Distrito Federal, Mxico del 7 al 9 de septiembre de 2011. Tambin se presentaron en la modalidad de pster en el XLIV Congreso Nacional de Ciencias Farmacuticas celebrado en Ixtapa, Zihuatanejo del 23 al 26 de octubre de 2011.

AGRADECIMIENTOS
Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologa (CONACyT) por haberme brindado la oportunidad de contar con su apoyo en la realizacin de esta investigacin. Al Dr. Rafael Silva Torres por su confianza, por prestarme su espacio y por reconocer mi trabajo. A la M. en C. Hortensia Montellano Rosales por colaborar en la realizacin de este trabajo, por abrirme las puertas de su espacio, por su confianza, paciencia y atenciones. A mis sinodales por sus oportunas sugerencias para enriquecer este trabajo.

DEDICATORIAS
Principalmente a Jehov Dios, quien me ha cuidado y mantenido con vida hasta este da. Hoy, con el logro de este nuevo paso, quiero dedicar este trabajo, que ha significado un gran esfuerzo y sacrificio no solo de mi parte sino de muchas personas, a todos aquellos que de alguna u otra forma con su amor, apoyo y comprensin me alentaron a culminar esta etapa de mi vida, por lo que mantengo la promesa de seguir siempre adelante. A mi hija Andrea, por robarle mucho tiempo de cuidados y atenciones, por ser la fuente de mi inspiracin y motivacin para superarme cada da ms a fin de que la vida nos depare un mejor futuro. A mi madre por su amor, paciencia, esfuerzo y por su apoyo incondicional en todos los sentidos. A mi padre por tenerme en alta estima, por confiar en m. A mis hermanas Ingrid y Daniela por aguantar todos mis malos ratos, por apoyarme con Andrea, sin su ayuda realmente no hubiese podido culminar este eslabn profesional. A mi asesora la Dra. Mara Estela Melndez Camargo, que siempre ha confiado en mis ideas y trabajo. Pero sobre todo, porque ha puesto en m la mentalidad de que se puede ser cada vez mejor.

CONTENIDO GENERAL
Pgina LISTA DE ABREVIATURAS.I GLOSARIO DE TRMINOS.III RESUMEN..V ABSTRACTVI 1. INTRODUCCIN..........................................................................................................................1 2. ANTECEDENTES.........................................................................................................................3 2.1 Eysenhardtia polystachya (Ort.) Sarg.......................................................................................4 2.1.1 Descripcin....4 2.1.2 Nombres comunes..........................................................................................................5 2.1.3 Distribucin geogrfica...................................................................................................5 2.1.4 Usos tradicionales...........................................................................................................6 2.1.5 Composicin qumica......................................................................................................7 2.2 Flavonoides.........8 2.2.1 Distribucin.....................................................................................................................8 2.2.2 Estructura qumica.8 2.2.3 Clasificacin.9

2.2.4 Caractersticas fsicas.10 2.2.5 Efectos farmacolgicos......11 2.2.6 Metabolismo11 2.2.7 Toxicidad.12 2.2.8 Separacin y aislamiento12 2.3 Cuantificacin de compuestos fenlicos totales13 2.3.1 Tcnica de Folin-Cioalteu......14 2.4 Cuantificacin de flavonoides totales15 2.4.1 Tcnica de quelacin con AlCl3.....16 2.5 Mtodos para evaluar la actividad antioxidante.....17 2.5.1 Clasificacin de los ensayos..18 2.5.2 Mtodo del DPPH.....21 2.6 Inflamacin.....23 2.6.1 Signos clnicos locales de la inflamacin..........24 2.6.2 Respuestas sistmicas de la inflamacin....24 2.6.3 Componentes generales de la respuesta inflamatoria..25 2.6.4 Mecanismos de la inflamacin..25 2.6.5 Tipos de inflamacin de acuerdo con la persistencia del estmulo................................26

2.7 Papel de las especies reactivas en la inflamacin...31 2.8 Frmacos antiinflamatorios.....................................................................................................33 2.8.1 Antiinflamatorios no esteroideos.......33 2.9 Indometacina........................................................................................................................40 2.9.1 Caractersticas y mecanismo de accin......40 2.9.2 Farmacocintica y farmacodinamia...............................................................................41 2.9.3 Efectos adversos..........................................................................................................42 2.10 Modelos farmacolgicos preclnicos para evaluar la actividad antiinflamatoria..43 3. JUSTIFICACIN........................................................................................................................44 4. HIPTESIS...............................................................................................................................45 5. OBJETIVOS..............................................................................................................................45 5.1 Objetivo general....................................................................................................................45 5.2 Objetivos particulares...........................................................................................................45 6. METODOLOGA........................................................46 6.1 Recoleccin e identificacin de Eysenhardtia polystachya (Ort.) Sarg....46 6.2 Preparacin del extracto etanlico...................................46 6.3 Anlisis fitoqumico preliminar....46 6.4 Aislamiento de la fraccin rica en flavonoides...................................................................46

6.5 Cuantificacin de los fenoles totales...48 6.6 Cuantificacin de los flavonoides totales..49 6.7 Determinacin de la capacidad antioxidante in vitro..50 6.8 Evaluacin farmacolgica de la actividad antiinflamatoria..51 6.9 Evaluacin de la actividad ulcerogastroduodenal..........52 6.10 Anlisis estadstico.....................................52 7. RESULTADOS.......53 7.1 Recoleccin, identificacin y obtencin del extracto etanlico...53 7.2 Anlisis fitoqumico preliminar....53 7.3 Aislamiento de los flavonoides.54 7.4 Cuantificaciones de los extractos...55 7.5 Evaluacin farmacolgica de la actividad antiinflamatoria..57 7.6 Evaluacin de la actividad ulcerogastroduodenal..59 7.6.1 Macroscpica.59 7.6.2 Histolgica...60 8. DISCUSIN......64 9. CONCLUSIONES...79 10. PERSPECTIVAS.80

11. REFERENCIAS...81 12. APNDICES.91 APNDICE 1 Resultados del anlisis fitoqumico preliminar....91 APNDICE 2 Validacin estadstica del mtodo de cuantificacin de fenoles totales95 APNDICE 3 Validacin estadstica del mtodo de cuantificacin de flavonoides totales.100 APNDICE 4 Validacin del mtodo de evaluacin del potencial antioxidante in vitro DPPH..103

RELACIN DE FIGURAS
Pgina Figura 1. Estructuras de Eysenhardtia polystachya (Ort.) Sarg..5 Figura 2. Esqueleto comn de los flavonoides (fenilbenzopirano).9 Figura 3. Estructura bsica de diversos flavonoides..10 Figura 4. Bandas de absorcin de la quercetina.....16 Figura 5. Formacin del complejo de coordinacin de color amarillo debido a la quelacin del aluminio con el flavonol quercetina..17 Figura 6. Estructura del 2,2-difenil-1-picrilhidracilo, DPPH...22 Figura 7. Mediadores inflamatorios derivados del metabolismo de los fosfolpidos de la membrana y de la va de la LOX del AA; frmacos que inhiben su formacin....36 Figura 8. Mediadores inflamatorios derivados del metabolismo del AA por la va de la COX y frmacos que inhiben su formacin .37 Figura 9. Mecanismos de dao del tracto gastrointestinal, causados por los AINE.39 Figura 10. Estructura de la indometacina..40 Figura 11. Efecto antiinflamatorio de las fracciones ricas en flavonoides de Eysenhardtia polystachya (Ort.) Sarg sobre el peso final de los granulomas..59 Figura 12. Estmago y duodeno de una rata tratada con NaHCO3 al 5% (testigo).60 Figura 13. Estmago y duodeno de una rata tratada con indometacina (5 mg/kg p.c.).......60

Figura 14. Estmago y duodeno de una rata tratada con la fraccin rica en flavonoides F3. (1115) (25 mg/kg p.c.)..60 Figura 15. Estmago y duodeno de una rata tratada con la fraccin rica en flavonoides F4. (1620) (25 mg/kg p.c.)..60 Figura 16. Regin fndica del estmago de una rata tratada con NaHCO3 al 5%..............61 Figura 17. Regin inicial de duodeno de una rata tratada con NaHCO3 al 5%.....73 Figura 18. Clulas fndicas de la mucosa estomacal de una rata tratada con indometacina (5 mg/kg de p.c.).73 Figura 19. Tnica submucosa del estmago de una rata tratada con indometacina (5 mg/kg de p.c.).73 Figura 20. Regin inicial de duodeno de una rata tratada con indometacina (5 mg/kg p.c.).74 Figura 21. Mucosa duodenal de una rata tratada con indometacina (5 mg/kg p.c.)..............................................................................................................................................74 Figura 22. Regin fndica de estmago rata tratada con F3. (11-15) (25 mg/kg de p.c.)......74 Figura 23. Mucosa duodenal de rata tratada con F3. (11-15) (25 mg/kg de p.c.)..................74 Figura 24. Estmago de rata tratada con F4. (16-20) (25 mg/kg de p.c.)...............................74 Figura 25. Regin inicial de duodeno de rata tratada con F4. (16-20) (25 mg/kg de p.c.)...74

RELACIN DE TABLAS
Pgina Tabla 1. Mediadores qumicos implicados en la inflamacin aguda y sus principales acciones..28 Tabla 2. Diluciones para preparar la curva de calibracin de los fenoles totales49 Tabla 3. Diluciones para prepara la curva de calibracin de los flavonoides totales50 Tabla 4. Rendimientos de la separacin de los metabolitos del extracto etanlico por DCC......55 Tabla 5. Contenido de los fenoles totales, los flavonoides totales y capacidad antirradical contra el DPPH de los extractos de E. polystachya..56 Tabla 6. Efecto antiinflamatorio de las fracciones ricas en flavonoides de Eysenhardtia polystachya (Ort.) Sarg. sobre la inflamacin crnica inducida mediante el modelo del granuloma en la rata...58

LISTA DE ABREVIATURAS

LISTA DE ABREVIATURAS

AA ABTS ANOVA AINE CAT COX DCC DPPH FC GC GI GSH GSHPx H1 H-E HPLC iNOS I.C. 95%, a I.C. 95%,b L.C. L.d . L.D. LOX N NADPH nm NO

cido araquidnico 6-sulfonato-3-etilbenzotiazolina Anlisis de varianza unifactorial Antiinflamatorios no esteroideos Catalasa Enzima ciclooxigenasa Siglas en ingls de cromatografa en columna seca 2,2-difenil-1-picrilhidracilo Folin-Ciocalteu Siglas en ingls de cromatografa de gases Gastrointestinal Glutatin reducido Glutatin peroxidasa Protn Hematoxilina-eosina Siglas en ingls de cromatografa de lquidos de alta resolucin Sintasa inducible del xido ntrico Intervalo de confianza del 95% para la ordenada al origen Intervalo de confianza del 95% para la pendiente Lmite de cuantificacin Lmite de decisin Lmite de deteccin Enzima lipooxigenasa Nmero de parejas de datos en una regresin lineal Fosfato de nicotinamida adenina dinuclotido, forma reducida Nanmetros xido ntrico
I

LISTA DE ABREVIATURAS

PMN r r2 RMN ROS RNS S Sa Sb Sy/x Syc* SOD TE TAH TLC TNF- TX UV/Vis YB

Polimorfonucleares Coeficiente de correlacin Coeficiente de determinacin Resonancia magntica nuclear Siglas en ingls de especies reactivas de oxgeno Siglas en ingls de especies reactivas de nitrgeno Sensibilidad del mtodo, pendiente de una regresin lineal Error estndar de la ordenada al origen Error estndar de la pendiente Desviacin estndar de la regresin Lmite superior de la curva de calibracin en trminos de absorbencia Superxido dismutasa Transferencia de electrones Transferencia de tomos de hidrgeno Siglas en ingls de cromatografa en capa fina Factor de necrosis tumoral alfa Tromboxano Ultravioleta/Visible Cero estadstico, ordenada al origen de una regresin lineal

II

GLOSARIO DE TRMINOS

GLOSARIO DE TRMINOS
Efecto hipercrmico: incremento en la intensidad de la absorcin, es decir, un aumento en la magnitud del coeficiente de absortividad molar para una longitud de onda dada, por efecto del disolvente o de los sustituyentes. Efecto o desplazamiento batocrmico: cuando la longitud de onda de la absorcin de una sustancia se desplaza hacia longitudes de onda ms grandes o de menor energa por efecto del disolvente o por sustituyentes; tambin se conoce como corrimiento hacia el rojo. Error de tipo I: error que se comete cuando se acepta la hiptesis nula cuando en realidad es falsa. Erro de tipo II: error que se comete cuando se rechaza la hiptesis nula cuando en realidad es verdadera. Isocrtica: cuando en una separacin cromatogrfica se utiliza un solo disolvente o mezcla de stos como fase mvil. Lmite de cuantificacin: seal en la cual hay un 95% de confianza de que no se est cometiendo un error de tipo I o de tipo II; empleando 10 desviaciones estndar de la regresin. En trminos de cantidad, es aquella concentracin ms baja del compuesto que puede cuantificarse en un determinado mtodo analtico. Lmite de decisin: seal en la cual hay un 95% de confianza de que no se est cometiendo un error de tipo I o de tipo II; empleando 6 desviaciones estndar de la regresin. Lmite de deteccin: seal en la cual hay un 95% de confianza de que no se est cometiendo un error de tipo I o de tipo II; empleando 3 desviaciones estndar de la

III

GLOSARIO DE TRMINOS

regresin. En trminos de cantidad, es aquella concentracin mnima de sustancia que puede ser detectada con fiabilidad por un mtodo analtico determinado, an cuando no se pueda cuantificar.

IV

RESUMEN

RESUMEN

os flavonoides exhiben una fuerte actividad antioxidante y entre otras propiedades son capaces de inhibir el proceso antiinflamatorio por diversos mecanismos de accin, in vitro e in vivo. Investigaciones recientes, en nuestro laboratorio, demostraron la presencia de flavonoides en Eysenhardtia polystachya (Ort.) Sarg. (palo dulce), rbol ampliamente distribuido en Mxico, as como la actividad antiinflamatoria de sus hojas y corteza despus de la administracin de la infusin y decoccin a la dosis de 200 mg/kg de peso corporal (p.c.) y del extracto etanlico a las dosis de 50 y 100 mg/kg de p.c. en un modelo murino de inflamacin crnica granulomatosa. Por lo anterior, el objetivo de este estudio fue separar la fraccin rica en flavonoides de Eysenhardtia polystachya (Ort.) Sarg. y evaluar su efecto antiinflamatorio, as como su efecto antioxidante. La especie vegetal se recolect, se identific, se sec y se moli la corteza. Se prepar un extracto etanlico, a partir del cual se realiz una separacin cromatogrfica en columna seca. A la infusin y decoccin de hojas y corteza, al extracto etanlico as como a las fracciones resultantes de la separacin, se les realiz un estudio fitoqumico preliminar y se les cuantificaron los fenoles totales (mtodo de FC), los flavonoides totales (mtodo de quelacin con AlCl3) y se les determin su actividad antioxidante in vitro, al reducir al radical DPPH. Para evaluar la actividad antiinflamatoria de las fracciones, se utilizaron ratas Wistar hembras adultas de 200 20 g de p.c., a las cuales se les indujo la inflamacin utilizando el modelo del granuloma. Se formaron cuatro grupos, el testigo (vehculo, solucin de NaHCO3 al 5%, 1 L/kg de p.c.), el testigo positivo tratado con indometacina (5 mg/kg de p.c.) y los tratados con las fracciones F3. (16-20) y F4. (21-26) a la dosis de 25 mg/kg de p.c. Asimismo, se realiz la diseccin del estmago y duodeno de las ratas, con la finalidad de observar algn tipo de alteracin presente en dichos rganos, posteriormente se les realiz un estudio histopatolgico mediante la tcnica de H-E. En todos los extractos se detectaron alcaloides, azcares reductores, cumarinas, glucsidos cardiacos, quinonas, saponinas, taninos y flavonoides (flavonas y flavonoles), pero en el extracto etanlico, la proporcin de metabolitos detectados fue mayor con respecto al resto de los extractos. Los pesos secos y finales de los granulomas obtenidos de las ratas tratadas con las fracciones ricas en flavonoides e indometacina disminuyeron con respecto al grupo testigo. Las fracciones no produjeron erosiones, lceras ni alguna otra alteracin en el estmago y el duodeno, en comparacin con la que provoca la indometacina. La cantidad de fenoles totales y flavonoides no tuvieron una relacin directa con la capacidad antirradical de los extractos, lo cual no quiere decir, que no sean potentes antioxidantes por otros mecanismos o en otros modelos in vitro. Los resultados obtenidos de esta investigacin, demuestran que las fracciones ricas en flavonoides inducen un efecto antiinflamatorio probablemente provocado por la inhibicin selectiva de la COX-2.
V

ABSTRACT

ABSTRACT

lavonoids exhibited strong antioxidant activity and other properties that are capable of inhibiting the inflammatory process by different mechanisms of action in vitro and in vivo. Recent research in our laboratory demonstrated the presence of flavonoids in Eysenhardtia polystachya (Ort.) Sarg. (sweet wood) a tree widely distributed in Mexico, as well as antiinflammatory activity of leaves and bark after the administration of infusion and decoction at a dose of 200 mg/kg (bw) and ethanol extract at doses of 50 and 100 mg/kg (bw) in a murine model of chronic granulomatous inflammation. Therefore, the aim of this study was to separate the flavonoid-rich fraction of Eysenhardtia polystachya (Ort.) Sarg. and evaluate its anti-inflammatory and antioxidant effects. The specie was collected, identified, dried and ground bark. Ethanolic extract was prepared, from which there was a dry column chromatographic separation. The infusion and decoction of leaves and bark, the ethanol extract and the fractions resulting from the separation, were performed a preliminary phytochemical study and were quantified total phenols (FC method), total flavonoids (method of chelation with AlCl3) and their antioxidant activity were determined in vitro by reducing the radical DPPH. To evaluate the antiinflammatory activity of the fractions, adult female Wistar rats of 200 20 g (bw) were used, in which inflammation was induced using the model of granuloma. Four groups were formed, the control (vehicle solution NaHCO3 5%, 1 mL/kg, bw), the positive control treated with indomethacin (5 mg/kg, bw) and those treated with fractions F3. (16-20) and F4. (21-26) at a dose of 25 mg/kg, bw. Furthermore, the dissection of the stomach and duodenum of rats was performed, in order to observe any alteration present in these organs, then underwent a histopathological study using the technique of H-E. In all extracts were detected alkaloids, reducing sugars, coumarins, cardiac glycosides, quinones, saponins, tannins and flavonoids (flavones and flavonols), but in the ethanol extract the ratio of metabolites detected was higher compared to the rest of the extracts. Final and dry weights of the granulomas obtained from rats treated with fractions rich in flavonoids and indomethacin significantly decreased as compared to the control group. Fractions did not produce erosions, ulcers or some other alterations in the stomach and duodenum compared with indomethacin. The amount of total phenols and flavonoids were not directly related to the antiradical capacity of extracts, this does not mean, it has not antioxidant activity produced by other mechanisms or detected by other in vitro models. The results of this research show that the fractions rich in flavonoids induce an antiinflammatory effect in chronic inflammation, probably produced by its selective inhibition of COX-2

VI

INTRODUCCIN

1. INTRODUCCIN

a naturaleza ha sido una fuente de agentes medicinales por miles de aos y hasta hace poco menos de un siglo, las plantas medicinales constituyeron el principal recurso

teraputico. En la bsqueda de la salud, el hombre ha profundizado en el conocimiento de las especies vegetales que poseen propiedades medicinales y ha ampliado su experiencia en el empleo de los productos que de ellas se extraen. De hecho, una gran cantidad de los frmacos actuales se han aislado de fuentes naturales. Las especies vegetales constituyen un recurso valioso en los sistemas de salud de los pases en desarrollo, y aunque no existen datos precisos para evaluar la extensin del uso global de las plantas medicinales, la Organizacin Mundial de la Salud (OMS) ha estimado que cerca del 65-80% de la poblacin mundial de los pases en desarrollo dependen de las plantas para su atencin primaria de la salud. Asimismo, se estima que la poblacin mundial ser de 7 500 millones de personas para el ao 2020, de las cuales el 75% vivir en los pases en desarrollo y consumir slo el 15% de los medicamentos totales del mercado. Debido a lo anterior, es posible predecir que la mayora de la poblacin en un futuro depender aun ms de las plantas medicinales para aliviar sus males (Gilani y Atta-ur-Rahman, 2005; Calixto, 2005). Actualmente, ya han sido identificadas un gran nmero de especies con actividad teraputica, y en Mxico como en otros pases, forman parte integral de la rica tradicin de la cultura popular. Cabe destacar, que Mxico por su localizacin geogrfica, posee una gran biodiversidad que no ha utilizado en beneficio de su propio desarrollo, a pesar de que hasta el ao 2005, era el segundo pas en Latinoamrica con mayor nmero de publicaciones anuales en los ltimos 25 aos sobre plantas farmacolgicamente activas (Calixto, 2005). Sin embargo, en Mxico, muchas de las plantas medicinales a pesar de ser muy utilizadas todava no cuentan con el respaldo cientfico que avalen su uso desde una perspectiva biomdica, careciendo en este sentido de informacin sobre su efectividad, toxicidad y
-

1-

INTRODUCCIN

caracterizacin de metabolitos, entre otros (Farmacopea Herbolaria de los Estados Unidos Mexicanos, Anexo 2, 2001) y por lo tanto, no cumplen con las caractersticas necesarias para ser consideradas como medicamentos y no obstante son comercializadas constituyendo riesgos a la salud por sus posibles efectos adversos (Enrquez y col., 2005). Son varias las especies que han mostrado cientficamente actividad antiinflamatoria que se ha atribuido a la presencia de flavonoides, utilizado varios modelos de la induccin de la inflamacin aguda o crnica in vivo. Al utilizar modelos in vitro, tambin se ha llegado a la conclusin de que algunas especies poseen actividad antiinflamatoria y hasta se ha dilucidado su mecanismo de accin, por ejemplo, Wang y col., (2008) demostraron la actividad antiinflamatoria de los flavonoides aislados de Pogonatherum crinitum mediante el modelo de macrfagos murinos activados con lipopolisacrido. Park y col., (2007) reportaron la actividad antiinflamatoria y el mecanismo molecular de tres isoflavonas y sus metabolitos transformados por la microflora intestinal humana, en clulas microgliales estimuladas por lipopolisacrido.

2-

ANTECEDENTES

2. ANTECEDENTES

os flavonoides constituyen una de las subfamilias de polifenoles naturales a las que la comunidad cientfica ha dedicado ms atencin en los ltimos aos. Sus mltiples

propiedades biolgicas observadas experimentalmente y su abundancia en la dieta, junto con su presencia en numerosos remedios de la medicina tradicional, los convierten en posibles candidatos para explicar la asociacin encontrada entre el consumo de determinados productos de origen vegetal y la disminucin del riesgo de presentar determinadas enfermedades crnicas (lvarez y Orallo, 2003a). Desde hace algunos aos, tanto pases altamente desarrollados como aquellos con escasos recursos, han retomado y desarrollado el uso de las plantas medicinales con fines teraputicos, ya que disminuyen o eliminan sntomas de manera similar a cuando se utilizan medicamentos alopticos (Garca y col., 2002). En la actualidad, en Mxico, la medicina tradicional sigue satisfaciendo las necesidades de alivio y curacin que la poblacin rural requiere, ya sea debido a la tradicin o a la falta de recursos econmicos para tratarse con alopata. Se ha observado que compuestos qumicamente relacionados, como los polifenoles, pueden ofrecer mecanismos marcadamente diferentes y propiedades fisiolgicas de distintos grados. Por ende, es muy importante determinar la clase de metabolitos que son responsables del efecto farmacolgico de aquellas especies vegetales que ya son utilizadas de forma tradicional para aliviar ciertos padecimientos, requiriendo para ello su separacin, aislamiento de la matriz, caracterizacin y su posterior evaluacin biolgica; tal es el caso de Eysenhardtia polystachya (Ort.) Sarg.

3-

ANTECEDENTES

2.1 Eysenhardtia polystachya (Ort.) Sarg. 2.1.1 Descripcin Es un rbol peculiar pequeo de 2 hasta 8 m de altura que posee ramas jvenes que se recubren con pelos finos. Pertenece a una de las tres especies de Eysenhardtia encontradas en Norteamrica.

Es de la familia Fabaceae (antes Leguminosae). Tiene hojas alternas, compuestas, pinnadas, de 3 a 5 cm de largo, fololos de 10 a 15 pares por hoja, elpticos, de 7 a 13 mm de largo por 3 a 5 mm de ancho, con glndulas resinosas aromticas presentes. Sus tallos son ramificados de color caf oscuro. La corteza externa es amarilla, de textura ligeramente rugosa, escamosa, cuando se seca se desprende en placas irregulares de color oscuro de 1 mm de grosor; la corteza interna es pardo rojiza. La madera puesta en el agua desprende una sustancia que tie de color amarillo azuloso. Posee inflorescencias blancas, olorosas, dispuestas en racimos apretados, espigados terminales o subterminales, de 5 a 7 cm de largo; cliz campanulado, de 2.5 a 3 mm de largo, 5lobulados; corola blanca, formada por 5 ptalos libres, de 5 mm de largo por 1.3 a 2 mm de ancho, oblongos. Los frutos son unas vainas ligeramente curvadas, atenuadas en el pice, pubescentes o subglabras de 7 a 9.5 mm de largo, con el estilo persistente, frgil e indehiscente, provistas con glndulas; cada vaina contiene una semilla. La testa de las semillas es delgada y permeable al agua (Argueta y col., 1994). Este rbol florece de mayo a octubre y fructifica de noviembre a diciembre (Sargent, 1892).

4-

ANTECEDENTES

Corteza

Hojas

Inflorescencias

Frutos

Figura 1. Estructuras de Eysenhardtia polystachya (Ort.) Sarg.

2.1.2 Nombres comunes Sus nombres varan de acuerdo a su localizacin geogrfica, por ejemplo se le conoce como cuate (Jal.); coatillo (Pue.); coat (l. nhuatl); cohuatli, cuatle (Oax.); lana (l. chontalpa, Oax.); palo cuate, rosilla (Sin.); palo dulce (Sin., Mex., Hgo., Pue., Mich.); taray (N.L., Dgo.); tlapahuaxpatli; ursa (l. otom, Hgo.); vara dulce, varaduz (Dgo.) (Sargent, 1892). 2.1.3 Distribucin geogrfica Estos rboles, estn ampliamente distribuidos en ambas vertientes y en la parte central del pas, en altitudes de entre 150 a 3 000 m. Su presencia es comn en todo el pas, tanto
-

5-

ANTECEDENTES

en el bosque templado fro, mezclado con conferas y encinares, como en el trpico seco y en regiones semidesrticas; principalmente, en los estados de Colima, Chiapas, Chihuahua, Coahuila, Distrito Federal, Durango, Guanajuato, Guerrero, Hidalgo, Jalisco, Mxico, Michoacn, Morelos, Oaxaca, Puebla, Quertaro, San Luis Potos, Tamaulipas, Tlaxcala, Veracruz y Zacatecas (Sargent, 1892). 2.1.4 Usos tradicionales Debido a las caractersticas energticas de la madera, se le utiliza como combustible (lea); las hojas, vstagos, frutos y semillas se usan como forraje para el ganado bovino y caprino. En las actividades artesanales se le utiliza para elaborar copas y vasijas (Sargent, 1892). Los usos medicinales (fruto, semilla, hoja y corteza) que se le han atribuido desde el siglo XVI son diversos, por ejemplo, con la madera se prepara una infusin a la que se le atribuyen propiedades contra las enfermedades renales y de la vescula, tambin se utiliza como anticonceptivo. Las hojas y tallos en cocimiento se emplean para aliviar las molestias debidas a los clculos renales y contra el aborto, la flor se usa para la diarrea en nios. En el siglo XX, se refiere su uso como planta antiespasmdica, antipirtica, cicatricial regenerativa y para las enfermedades de los ojos, entre otras (Argueta y col., 1994; Alvarez y col., 1998). Sin embargo, cabe destacar que las nicas actividades teraputicas que han sido evaluadas cientficamente son la antiinflamatoria inducida por el uso de los extractos acuosos (infusin y decoccin a la dosis de 200 mg/kg de p.c.) y etanlico (50 y 100 mg/kg de p.c.) de la corteza, tronco y hojas de palo dulce (Pablo, 2009), en este mismo estudio se observ que el uso de estos extractos para disminuir el proceso inflamatorio, no provoca alteraciones gastroduodenales en contraste con la indometacina; la diurtica demostrada por Salazar (2007); y contra la urolitiasis, demostrando que las isoflavonas aisladas de la corteza actan como inhibidores en la formacin y crecimiento de los cristales de oxalato y fosfato de calcio, reduciendo el grado de agregacin y el tamao de la partcula precipitada (Prez y col., 2002);

6-

ANTECEDENTES

tambin, se han identificado isoflavanos de la corteza de palo dulce que en experimentos demostraron tener actividad citotxica y antimicrobiana (Alvarez y col., 1998). 2.1.5 Composicin qumica Eysenhardtia polystachya ha sido objeto de numerosos estudios fitoqumicos, lo cual se debe en parte a que esta especie es ampliamente usada en la medicina tradicional. Beltrami y col., (1982), reportaron el aislamiento de las dos primeras muestras de la existencia natural de C-glucosil--hidroxidihidrochalconas y de los flavonoides coatlina A y B de la madera del tronco. Burns y col., (1984) aislaron del duramen, la 7-hidroxi-2,4,5trimetoxiisoflavona (1), que es el principal constituyente fenlico fluorescente de E. polystachya, el cual tiene un inters histrico por ser el indicador cido-base usado por Robert Boyle en el siglo XVII; adems, de la corteza aislaron el 9-metoxi-2,3-metilenedioxicoumestan. En el tallo, se han detectado los flavonoides 3,4-dimetoxi-8,9-metilendioxipterocarpano (2) y dihidrorotenona, el esterol -sitosterol y un componente de estructura no determinada, el agustlegorretoside. En la corteza del tallo, se han detectado los mismos componentes adems del triterpeno -amirina y en la madera del tronco, la cumarina flemichaparina C (Argueta y col., 1994). En 1998, Alvarez y col., aislaron de la corteza de los troncos, dos isoflavanos citotxicos, (3S)-7-hidroxi-2,3,4,5,8-pentametoxiisoflavano junto con los conocidos y (3S)-3,7-

dihidroxi-2,4,5,8-tetrametoxiisoflavano,

constituyentes

estigmasterol, isoduartina, cuneatina, 1 y 2. lvarez y Delgado, (1999) aislaron algunos isoflavonoides de la corteza y reportaron la estructura de cuatro -hidroxidihidrochalconas. En 2002, Prez y col., aislaron de la corteza, la 7-hidroxi-4-etoxiisoflavona y 1. Recientemente, Salazar (2007) y Pablo (2009) detectaron la presencia de flavonoides, alcaloides, azcares reductores, quinonas, saponinas y taninos tanto en la infusin, la decoccin y el extracto etanlico de Eysenhardtia polystachya (Ort.) Sarg recolectada en el municipio de Zempoala, Hidalgo.

7-

ANTECEDENTES

2.2 Flavonoides Los flavonoides fueron descubiertos por Albert Szent-Gyrgy -ganador del premio Nobel de Fisiologa y Medicina en 1937- quien en 1930 aisl de la cscara del limn a la citrina (una mezcla de eriodictiol y hesperidina), capaz de regular la permeabilidad de los capilares. Los flavonoides se denominaron en un principio vitamina P (por permeabilidad) y tambin vitamina C2 (porque se comprob que algunos flavonoides tenan propiedades similares a la vitamina C). Sin embargo, el hecho de que los flavonoides fueran vitaminas no pudo ser confirmado y ambas denominaciones se abandonaron alrededor de 1950 (Middleton y Kandaswami, 1994; Martnez-Flores y col., 2002). 2.2.1 Distribucin Los flavonoides son metabolitos secundarios exclusivamente de origen vegetal, su presencia en el reino animal se debe a la ingestin de las plantas. Estn distribuidos
ubicuamente entre los vegetales superiores vasculares, siendo las rutceas, poligonceas, compuestas y umbelferas las principales familias que los contienen. Abundan, sobre todo, en las partes areas jvenes y ms expuestas al sol, como las hojas, los frutos y las flores, ya que la luz solar favorece su sntesis. Se pueden encontrar como agliconas y/o en mayor proporcin en forma de O-hetersidos o C-hetersidos, unidos generalmente a la glucosa, aunque tambin pueden estar unidos a la ramnosa y a veces a la galactosa. La mayor parte de los flavonoides son O-hetersidos (Gimeno, 2004; Lpez, 2002; Pietta, 1999).

2.2.2 Estructura qumica Todos los flavonoides se originan por una ruta biosinttica mixta a travs de la va del cido shikmico y la de los polictidos. Se sintetizan a partir de flavononas derivadas a su vez de chalconas provenientes de la va fenilpropanoide. Su formacin tiene lugar a partir de los aminocidos aromticos fenilalanina y tirosina y tambin de unidades de acetato (Drago, 2007; Lpez, 2002; Paredes y Clemente, 2005; Seigler, 1998).

8-

ANTECEDENTES

Qumicamente, son compuestos de bajo peso molecular que comparten un esqueleto comn de difenilpiranos (C6-C3-C6), compuesto por dos anillos de fenilo (Ay B) ligados a travs de un anillo C de pirano (heterocclico). Los tomos de carbono en los anillos C y A se enumeran del 2 al 8, y los del anillo B desde el 2' al 6' (Figura 2) (Martnez-Flores y col., 2002). Se considera que su estructura deriva de la -cromona (o benzo--pirona) con un fenilo en posicin 2. As pues, son 2-fenil--cromonas. De los tres anillos, el A se biosintetiza a travs de la ruta de los polictidos y el B y la unidad C, proceden de la ruta del cido shikmico (Lpez, 2002; Paredes y Clemente, 2005).
3' 2' 8 7 A 6 5 4 B
O

4' 5' 6'

C 3

Figura 2. Esqueleto comn de los flavonoides (fenilbenzopirano)

2.2.3 Clasificacin Los flavonoides se clasifican a partir de sus variaciones estructurales. Al modificar el esqueleto comn de los flavonoides por glicosilacin, oxidacin, reduccin o alquilacin, el ncleo fenilpropanoide genera un escaso nmero de estructuras bsicas de las cuales se deriva la amplia gama de flavonoides entre los que se incluyen: flavanonas, flavonoles, flavonas, flavanoles, antocianinas, flavanonoles, isoflavonas, chalconas y neoflavonas (Geissman y Crout, 1969; Seigler, 1998; Brielmann y col., 2006) (Figura 3). Las diferentes clases de flavonoides difieren en el nivel de oxidacin y la sustitucin de grupos en el anillo C, mientras los componentes individuales dentro de una clase difieren en la sustitucin en los anillos A y B (Pietta, 1999; Seyoum y col., 2006).

9-

ANTECEDENTES

OH OH O O O

Flavanona

Flavonol

Flavona

OH

OH

OH O

Flavanol

Antocianidina

Flavanonol
O O O

OH HO

O O

Isof lavona

Chalcona Neof lavona

Figura 3. Estructura bsica de diversos flavonoides (Domnguez, 1979; Drago, 2002; Lpez, 2002; Martnez-Flores y col., 2002; Paredes y Clemente, 2005).

2.2.4 Caractersticas fsicas Los flavonoides son sustancias slidas cristalizadas de color blanco o amarillento. Sus hetersidos son solubles en agua caliente, alcohol y disolventes orgnicos polares, siendo insolubles en los apolares. Sin embargo, cuando estn en estado libre, son poco solubles en agua, pero son solubles en disolventes orgnicos ms o menos oxigenados, dependiendo de su polaridad. Adems, son sustancias que se oxidan ms rpidamente que otro tipo de sustancias, motivo por el cual se consideran como antioxidantes (Lpez, 2002).

10 -

ANTECEDENTES

2.2.5 Efectos farmacolgicos Los flavonoides constituyen una de las familias de compuestos naturales ms interesantes, su amplia bioactividad y su elevada presencia en la dieta humana los hacen merecedores de atencin en la investigacin farmacolgica. Los efectos curativos de muchos remedios de la medicina natural tradicional pueden ser atribuidos a la presencia de estas molculas y a partir de esto, los flavonoides han ido ganando inters como agentes teraputicos potenciales frente a una amplia variedad de enfermedades.

Desde su descubrimiento, los flavonoides se han descrito con propiedades pleiotrpicas, tales como antioxidantes, antiinflamatorias, antiagregantes, antiateroesclerticas,

antihemorrgicas, vasodilatadoras, antineoplsicas, antivirales, antibacterianas, antialrgicas, hepatoprotectoras, diurticas, antihipertensivas, antiespasmdicas y antiulcerosas gstricas, ejercidas por diversos mecanismos de accin (Middleton y Kandaswami, 1994). En fitoterapia, los flavonoides se emplean principalmente en los casos de fragilidad capilar como venotnicos, tambin se utilizan en proctologa, metrorragias y retinopatas (lvarez y Orallo, 2003a, b). Actualmente, los campos en los que ms estudios se realizan con los flavonoides son las enfermedades cardiovasculares y el cncer, dos de los principales problemas sanitarios del mundo occidental. Los mecanismos de accin y las posibles molculas diana de stos
compuestos continan siendo objeto de la investigacin biomdica (lvarez y Orallo, 2003a;

Lpez, 2002). Cabe destacar que el flavopiridol que inhibe ciclinas dependientes de cinasas, induce apoptosis, suprime la inflamacin y modula respuestas inmunolgicas, es el primer flavonoide con actividad biolgica que ha entrado a la clnica como frmaco anticancergeno (Rao y col., 2005). 2.2.6 Metabolismo El metabolismo de los flavonoides es intenso y una parte importante se excreta por la

11 -

ANTECEDENTES

orina. Su biotransformacin tienen lugar en dos localizaciones: en el hgado, por medio de reacciones de biotransformacin de fase I en las que se introducen o exponen grupos polares, en segundo lugar en el colon, mediante reacciones de biotransformacin de fase II, en las que los microorganismos degradan a los flavonoides no absorbidos produciendo cidos fenlicos que pueden ser reabsorbidos. Estos compuestos y sus metabolitos procedentes del colon, se conjugan con el cido glucurnico, los sulfatos, o la glicina. Los conjugados, solubles en agua, se excretan por la orina (Pietta, 1999; Martnez-Flores y col., 2002; Possemiers y col., 2011).

2.2.7 Toxicidad Los cientficos han calculado la ingesta promedio de los flavonoides en diversos pases del mundo y se ha encontrado que de acuerdo a las costumbres alimenticias, sta vara considerablemente. Asimismo, se han encontrado variaciones entre gneros (Manach y col., 2004). En general, a dosis normales que oscilan entre 25 mg a 1 g por da, los flavonoides son seguros y sin efectos adversos, pero pueden ser txicos si su ingestin est entre el 1 y el 5% del total de la dieta. Debido a su capacidad de eliminar radicales libres, existe la posibilidad de que presenten propiedades prooxidantes y mutagnicas, determinadas por su estabilidad/labilidad redox del compuesto radical formado a partir del flavonoide original, es decir, el radical aroxilo puede autooxidarse o bien formar compuestos cuaternarios entre el ADN o el cobre (Martnez-Flores y col., 2002; Gimeno, 2004). 2.2.8 Separacin y aislamiento En la actualidad existen diversas formas de separar y aislar a los flavonoides presentes en las plantas (Markham, 1975; Pablo, 2009; Ajila y col., 2011).

12 -

ANTECEDENTES

2.3 Cuantificacin de compuestos fenlicos totales La cuantificacin e identificacin de los componentes fenlicos en la dieta ha despertado un gran inters por su importancia nutricional, lo que ha hecho que cada da sean ms los datos que se pueden encontrar en la bibliografa cientfica sobre el perfil fenlico de los alimentos y los remedios herbolarios. Adems, la gran diversidad de los compuestos fenlicos dispersos en los tejidos vegetales, as como sus diferentes estructuras qumicas, han trado consigo la necesidad de desarrollar un gran nmero de tcnicas analticas para su identificacin y cuantificacin (Martnez y col., 2000). Dentro de las tcnicas analticas para la cuantificacin y/o identificacin de estos compuestos se encuentran las tcnicas cromatogrficas como son la TLC, la GC y HPLC (Escarpa y Gonzalez, 2001), as como espectrofotomtricas (Martnez y col., 2000).

a) Tcnicas cromatogrficas. Las tcnicas cromatogrficas han permitido la separacin, aislamiento, purificacin e identificacin de los compuestos fenlicos, as como el estudio de su interaccin con otros componentes de los alimentos. Hoy en da, las tcnicas de HPLC son las ms empleadas para su separacin y cuantificacin.

Existen distintos soportes y fases mviles que permiten el anlisis de un gran nmero de polifenoles de inters nutricional, como los fenoles simples, cidos fenlicos y sus derivados, y los distintos flavonoides. Sin embargo, la principal desventaja de esta tcnica, es que requiere la utilizacin de mtodos de extraccin adecuados a cada uno de los compuestos a analizar, lo que conduce a un tratamiento muy elaborado de las muestras (Martnez y col., 2000).

b) Tcnicas espectrofotomtricas. Los mtodos espectrofotomtricos no son nuevos en el campo de la qumica analtica y hasta hoy en da son usados frecuentemente para la determinacin de polifenoles (Escarpa y Gonzalez, 2001). Se han realizado numerosos estudios para desarrollar tcnicas rpidas de cuantificacin de compuestos fenlicos
-

13 -

ANTECEDENTES

mediante ensayos ultravioletas. Cada grupo de compuestos fenlicos se caracteriza por tener una o varias mximas a distintas longitudes de onda dentro del espectro ultravioleta. As, los fenoles simples tienen una mxima entre 220 y 280 nm, mientras que los compuestos fenlicos relacionados presentan una amplia variacin en la longitud de onda a la cual presentan una absorbencia mxima. Una de las tcnicas ms empleadas dentro de este grupo es la determinacin del cido clorognico, el cual se cuantifica despus de su extraccin con etanol y se lee su mxima a una longitud de onda de 325-328 nm (Martnez y col., 2000).

Entre este tipo de tcnicas, los mtodos usados comnmente para determinar polifenoles en especies vegetales destacan el ensayo de la vainillina para la determinacin de compuestos flavan-3-ol, dihidrochalconas y proantocianidinas que tienen una unin simple en la posicin 2,3 y poseen grupos hidroxilos en la posicin meta del anillo B (Martnez y col., 2000) y el ensayo de Folin-Ciocalteu (FC) para la cuantificacin de polifenoles totales; esta tcnica lleg a ser la ms utilizada para determinar de manera cuantitativa a los polifenoles y es la ms reportada actualmente (Faria y col., 2005).

A continuacin se analiza el fundamento del mtodo utilizado en el presente trabajo para la determinacin de compuestos fenlicos.

2.3.1 Tcnica de Folin-Ciocalteu El ensayo de FC cuantifica los fenoles totales de una muestra a travs de su capacidad reductora, aunque no est directamente relacionada con la medicin de actividad antioxidante, puede ser til para tales estudios, en especial si se combina con otros mtodos que evalen dicha capacidad (Heimler y col., 2010).

Es uno de los mtodos ms antiguos para determinar el contenido de fenoles totales. Originalmente, el reactivo para determinar fenoles fue propuesto por Folin y Denis (1912), quienes descubrieron que una mezcla de cidos fosfotngstico y fosfomolbdico
14 -

ANTECEDENTES

reaccionaban con derivados fenlicos y al agregar un lcali, la reaccin daba un color azul. Aunque ste fue considerado un mtodo oficial para detectar fenoles totales, la mezcla de reaccin produca ocasionalmente un precipitado blanco, que interfera con el mtodo colorimtrico. En 1927, Folin y Ciocalteu mejoraron el mtodo al incrementar la proporcin de molibdato y prevenir la precipitacin al agregar sulfato de litio al reactivo original, lo cual brind una mayor sensibilidad y reproducibilidad al mtodo. Posteriormente, Singleton y Rossi (1965), analizaron el mtodo y reportaron que los sulfitos, los azcares y las aminas aromticas interfieren con el mtodo. Actualmente, considerando la heterogeneidad de los fenoles naturales y la posibilidad de interferencias de otras sustancias fcilmente oxidables, existen otros mtodos que compiten con el de FC, por ejemplo la titulacin con permanganato, colorimetra con sales de hierro y absorbencia con luz UV, sin embargo ninguno es perfecto (Singleton y col., 1999). La tcnica de FC, consiste en mezclar el reactivo comercial de FC en un medio altamente bsico (Na2CO3 al 5-10%, acuoso). Los polifenoles son fcilmente oxidables en medio bsico por el reactivo de FC, los fenoles en su pK (usualmente cerca de pH 10) se convierten en iones fenolatos quienes al perder un electrn producen un radical libre semiquinona, si se remueve otro electrn da una quinona o bien se produce la polimerizacin. La molcula que acepta ese electrn se reduce, as pues, lo que cuantifica la reaccin es la reduccin del fosfomolibdato de MoO4+ a MoO3+ que produce un color azul, este compuesto puede ser identificado y cuantificado por espectroscopa de UV/Vis debido a que absorbe a una longitud de 760 nm. El contenido de fenoles totales generalmente, se expresa en equivalentes de cido glico (Singleton y col., 1999). Esta tcnica, slo se puede emplear en muestras hidroflicas, dado que el ensayo se lleva a cabo en una fase acuosa (Huang y col., 2005). 2.4 Cuantificacin de flavonoides totales La espectroscopia UV ha llegado a ser la mejor tcnica para el anlisis estructural de los flavonoides por dos principales razones: 1) requiere slo una pequea cantidad de sustancia

15 -

ANTECEDENTES

pura y 2) la informacin estructural obtenida de un espectro UV se incrementa por el uso de reactivos especficos que reaccionan con uno o ms grupos funcionales del ncleo de los flavonoides. La adicin de cada uno de esos reactivos por separado a una solucin alcohlica de los flavonoides induce cambios estructuralmente significativos en el espectro UV. Los cambios de este tipo son comnmente inducidos por la adicin de metxido de sodio (NaOMe), acetato de sodio (NaOAc), acetato de sodio/cido brico (NaOAc/H3BO3), cloruro de aluminio (AlCl3) y cloruro de aluminio/cido clorhdrico (AlCl3/HCl) (Markham y Mabry, 1975). Estudios ms recientes emplean cloruro de aluminio/acetato de potasio (AlCl 3/KOAc) (Salamanca y col., 2007).

El espectro UV de muchos flavonoides consiste en dos mximos de absorcin, uno de los cuales ocurre en el intervalo de 240-285 nm (banda II) y la otra entre los 300-400 nm (banda I). En trminos generales, la banda de absorcin II se considera que se origina del sistema benzoilo del anillo A y la banda I del sistema cinamoilo del anillo B (Figura 4) (Markham y Mabry, 1975).

Figura 4. Bandas de absorcin de la quercetina (modificado de Markham y Mabry, 1975)

2.4.1 Tcnica de quelacin con AlCl3 Se basa en la formacin de un complejo resultante de la quelacin con Al de los grupos 5-hidroxi-4-ceto, 3-hidroxi-4-ceto y O-dihidroxi (Figura 5), que puede ser evidenciado y cuantificado por desplazamientos batocrmicos de una o ambas bandas caractersticas de los flavonoides en el espectro. La estabilidad relativa de los complejos ocurre en el siguiente orden: 3-hidroxi (flavonol)
-

16 -

ANTECEDENTES

> 5-hidroxi (flavona) > 5-hidroxi (flavanona) > grupos O-dihidroxil > 3-hidroxil (dihidroflavonol) (Markham y Mabry, 1975).
OH OH O Al1+

2' 8
OH O

2' B 8 5' 6' AlCl 3

OH O

B 2 6' 3
OH

2 3
OH

5'

A 6

A 6

OH

O Al
2+

Figura 5. Formacin del complejo de coordinacin de color amarillo debido a la quelacin del aluminio con el flavonol quercetina (modificado de Markham y Mabry, 1975)

2.5 Mtodos para evaluar la actividad antioxidante En la actualidad, hay un inters creciente en los antioxidantes, particularmente en aquellos que previenen los supuestos efectos deletreos de los radicales libres en el ser humano, el deterioro de las grasas y otros componentes de los alimentos. En ambos casos, hay una preferencia por los antioxidantes de fuentes naturales sobre los de tipo sinttico. Asimismo, hay un incremento paralelo en el uso de mtodos para estimar la eficiencia de estas sustancias como antioxidantes (Molyneux, 2004).

La actividad antioxidante de un compuesto puede evaluarse in vitro por medio de experimentos sencillos que examinan directamente dicha habilidad y que a la vez evalan el posible efecto prooxidante sobre diferentes molculas. Cabe destacar que estos experimentos miden la capacidad de captacin de un radical (oxidante) y no la capacidad antioxidante preventiva de una muestra (Huang y col., 2005). Estos mtodos se enfocan en diferentes mecanismos del sistema de defensa antioxidante, tales como la captacin de oxgeno y radicales hidroxilo, la reduccin del radicales peroxilo lipdicos y la inhibicin de la peroxidacin lipdica o quelacin de iones metlicos (Faria y col., 2005).

17 -

ANTECEDENTES

Estos mtodos deben ser rpidos, reproducibles y requerir cantidades pequeas de los compuestos qumicos por analizar, adems de no estar influenciados por las propiedades fsicas de dichos compuestos (Marco, 1968).

Los resultados de los ensayos in vitro pueden usarse como un indicador directo de la actividad antioxidante in vivo; un compuesto que es poco efectivo in vitro, no ser mejor in vivo (Aruoma y col., 1997). Estos ensayos tambin pueden alertar sobre posibles efectos dainos de los compuestos qumicos. Algunos de los mtodos para determinar la actividad antioxidante consisten en acelerar la oxidacin en un sistema lipdico, usualmente por calentamiento, y monitoreando a continuacin el consumo de oxgeno, la degradacin de un sustrato o bien la formacin de un producto (hidroperxidos) (Brand-Williams y col., 1995). Debido a que muchos factores pueden afectar la oxidacin, incluyendo la temperatura, la presin de oxgeno y los catalizadores metlicos, los resultados pueden variar dependiendo de las condiciones de oxidacin empleadas. Incluso el riesgo de degradacin de los antioxidantes en estas condiciones es muy alto (Bondet y col., 1997). Los ensayos que miden los sustratos o los productos, tambin pueden dar resultados variables, dependiendo de su especificidad (Fukumoto y Mazza, 2000).

2.5.1 Clasificacin de los ensayos Dependiendo del tipo de reaccin involucrada, los ensayos se pueden clasificar en dos tipos: ensayos basados en reacciones en donde hay transferencia de tomos de hidrgeno (TAH) y los basados en la transferencia de electrones (TE). Tambin hay ensayos que miden la captacin de radicales libres del oxgeno y del nitrgeno en modelos in vitro (Huang y col., 2005).

a) Ensayos basados en la TAH. Estn generalmente contienen un generador sinttico de radicales libres, un componente molecular oxidable y un antioxidante. La mayora de estos ensayos tienen un esquema de reaccin competitiva, en el cual el antioxidante y el sustrato compiten para generar trmicamente radicales peroxilo a travs de la descomposicin de los
18 -

ANTECEDENTES

compuestos azo. Actualmente el generador sinttico de radicales libres ms empleado es el 2,2-azobis (2-metilpropranimidamida) diclorohidrato (AAPH) (Huang y col., 2005).

Los siguientes son modelos in vitro ms frecuentemente usados para la evaluacin de la actividad antioxidante basados en este mecanismo.

1) Mtodo de IOU (inhibited oxygen uptake). No ha tenido un amplio uso debido a las condiciones irreales de altas presiones de oxgenos empleadas (Hung y col., 2005).

2) Mtodo de la inhibicin de la oxidacin de LDL. Este mtodo induce artificialmente la autoxidacin del cido linoleico o LDL por el Cu (II) o un iniciador azo y permite evaluar la proteccin de un sustrato por un antioxidante en un modelo de membrana biolgica o una lipoprotena (Faria y col., 2005).

3) Mtodo ORAC (oxygen radical absorbance capacity) (Cao y col., 1997). Es ampliamente usado en investigacin y en la industria de los alimentos. Se usa en muestras hidroflicas y lipoflicas.

4) Ensayo del blanqueamiento de crocina. Su aplicacin industrial es limitada debido a su gran variabilidad ante diferentes antioxidantes (Huang y col., 2005).

5) Mtodo del TRAP (total radical trapping antioxidant parameter). El progreso de la reaccin se monitorea fluoromtricamente (Huang y col., 2005). 6) Mtodo del N, N-dimetil-p-fenilendiamina (DMPD+). Es un mtodo rpido, barato que asegura sensibilidad y reproducibilidad en la medicin de la actividad antioxidante de compuestos hidroflicos. Se reporta como TEAC (trolox equivalent antioxidant capacity). Tiene la ventaja sobre el mtodo del ABTS- de que el punto final de la reduccin se detecta por una aparicin gradual de color y no por una decoloracin (Fogliano y col., 1999).
19 -

ANTECEDENTES

b) Ensayos basados en la TE. Las reacciones basadas en este mecanismo miden la capacidad antioxidante a travs de la reduccin de un antioxidante, que cambia de color cuando se reduce. El grado de cambio de color se correlaciona con las concentraciones antioxidantes de las muestras.

Los siguientes son los modelos in vitro ms frecuentemente usados para la evaluacin de la actividad antioxidante basados en la TE.

1) Ensayo de fenoles totales por el reactivo de Folin-Ciocalteu (ver apartado 2.3.1)

2) Ensayo TEAC (trolox equivalent antioxidant capacity). Este mtodo fue reportado por primera vez en 1993 y despus se modific y actualmente se conoce como el mtodo del 6sulfonato-3-etilbenzotiazolina (ABTS-). Cuando este anin radical se reduce hay una decoloracin, la concentracin de antioxidantes da el mismo porcentaje de cambio de absorbencia del ABTS- que el trolox 1 mM y esto se conoce como TEAC. Es til para muestras hidroflicas y lipoflicas (Re y col., 1999; Tsai y col., 2011). Otra modificacin del mtodo se conoce como VCEAC (vitamin C equivalent antioxidant capacity) (Kim y col., 2003).

3) Ensayo FRAP (ferric ion reducing antioxidant parameter). El reactivo de FRAP contiene al oxidante que es una sal frrica (TPTZ, 2, 4, 6-tripiridil-s-triazina) mezclada con FeCl3 en medio cido. Debido al Fe (III) libre del reactivo, pueden existir interferencias en las determinaciones, ya si las muestran poseen componentes que actan como queladores de metales se pueden unir al Fe (III) y formar complejos capaces de reaccionar con los antioxidantes (Benzie y Strain, 1996; Faria y col., 2005); Huang y col., 2005; Xu y col., 2010; Tsai y col., 2011).

4) Capacidad de reduccin de cobre (II). Se basa en la reduccin del Cu (II) a Cu (I) por los antioxidantes. Hay poca informacin publicada sobre este ensayo (Huang y col., 2005).

20 -

ANTECEDENTES

5) Mtodo del radical 2,2-difenil-1-picrilhidracilo (DPPH) (ver apartado 2.5.1).

c) Ensayos que miden la capacidad de captacin de ROS y NOS. Debido a que las evidencias experimentales han sugerido directa o indirectamente que hay seis principales especies reactivas que causan dao oxidativo en humanos, a saber, aniones superxido (O2-) (Kim y col., 2003), perxido de hidrgeno (H2O2), radicales hidroxilo (HO), singletes de oxgeno (1O2) y peroxinitritos (ONOO-), se han desarrollado ensayos que miden la capacidad de captacin de estos radicales por los fitoqumicos. Sin embargo, no existe un ensayo que mida la capacidad antioxidante de los radicales peroxilo (ROO) (Huang y col., 2005). d) Otros ensayos. Debido al equipo que requiere la realizacin de estas pruebas, son poco comunes. Se han reportado, los ensayos de TOSC (total oxidant scavenging capacity), la de la inhibicin de la reaccin de oscilacin de Briggs-Rauscher, el de quimioluminiscencia y el de electroquimioluminiscencia (Huang y col., 2005; Roginsky y Lissi, 2005; Erdemoglu y col., 2009).

En homogeneizados de tejidos, se aplican tcnicas basadas en la medicin de los productos secundarios de la lipoperoxidacin, como el mtodo del tiocianato, la determinacin de TBARS (thiobarbituric acid reactive substances) (Fogliano y col., 1999). Tambin se cuantifica la actividad de diversas enzimas que pertenecen al sistema antioxidante endgeno, tales como, la CAT, la SOD y la GSHPx (Narvez-Mastache y col., 2007).

A continuacin se describe el mtodo utilizado en el presente trabajo:

2.5.2 Mtodo del DPPH El 2,2-difenil-1-picrilhidracilo (DPPH) es un radical libre estable en virtud de su deslocalizacin electrnica sobre toda la molcula (Figura 6). Esta resonancia, le provee un profundo color violeta, adems de que impide su dimerizacin (Molyneux, 2004).

21 -

ANTECEDENTES

NO 2

O2 N

NO 2

Figura 6. Estructura del 2,2-difenil-1-picrilhidracilo, DPPH

Brand-Williams y col., (1995) reportaron por primera vez el mtodo, con el que evaluaron la actividad antioxidante de diversos compuestos y extractos usando el DPPH en una solucin metanlica.

En su forma de radical libre, el DPPH absorbe a 515 nm y cuando se reduce por accin de un antioxidante (AH) o de un radical (R), la absorcin desaparece.

DPPH + AH DPPH-H + A DPPH + R DPPH-R

En consecuencia, la desaparicin del DPPH proporciona un ndice para estimar la capacidad del compuesto de prueba para atrapar radicales. El modelo que explica la actividad de un compuesto como antirradical se ejemplifica con la siguiente ecuacin:

DPPH + AH DPPH-H + A A + A A-A

Donde AH es un antioxidante que acta como antirradical donando tomos de hidrgeno, dando como resultado radicales con estructuras moleculares estables que detendrn la reaccin en cadena, tal es el caso de los fenoles. El nuevo radical formado (A )

22 -

ANTECEDENTES

puede interactuar con otro radical para formar molculas estables (DPPH-A, A-A) (Molyneux, 2004).

En este mtodo, la eficiencia antioxidante se mide a temperatura ambiente, lo cual elimina el riesgo de la degradacin trmica de las molculas que se analizan. El mecanismo de reaccin entre el DPPH y un compuesto antioxidante depende de la conformacin estructural del mismo, algunos compuestos reaccionan muy rpidamente con el DPPH reduciendo un nmero de molculas de DPPH igual al nmero de grupos hidroxilo disponibles, pero para la mayora de los compuestos analizados, las reacciones son ms lentas y el mecanismo parece ser ms complejo, por lo que las comparaciones cuantitativas no son siempre apropiadas. Para algunos antioxidantes ya existen estudios sobre su comportamiento cintico en la reaccin con el DPPH (Bondet y col., 1997), asimismo, se ha determinado la relacin estructura-actividad de captacin de radicales libres de diversos flavonoides. La reaccin se lleva a cabo generalmente en medio metanlico, para muestras insolubles se puede emplear el DMSO (Seyoum y col., 2006).

2.6 Inflamacin La inflamacin es una reaccin fisiopatolgica del husped a un estmulo nocivo, cuyo objetivo es eliminarlo, por lo que la capacidad de desencadenar una reaccin inflamatoria resulta esencial para la supervivencia. Cualquier factor que induce dao tisular puede ser descrito como la patogenia de la inflamacin. Los estmulos nocivos que desencadenan los procesos inflamatorios pueden ser de diversa ndole, tales como las lesiones causadas por los agentes qumicos (cidos, lcalis, alergenos, aceite mineral, etc.), los fsicos (hematomas, quemaduras, congelacin, radiaciones, etc.), los bioqumicos (microorganismos, parsitos, endotoxinas, toxinas de animales, etc.). Cada estmulo desencadena un tipo de respuesta caracterstica, que determina la magnitud e intensidad del proceso inflamatorio (Rang y col., 2004; Hu y col., 2005; Burke y col., 2007). La intensidad de la respuesta inflamatoria es crucial: si sta es insuficiente puede conducir a
-

23 -

ANTECEDENTES

la inmunodeficiencia, lo que da lugar a las infecciones y cncer. Por otro lado, un exceso de respuesta causa morbilidad y mortalidad que acompaan a las enfermedades con un importante componente inflamatorio, como la artritis reumatoide, la esclerosis mltiple, la isquemia cerebral y del corazn, las enfermedades de Crohn y Alzheimer. En algunos casos, la respuesta inflamatoria alcanza la circulacin sistmica, como en la sepsis, meningitis y muchos otros traumas (Lansky y col., 2007). En estos casos, la inflamacin puede ser mucho ms daina para el organismo que el estmulo original. 2.6.1 Signos clnicos locales de la inflamacin A nivel macroscpico, la inflamacin generalmente se caracteriza por la presencia de calor, dolor, rubor, tumefaccin (hinchazn) y alteracin o prdida de la funcin en el rea afectada. Estos signos de la respuesta inflamatoria son inducidos por 1) cambios del flujo y calibre vascular (denominados tambin cambios hemodinmicos), 2) cambios en la permeabilidad vascular y 3) fenmenos celulares que corresponden a la exudacin y emigracin leucocitaria desde la microcirculacin hasta el foco inflamatorio. A nivel local de los tejidos, los cambios pueden dividirse en fenmenos celulares y vasculares. Los mediadores se generan a partir del plasma y las clulas, que a su vez, modifican y regulan las reacciones vasculares y celulares (Crotan y col., 1990). La respuestas inflamatorias surgen en tres fases cronolgicas precisas, dependiendo de la patogenicidad y persistencia del estmulo, cada fase parece ser mediada por mecanismos diferentes: 1) una fase aguda que se caracteriza por vasodilatacin local transitoria y mayor permeabilidad capilar, 2) una fase subaguda tarda caracterizada por la infiltracin de leucocitos y las clulas fagocticas, y 3) una fase proliferativa crnica en que hay degeneracin y fibrosis hsticas (Burke y col., 2007). 2.6.2 Respuestas sistmicas de la inflamacin Adems de los cambios locales en la zona inflamada, con frecuencia surgen varias respuestas generales, como signos extrafocales (como linfadenopata dolorosa, fiebre y

24 -

ANTECEDENTES

astenia) y datos hematolgicos (como leucocitosis, neutroflia, trombocitosis e incremento en la velocidad de sedimentacin globular) (Leyva y Quezada, 2008). Existe tambin un incremento de determinadas protenas plasmticas denominadas protenas de fase aguda. Entre ellas figura la protena C reactiva, la 2-macroglobulina, el fibringeno, la 1antitripsina y algunos componentes del complemento. La protena C reactiva se une a determinados microorganismos y los complejos resultantes activan al complemento (Rang y col, 2004). Tambin, puede haber una prdida de peso debido a un aumento en el gasto energtico as como astenia para reducir la demanda de energa. La mayora de las manifestaciones sistmicas de la inflamacin son consecuencia de la accin de citocinas proinflamatoria, como las interleucinas 1 y 6 (IL-1, 6) y el TNF- (Leyva y Quezada, 2008). 2.6.3 Componentes generales de la respuesta inflamatoria El terreno de la respuesta inflamatoria es el tejido conjuntivo vascularizado, incluyendo el plasma, las clulas circulantes, los vasos sanguneos y los componentes celulares y extracelulares del tejido conjuntivo. Las clulas circulantes que tienen importancia en la inflamacin son los neutrfilos, los monocitos, los eosinfilos, los linfocitos, los basfilos y las plaquetas. Las clulas del tejido conjuntivo son las clulas cebadas que estn en ntima relacin con los vasos sanguneos, los fibroblastos y en ocasiones los linfocitos y los macrfagos del mismo. Los componentes extracelulares de mismo, son la membrana basal y los distintos tipos de colgeno, elastina y proteoglicanos (sulfato heparn, sulfato de condroitin y cido hialurnico) (Crotan y col., 1990). 2.6.4 Mecanismos de la inflamacin Innumerables mecanismos participan en el desencadenamiento y la resolucin del proceso inflamatorio, stos son muy complejos, varan de un tejido a otro y dependen del agente etiolgico. Los mecanismos comunes incluyen la liberacin de diversos mediadores, los estmulos quimiotcticos, la fagocitosis y la liberacin de enzimas lisosomales, as como la

25 -

ANTECEDENTES

activacin de las vas de la coagulacin, la fibrinoltica, de las cininas y del complemento. Estudios anteriores, destacaron la promocin de la migracin de clulas fuera de los vasos muy finos, pero investigaciones recientes se han orientado hacia interacciones adhesivas que incluyen las selectinas E, P y L, la molcula de adherencia intercelular 1 (ICAM-1), la molcula de adherencia de clulas vasculares 1 (vascular cell adhesin molecule-1, VCAM-1) y las integrinas leucocitarias, en la adherencia de leucocitos y plaquetas al endotelio en los sitios de inflamacin. Las clulas endoteliales activadas intervienen decisivamente en la biodestinacin de clulas circulantes hacia los sitios de inflamacin, as como en la produccin de selectinas, integrinas y en la superfamilia de inmunoglobulinas. La expresin de las molculas de adherencia vara segn los tipos celulares que intervienen en la reaccin inflamatoria. Adems de las molculas de adherencia celular, el reclutamiento de las clulas de inflamacin hacia los sitios de la lesin incluye las interacciones concertadas de varios tipos de mediadores solubles; entre ellos figuran el factor C5a del complemento, el factor activador plaquetario y el leucotrieno B4 (LTB4). Todos ellos actan como agonistas quimiotcticos. Algunas citocinas tambin desempean funciones esenciales para concertar el proceso inflamatorio, en particular la IL-1 y el TNF que son secretados por monocitos, macrfagos, adipositos y otras clulas. Otras citocinas y factores del crecimiento (como son IL-2, IL-6, IL-8 y el factor estimulante de colonias de granulocitos y macrfagos (granulocyte-macrophage colony stimulating factor, GM-CSF) contribuyen a las manifestaciones de la reaccin inflamatoria (Burke y col., 2007). 2.6.5 Tipos de inflamacin de acuerdo con la persistencia del estmulo 2.6.5.1 Inflamacin aguda y subaguda tarda Tienen una duracin relativamente corta, desde unos minutos a varias horas o uno o dos das, y sus principales caractersticas son la vasodilatacin local transitoria, la mayor permeabilidad capilar, la exudacin de lquido y protenas plasmticas (edemas) y la emigracin leucocitaria, predominantemente de neutrfilos. Independientemente de la naturaleza del
-

26 -

ANTECEDENTES

agente lesivo, estos tipos de inflamacin son bastante estereotipados. La respuesta inflamatoria se produce en el tejido conjuntivo, hacia el cual filtran el plasma y los elementos formes de la sangre desde los vasos sanguneos lesionados por la agresin o desde los vasos que se hacen ms permeables en respuesta a la lesin. Se produce as, el enrojecimiento (eritema) por la dilatacin de los vasos, el hinchamiento (edema) por el escape de lquido a los tejidos blandos y el endurecimiento por la acumulacin de los lquidos y las clulas. Estos fenmenos desembocan en la prdida de la capacidad normal de los vasos sanguneos para retener en su interior las clulas y los lquidos; pero estos cambios no significan obligatoriamente una alteracin estructural del vaso. Los neutrfilos son los componentes ms numerosos en este tipo de inflamacin y se encargan de la fagocitosis de las bacterias y de otros microorganismos extraos, adems de la fagocitosis pasiva de las clulas del tipo conjuntivo, de los eritrocitos daados y de la fibrina. Los monocitos tambin penetran al tejido conjuntivo durante la inflamacin y se transforman en macrfagos que fagocitan las clulas y los restos titulares, la fibrina, las bacterias remanentes e incluso los neutrfilos utilizados. Los linfocitos, los eosinfilos y los basfilos se relacionan con los aspectos inmunolgicos del proceso inflamatorio. Los mediadores qumicos de la respuesta inflamatoria aguda pueden originarse en el plasma, en las clulas y probablemente, en los tejidos lesionados. Estos pueden dividirse en los siguientes grupos: Aminas vasoactivas: histamina y serotonina Proteasas plasmticas: 1) el sistema de cininas (bradicinina y calicrena) 2) el sistema del complemento (C3a, C5a, C5b-C9)

27 -

ANTECEDENTES

3) el sistema fibrinoltico de la coagulacin (fibrinopptidos, productos de la degradacin de la fibrina) Los metabolitos del cido araquidnico (AA): 1) va COX (endoperxidos, prostaglandinas, TX) 2) va LOX (leucotrienos; HPETE, HETE) Constituyentes lisosmicos (proteasas) Radicales libres derivados del oxgeno Factores activadores de plaquetas, FAP Citocinas Factores de crecimiento

Las principales acciones que ejercen estos mediadores en la respuesta inflamatoria aguda y subaguda tarda pueden resumirse en la Tabla 1.

Tabla 1. Mediadores qumicos implicados en la inflamacin aguda y sus principales acciones

Caracterstica de la respuesta inflamatoria

Vasodilatacin Vasoconstriccin Incremento de la permeabilidad vascular Quimiotaxis

Mediadores
Prostaglandinas (PGI2, PGE1, PGE2, PGD2) TXA2, HPETE, endoperxidos, leucotrienos C4, D4, E4 Aminas vasoactivas, C3a y C5a (a travs de la liberacin de aminas), bradicinina, leucotrienos C4, D4, E4, FAP C5a, leucotrieno B4, HHT, HPETE, HETE, D4, E4, otros lpidos qumiotcticos, productos bacterianos IL-1, TNF, prostaglandinas Prostaglandinas, bradicinina Enzimas lisosmicas de los neutrfilos y macrfagos, metabolitos del oxgeno

Fiebre Dolor Lesin tisular

(modificado de Crotan y col., 1990)

La evolucin del foco inflamatorio puede seguir diferentes rutas. La ideal es la resolucin, que consiste en el restablecimiento de la normalidad tisular y funcional, por lo

28 -

ANTECEDENTES

que se requiere una organizacin y restablecimiento de la permeabilidad vascular, el cese de la migracin leucocitaria, la apoptosis de los leucocitos PMN extravasados y la eliminacin de los mediadores qumicos; entonces el restablecimiento se logra por la accin del drenaje linftico y la digestin macrofgica que conducen a la eliminacin del edema, las clulas inflamatorias y los restos necrticos.

Cuando la destruccin del tejido es amplia o las clulas no tienen la capacidad de regeneracin, la secuela ser la cicatrizacin, que consiste en la curacin mediante la sustitucin del tejido original por el tejido conjuntivo, conocido como fibrosis. Por ltimo, si el agente patgeno persiste, la respuesta inflamatoria aguda podra convertirse en una respuesta inflamatoria crnica (Leyva y Quezada, 2008).

2.6.5.2 Inflamacin crnica Es una reaccin lenta y latente que continua durante meses e incluso aos y supone la destruccin tisular, as como la proliferacin local de las clulas y del tejido conjuntivo. Puede desarrollarse por diferentes causas, como a) la progresin de una inflamacin aguda, b) episodios recurrentes de inflamacin aguda y c) la inflamacin crnica in novo. Se caracteriza por la presencia constante de linfocitos, monocitos y clulas plasmticas, debido a que el estmulo nocivo ha sido persistente. La presencia de estas clulas inflamatorias puede dar lugar a alteraciones funcionales del tejido, ya sea por la accin directa de los mediadores producidos por las clulas linfoides o bien por el depsito continuo de colgeno por los fibroblastos debida a la cicatrizacin. Los principales tipos celulares que se encuentran en las zonas de inflamacin crnica son las clulas mononucleares y las clulas anormales derivadas de los macrfagos. En las zonas de la cicatrizacin y la inflamacin crnica estn activos diversos factores de crecimiento; existe angiogenia y tambin una mayor actividad de los fibroblastos, que se encuentran por debajo del tejido fibroso.

29 -

ANTECEDENTES

Los mediadores ms importantes en la cicatrizacin, en los procesos de reparacin y las reacciones inflamatorias crnicas son, entre otros, el factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF), el de crecimiento del endotelio vascular, el de crecimiento transformador, el de crecimiento tumoral-beta (TGF-) y varios factores de crecimiento de fibroblastos (FGF). 2.6.5.3 Inflamacin crnica granulomatosa Es un tipo especfico de reaccin inflamatoria crnica, que se caracteriza por la acumulacin de macrfagos modificados que se denominan clulas epitelioides y que se inicia por diversos agentes infecciosos y no infecciosos. Para la formacin de granulomas es necesaria la presencia de productos irritantes poco digeribles, de una reaccin inmunitaria mediada por clulas T (con produccin de interfern-) frente al agente irritante, o de ambos. El monocito evoluciona a macrfago, que es ms activo y tiene grnulos ms potentes, un citoplasma ms amplio y con mayor capacidad de divisin. El macrfago se activa por la respuesta a un estmulo y se convierte en una clula ms grande, con un citoplasma ms amplio, ms retculo endoplsmico rugoso, ms mitocondrias y un ncleo alargado (clula epitelioide). El macrfago es sensible a agentes inflamatorios que son irritantes y difciles de degradar, pero que son inertes. Se llama granuloma a la zona local de la inflamacin granulomatosa, que consiste en la acumulacin microscpica de macrfagos transformados en clulas epitelioides (0,5 a 2 mm), rodeados de un collar de leucocitos mononucleares, principalmente linfocitos y en ocasiones clulas plasmticas. Los granulomas ms evolucionados aparecen rodeados de fibroblastos. Con frecuencia, las clulas epitelioides se fusionan y forman clulas gigantes en la periferia de los granulomas. Estn constituidas por una masa de citoplasma que contiene veinte o ms ncleos dispersos por el mismo (clulas gigantes de tipo cuerpo extrao), si se disponen en la periferia se denominan clulas gigantes tipo Langhans y si son centrales, con citoplasma vacuolado, se denominan clulas gigantes de tipo Touton. Estas clulas pueden tener

30 -

ANTECEDENTES

inclusiones citoplasmticas denominadas cuerpos conchoides o de Schaumann (Crotan y col., 1990). 2.7 Papel de las especies reactivas en la inflamacin Durante la inflamacin existe una generacin excesiva de radicales libres, provenientes de diferentes fuentes, las cuales a su vez participan activamente en la evolucin del proceso inflamatorio y sus consecuencias. Los metabolitos reactivos del oxgeno elaborados en los neutrfilos y macrfagos pueden ser liberados tras la exposicin a los agentes quimiotcticos, inmunocomplejos o ante la fagocitosis (Crotan y col., 1990). Por ejemplo, cuando la NADPH oxidasa que reside en las clulas mono y PMN se activa, genera especies reactivas del oxgeno (ROS). Adems del rol defensivo de las ROS como microbicidas, stas son el estmulo ms potente que incrementa la permeabilidad vascular, la produccin de citocinas proinflamatorias (TNF-, IL-8, IL-1) que a su vez estimulan ms produccin de ROS, de factores quimiotcticos (LB4), activan las molculas de adhesin leucocitaria endotelial, inactivan antiproteasas como la -1-antitripsina lo cual incrementa la destruccin de los componentes tisulares como la elastina, provocan peroxidacin lipdica en las membranas plasmticas y oxidacin del DNA. De esta forma, las ROS desregulan las funciones celulares e inducen dao tisular, lo cual incrementa en estado de inflamacin (Kim y col., 2008; Roome y col., 2008). Las ROS promueven la actividad de los factores proinflamatorios nucleares sensibles a cambios redox, incluyendo el factor de transcripcin nuclear kappa B (NFB) (Kim y col., 2008). Este a su vez aumenta la expresin del gen codificante de la enzima xido ntrico sintasa inducida (iNOS), que promueve la sntesis de xido ntrico (NO, gas considerado un radical libre) por las clulas endoteliales, lo cual determina la vasodilatacin. El NO tiene una accin corta y local. Tambin es producida por los macrfagos, ya que las interleucinas activan las sintasas del NO; cuando stas se liberan en cantidades incontroladas, se producen vasodilatacin perifrica y necrosis tisular (Leyva y Quezada, 2008).

31 -

ANTECEDENTES

Los isoprostanos son ismeros de las prostaglandinas que se producen in vivo independientemente de la COX, por peroxidacin no enzimtica del AA y del cido docosohexanoico (DHA) inducida por radicales libres. Durante su formacin, se producen varios intermediarios, entre los cuales estn los isocetales o isolevuglandinas, celtoaldehdos acclicos altamente reactivos, que contribuyen y amplifican el dao celular debido a su habilidad para modificar covalentemente biomolculas crticas. Los isoprostanos son marcadores del estrs oxidativo y se ha demostrado que tienen numerosos efectos biolgicos, lo cual sugiere que funcionan como mediadores patofisiolgicos del estrs oxidativo, por lo que se sugiere su importancia en la prctica mdica (Montuschi, 2004). Los isoprostanos, y en particular, los isocetales, son importantes agentes que contribuyen al dao tisular, ya que su produccin es retroalimentada, por los radicales libres generados en exceso durante la inflamacin. Las fuentes potenciales de O2- (la produccin de esta especie determina el balance fisiolgico de las ROS) incluyen la cadena de trasporte de electrones mitocondrial, el citocromo P450, la xantina oxidasa, las sintasas del NO, pero las principales son las enzimas COXs, LOXs y las NADPH oxidasas. Se ha observado que la actividad de la 5-LOX est relacionada con la produccin intracelular de ROS. El O2- se dismuta a H2O2 y se cree que esta ltima ROS es la ms importante en la modulacin de los eventos proinflamatorios (Kim y col., 2008). La inflamacin crnica es una de las principales causas de cncer e investigaciones han demostrado que el mecanismo de accin involucra la participacin de agentes oxidantes (Ames y col., 1993). La sobreproduccin de oxidantes conduce tambin a una deplecin de los sistemas antioxidantes endgenos. Por lo tanto, la influencia de los radicales libres en una determinada reaccin inflamatoria depende del equilibrio entre la produccin e inactivacin de estos metabolitos por las clulas y tejidos a travs de sus mecanismos protectores antioxidantes (Crotan y col., 1990). Debido a que la tensin oxidativa es un factor desencadenante metablico potente para

32 -

ANTECEDENTES

el proceso inflamatorio (Lansky y col., 2007), la regulacin de las concentraciones de ROS intracelulares y extracelulares, as como de las especies reactivas de nitrgeno durante la inflamacin tienen un rol crucial en el tratamiento de las enfermedades que presenten eventos inflamatorios. 2.8 Frmacos antiinflamatorios La inflamacin aguda o fisiolgica es una respuesta benfica al dao tisular, pero cuando se retrasa su resolucin oportuna, puede dar lugar a enfermedades inmunoasociadas, tales como artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria intestinal (EII), cncer, entre otras (Lansky y col., 2007), todas directa o indirectamente, a travs de la introduccin de las clulas inflamatorias en el estroma circundante. Es por esto que la industria farmacutica ha creado frmacos que disminuyen el proceso inflamatorio, las dos clases ms importantes de agentes farmacolgicos que inhiben la respuesta inflamatoria aguda, subaguda o crnica son: 1) Frmacos antiinflamatorios esteroides o corticoesteroides (hormonas

glucocorticoideas suprarrenales, AIE), cuyo prototipo es la hidrocortisona. 2) Frmacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE), cuyo prototipo es la aspirina (Rang

y col., 2004; Burke y col., 2007). 2.8.1 Antiinflamatorios no esteroideos Son los medicamentos ms recetados en casi todos los pases del mundo. La denominacin antiinflamatorios no esteroideos hace referencia, adems de a su estructura qumica, a su mecanismo de accin independiente del efecto de los esteroides sobre la fosfolipasa A2. Todos los AINE tienen una eficacia teraputica similar y ninguno est exento de reacciones adversas, por lo que en el momento de su prescripcin debe considerarse el costo del tratamiento de cada uno de ellos (Kravzov y Altagracia, 1997).

33 -

ANTECEDENTES

2.8.1.1 Mecanismo de accin Los principales efectos teraputicos de los AINE provienen de sus capacidad de inhibir la biosntesis y liberacin de prostaglandinas como mediadores de la inflamacin (al inhibir con mayor o menor potencia y especificidad, las isoformas de la COX), as como la disminucin inespecfica de la permeabilidad, ya que las prostaglandinas actan como factores inmediatos de la inflamacin y son las responsables del dolor, la vasodilatacin, el aumento de la permeabilidad vascular y la fiebre (Figura 8). La va 5-lipooxigenasa [5-LOX], que produce leucotrienos, no resulta afectada por los AINE. Tampoco se ve afectado el metabolismo del cido araquidnico (AA) que llevan a cabo las enzimas que contienen al citocromo P-450 (Figura 7). La primera enzima en la va de sntesis de las prostaglandinas es la sintasa de prostaglandina G/H, llamada tambin COX, enzima que transforma el AA (liberado de las membranas celulares, debido a la presencia del estmulo nocivo) en los productos inestables PGG2 y PGH2, y que culmina en la produccin de TXA2 y diversas prostaglandinas. Se conocen dos formas de COX, la forma 1 (COX-1) y la forma 2 (COX-2). Se han descrito variantes de la COX-1 que conservan su actividad enzimtica a pesar del corte y empalme, una de las cuales se denomina "COX-3". La COX-1 es predominantemente una isoforma constitutiva que aparece en casi todas las clulas y tejidos normales, en tanto que las citocinas y los mediadores de inflamacin que acompaan a esta ltima inducen la produccin de COX-2. Sin embargo, la COX-2 tambin se expresa en forma constitutiva en algunas zonas de los riones y del encfalo, y su actividad es inducida por clulas endoteliales. Como dato importante, la isoforma constitutiva dominante en las clulas del epitelio gstrico es COX-1, y constituye la principal fuente para la formacin de prostaglandinas citoprotectoras (Burke y col., 2007; Rang y col., 2007; Halter y col., 2001).

34 -

ANTECEDENTES

Los antiinflamatorios no esteroideos, en concentraciones altas, tambin aminoran la produccin de radicales superxido, inducen la apoptosis, inhiben la expresin de molculas de adherencia, disminuyen la cantidad de citocinas proinflamatorias (como TNF-, IL-1); modifican la actividad de linfocitos y alteran otras funciones de la membrana celular. Sin embargo, difieren las opiniones en cuanto a que las acciones mencionadas puedan contribuir a la actividad antiinflamatoria de dicho grupo de frmacos en las concentraciones que se logran en el uso clnico (Burke y col., 2007; Kravzov y Altagracia, 1997).

35 -

ANTECEDENTES

Fosfolpidos de la membrana celular Fosfolipasa A2

Glucocorticoides

cido araquidnico (AA)

Liso-gliceril-fosforilcolina

Va lipooxigenasa

Va ciclooxigenasa

Citocromo P-450

FAP (vasodilatador, aumenta la permeabilidad vascular, broncoconstrictor, quimiotaxina)

12-lipooxigenasa 5-lipooxigenasa 5-HPETE

Antagonistas del FAP

12-HETE (quimiotaxina) 15- lipooxigenasa LTC4 Lipoxinas A y B Antagonistas de los receptores de leucotrienos

LTA4

LTB4 (quimiotaxina)

LTB4 LTE4 (Broncoconstrictores; aumentan la permeabilidad vascular)

Figura 7. Mediadores inflamatorios derivados del metabolismo de los fosfolpidos de la membrana y de la va de la LOX del AA; frmacos que inhiben su formacin (modificado de Crotan y col., 1990)

36 -

ANTECEDENTES

Fosfolpidos de la membrana celular Fosfolipasa A2 AINE AA

COOH

Va ciclooxigenasa Endoperxidos cclicos PGG2 y PGH2

Antagonistas de TXA2 sintetasa

PGI2 (vasodilatador; hiperalgsico; detiene la agregacin plaquetaria) Antagonistas de PG TX2A (trombtico; vasoconstrictor)

PGF2 (broncoconstrictor; contraccin miometrial)

PGD2 (inhibe la agregacin plaquetaria, vasodilatador)

PGE2 (vasodilatador, hiperalgsico)

Figura 8. Mediadores inflamatorios derivados del metabolismo del AA por la va de la COX y frmacos que inhiben su formacin (modificado de Crotan y col., 1990)

37 -

ANTECEDENTES

2.8.1.2 Efectos adversos La reaccin adversa ms comn de los AINE (con excepcin de los COX-2 selectivos y de los paraaminofenoles, que producen erosiones y lceras mucosas con un riesgo 3 veces menor que con los no selectivos) es lo que se ha denominados gastropata por AINE, es decir irritacin ulcerogastroduodenal, cuando se consumen frecuentemente. Los mecanismos por los cuales los AINE provocan dao en la mucosa gastrointestinal son diversos. La inhibicin de la COX provoca un decremento en la secrecin de moco y bicarbonato, reduce el flujo sanguneo y causa dao vascular, la acumulacin de leucocitos, la disminucin en el nmero de clulas, factores que contribuyen al gnesis del dao en la mucosa. Adems, debido a la inhibicin de la formacin de prostaglandinas, existe un aumento del nmero de neutrfilos adheridos al endotelio vascular de las vnulas gstricas y mesentricas, lo cual causa estasis microvascular y dao a la mucosa por isquemia y el incremento de radicales libres y proteasas. Aunque la inhibicin de la sntesis de prostaglandinas juega un rol importante en la induccin del dao en la mucosa, no es el nico mecanismo por el cual los AINE provocan dao en la mucosa gastrointestinal, ya que estos frmacos tambin inducen dao local en el sitio de contacto, al incrementar la permeabilidad gastrointestinal (GI), lo cual a su vez permite que pasen factores agresivos de la luz a la mucosa (Halter y col., 2001). Los AINE tambin afectan el tracto gastrointestinal por otros mecanismos (Figura 9).

38 -

ANTECEDENTES

Inhibicin de la produccin de TX en plaquetas Inhibicin de plaquetaria Incremento en sangrado la el agregacin tiempo de

Propiedades irritantes tpicas Incremento en la permeabilidad GI Desacoplamiento de la fosforilacin oxidativa mitocondrial Prdida del control citoesqueltico en las uniones tight junction Decremento de la hidrofobicidad Efecto global: erosiones y lceras GI

Efecto global: hemorragia digestiva

Inhibicin de prostaglandinas

la

sntesis

de

Dao en los vasos sanguneos Incremento de las molculas de adhesin Acumulacin de leucocitos Dao en las clulas endoteliales Efecto global: erosiones y lceras GI

Decremento en la secrecin de moco y bicarbonato Vasoconstriccin Efecto global: deterioro de la defensa y reparacin de la mucosa

AINE

Inhibicin de los mecanismos de reparacin Inhibicin de la proliferacin celular Incremento en la apoptosis Inhibicin de la angiognesis Efecto global: reparacin GI deterioro de la

Otros efectos de los AINE: Inhibicin de otras enzimas incluyendo la fosfolipasa (ejemplo, sulindac) Produccin de especies reactivas de oxgeno Interacciones con la sintasa inducible de xido nitroso y xido ntrico Efectos directos sobre los genes (ejemplo, aspirina)

Figura 9. Mecanismos de dao del tracto gastrointestinal, causados por los AINE (Halter y col., 2001)

39 -

ANTECEDENTES

2.9 Indometacina 2.9.1 Caractersticas y mecanismo de accin Indometacina, un derivado indlico metilado, es un potente antiinflamatorio no esteroideo (AINE) no selectivo utilizado desde 1965. Se introdujo en 1963 para tratar la artritis reumatoide y los trastornos afines. Su nombre qumico es 1-(p-clorobenzoil)-5-metoxi-2metilindol-3 actico.
O H 3CO CH 2 COH CH 3 N C O Cl

Figura 10. Estructura de la indometacina

Se considera que el grupo carbonilo en la posicin 3 le confiere acidez a la molcula y por lo tanto mayor potencia antirreumtica, mientras que el grupo arilacilo en la posicin 1, el metoxilo en la posicin 5 y la presencia del halgeno en la posicin para del grupo 1-benzoilo, son en gran parte los responsables de su actividad antiinflamatoria, ya que estos grupos pueden formar puentes de hidrgeno que retardan su absorcin y prolongan sus efectos (Salama y Avendao, 2005). La indometacina tiene un peso molecular de 357.8, pKa de 4.5, es un polvo blanco amarillento plido a amarillo tostado; inodoro o con olor suave; de sabor ligeramente amargo; sensible a la luz; estable en el aire y estable al calor, en la condiciones habituales de temperatura ambiente; una forma polimrfica se funde alrededor de 155 C y la otra alrededor de 162 C. Es insoluble en agua, pero soluble en etanol, ter, acetona y aceite de ricino. Es estable en soluciones neutras o ligeramente cidas. Se descompone en bases fuertes. Tanto la forma slida como sus soluciones se deben proteger de la luz solar.

40 -

ANTECEDENTES

La dosis letal media (DL 50) intraperitoneal (i.p.) en ratas, es de 13 mg/kg. La sal sdica trihidratada, es un polvo cristalino amarillo plido que en estado seco es bastante estable, muy soluble en metanol, soluble en agua y etanol, muy ligeramente soluble en cloroformo y acetona (Budavari, 2001). La indometacina es un potente inhibidor de la va de la COX, ms afn por la COX-1, por lo tanto inhibe la sntesis de prostaglandinas. Reduce la produccin de renina por parte de las clulas yuxtaglomerulares, lo cual puede dar como resultado importantes efectos sobre la presin arterial, el agua y la sal, independientes de las prostaglandinas. La indometacina tambin inhibe movilidad de los PMN y puede tener un efecto vasoconstrictor directo independiente de la COX. Asimismo, puede afectar las funciones del monofostafo de adenosina cclico (AMPc) en virtud de su efecto inhibidor sobre la fosfodiesterasa (Burke y col., 2007). La actividad antiinflamatoria de la indometacina, fue demostrada por primera vez en animales, al medir su capacidad para inhibir la formacin del granuloma o el edema inducido por la inyeccin subplantar de la carragenina en ratas. 2.9.2 Farmacocintica y farmacodinmia La indometacina tiene una excelente biodisponibilidad por va oral, pero tambin puede ser absorbida en la mucosa rectal cuando se administra en supositorios. Una vez absorbida, se alcanzan concentraciones mximas en 1 o 2 h y se une en un 90% a las protenas plasmticas. La concentracin del frmaco en el lquido cefalorraqudeo es pequea, pero la del lquido sinovial es igual a la del plasma, en cuestin de 5 h despus de la administracin. Entre 10 y 20% del producto se excreta sin cambios por la orina, en parte por la secrecin tubular. La mayor parte se transforma en metabolitos inactivos por las enzimas
-

41 -

ANTECEDENTES

microsomales hepticas, como los que resultan de la O-desmetilacin (aproximadamente la mitad), la conjugacin con cido glucurnico (aproximadamente 10%) y la N-desacilacin (Burke y col., 2007). Los metabolitos libres y conjugados se eliminan en la orina, la bilis y las heces. Se observa reciclado enteroheptico de los conjugados y probablemente de la propia indometacina. La semivida en plasma es variable, pero dado el ciclo enteroheptico, dura unas 2.5 h en humanos. 2.9.3 Efectos adversos Los AINE, entre ellos la indometacina, son los medicamentos con mayor nmero de reportes de efectos adversos, su administracin provoca efectos txicos generales con diferentes grados de severidad (Halter y col., 2001; Hanson, 2003). El ms frecuente es una propensin a inducir lceras gstricas o intestinales, que se acompaan a veces por leucopenia, trombocitopenia y en ocasiones anemia aplsica, resultante de la prdida sangunea (Kravzov y Altagracia, 1997). Un porcentaje muy alto de personas (35 a 50%) que reciben indometacina en las dosis teraputicas usuales, muestran sntomas adversos y cerca de 20% debe interrumpir su uso por esa causa. Muchos de tales efectos son dependientes de la dosis. Las molestias gastrointestinales son frecuentes y pueden ser graves. Surge a veces diarrea y en ocasiones, conlleva lesiones ulcerosas en los intestinos. En un experimento utilizando un modelo de lcera gstrica, se observ que la indometacina redujo la velocidad de la curacin predominantemente, en la segunda semana despus de la induccin de lcera, mientras que su accin fue marginal en la primera semana (Halter y col., 2001). El efecto ms frecuente en el SNC (y con ello el ms frecuente en general) es la cefalalgia frontal intensa que aparece en el 25 a 50% de las personas que reciben el medicamento por largo tiempo. Se observan a veces mareos, vrtigos, obnubilacin leve y confusin psquica. Tambin, se han sealado convulsiones y en casos de depresin, pueden presentarse, psicosis, alucinaciones graves y suicidios.

42 -

ANTECEDENTES

2.10 Modelos farmacolgicos preclnicos para evaluar la actividad antiinflamatoria Los modelos de inflamacin permiten estimar el potencial de los candidatos a ser frmacos antiinflamatorios de uso en humanos (Martnez y col., 2004). Existen diversos mtodos in vivo e in vitro que permiten estudiar el efecto antiinflamatorio a nivel sistmico, stos se deben elegir de acuerdo a la etapa de inflamacin que se pretenda evaluar. Los mtodos se describen minuciosamente en Pablo, 2009.

43 -

JUSTIFICACIN

3. JUSTIFICACIN

os frmacos antiinflamatorios de uso actual, inducen efectos secundarios en la mayora de los pacientes, por ejemplo los AINE provocan irritacin de la mucosa gstrica de

diversa severidad, por lo que es indispensable contar con nuevas alternativas teraputicas con efecto antiinflamatorio, menor toxicidad y costo. Las propiedades antioxidantes de los flavonoides y sus posibles acciones fisiolgicas, han producido inters en estos compuestos en los ltimos aos. Diversos polifenoles con

potencial antioxidante han mostrado actividad antiinflamatoria al inhibir enzimas implicadas en dicho proceso, por lo que se ha sugerido una relacin entre el estrs oxidativo y las enfermedades inflamatorias. Estudios previos reportaron la presencia de diversos flavonoides en Eysenhardtia polystachya (Ort.) Sarg. por lo que resulta interesante evaluar si su actividad antiinflamatoria se debe a estos metabolitos.

44 -

HIPTESIS Y OBJETIVOS

4. HIPTESIS

i las fracciones flavonoicas son las responsables de la actividad antiinflamatoria y antioxidante de los extractos totales de Eysenhardtia polystachya (Ort.) Sarg., entonces el

proceso inflamatorio disminuir en el modelo del granuloma en la rata.

5. OBJETIVOS
5.1 Objetivo general

eparar la fraccin rica en flavonoides de Eysenhardtia polystachya (Ort.) Sarg. y evaluar su efecto antiinflamatorio mediante el modelo del granuloma en la rata, as como su

efecto antioxidante in vitro. 5.2 Objetivos particulares Separar los compuestos de naturaleza flavonoica presentes en el extracto etanlico de la corteza de palo dulce Cuantificar los fenoles totales y los flavonoides totales presentes en el extracto crudo y las fracciones Determinar el potencial antioxidante in vitro del extracto crudo y de las fracciones Evaluar la actividad antiinflamatoria de las fracciones ricas en flavonoides Evaluar la actividad ulcerogastroduodenal de los tratamientos a nivel macroscpico e histolgico Integrar los resultados anteriores a travs del establecimiento de inter-relaciones entre la actividad biolgica y la naturaleza qumica de los compuestos

45 -

METODOLOGA

6. METODOLOGA
6.1 Recoleccin e identificacin de Eysenhardtia polystachya (Ort.) Sarg. Se recolectaron trozos de tronco, corteza, tallos y hojas de la especie vegetal y se identificaron por la Biloga Laura Doval Ugalde, en el Departamento de Botnica de la Escuela Nacional de Ciencias Biolgicas del IPN, de acuerdo con las claves taxonmicas correspondientes. Las partes de la especie se secaron al aire libre y a la sombra, una vez secas se molieron, con excepcin de las hojas, hasta obtener partculas de tamao medio. 6.2 Preparacin del extracto etanlico La preparacin del extracto etanlico, se realiz mediante el mtodo de maceracin, que consisti en colocar las partes de la especie vegetal, excepto las hojas, (6.1 kg,

previamente secas y molidas) en un recipiente con 16.5 L de etanol y se dejaron reposar aproximadamente 7 das a temperatura ambiente (Granda, y col., 1988; Farmacopea Herbolaria de los Estados Unidos Mexicanos, Anexo 5, 2001). Al trmino de este tiempo, para concentrar el extracto, se evapor el etanol a presin reducida. 6.3 Anlisis fitoqumico preliminar Se realiz un anlisis fitoqumico preliminar de la infusin y decoccin de las hojas y la corteza del palo dulce, as como del extracto etanlico con el fin de corroborar la presencia de compuestos fenlicos, en particular flavonoides, mediante reacciones colorimtricas y de precipitacin (Domnguez, 1979; Pablo, 2009). 6.4 Aislamiento de la fraccin rica en flavonoides a) Cromatografa por filtracin en gel Se pesaron 500 mg del extracto etanlico y se colocaron en una columna cromatogrfica de vidrio de 30 cm de largo y 2.5 cm de dimetro interno, previamente empacada con 50 g de sephadex LH-20 (gel dextrano, donde las molculas estn unidas entre s con enlaces

46 -

METODOLOGA

cruzados), el eluyente fue metanol (MeOH). La velocidad de flujo fue de 1.5 mL/min. El avance del extracto por la columna se sigui por los diferentes colores en los que se separaba el extracto. A cada fraccin (10 mL) se le comprob la presencia de flavonoides mediante la reaccin colorimtrica con 2 gotas de cido sulfrico concentrado (H2SO4 conc.) (Domnguez, 1979; Pablo, 2009). Las fracciones que resultaron tener intensidad de color similar se reunieron y a estas mezclas de fracciones se les realizaron cromatografas de capa fina de slica gel HF254 utilizando como fase mvil una solucin de AcEt/MeOH/H2O (80:15:5, v/v) para separar los metabolitos, ya que los flavonoides poseen diferentes solubilidades (Domnguez, 1979) (y se desconoca si se encontraban libres o como glicsidos). Los cromatogramas se revelaron utilizando luz UV de onda larga de 366 nm, vainillina 1%-H2SO4, vapores de amoniaco (NH3) y/o yodo sublimado (I2) (Erdemoglu y col., 2009). Nuevamente, las fracciones que tuvieron manchas, color y Rf similares se juntaron y se concentraron. b) Cromatografa de columna seca Antes de realizar la separacin del extracto etanlico por medio de la cromatografa en columna seca (DCC), se obtuvo la fase mvil que mejor separaba los metabolitos presentes en el extracto, para lo cual se emplearon placas cromatogrficas de slica gel HF254 con soporte de aluminio y/o vidrio. Las fases mviles que se analizaron fueron a) isocrticas: mezclas de hexano/AcEt (60:40, v/v), MeOH/acetona (60:40, v/v), AcEt:MeOH (60:40, v/v), AcEt/MeOH/H2O con las siguientes proporciones 80:15:5, 70:25:5, 70:20:10, 70:15:5 y, v/v, y b) por gradiente: hexano/CHCl3/AcEt (50:30:20, v/ v) y posteriormente AcEt/MeOH (90:10, v/v) al hacer una cromatografa bidimensional. La columna se empac con 2 750 g de slica gel, se pesaron aproximadamente 30 g del extracto etanlico y se colocaron en una columna de 121 cm de largo por 15 cm de dimetro, el eluyente fue una mezcla de AcEt/MeOH/H2O (70:15:15, v/v). A las fracciones obtenidas se les realizaron reacciones colorimtricas y varios cromatogramas en capa fina de slica gel para comprobar la composicin qumica, asimismo, se
-

47 -

METODOLOGA

cuantificaron los fenoles y los flavonoides totales presentes en dichas fracciones. 6.5 Cuantificacin de los fenoles totales Para la cuantificacin de los fenoles totales se utiliz em mtodo de FC. El da del anlisis se prepararon soluciones stock de 1 mg/mL de cido glico (se solubiliz en etanol y se afor con agua desionizada) y quercetina (disuelta en metanol). Las diluciones para obtener la curva de calibracin se muestran en la tabla 2. A 20 L del extracto o estndar correspondiente, por triplicado, se le agregaron 1.5 mL de agua destilada, posteriormente 100 L de reactivo de FC, se mezclaron vigorosamente y despus de 5 min (el tiempo no excedi de 8 min) se agregaron 300 L de solucin de Na2CO3 al 20%, se dej reposar por 2 h a temperatura ambiente o 30 min a 40C. Para determinar la mxima de absorcin de la mezcla de reaccin se obtuvo el espectro caracterstico entre 400 y 800 nm. Posteriormente, se midi la absorbencia a 765 nm. Para la referencia, el volumen de la solucin stock se reemplaz por agua desionizada. La concentracin de los fenoles se calcul con base en la curva de calibracin y se expres como mg equivalentes de cido glico/g de extracto y mg equivalentes de quercetina/g de extracto (modificado de Waterhouse, 2002).

48 -

METODOLOGA

Tabla 2. Diluciones para preparar la curva de calibracin de los fenoles totales Sol. Stock (L) 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 Agua desionizada (L) 1000 950 900 850 800 750 700 650 600 550 500 450 400 Concentraciones finales (g/mL) 0 0.5208 1.0417 1.5625 2.0833 2.6042 3.125 3.6458 4.1667 4.6875 5.2083 5.7292 6.25

6.6 Cuantificacin de los flavonoides totales Para la cuantificacin de los flavonoides totales se emple la tcnica de quelacin con AlCl3. Se prepar una solucin stock de 50 g/mL de quercetina en MeOH. Para realizar la curva de calibracin se tomaron alcuotas de la solucin stock, por duplicado, se les agreg MeOH para obtener un volumen final de 4 mL por cada punto de la curva (Tabla 3), se les adicionaron 100 L de reactivo de AlCl3 al 10% y se mezclaron vigorosamente. Para determinar la mxima de absorcin de la mezcla de reaccin se obtuvo el espectro caracterstico entre 200 y 600 nm. Posteriormente, se midi la absorbencia a 440 nm. Para la referencia, el volumen de la solucin stock se reemplaz por ms volumen de MeOH. La concentracin de flavonoides totales se calcul con base en la curva de calibracin y se expres como mg equivalentes de quercetina/g de extracto (modificado de Lamaison y Carnet, 1990; Chang y col., 2002).

49 -

METODOLOGA

Tabla 3. Diluciones para preparar la curva de calibracin de los flavonoides totales Sol. Stock (mL) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 Metanol Concentraciones finales (mL) (g/mL) 4.0 0 3.9 1.25 3.8 2.5 3.7 3.75 3.6 5.0 3.5 6.25 3.4 7.5

6.7 Determinacin de la capacidad antioxidante in vitro Para determinar la capacidad antioxidante se utiliz el mtodo del DPPH, reportado por Brand-Williams (1995), con algunas modificaciones. El da del anlisis se prepar una solucin de DPPH a una concentracin de 63.4 M en metanol. Asimismo, se prepar una solucin stock de 500 g/mL de quercetina en MeOH (control positivo). Todas las muestras se prepararon a la misma concentracin que la solucin stock. En tubos de ensaye se colocaron por duplicado 1 mL de las muestras a analizar y 1 mL del reactivo de DPPH. Cada tubo se agit y se dej reposar por 30 min a temperatura ambiente y en la oscuridad. Para determinar la mxima del DPPH se obtuvo el espectro caracterstico entre 400 y 800 nm. Posteriormente, se midi la absorbencia a 514 nm. Para la referencia, el volumen de la solucin stock se reemplaz por MeOH. La potencia o actividad antioxidante se calcul como el porcentaje utilizando la siguiente frmula:

Donde: A1 = absorbencia de la muestra A0 = absorbencia del control

50 -

METODOLOGA

6.8 Evaluacin farmacolgica de la actividad antiinflamatoria Se utilizaron ratas Wistar hembras adultas de 200 20 g de peso corporal (p.c.), las cuales se mantuvieron a las condiciones del bioterio (temperatura constante 22-24 C; humedad relativa 50-55%; ciclos de luz/oscuridad 12 x 12 h) para su adaptacin, de 6 a 7 das. Los animales fueron alimentados con dieta estndar de Rat Chow y agua a libre demanda. El manejo y cuidado de los animales se realiz de acuerdo a los procedimientos aceptados internacionalmente (NOM-062-ZOO-1999). Despus del periodo de adaptacin, las ratas se pesaron, se colocaron en jaulas individuales y se distribuyeron aleatoriamente en los grupos de tratamiento. La induccin de la inflamacin se realiz utilizando el modelo del granuloma, para lo cual se pesaron aproximadamente 50 mg de algodn para elaborar los pellets, los cuales se esterilizaron en una estufa a 60 C, 24 h antes del inicio del experimento. El sptimo da, las ratas se anestesiaron con ter etlico y se les realiz una incisin subcutnea de aproximadamente 1 cm por debajo de la axila, en donde se introdujo el pellet de algodn, segn el modelo del granuloma (Mrquez-Flores y col., 2009). La incisin se sutur utilizando hilo de nylon calibre 4.0, realizando 3 puntadas. Los grupos de tratamiento fueron: el testigo (vehculo, solucin de bicarbonato de sodio al 5%, 1 L/g de p.c.), el testigo positivo tratado con indometacina (5 mg/kg de p.c.) y los tratados con las fracciones 11-15 y 16-20 obtenidas de la separacin cromatogrfica del extracto etanlico (25 mg/kg de p.c.) por ser stas las de mayor contenido flavonoico segn el anlisis fitoqumico preliminar. La administracin se realiz por va oral durante siete das. Los animales tuvieron alimento y agua ad libitum. Al octavo da despus del inicio del tratamiento, las ratas se sacrificaron utilizando cloroformo, se retiraron los pellets y se pesaron para obtener el peso hmedo del granuloma, posteriormente, se colocaron en una estufa a 60 C hasta obtener el peso constante (peso seco).

51 -

METODOLOGA

El peso final del granuloma se calcul por la diferencia entre el peso seco y el peso del pellet de algodn antes de introducirlo al cuerpo de las ratas. 6.9 Evaluacin de la actividad ulcerogastroduodenal 6.9.1 Macroscpica Inmediatamente despus de sacrificar a las ratas y retirar el granuloma, se abri el abdomen de las ratas y se realiz la diseccin del estmago y duodeno de cada animal, exponiendo su interior, con la finalidad de observar la presencia o ausencia de erosiones, lceras, hemorragias o algn tipo de irritacin presente en dichos rganos (caracterizada por una coloracin rojiza). 6.9.2 Histolgica Despus de la observacin de los tejidos, se les fij en formol al 10% para realizarles un estudio histopatolgico mediante la tcnica de hematoxilina-eosina (Pablo, 2009). Se observaron todas las capas de los tejidos, poniendo nfasis en la mucosa, para detectar cualquier alteracin en ellas (discontinuidades, ausencia de alguna capa, erosiones o lceras), as como la presencia o ausencia de leucocitos y eritrocitos en la luz de los tejidos. Para distinguir las caractersticas histolgicas de los rganos normales y los irritados se tomaron como referencia las observaciones de las laminillas correspondientes al grupo testigo, as como las encontradas en la bibliografa e informacin sobre los cambios histolgicos que ocurren cuando hay lesiones en los rganos (Dayal y DeLellis, 1990; Di Fiore, 1981). Por lo menos, 30 cortes histolgicos de tejido de cada animal fueron analizados con un mnimo de seis animales por cada tratamiento. 6.10 Anlisis estadstico Se realiz un ANOVA para determinar las diferencias significativas en los diferentes ensayos. Para la comparacin post-hoc se utiliz la prueba estadstica Student-NewmanKeuls. Se consideraron diferencias significativas cuando P<0.05.
-

52 -

RESULTADOS

7. RESULTADOS
7.1 Recoleccin, identificacin y obtencin del extracto etanlico La especie vegetal se recolect en la comunidad de San Pedro Tlaquilpan perteneciente al municipio de Zempoala, Hidalgo en febrero de 2010. La identificacin botnica indic que las partes recolectadas pertenecan a un ejemplar de la especie Eysenhardtia polystachya (Ort.) Sarg. A partir de 6 100 g de planta seca y utilizando 16.5 L de etanol, se obtuvieron 334.91 g (rendimiento 5.5%) de extracto etanlico de color amarillo-verdoso y consistencia siruposa. 7.2 Anlisis fitoqumico preliminar Los resultados del estudio fitoqumico preliminar de los metabolitos secundarios de los diferentes extractos de palo dulce se muestran en el apndice 1. En general, Eysenhardtia polystachya (Ort.) Sarg. posee alcaloides, azcares reductores, cumarinas, glucsidos cardiacos, flavonoides, quinonas, saponinas y taninos, los cuales se encuentran en mayor o menor cantidad en sus hojas y/o corteza. La extraccin con los disolventes orgnicos, en este caso metanol, es capaz de extraer una mayor proporcin de metabolitos que el agua. Los tipos de flavonoides detectados en todos los extractos al realizar todas las reacciones correspondientes fueron: flavonas (reaccin de Shinoda) y flavonoles (NaOH 10%). Estos resultados fueron comparados con un extracto etanlico de palo dulce preparado en 2008 y un liofilizado de la especie obtenido en 2007 (Pablo, 2009; Salazar, 2007), indicando que los flavonoides son un grupo de metabolitos secundarios que se exhiben habitualmente en el palo dulce.

53 -

RESULTADOS

7.3 Aislamiento de los flavonoides a) Cromatografa por filtracin en gel Al realizar esta tcnica se obtuvo una separacin exitosa a travs de la columna, ya que el extracto se dividi en colores, de arriba abajo, caf, amarillo, verde y amarillo muy tenue. Se obtuvieron 75 fracciones de aproximadamente 10 mL cada una, de las cuales, al tomar alcuotas de 0.5 mL y adicionarles 2 gotas de H2SO4 conc. se obtuvieron tonalidades amarillas, rojas, guindas, rosas y rosas muy tenues, lo cual indic una concentracin relativa de flavonoides en las fracciones, siendo las fracciones con tonalidad guinda las ms ricas en estos metabolitos. Al reunir las fracciones de acuerdo a su tonalidad se obtuvieron 5 fracciones, a las cuales se les realiz una cromatografa en placa fina y al observar el comportamiento de los Rfs y los colores de las manchas similares, se decidi utilizar slo 4 fracciones reunidas de la siguiente manera: F1 (1-4), F2 (5-12), F3 (13-25) y F4 (26-75). Una vez que se concentraron las fracciones a presin reducida, se eligi la fraccin F2, por ser sta la fraccin con mayor proporcin de flavonoides segn el anlisis fitoqumico. Sin embargo, debido a los bajos rendimientos encontrados, se opt por realizar la tcnica cromatogrfica de columna seca para separar a los metabolitos. b) Cromatografa de columna seca La fase mvil que separ mejor los metabolitos presentes en el extracto fue la mezcla isocrtica AcEt/MeOH/H2O en la siguiente proporcin 70:25:5, obtenindose las siguientes caractersticas de las manchas que corresponden a: amarilla con Rf de 0.175, amarilla con Rf de 0.75 y naranja con Rf de 0.975. Por lo anterior, esta fase mvil se emple para la elucin de los metabolitos en la DCC. Por esta tcnica, se obtuvieron 26 fracciones, a las que despus de realizarles pruebas fitoqumicas preliminares para los flavonoides y varias cromatografas en placa fina, se decidi reunir las fracciones para tener slo 5, reunidas de la siguiente manera: F1 (1-5), F2 (6-10), F3 (11-15), F4 (16-20) y F5 (21-26), de acuerdo con el comportamiento de los Rfs y los colores de las

54 -

RESULTADOS

manchas. Una vez que se concentraron las fracciones a presin reducida, el anlisis fitoqumico mostr una mayor cantidad de flavonoides en F3 y F4, por lo que stas se eligieron para ser evaluadas farmacolgicamente como probables agentes antiinflamatorios en el modelo del granuloma. El rendimiento de la separacin y los resultados de las pruebas para flavonoides se muestran en la tabla 4.
Tabla 4. Rendimientos de la separacin de los metabolitos del extracto etanlico por DCC Cantidad obtenida (g) 1.05 1.88 3.90 3.05 11.2 21.08 Rendimiento (%) 3.5 6.3 13 10.2 37.3 70.3 Pruebas para flavonoides Shinoda NaOH al 10% + ++ + ++++ +++ +++ ++ + +

Fraccin 1. 1-5 2. 6-10 3. 11-15 4. 16-20 5. 21-26 Total

De los 30 g de extracto etanlico colocados en la columna, slo se recuperaron en total 21.08 g, que representan el 70.3%, que indica una prdida por absorcin del extracto a la slica gel de 8.92 g. 7.4 Cuantificaciones de los extractos Todos los mtodos analticos empleados en esta investigacin fueron previamente valiadados, la informacin al respecto se encuentra en los apndices 2-4. Los resultados de las cuantificaciones realizadas a los diferentes extractos, as como las fracciones obtendidas de la separacin cromatogrfica del palo dulce se resumen en la tabla 5.

55 -

RESULTADOS

Tabla 5. Contenido de los fenoles totales, los flavonoides totales y capacidad antirradical contra el DPPH de los extractos de E. polystachya Fenoles totalesa (mg de EAG/g de muestra) Fenoles totalesb (mg de EQ/g de muestra) Flavonoides totalesc (mg de EQ/g de muestra) Actividad antirradicalar (%) DPPHd

Muestra Extracto etanlico de corteza E. polystachya Infusin corteza Decoccin corteza Infusin hojas Decoccin hojas F1. (1-5) F2. (6-10) F3. (11-15) F4. (16-20) F5. (21-26) Quercetina Vitamina E

287.31 7.65

160.75 4.52

3.72 0.64

93.96 1.00

69.96 5.16

32.37 3.05

0.01 0.01

00

59.72 3.35

26.33 1.98

0.97 0.01

10.57 0.21

52. 09 1.30

21.81 0.77

1.00 0.06

25.98 1.35

95.34 21.95 87.18 6.68 90.57 5.20 72.90 2.88 158.28 11.81 69.21 2.84 -

47.35 12.96 42.54 3.95 44.54 3.07 34.10 1.70 84.54 6.97 31.92 1.68 -

3.40 0.07 2.91 0.03 6.19 0.10 3.28 0.16 9.20 0.05 1.23 0.11 -

00 60.99 7.32 88.90 0.22 67.42 2.30 75.30 1.44 90.12 1.26 99.06 0.55 100 0

Los datos representan la media el error estndar de tres rplicas. aEl contenido de fenoles totales se expresa como mg equivalentes de cido glico (EAG/g de extracto) y bcomo mg equivalentes de quercetina (EQ/g de extracto). cEl contenido de flavonoides totales se expresa como mg equivalentes de quercetina (EQ/g de extracto). dEl potencial antioxidante contra el DPPH se midi a una concentracin de 0.5 mg de extracto/mL de solucin metanlica.

56 -

RESULTADOS

Los fenoles y los flavonoides, estn presentes tanto en las hojas como en la corteza del palo dulce. Las hojas, por ser las estructuras areas ms jvenes del rbol y ms expuestas a la luz poseen mayor cantidad de fenoles y flavonoides comparado con la corteza. En el caso de las hojas, cuando se extraen sus metabolitos por decoccin acuosa hay una mayor cantidad de fenoles y flavonoides cuantificables por la tcnica utilizada, que cuando se extraen por infusin; lo contrario ocurre en el caso de la corteza. El extracto etanlico exhibi una mayor cantidad de fenoles y flavonoides en comparacin con los extractos acuosos de corteza y hojas. En el caso de las fracciones, la fraccin F4. (16-20) exhibi la mayor cantidad de fenoles y flavonoides seguida de las fracciones F2>F1>F3>F5. Estos resultados aclararon aquellos encontrados en el anlisis fitoqumico preliminar (Tabla 4). El extracto etanlico de la corteza exhibi la mayor actividad de captacin del radical DPPH, debido a la alta cantidad de compuestos fenlicos y en particular flavonoides con respeto a los dems extractos analizados. Sin embargo, los dems extractos y fracciones no tuvieron el comportamiento esperado, a saber, un alto potencial antirradical de acuerdo a su contenido fenlico y flavonoico. La infusin de hojas y la decoccin de corteza contienen polifenoles capaces de estabilizar al DPPH, pero la decoccin de hojas y la infusin de corteza no fueron capaces de causar este efecto a las mismas concentraciones. La actividad contra el DPPH de las fracciones fue F5>F2>F4>F3>F1. 7.8 Evaluacin farmacolgica de la actividad antiinflamatoria Los resultados de peso hmedo del granuloma en el grupo tratado con indometacina (5 mg/kg de p.c.) y el tratado con la fraccin rica en flavonoides, F3. (1115) (25 mg/kg de p.c.), presentaron una disminucin, con respecto al grupo testigo (NaHCO3 al 5%); en tanto que no se present en el grupo tratado con la fraccin F4. (1620), obtenida de la separacin cromatogrfica del extracto etanlico, a la dosis de 25 mg/kg de p.c. (Tabla 6).
-

57 -

RESULTADOS

Tabla 6. Efecto antiinflamatorio de las fracciones ricas en flavonoides de Eysenhardtia polystachya (Ort.) Sarg. sobre la inflamacin crnica inducida mediante el modelo del granuloma la rata Tratamiento Solucin de NaHCO3 al 5% 1 L/g Indometacina/NaHCO3 al 5% 5 mg/kg F3. (11-15) 25 mg/kg F4. (16-20) 25 mg/kg Peso hmedo (g) Peso seco(g) Peso final (mg) 0.62 0.05 0.17 0.01 114.87 11.04 (7) 0.36 0.02* (7) 0.47 0.05 (7) 0.54 0.03* (8) (7) 0.10 0.01* (7) 0.12 0.01* (7) 0.13 0.01* (8) (7) 45.20 5.03* (7) 67.64 10.99* (7) 84.06 5.46* (8)

Los valores mostrados representan la media error estndar. *P<0.05. El valor entre parntesis indica el nmero de ratas utilizadas en cada grupo.

En el peso seco de los granulomas, los grupos tratados con indometacina (5 mg/kg de p.c.) y ambas fracciones ricas en flavonoides (25 mg/kg de p.c.) mostraron un decremento con respecto al grupo testigo (NaHCO3 al 5%) (Tabla 6). Con respecto al peso final de los granulomas (Figura 11), se observ una disminucin en los grupos tratados con indometacina (5 mg/kg de p.c.) y las fracciones (25 mg/kg de p.c.) con respecto al grupo testigo (NaHCO 3 al 5%).

58 -

RESULTADOS

140

120

Peso final del granuloma (mg)

100 *

* Bicarbonato de sodio, 5% Indometacina, 5mg/kg F3. (11-15), 25 mg/kg F4. (16-20), 25 mg/kg

80

60

40

20

Tratamiento

Figura 11. Efecto antiinflamatorio de las fracciones ricas en flavonoides de Eysenhardtia polystachya (Ort.) Sarg sobre el peso final de los granulomas. Las barras representan la media y las lneas verticales el error estndar de la media. *P<0.05

Adems, se observaron diferencias en el grosor de la cpsula formada en los diferentes grupos de experimentacin. En el grupo tratado con indometacina (5 mg/kg) se observ una cpsula muy delgada y en ocasiones fuertemente adherida al granuloma, a diferencia del tratado con solucin de bicarbonato de sodio al 5% en el que se observ la cpsula muy gruesa. En los tratados con las fracciones, el grosor de la cpsula fue mayor comparado con el de la indometacina, sin embargo, no llegaron a ser del tamao observado en el grupo tratado con solucin de bicarbonato de sodio al 5%, adems hubo un aumento en la exudacin de lquido. 7.6 Evaluacin de la actividad ulcerogastroduodenal 7.6.1 Macroscpica En el estmago y duodeno de las ratas tratadas con la solucin de NaHCO3 5%, no se

59 -

RESULTADOS

observ ningn tipo de irritacin, ni la presencia de lceras (Figura 12), a diferencia de las ratas tratadas con indometacina, en las que se observaron zonas de enrojecimiento en la mucosa gstrica, presencia de erosiones en el duodeno y en algunos casos, se observ que los intestinos estaban sumamente adelgazados, al grado de romperse con facilidad al ser removidos de los cuerpos, por lo que resultaba intil emplearlos para el estudio histopatolgico (Figura 13). En los grupos tratados con las fracciones no se observ ningn signo de irritacin o ulceracin en el tracto gastrointestinal, de hecho el comportamiento fue similar al grupo testigo (Figuras 14 y 15).

A B C D

Figura 12. Estmago y duodeno de una rata Figura 13. Estmago y duodeno de una rata tratada con NaHCO3 al 5% (testigo). No se observa tratada con indometacina (5 mg/kg p.c.). Se irritacin. A. Fondo, B. Cuerpo, C. Regin pilrica, observa enrojecimiento y presencia de lceras. D. Duodeno.

Figura 14. Estmago y duodeno de una rata Figura 15. Estmago y duodeno de una rata tratada con la fraccin rica en flavonoides F3. (11- tratada con la fraccin rica en flavonoides F4. 15) (25 mg/kg p.c.). No se observa irritacin. (16-20) (25 mg/kg p.c.). No se observa irritacin.

7.6.2 Histologa El anlisis histolgico evidenci que los tejidos de los animales tratados con NaHCO 3 no presentaron alteraciones, ya que las cuatro capas histolgicas concntricas, mucosa, submucosa, muscular y serosa del estmago (Figura 16) y duodeno en todas sus regiones se mantuvieron intactas (Figura 17). En cuanto a los cortes de los tejidos de animales tratados

60 -

RESULTADOS

con indometacina se observaron alteraciones de las capas que conforman el estmago y el duodeno, manifestadas por disminucin en el nmero de clulas, desprendimiento de stas, que se observan como discontinuidades en los tejidos, adems de la presencia de leucocitos y eritrocitos (Figuras 18-21). Los tejidos de los animales tratados con las fracciones ricas en flavonoides (25 mg/kg de p.c.), mostraron comportamientos similares al tratamiento de NaHCO3 (Figuras 22-25).

T1 T3 T2 T4 T3
Figura 16. Regin fndica del estmago de una rata tratada con NaHCO3 al 5%. No hay alteracin de las capas. Tcnica H-E, 10x. T1. Tnica mucosa, M. Muscular de la mucosa, T2. Tnica submucosa, T3. Tnica muscular, T4. Tnica serosa.

V
A

Figura 17. Regin inicial del duodeno de una rata tratada con NaHCO3 al 5%. No se observa ninguna alteracin. Tcnica H-E, 10x. V. Vellosidades intestinales, L. Lmina propia con glndulas de Lieberkhn, T3. Tnica muscular.

N E

Figura 18. Clulas fndicas de la mucosa estomacal de una rata tratada con indometacina (5 mg/kg de p.c.). Se observan eritrocitos caractersticos del dao provocado por el AINE. Tcnica H-E, 40x. E. Eritrocitos.

Figura 19. Tnica submucosa del estmago de una rata tratada con indometacina (5 mg/kg de p.c.). Se observan neutrfilos. Tcnica H-E, 40x. N. Neutrfilos.

61 -

RESULTADOS

V V

T33 T

Figura 20. Regin inicial de duodeno de rata tratada con indometacina (5 mg/kg p.c.). Se observan discontinuidades y desprendimiento de clulas. Tcnica H-E, 10x. V. Vellosidades, L. Lmina propia con glndulas de Lieberkhn, T3. Tnica muscular.

Figura 21. Mucosa duodenal de rata tratada con indometacina (5 mg/kg p.c.). Se observan monocitos dentro y fuera de las glndulas de Lieberkhn. Tcnica H-E, 40x. M. Monocitos.

T1

V L M

M T2
Figura 22. Regin fndica de estmago de rata tratada con F3. (11-15) (25 mg/kg p.c.). No hay alteracin de las capas. Tcnica H-E, 10x. T1. Tnica mucosa, M. Muscular de la mucosa, T2. Tnica submucosa.

Tc T3
Figura 23. Mucosa duodenal de rata tratada con F3. (11-15) (25 mg/kg p.c.). No se observa alteracin de las capas. Tcnica H-E, 10x. V. Vellosidades intestinales, L. Lmina propia con glndulas de Lieberkhn, M. Muscular de la mucosa, Tc. Tnica celular con glndulas de Brunner, T3. Tnica muscular.

T1 T2 T3 L T3
Figura 24. Estmago de rata tratada con F4. (16- Figura 25. Regin inicial de duodeno de rata 20) (25 mg/kg p.c.). No hay alteracin en las tratada con F4. (16-20) (25 mg/kg p.c.). No se capas. Tcnica H-E, 10x. T1. Tnica mucosa, M. observan alteraciones. Tcnica H-E, 10x. V.

V M

62 -

RESULTADOS

Muscular de la mucosa, T2. Tnica submucosa con Vellosidades, L. Lmina propia con glndulas de arteriolas, T3. Tnica muscular. Lieberkhn, T3. Tnica muscular.

63 -

DISCUSIN

8. DISCUSIN

l estudio de las plantas medicinales tiene como objetivo contribuir al conocimiento qumico, farmacolgico y toxicolgico de las especies vegetales, propiciar su uso como

alternativa teraputica, adems, de conducir al descubrimiento de nuevos frmacos, candidatos para evitar o disminuir los sntomas de una variedad de enfermedades que amenazan la salud humana.

Con el avance en el conocimiento sobre la etiologa y mecanismos de las diferentes condiciones fisiopatolgicas, particularmente de la inflamacin, se ha visto que las ROS y las RNS contribuyen y potencian dicha condicin (Faria y col., 2005; Kim y col., 2003; Montuschi y col., 2004; Tsai y col., 2011), y aunque los mecanismos endgenos de defensa, han evolucionado para ofrecer proteccin, se ha visto que algunos agentes de origen vegetal, aumentan las reservas de antioxidantes del organismo para disminuir el estrs oxidativo. Asimismo, investigaciones clnicas y estudios epidemiolgicos han establecido una correlacin inversa entre la ingesta de frutas y vegetales y la incidencia de enfermedades del corazn, el cncer, la inflamacin y los desrdenes relacionados con el envejecimiento. Adems, se ha observado que una administracin continua de fuentes antioxidantes exgenas incrementa la produccin y funcin de las endgenas, lo cual resulta til en el caso de los tratamientos de enfermedades crnicas (Pietta, 1999). Debido a estos hechos, una revisin en la literatura revel que el nmero de publicaciones sobre antioxidantes y el estrs oxidativo se cuadriplic en la ltima dcada; lo cual se debe al gran inters del pblico en general, mdicos y expertos en nutricin, investigadores en las ciencias de los alimentos y la salud, por conocer la capacidad antioxidante de las terapias basadas en la medicina tradicional as como de los alimentos que consumimos (Huang y col., 2005).

64 -

DISCUSIN

En la literatura, se informa el empleo de preparaciones galnicas obtenidas de plantas que tienen efecto antiinflamatorio y especialmente, se enfatizan dentro de stas a las que tienen flavonoides en su composicin qumica, los cuales al ser grupos polifenlicos, presentan una gran capacidad antioxidante, dirigida fundamentalmente contra los radicales hidroxilo y superxido, especies altamente reactivas implicadas en el inicio de la cadena de peroxidacin lipdica (Tsai y col., 2011). Tal es el caso de la tintura de salvia de playa (Pluchea carolinensis Jacq) que ha mostrado propiedades antiinflamatorias en procesos agudos y crnicos y en estudios fitoqumicos se aport la presencia de glucsidos, triterpenos, aceites esenciales, taninos y flavonoides (Garca y col., 2002). La mayora de las enfermedades presentan etapas inflamatorias y tanto la inflamacin como la reparacin pueden ser potencialmente perjudiciales ya que subyacen en la gnesis de enfermedades crnicas que provocan morbilidad y/o mortalidad; numerosos investigadores han buscado nuevos agentes antiinflamatorios derivados de la sntesis qumica o del metabolismo de las plantas. Los AINE se encuentran entre los ms utilizados, en el ao 2002 existan ms de 50 frmacos diferentes de este tipo en el mercado y continuamente surgen nuevas preparaciones. Todo esto hace suponer que ninguno de ellos es ideal para el control o la modificacin de los signos y los sntomas de la inflamacin. Un problema adicional es que prcticamente todos tienen efectos significativos no deseados, sobre todo en pacientes de la tercera edad. Por lo que, un tratamiento ideal sera aquel que disminuyera los signos de la inflamacin, controlando sus secuelas perjudiciales (Prez, 2002; Crotan y col., 1990). Los flavonoides de numerosas especies de plantas han mostrado actividad antiinflamatoria in vitro e in vivo, se ha visto que no son tan potentes en desrdenes agudos pero son agentes teraputicos potenciales en el tratamiento de la inflamacin crnica y producen menos efectos adversos que los tratamientos alopticos. En cambio, los frmacos esteroidales inhiben las manifestaciones inflamatorias agudas de enfermedades como la fiebre reumtica y la artritis reumatoide, sin embargo, tienen una utilidad limitada en la

65 -

DISCUSIN

prevencin y curacin de las inflamaciones crnicas como la artritis deformante, valvulopatas crnicas y la dermatitis atpica (Kim y col., 2004). Diversos mecanismos de accin han sido propuestos para explicar la accin antiinflamatoria in vivo de los flavonoides aunque estos no se han comprendido exactamente. Uno de sus importantes mecanismos de accin es la inhibicin de las enzimas que generan a los eicosanoides y estn relacionadas con la funcionalidad de los vasos, tales como la fosfolipasa A2, las COXs y LOXs, lo cual reduce las concentraciones de prostanoides y leucotrienos, que estn involucrados en variadas respuestas inmunolgicas (Middleton y Kandaswami, 1994; Nijveldt y col., 2001; Kim y col., 2004; Silva y col., 2005). Estudios recientes tambin han mostrado que ciertos flavonoides, especialmente los derivados de flavonas, expresan su actividad antiinflamatoria al menos en parte por la modulacin en la expresin de genes proinflamatorios como la COX-2, la iNOS y numerosas citocinas (Kim y col., 2004). Estos compuestos, tambin inhiben a la cinasa de la tirosina citoslica y membranal. Las protenas integrales de membrana, como la cinasa de la tirosina 3-monooxigenasa, estn involucrados en una variedad de funciones, tales como la catlisis enzimtica, de transporte a travs de membranas, la transduccin de seales que funcionan como receptores de hormonas y factores de crecimiento, y la transferencia de energa en la sntesis de ATP. La inhibicin de estas protenas resulta en la inhibicin del crecimiento y la proliferacin celular descontrolada. Los sustratos de la cinasa de la tirosina parecen jugar un papel clave en la ruta de transduccin de seales que regula la proliferacin celular (Nijveldt y col., 2001).

Otra de las propiedades antiinflamatorias de los flavonoides, es su capacidad para inhibir la desgranulacin de los neutrfilos. Los neutrfilos que contienen LOX producen compuestos quimiotcticos a partir del cido araquidnico. Estas enzimas tambin provocan la liberacin de citocinas. Esta es una manera directa para disminuir la liberacin de cido araquidnico por los neutrfilos y otras clulas del sistema inmune (Nijveldt y col., 2001).

66 -

DISCUSIN

Debido a los mecanismos de accin mencionados anteriormente y a la actividad antiinflamatoria que han mostrado in vivo, los flavonoides se consideran como candidatos potenciales para ser nuevos frmacos antiinflamatorios. Sin embargo, para establecer claramente el valor teraputico de los flavonoides en desrdenes inflamatorios y sus diversos mecanismos de accin, estos metabolitos necesitan ser elucidados qumicamente (Kim y col., 2004). Como parte de la investigacin continua de nuevos derivados de las plantas como agentes antiinflamatorios, se eligi a Eysenhardtia polystachya (Ort.) Sarg. rbol pequeo, ampliamente distribuido a travs de Mxico, del cual existen estudios previos que demuestran que el palo dulce tiene actividad citotxica, antimicrobiana e insecticida, antiurolitisica, diurtica y antiinflamatoria (Alvarez y col., 1998; Prez y col., 2002; Salazar, 2007; Pablo, 2009). En dichos estudios, se resalt su composicin qumica, y se detectaron diversos flavonoides, entre otros metabolitos secundarios. Por ende, se consider importante separar la fraccin del extracto etanlico ms rica en estos metabolitos por considerarlos responsables del efecto antiinflamatorio. El empleo de las plantas medicinales como materia prima, presenta grandes inconvenientes, tales como el bajo rendimiento, la baja reproducibilidad de su actividad y el riego potencial del impacto ambiental que puede causar su escasez. Adicionalmente, la homogeneidad y caractersticas de los productos derivados de las plantas, pueden afectarse debido a las variaciones que ocurren cada ao e incluso en cada estacin anual (Drago, 2007), por lo que en esta investigacin, estos aspectos se consideraron desde la colecta de la planta, y se tomaron en cuenta la estacin, el lugar y las estructuras del rbol a estudiar siguiendo los estudios realizados por Salazar (2007) y Pablo (2009). La posibilidad de la accin enzimtica que ocurre durante la maceracin, que provoca la hidrlisis de los glucsidos, se puede evitar sumergiendo el material vegetal en un disolvente en ebullicin o por un rpido secado antes de la extraccin. El pre-secado del material vegetal en general, parece aumentar el rendimiento de los extractos, posiblemente debido a

67 -

DISCUSIN

la ruptura de la estructura celular y como consecuencia un mejor acceso del disolvente (Markham, 1975). Por esta razn, se realiz la metodologa descrita previamente para la preparacin del extracto etanlico, adems de ser la misma reportada por Pablo (2009). Antes de la separacin de los metabolitos a partir del extracto etanlico, se llevaron a cabo pruebas las preliminares sencillas y rpidas que permitieron detectar cualitativamente, la presencia de determinados grupos de compuestos. Esto se logr mediante las tcnicas de tamizaje, que se ayudan de la qumica para evidenciar estos grupos de constituyentes mediante formacin de precipitados, coloraciones, etc. Estas reacciones se caracterizan por ser selectivas para las clases o grupos de compuestos que se investigan, son simples y rpidas, detectan la mnima cantidad posible y utilizan un mnimo de equipo de laboratorio. Los resultados negativos en estas pruebas, se pudo deber a la ausencia de los flavonoides, a la seleccin errnea del disolvente para extraer o a la presencia de sustancias extraas que interfirieron a una concentracin en el orden de trazas del compuesto ensayado (Domnguez, 1979). A pesar de las diversas bioactividades de las plantas medicinales contra varias enfermedades, los componentes activos de muchos extractos de plantas no han sido extrados de sus matrices naturales, analizados ni caracterizados a fondo debido a sus complejas mezclas que contienen hasta cientos de diferentes ingredientes (Ajila y col., 2011). La tcnica cromatogrfica por filtracin en gel sobre sephadex es un mtodo que ha sido utilizado por otros autores para la separacin de los flavonoides y alcaloides (Moscatelli y col., 2006; Wang y col., 2008; Orhan y col., 2007), debido a su alta reproducibilidad a micro escala y a escala tcnica, baja prdida de sustancias, el relativo poco tiempo involucrado en el proceso, adems de que no requiere de equipo costoso. La filtracin en gel es un mtodo flexible y por lo tanto, permite que sustancias muy inestables sean aisladas. La separacin ideal es en base al tamao molecular, sin embargo, tambin ocurre el proceso de adsorcin, exclusivamente con los grupos hidroxilos libres de las agliconas (Markham, 1975).

68 -

DISCUSIN

Al emplear esta tcnica, en la presente investigacin, se logr separar una mezcla de flavonoides, de bajo peso molecular. Sin embargo, debido a la poca cantidad obtenida de cada una de las fracciones, se decidi utilizar una cromatografa en columna seca y as obtener una mayor cantidad de las fracciones para ser evaluadas farmacolgicamente. Lo anterior, sugiere que el mtodo de separacin con sephadex se debe reproducir a fin de analizar la actividad antiinflamatoria de estas fracciones y elucidar a fondo sus componentes activos. La DCC, tiene el mismo principio que una TLC, pero a gran escala. Es una tcnica segura, potente y ms fcil que otras cromatografas. Se ha demostrado su utilidad en la investigacin, ya que ofrece un poder de separacin comparable al de las tcnicas ms modernas, pero es menos costosa al utilizar poco material, los disolventes y adsorbente utilizados son baratos y seguros y no requiere de peligrosas columnas presurizadas (Shusterman y col., 1997). Las desventajas encontradas fueron, el tiempo requerido para remover la slica gel de las fracciones, lo cual caus problemas en los microanlisis, y las prdidas por evaporacin en el volumen de fase mvil y el lavado de las fracciones. El modelo farmacolgico que se emple para evaluar la actividad antiinflamatoria de Eysenhardtia polystachya (Ort.) Sarg. fue el modelo del granuloma (Mrquez-Flores y col., 2009) ya que ste permite la evaluacin de la inflamacin de tipo subcrnico o crnico, caracterizada por la formacin de un granuloma (Okoli y col., 2007).

Se considera que al introducir un agente extrao insoluble lo suficientemente grande (pellet de algodn) en la axila de la rata, no se permitir la fagocitosis, por lo tanto, habr un acumulo de clulas epitelioides y clulas gigantes que se superpondrn en la superficie y rodearn al agente extrao, provocando un aumento del peso del pellet por la formacin de lo que se conoce como granuloma.

Se ha establecido que hay una correlacin entre el peso en seco de los pellets y el tejido granulomatoso. La respuesta de la implantacin subcutnea del pellet de algodn en rata se
-

69 -

DISCUSIN

divide en tres fases: 1) una fase trasudativa (escape de lquido con un bajo contenido proteico de densidad <1.02, glucosa similar a la glucemia, baja concentracin de deshidrogenasa lctica (LDH), con clulas sanguneas del sistema vascular hacia el tejido intersticial o cavidades corporales), se evidencia por el incremento en el peso hmedo del granuloma y ocurre durante las primeras tres horas despus de la insercin del pellet, 2) una fase exudativa (escape de lquido con alta concentracin proteica y de LDH, poca cantidad de glucosa y abundantes detritus celulares, con una densidad superior a 1.02), que ocurre entre las 3 y 72 horas despus de la implantacin (Leyva y Quezada, 2008). Durante esta, las cininas son los principales mediadores del granuloma, ya que causan vasodilatacin e incrementan la permeabilidad vascular en etapas tempranas de la inflamacin (Mujumdar y Misar, 2004). Y 3) la fase proliferativa que se evidencia por el aumento del peso seco del granuloma y ocurre entre los 3 y 6 das despus de la implantacin del pellet (Prez, y col., 2005; Intahphuak y col., 2004; Crotan y col., 1990; Swingle y Shideman, 1972). En el presente estudio slo se evalu la actividad antiinflamatoria de palo dulce en la fase proliferativa de la inflamacin. Este modelo, ha sido utilizado por otros autores (Panthong y col., 2003; Intahphuak y col., 2004; Mujumdar y Misar, 2004; Prez y col., 2005; Okoli y col., 2007), para evaluar plantas con propiedades similares, debido a que el modelo es prctico, econmico, sencillo y sobretodo menos agresivo para los animales de experimentacin, comparado con otros modelos como es el caso de la inyeccin subplantar de carragenina y cido araquidnico utilizadas en estudios como los realizados por Panthong y col., (2003), para evaluar la actividad antiinflamatoria de Clerodendrum petasites S. Moore; el modelo del edema en la oreja de ratn inducida con TPA (12-Otetradecanoilforbol-13-acetato), en donde el efecto antiinflamatorio se evala utilizando un micrmetro con el cual se mide el incremento en el tamao de la oreja tras la administracin de la sustancia (Mujumdar y Misar, 2004); as como los mtodos utilizados por Hu y col., (2005) a saber, la induccin de la pleuresa de trax en ratas con carragenina y el posterior

degollamiento de los animales para las tomas de muestra de la extravasacin de fluidos, la induccin del edema plantar y la artritis en ratas con carragenina.

70 -

DISCUSIN

La indometacina es un AINE que acta sobre la cascada del cido araquidnico inhibiendo no selectivamente a la COX, lo cual suprime la formacin de prostaglandinas y TXA2 , tambin inhibe la marginacin, adhesin y migracin de leucocitos, por lo que se considera un potente agente antiinflamatorio con buena biodisponibilidad, motivo por el cual se emple como frmaco de referencia para evaluar la actividad antiinflamatoria del palo dulce, tal como se hizo en otros estudios (Prez y col., 2005; Paulino y col., 2006). En un estudio reciente (Pablo, 2009), se demostr la actividad antiinflamatoria inducida por el uso de los extractos acuosos (infusin y decoccin a la dosis de 200 mg/kg de p.c.) y etanlico (50 y 100 mg/kg de p.c.) de la corteza, tronco y hojas de palo dulce en el modelo del granuloma, partiendo de este antecedente, se obtiene que an reduciendo la dosis de 50 mg/kg de p.c. del extracto etanlico, a 25 mg/kg de p.c. de las fracciones ricas en flavonoides se logra el efecto antiinflamatorio, lo cual es importante debido a que hay un ahorro en la cantidad de agente teraputico necesario para llevar a cabo el mismo efecto que cuando se ocupa mayor cantidad pero de extracto crudo. De acuerdo con los resultados, se puede sugerir que los extractos poseen la capacidad de actuar en eventos proliferativos de formacin de tejido granulomatoso (Swingle y Shideman, 1972) y que adems los flavonoides juegan un papel muy importante en la disminucin del proceso inflamatorio. El efecto ulcerativo que presentan los AINE se debe a que su accin no es selectiva, ya que adems de inhibir a la enzima COX-2 presente nicamente cuando hay tejidos daados o inflamados, inhiben a la COX-1 de accin citoprotectora en las vas gastrointestinales (Smyth y col., 2007). Al inhibir su produccin, se impide la formacin de moco gstrico, haciendo susceptible al tracto gastrointestinal a los efectos del jugo gstrico. La mucosa es una de las capas gstricas que est en contacto directo con la luz y por lo tanto previene del dao que causan el cido luminal, bacterias y otros agentes nocivos (Baggio y col., 2007; Dayal y DeLellis, 1990), por lo que al realizar el anlisis histolgico se enfoc la atencin en esta capa.

71 -

DISCUSIN

El estudio histolgico corrobor las observaciones obtenidas al inspeccionar los tejidos a nivel macroscpico, ya que los tejidos de los animales tratados con indometacina, presentaron discontinuidades en las capas gstricas y duodenales debidas probablemente a las propiedades irritantes tpicas de los AINE que provocan la prdida del control citoesqueltico en las uniones tight junction (Halter y col., 2001). A nivel de estmago, adems se observaron eritrocitos en las clulas fndicas de la mucosa, probablemente, debido a una hemorragia digestiva causada por la inhibicin de la produccin de TX en plaquetas, asimismo, se observaron neutrfilos en la submucosa del estmago, que es una capa de tejido conjuntivo laxo y elstico, que contiene numerosos vasos sanguneos. Se sabe, que debido a la inhibicin de la formacin de prostaglandinas por la indometacina, existe un rpido y significante incremento en el nmero de neutrfilos adheridos al endotelio vascular de las vnulas gstricas y mesentricas, lo cual causa estasis microvascular y dao a la mucosa por isquemia e incremento de radicales libres y proteasas lo cual a su vez contribuye a la formacin de erosiones y lceras en el tracto GI (Halter y col., 2001). A nivel de duodeno se observaron discontinuidades en el epitelio y/o ausencia de l, adems de la presencia de monocitos. Estos resultados corroboran lo que informa la literatura sobre los efectos adversos de los AINE, que al inhibir no selectivamente a la COX se impide la produccin de todas las prostaglandinas, inclusive las que actan como citoprotectoras de la mucosa gstrica, a saber PGI2 y PGE2 (lo cual explica los efectos adversos en la vas gastrointestinales aunque no de manera exclusiva, como ya se coment anteriormente), tambin se sabe que debido a la irritacin local que produce el frmaco puede haber una difusin retrgrada del cido al interior de la mucosa gstrica, que tambin induce el dao tisular (Burke y col., 2007). Cabe destacar, que cuando se utilizaron las fracciones ricas en flavonoides a la dosis de 25 mg/kg de p.c. no se observaron alteraciones en ninguna regin de los tejidos gstricos ni duodenales. Considerando que las fracciones ricas en flavonoides (25 mg/kg de p.c.) de Eysenhardtia polystachya (Ort.) Sarg. inducen un efecto antiinflamatorio sin producir

72 -

DISCUSIN

gastropatas, se puede sugerir que el probable mecanismo de accin sea la inhibicin selectiva de la COX-2, sin conducir a la inhibicin de las prostaglandinas gastroprotectoras (en particular PGI2 y PGE2), que inhiben la secrecin cida, mejoran la corriente sangunea en la mucosa, y estimulan la secrecin de moco protector y la apoptosis. Adems de que al inhibir selectivamente la va de la COX, no se desactivara la ruta bioqumica a la va de la LOX, que al inhibirse parece tambin contribuir a la ulcerogenicidad, y probablemente, a una mayor susceptibilidad a la infeccin por Helycobacter pylori (Leza y Lizasoain, 2004). Otro factor que pudo haber contribuido a la proteccin de los epitelios gstricos, es la produccin de NO que aunque ejerce acciones fundamentalmente proinflamatorias: es un potente vasodilatador, aumenta la permeabilidad vascular e incrementa la sntesis de prostaglandinas proinflamatorias en respuesta a la estimulacin por citocinas; tambin tiene acciones antiinflamatorias, ya que si se libera de las clulas endoteliales, inhibe la adherencia de neutrfilos y la agregacin plaquetaria y adems posee acciones gastroprotectoras al aumentar el flujo sanguneo de la mucosa, regula la motilidad gstrica, la secrecin de moco y cido e inhibe las actividades de los neutrfilos (aunque no se sabe claramente como ocurre) (Rang y col., 2004). Asimismo, los propios flavonoides de la corteza de palo dulce pudieron haber contribuido a la proteccin del epitelio gstrico ya que existen estudios que indican que dichos metabolitos poseen la capacidad de inhibir con alta potencia la actividad de las bombas de H+ y K+ - ATPasa presentes, responsables de la produccin de la secreciones cidas del estmago (Baggio y col., 2007). Los flavonoides de las fracciones, probablemente, tambin mostraron su primer defensa antioxidante en el tracto gastroduodenal, al limitar la formacin de las ROS y neutralizarlas para evitar ms dao (Pietta, 1999). Estudios previos sealan que los terpenoides tienen actividad gastroprotectora, debido a que refuerzan los factores defensivos de la mucosa gstrica, como la regulacin del flujo sanguneo, que de no ser adecuado contribuye al desarrollo de hemorragias y lesiones necrticas (Ishikawa y col., 2008). Los taninos y triterpenos tambin han mostrado potente

73 -

DISCUSIN

actividad antiulcerognica. Cabe destacar que en el anlisis fitoqumico del extracto etanlico, a partir del cual se obtuvieron las fracciones, se detectaron saponinas triterpenoides y taninos que pueden contribuir al efecto antiulcerognico. La distribucin de los polifenoles en las plantas vara en gran medida entre las especies dentro de un mismo gnero, por las prcticas de cultivo, las condiciones climticas y las edficas, las condiciones de colecta, el almacenamiento y las preparacin de los extractos (Kim y col., 2003; Heimler y col., 2010), por ende, es necesaria la informacin sobre la composicin de los polifenoles y la actividad antioxidante de la variedad recolectada de palo dulce.

Es por este motivo, que parte de los objetivos de este trabajo fue profundizar en el anlisis cuali-cuantitativo de los polifenoles: obtener sus perfiles cromatogrficos, cuantificar a los fenoles y flavonoides totales, y evaluar su potencial antioxidante in vitro, lo cual constituye el punto de partida para posteriores estudios de citotoxicidad y actividad antioxidante mediada por flavonoides y para relacionar estos resultados con las actividades farmacolgicas que han sido demostradas previamente.

En una revisin de los diversos mtodos espectrofotomtricos para la determinacin de los fenoles totales, se recomend el ensayo de FC, como el ms conveniente (Escarpa y Gonzalez, 2001). Por esta razn, se decidi usarlo en la determinacin de los fenoles presentes en los extractos de E. polystachya.

El ensayo de FC tiene ventajas notables sobre otros ensayos basados en la TE, como son: que el reactivo de FC est disponible comercialmente y el procedimiento est estandarizado, la de absorcin del cromforo a 730 nm minimiza las interferencias de la matriz de las muestras, ya que frecuentemente poseen color, el ensayo es comnmente aceptado y se realiza rutinariamente en laboratorios de todo el mundo, es sencillo, requieren de poco equipo y ha producido una gran cantidad de datos que se pueden comparar, reportados

74 -

DISCUSIN

como contenido de fenoles totales en lugar de la capacidad de reduccin del reactivo de FC (Huang y col., 2005).

Bajo condiciones adecuadas, el ensayo incluye a los monofenoles y da reacciones predecibles con los tipos de fenoles encontrados en la naturaleza. Debido a que los fenoles son diversos y reaccionan en diferente grado, la expresin de los resultados como un nico nmero como equivalentes de un estndar es arbitraria. Debido a que la reaccin es independiente, cuantitativa y predecible, el anlisis de una mezcla de fenoles se puede recalcular en trminos de cualquier otro estndar, razn por la cual, en esta investigacin se utilizaron el cido glico y la quercetina como estndares (Singleton y col., 1999).

Numerosas publicaciones sobre antioxidantes, reportaron excelentes correlaciones entre el contenido de fenoles totales (cuantificados por el reactivo de FC) y la actividad antioxidante (medida por los ensayos de FRAP, TEAC, VCEAC o DPPH) (Kim y col., 2003; Tsai y col., 2011). Sin embargo, debido a que estos ensayos estn basados en reacciones redox similares, es redundante realizar una multitud de ensayos que cuantifiquen la capacidad de reduccin de un antioxidante o mezcla de estos, pero es importante emplear ensayos que sean comnmente aceptados y validados (Huang y col., 2005). Por tal motivo, es este trabajo se realizaron slo dos ensayos que evaluaron la capacidad antioxidante de los extractos analizados, el de FC y el de DPPH, ya que estos se basan en el mecanismo de TE.

La necesidad de cuantificar a los flavonoides en productos naturales, es cada vez ms frecuente, ya que estos datos permiten correlacionarlos con su alto potencial farmacolgico. La cuantificacin de flavonoides se ha realizado mediante ensayos de TLC, anlisis colorimtricos, GC, GC acoplada a masas y HPLC. Aunque, los mtodos por GC y HPLC aportan informacin definitiva en la caracterizacin de las muestras presentan limitaciones importantes debido a los costos del equipamiento y la participacin de personal con formacin especfica en el rea instrumental (Salamanca y col., 2007). En cambio, los

75 -

DISCUSIN

mtodos espectrofotomtricos permiten cuantificar flavonoides con estructuras similares, aunque presentan limitaciones en la sensibilidad y especificidad.

Las flavonas y flavonoles (3,5-hidroxiflavonas y 3,5-hidroxiflavonoles), desde el punto de vista reactivo, forman complejos amarillos estables con el AlCl3 y son susceptibles de analizarse mediante espectrofotometra de UV/Vis; entre tanto, los grupos hidroxilo en la posicin C5 de las flavanonas y flavanonoles reaccionan mejor con la 2,4-dinitrofenilhidrazina (Chang y col., 2002). En este estudio se utiliz la tcnica de quelacin con AlCl 3 porque adems de cuantificar a los flavonoides, aporta la evidencia de que los extractos del palo dulce tambin actan como antioxidantes al quelar metales; y se utiliz al flavonol quercetina como estndar, porque la presencia del grupo catecol tiene una gran contribucin en la quelacin de metales, que se evidencia por la produccin de un mayor efecto batocrmico que cuando no existe ese grupo (Pietta, 1999).

Estudios previos de extractos de plantas de la familia Fabaceae y en particular tres especies del gnero Eysenhardtia (no se estudi la especie polystachya), disminuyen el estrs oxidativo e incrementan la actividad de diversos componentes del sistema antioxidante endgeno, en particular la GSH, las vitaminas C y E, la SOD, la GSHPx y la CAT (NarvezMastache y col., 2007).

En el presente estudio se evalu la capacidad antioxidante de la infusin y decoccin de las hojas y corteza, el extracto etanlico y las fracciones ricas en flavonoides del palo dulce, ya resulta interesante conocer si el retraso o la inhibicin de la oxidacin ejercida por los polifenoles y en particular por los flavonoides y sus metabolitos, es un mecanismo por el cual estos extractos coadyuven en la disminucin de la inflamacin in vivo y en el dao tisular en la zona de inflamacin, as como, que protejan el tracto GI.

Para evaluar la actividad antioxidante in vitro, se us el mtodo del DPPH por ser comnmente usado para evaluar la habilidad captadora de radicales libres de tratamientos
76 -

DISCUSIN

herbales, por su exactitud y reproducibilidad, adems de que el reactivo est disponible comercialmente en su forma de radical y no se forma in situ como en otros ensayos, lo que hace al ensayo simple y estable en las condiciones trabajadas (Tsai y col., 2011).

Los resultados de las cuantificaciones, no mostraron inter-relaciones entre el incremento de fenoles y flavonoides totales con la actividad antioxidante al reducir al DPPH, lo cual se debe a la presencia o ausencia de grupos hidroxilo de los fenoles y en particular de los flavonoides, en los diferentes extractos analizados, en la posicin adecuada para ser capaces de donar electrones o quelar aluminio (Xu y col., 2010).

En el caso de la capacidad de reduccin del reactivo de FC o llamada tambin cuantificacin de fenoles, hay que considerar que los fenoles simples o monofenoles tambin reaccionan con el reactivo de FC aunque estos no son antioxidantes al captar a los radicales libres y por lo tanto, no se esperaba necesariamente una correlacin entre el contenido de fenoles totales y la capacidad antioxidante de las muestras por el mecanismo de captar radicales libres. Por lo anterior y para evitar confusiones en la interpretacin de resultados bajo el nombre de contenido de fenoles totales, se sugiere usar el trmino de capacidad de reduccin del reactivo de FC (Huang y col., 2005; Heimler y col., 2010).

Con respecto a la cuantificacin de los flavonoides y la actividad antioxidante al reducir al DPPH, se sabe que en general, la presencia del grupo catecol en el anillo B y el grupo 3-y 5-hidroxilo en el anillo heterocclico de los flavonoides incrementa su actividad como captadores de radicales libres mientras que la glicosilacin la reduce notablemente (Martnez-Flores y col., 2002; Pietta, 1999).

En el caso de la ausencia de la actividad antirradicalar de algunos extractos, no quiere decir que estos no sean antioxidantes por otros mecanismos, como la quelacin de iones metlicos para prevenir la iniciacin de la formacin de los radicales libres, la inhibicin de la oxidacin lipdica, la inhibicin de las enzimas que forman a los radicales libres y la extincin
77 -

DISCUSIN

de estos (Kim y col., 2003). Asimismo, el hecho de que se haya detectado una alta actividad antirradical con un contenido bajo de fenoles y flavonoides, conduce a especular que la actividad antirradicalar est mediada por otras sustancias que no fueron detectadas en las pruebas de cuantificacin. Por varias razones, es conveniente utilizar un ensayo que mida a la vez ms de un parmetro de la actividad antiinflamatoria. En primer lugar, hay confusin sobre lo que se entiende por el trmino "antiinflamatorio" ya que hay que recordar que existen cinco signos locales de la inflamacin y un agente teraputico puede actuar disminuyendo uno o ms de ellos. Adems, una evaluacin simultnea de un frmaco o extracto vegetal contra la inflamacin aguda y proliferativa proveera ms informacin para predecir qu tipos de enfermedades se pueden tratar con el agente teraputico en cuestin. Tambin, es importante considerar que el conocimiento del efecto de un agente farmacolgico o la falta de efecto en ms de un parmetro de actividad antiinflamatoria podran dar pistas sobre su mecanismo de accin. Puesto que en la actualidad, ningn ensayo que evale la actividad antiinflamatoria es totalmente satisfactorio para predecir si el agente teraputico en cuestin es potencialmente til, para la evaluacin de la eficacia del medicamento es deseable la inclusin de ms parmetros ya sea en el mismo o en ensayos adicionales (Swingle y Shideman, 1972). Por lo que queda abierta la necesidad de continuar con la investigacin de esta especie. De acuerdo a los resultados obtenidos, el presente estudio avala el uso de las fracciones ricas en flavonoides de Eysenhardtia polystachya (Ort.) Sarg. en el tratamiento de la inflamacin crnica granulomatosa, segn el modelo del granuloma, sin producir efectos ulcerognicos, caracterstica clnica deseable en los frmacos antiinflamatorios, adems de que su empleo es inocuo a nivel sistmico con un margen de seguridad amplio (la DL50 del extracto etanlico fue mayor de 32 g/kg de p.c.) (Pablo, 2009). Adems, el palo dulce, es una fuente rica de compuestos antioxidantes naturales con capacidad para quelar metales y reducir a los radicales libres in vitro.

78 -

CONCLUSIONES

9. CONCLUSIONES

as fracciones ricas en flavonoides de Eysenhardtia polystachya (Ort.) Sarg. indujeron actividad antiinflamatoria y no provocaron alteraciones morfolgicas ni histolgicas.

Se obtuvieron y cuantificaron a los fenoles y flavonoides totales en los extractos y fracciones analizadas de Eysenhradtia polystachya (Ort.) Sarg., asimismo, se demostr la capacidad antioxidante de los extractos.

La cantidad de fenoles y flavonoides totales no tuvieron una relacin directa con la capacidad antioxidante de los extractos.

Se sugiere que el probable mecanismo de accin de los flavonoides presentes en las fracciones evaluadas farmacolgicamente en el modelo del granuloma sea la inhibicin selectiva de la COX-2.

79 -

PERSPECTIVAS

10. PERSPECTIVAS

or lo anterior, este estudio es un antecedente para que se contine con la investigacin de esta planta medicinal en otros modelos de inflamacin, as como aquellos que

midan la capacidad antioxidante in vivo, para establecer sus mecanismos de accin y en un futuro, se considere como materia prima en la creacin de un fitofrmaco con propiedades antiinflamatoria, diurtica, antiurolitisica y antioxidante. Asimismo, una vez que se haya demostrado la eficacia de los flavonoides, se produzcan estos metabolitos mediante ingeniera gentica para incrementar el rendimiento y se cree un medicamento.

80 -

REFERENCIAS

11. REFERENCIAS
Ajila CM, Brar SK, Verma M, Tyagi RD, Godbout S, Velro JR. 2011. Extraction and analysis of

polyphenols: Recent trends. Critical Reviews in Biotechnology, 31 (3): 227-249.

lvarez CE, Orallo CF. 2003a. Actividad biolgica de los flavonoides (I). Accin frente al

cncer. Bioqumica, 22 (10): 130-140.

lvarez CE, Orallo CF. 2003b. Actividad biolgica de los flavonoides (II). Accin cardiovascular

y sangunea. Bioqumica, 22 (11): 102-110.

Alvarez L, Delgado G. 1999. C- and O-glycosyl--hidroxydihydrochalcones from Eysenhardtia

polystachya. Phytochemistry, 50: 681-687.

Alvarez L, Rios MY, Esquivel C, Chvez MI, Delgado G, Aguilar MI, Villareal ML, Navarro V.

1998. Cytotoxic isoflavans from Eysenhardtia polystachya. Journal of Natural Products, 61: 767-770.
Ames BN, Shigenaga MJ, Hagen TM. 1993. Oxidants, antioxidants, and the

degenerative diseases of the aging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 90: 7915-7922.
Argueta VA, Cano ALM, Rodarte ME. 1994. Atlas de las Plantas de la Medicina

Tradicional Mexicana. Tomo II. Instituto Nacional Indigenista, Mxico, pp. 1102-1103.
Auroma OI, Halliwell B, Williamson G. 1997. In vitro methods for characterizing potential

prooxidant and antioxidant actions of nonnutritive substances in plant foods. In Auroma OI, Cuppett SL. (eds.), Antioxidant methodology, in vivo and in vitro concepts. Ed. AOCS press, Champaign, Illinois, pp. 172-204.
Baggio CH, Freitas CS, Otofuji GdM, Cipriani TR, de Souza LM, Sassaki GL, lacomini M,

Andrade MMC, Mesia-Vela S. 2007. Flavonoid-rich fraction of Maytenus ilicifolia Mart. ex. Reiss protects the gastric mucosa of rodents through inhibition of both H+, K+-ATPase activity and formation of nitric oxide. Journal of Ethnopharmacology, 113: 433-440.
Beltrami E, De Bernardi M, Fronza G, Mellerio G, Vidari G, Vita-Finzi P. 1982. Coatline A

and B, two C-glucosyl--hidroxydihidrochalcones from Eysenhardtia polystachya. Phytochemistry, 21(12): 1931-3933.

81 -

REFERENCIAS

Benzie IFF, Strain JJ. 1996. The ferric reducing ability of plasma (FRAP) as a measure of

antioxidant power: the FRAP assay. Journal of Analysis Biochemistry, 239: 70-76.
Bondet V, Brand WW, Berset C. 1997. Kinetics and mechanisms of antioxidant activity

using the DPPH free radical method. Food Science and Technology, 30(6): 609-615.
Brand-Williams WW, Cuvelier ME, Berset C. 1995. Use of a free radical method to

evaluate antioxidant activity. Food Science and Technology, 28(1): 25-30.

Brielmann HL, Setzer WN, Kaufman PB, Kirakosyan A, Cseke LJ. 2006. Phytochemicals: The

Chemical Components of Plants. En: Cseke LT, Kirakosyan A, Kaufman PB, Warber S, Duke JA, Brielmann HL (eds), Natural Products from Plants. 2da. edicin. Taylor & Francis, E.U.A., pp. 19-25.
Budavari S. 2001. The Merck Index. An encyclopedia of chemicals, drugs, and biologicals.

Merck. Thirteen edition, USA, p. 382.

Burke A, Smyth E, FitzGerald GA. 2007. Agentes analgsicos-antipirticos; farmacoterapia

de la gota. En: Brunton LL, Lazo JS, Parker KL (eds.), Goodman & Gilmans Las bases farmacolgicas de la teraputica. 11va edicin. McGraw-Hill Interamericana Editores, Mxico, pp. 671-696.
Burns TD, Dalgarno BG, Gargan PE, Grimshaw J. 1984. An isoflavone and a

coumestan from Eysenhardtia polystachya -Robert Boyles fluorescent acid-base indicator. Pytochemistry , 23(1): 167-169.
Calixto JB. 2005. Twenty-five years of research on medicinal plants in Latin America.

A personal view. Journal of Ethnopharmacology, 100: 131-134.

Cao G, Booth SL, Sadowski JA, Prior RL. 1998. Increases in human plasma antioxidant

capacity after comsumption of controlled diets high in fruit and vegetables. American Journal of Clinical Nutrition, 68: 1081-1087.
Chang C-C, Yang M-H, Wen H-M, Chern J-C. 2002. Estimation of total flavonoid content in

propolis by two complementary colorimetric methods. Journal of Food and Drug Analysis, 10: 178-182.
Chun OK, Kim D-O. 2004. Consideration on equivalent chemicals in total phenolic assay of

chlorogenic acid-rich plums. Food Research International, 37: 337-342.

82 -

REFERENCIAS

Crotan R, Kumar V, Robbins SL. 1990. Volumen I Patologa estructural y funcional. 4.

edicin. McGraw-Hill Interamericana Editores, Madrid, pp. 39-67.

Dayal Y, DeLellis RA. 1990. El tubo digestivo. En: Crotan R, Kumar V, Robbins SL (eds.),

Volumen II Patologa estructural y funcional. 4. edicin. McGraw-Hill Interamericana Editores, Madrid, p. 884-898.
Di Fiore MSH. 1981. Atlas de histologa normal . 7. edicin. El Ateneo, Buenos

aires.
Domnguez XA. 1979. Mtodos de investigacin fitoqumica. Limusa, Mxico, pp. 281. Drago SME. 2007. Flavonoides recombinantes de relevancia farmacutica. Revista

Mexicana de Ciencias Farmacuticas , 38 (4): 45-47.

Enrquez RE, Frati MAC, Gonzlez PE. 2005. Hacia una poltica farmacutica integral

para Mxico. Secretaria de Salud, Mxico, pp. 49-55.

Erdemoglu N., Turan NN, Akkol EK., Sener B, Abacioglu N. 2009. Estimation of anti-

inflammatory, antinociceptive and antioxidant activities on Arctium minus (Hill) Bernh. Ssp. minus. Journal of Ethnopharmacology, 121: 318-323.
Escarpa A, Gonzalez MC. 2001. An overview of analytical chemistry of phenolic

compounds in foods. Critical Reviews in Analytical Chemistry , 31 (2): 57-139.

Faria A, Olveira J, Neves P, Gameiro P, Santos BC, De Freitas V, Mateus N. 2005.

Antioxidant properties of prepared blueberry ( Vaccinium myrtillus ) extracts. Journal of Agricultural and Food Chemistry , 53: 6896-6902.
Farmacopea Herbolaria de los Estados Unidos Mexicanos. 2001. Anexo 2: Seguridad

de uso de plantas medicinales . Secretaria de Salud. Mxico, pp. 155.

Farmacopea Herbolaria de

los Estados Unidos Mexicanos.

2001.

Anexo 5:

Preparacin de tisanas . Secretaria de Salud. Mxico, pp. 169.

Fogliano V, Verde V, Randazzo G, Ritieni A. 1999. Method for measuring antioxidant

activity and its application to monitoring the antioxidant capacity of wines. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 47: 1935-1940.
Folin O, Denis W. 1912. On phosphotungstic-phosphomolybdic compounds as color

reagents. The Journal of Biological Chemistry, 12 (2): 239-243.

83 -

REFERENCIAS

Fukumoto LR, Mazza G. 2000. Assessing antioxidant and prooxidant activities of phenolic

compounds. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 48: 3597-3604.

Garca BL, Rojo DDM, Garca GLV, Hernndez AM. 2002. Plantas con propiedades

antiinflamatorias. Revista Cubana de Investigaciones Biomdicas, 21 (3): 214-216.

Geissman TA, Crout DHG. 1969. Organic chemistry of secondary plant metabolism.

Freeman, Cooper & Company. E.U.A, pp. 183-230.

Gilani

AH, Atta-ur-Rahman. 2005. Trends in ethnopharmacology.

Journal of

Ethnopharmacology, 100: 43-49.

Gimeno CE. 2004. Compuestos fenlicos. Un anlisis de sus beneficios para la salud.

Nutricin, 23(6): 80-84.

Granda MM, Fuentes VR, Acosta L, Cabrera I. 1988. Plantas medicinales I. Centro de

informacin y documentacin agropecuario, La Habana, pp. 28.

Halter F, Schmassmann A, Peskar BM, Tarnawski AS. 2001. Cyclooxygenase 2-implications on

maintenance of gastric mucosal integrity and ulcer healing: controversial issues and perspectives. Gut and International Journal of Gastroenterology and Hepatology, 49: 443543.
Hanson RG. 2003. Drogas analgsicas, antipirticas y antiinflamatorias. En: Remington (ed.)

Tomo II Remington Farmacia. 20 edicin. Mdica Panamericana, Buenos Aires, p. 17281734.

Heimler D, Vignolini P, Isolani L, Arfaioli P, Ghiselli L, Romani A. 2010. Polyphenol content of

modern and old varieties of Triticum aestivum L. and T. durum Desf. grains in two years of production. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 58: 7329-7334.
Hu F, Hepburn RH, Li Y, Chen M, Radloff ES, Daya S. 2005. Effects of ethanol and water

extracts of propolis (bee glue) on acute inflammatory animal models. Journal of Ethnopharmacology, 100: 276-283.
Huang D, Ou B, Prior RL. 2005. The chemistry behind antioxidant capacity assays. Journal

of Agricultural and Food Chemistry, 53: 1841-1856.

Intahphuak S, Panthong A, Kanjanapothi D, Taesotikul T, Krachangchaeng C, Reutrakul V.

2004. Anti-inflammatory and analgesic activities of Mallotus spodocarpus Airy Shaw. Journal
84 -

REFERENCIAS

of Ethnopharmacology, 90: 69-72.

Ishikawa T, Dos Santos DR, Collantes DIE, Yhosida M, Bacchi EM, Myaje KET. 2008.

Evaluation of gastroprotective activity of Plinia edulis (Vell). Sobral (Myrtaceae) leaves in rats. Journal of Ethnopharmacology, 118: 527-529.
Kim D-O., Chun OK, Kim, YJ, Moon H-Y, Lee CY. 2003. Quantification of polyphenolics and

their antioxidant capacity in fresh plums. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 54: 6509-6515.
Kim HP, Son KH, Chang HW, Kang SS. 2004. Anti-inflammatory plant flavonoids and

cellular action mechanisms. Journal of Pharmacological Sciences , 96: 229-245.

Kim YS, Kim T, Moon K, Kim TJ, Shin D, Cho YS, Moon H, Lee K. 2008. Regulation of

pro-inflammatory responses by lipoxygenases via intracellular reactive oxygen species in vitro and in vivo. Experimental and Molecular Medicine , 40 (4): 461-476.
Kravzov JJ, Altagracia MM. 1997. Situacin de los agentes antiinflamatorios no

esteroidales en Mxico. Revista Mexicana de Ciencias Farmacuticas, 28 (4): 14-20.

Lamaison JLC, Carnet A. 1990. Teneurs en principaux flavonoids des fleurs de Crataegeus

monogyna Jacq et de Crataegeus laevigata (Poiret D. C) en fonction de la vegetation. Pharmaceutica acta Helvetiae, 65: 315-320.
Lansky EP, Newman RA. 2007. Punica granatum (pomegranate) and its potential for

prevention and treatment of inflammation and cancer. Journal of Ethnopharmacology, 109: 177206.
Leyva HER, Quezada RD. 2008. Respuesta inflamatoria. En: Leyva HER, Gaitn CLA (eds.),

Patologa general e inmunologa. Editorial Trillas, Mxico, pp. 149-184.

Leza JC, Lizasoain I. 2004. Frmacos antiinflamatorios no esteroideos y otros analgsicos-

antipirticos. En: Lorenzo P, Moreno A, Leza JC, Lizasoain I, Moro MA (eds.), Velzquez Farmacologa bsica y clnica. 17 edicin. Mdica Panamericana, Buenos Aires, p. 513526.
Lpez LMT. 2002. Flavonoides. Fitoterapia, 21 (4): 108-114. Manach C, Scalbert A, Morand C, Rmsy C, Jimnez L. 2004. Polyphenols: food sources

and bioavailability. American Journal of Clinical Nutrition, 79: 727-747.

85 -

REFERENCIAS

Marco GJ. 1968. A rapid method for evaluation of antioxidants. Journal of the American Oil

Chemists Society, 45 (9): 594-598.

Markham KR. 1975. Isolation techniques for flavonoids. En: Harbone JB, Mabry TJ, Mabry H

(eds.), The Flavonoids. Academic Press, New York, pp. 1-44.

Markham KR, Mabry TJ. 1975. Ultraviolet-visible and proton magnetic resonance

spectroscopy of flavonois. En: Harbone JB, Mabry TJ, Mabry H (eds.), The Flavonoids. Academic Press, New York, pp. 45-77.
Martnez RC, Garca SM, Martnez MSM, Larionova M, Sebazco PC, Mach LM, Ruiz AV. 2004.

Evaluacin antiinflamatoria del flavonoide 2-o-ramnosil 4-o-metil vitexina en ratas. Revista Cubana de Plantas Medicinales, 9 (1): 112-125.
Martnez-Flrez S, Gonzlez-Gallego J, Culebras JM, Tun MJ. 2002. Los flavonoides:

propiedades y acciones antioxidantes. Nutricin Hospitalaria, XVII (6): 271-278.

Martnez VI, Periago MJ, Ros G. 2000. Significado nutricional de los compuestos fenlicos

de la dieta. Archives Lationamerican of Nutrition, 50, 5-18.

Mrquez-Flores YK, Montellano-Rosales H, Campos AME, Melndez-Camargo ME. 2009.

Anti-inflammatory activity of aqueous and methanolic extracts of Oenothera rosea LHr.exAit in the rat. Revista Mexicana de Ciencias Farmacuticas, 40 (3): 11-16.
Middleton EJr, Kandaswami C. 1994. The impact of plant flavonoids on mammalian biology:

implications for immunity, inflammation and cancer. En: Harborne JB (ed), The flavonoids. Advances in research since 1986. Chapman & Hall, London, pp. 619-652.
Molyneux P. 2004. The use of the stable free radical diphenylpicryl-hydrazyl (DPPH) for

estimating antioxidant activity. Songklanakarin Journal Science Technology, 26(2): 211-219.

Montuschi P, Barnes PJ, Jackson RL. 2004. Isoprostanes: markers and mediators of

oxidative stress. The FASEB Journal, 18: 1791-1797.

Moscatelli V, Hnatyszyn O, Acevedo C, Megas J, Alcaraz MJ, Ferraro G. 2006. Flavonoids from

Artemisia copa with anti-inflammatory activity. Planta Medica, 72: 72-76.

Mujumdar AM, Misar AV. 2004. Anti-inflammatory activity of Jatropha curcas roots in mice

and rats. Journal of Ethnnopharmacology, 90: 11-15.

86 -

REFERENCIAS

Narvez-Mastache JM, Soto C, Delgado G. 2007. Antioxidant evaluation of Eysenhardtia

species (Fabaceae): relay synthesis of 3-O-acety-11, 12-epoxy-oleanan-28, 13-olide isolated from E. platycarpa and its protective effect in experimental diabetes. Biological & Pharmaceutical Bulletin, 30 (8): 1503-1510.
Nijveldt RJ, Van Nood E, Van Hoorn DEC, Boelens PG, Van Norren K, Van Leeuwe PAM.

2001. Flavonoids: a review of probable mechanisms of action and potential applications. American Journal of Clinical Nutrition, 74: 418425.
Norma Oficial Mexicana NOM-062-ZOO-1999 . Especificaciones tcnicas para la

produccin, cuidado y uso de los animales de laboratorio

Okoli CO, Akah PA, Nwafor SV, Anisiobi AI, Ibegbunam IN, Erojikwe O. 2007.

Anti-inflammatory activity of hexane leaf extract of Aspilia Africana C. D. Adams. Journal of Ethnopharmacology , 109: 219-225.
Orhan I, Kpeli E, ener B, Yesilada E. 2007. Appraisal of anti-inflammatory

potential

of

the

clubmoss,

Lycopodium

clavatum

L.

Journal

of

Ethnopharmacology , 109: 146-150.

Pablo PSS. 2009. Evaluacin del efecto antiinflamatorio de los extractos acuosos y etanlico

de Eysenhardtia polystachya (Ort.) Sarg. y separacin de flavonoides. Tesis de Licenciatura del Instituto Politcnico Nacional. Escuela Nacional de Ciencias Biolgicas.
Panthong A, Kanjanapothi D, Taesotikul T, Wongcome T, Reutrakul V. 2003.

Anti-inflammatory and antipyretic properties of Clerodendrum petasites S. Moore. Journal of Ethnopharmacology , 85: 151-156.
Paredes SF, Clemente FA. 2005. Polifenoles de aplicacin en farmacia.

Fitoterapia , 21(4): 85-94.

Park JS, Woo MS., Kim DH, HJW, Kim WK, Lee JC, Kim HS. 2007. Anti-inflammatory

mechanisms of isoflavone metabolites in lipopolysaccharide-stimulated microglial cells. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 320 (3): 1237-1245.
Paulino N, Teixera C, Martins R, Scremin A, Dirsh VM, Vollmar AM, Abreu SRL, de Castro SL,

Marcucci MC. 2006. Evaluation of analgesic and anti-inflammatory effects of a brazilian green propolis. Planta Medica, 72: 899-906.
87 -

REFERENCIAS

Prez GRM. 2002. Compuestos aislados de plantas con actividad antiinflamatoria, antiviral e

hipoglucemiante. Instituto Politcnico Nacional. 1ra edicin. Mxico, pp. 13-77.

Prez GRM, Vargas SR, Garca DLM, Dvila BL. 2002. Efecto de isoflavonas aisladas de

Eysenhardtia polystachya sobre el crecimiento de cristales de oxalato y fosfato de calcio urinario. Boletn del Colegio Mexicano de Urologa, 17 (3): 134-139.
Prez S, Meckes M, Prez C, Susunaga S, Zavala MA. 2005. Anti-inflammatory activity of

Lippia dulcis. Journal of Ethnopharmacology, 102: 1-4.

Pietta PG. 2000. Flavonoids as antioxidants. Journal of Natural Products, 63 (7): 1035-

1042.
Possemiers S, Bolca S, Verstraete W, Heyerick A. 2011. The intestinal microbiome: a

separate organ inside the body with the metabolic potential to influence the bioactivity of botanicals. Fitoterapia, 82 (3): 53-66.
Rang HP, Dale MM, Ritter JM, Moore PK. 2004. Farmacologa. 5ta edicin. Editorial

Elsevier, Espaa, pp. 217-260.

Re R, Pellegrini N, Proteggente A, Pannala A, Yang M, Rice-Evans C. 1999. Antioxidant

activity applying and improved ABTS radical cation decolorization assay. Free Radical Biology and Medicine, 26: 1231-1237.
Rao, YK, Fang SH, Tzeng YM. 2005. Anti-inflammatory activities of flavonoids isolated

from Caesalpinia pulcherrima. Journal of Ethnopharmacology, 100: 249-253.

Roginsky V, Lissi EA. 2005. Review of methods to determine chain-breaking antioxidant

activity in food. Food Chemistry, 92: 235-254.

Roome T, Dar A, Ali S, Naqvi S, Iqbal CM. 2008. A study on antioxidant, free radical

scavenging, anti-inflammatory and hepatoprotective actions of Aegiceras corniculatum (stem) extracts. Journal of Ethnopharmacology, 118:514-521.
Salama AM, Avendao IY. 2005. Actividad antiinflamatoria de -amirona y 4,7-

dimetoxiapigenina aislados de Alnus acuminata. Revista del Colegio de Ciencias Qumicas y Farmacuticas, 34 (2): 117-121.
Salamanca GG, Correa CIL, Principal J. 2007. Perfil de flavonoides e ndices de oxidacin de

algunos propleos colombianos. Zootecnia Tropical, 25 (2): 95-102.

88 -

REFERENCIAS

Salazar RM. 2007. Estudio etnobotnico de Eysenhardtia polystachya (Ort.) Sarg. en una

comunidad del municipio de Zempoala, Hidalgo y evaluacin del efecto diurtico en rata. Tesis de Licenciatura de la Universidad Autnoma del Estado de Hidalgo. Instituto de Ciencias de la Salud.
Sargent CS. 1892. The Silva of North America: A description of the trees which grow

naturally in North America exclusive of Mexico. Houghton, Mifflin and Company, Boston, New York, 3: 29.
Seigler SD. 1998. Plant Secondary Metabolism. E.U.A. pp. 151-192. Seyoum A, Asres K, El-Fiky FK. 2006. Structure-radical scavenging activity relationships of

flavonoids. Phytochemistry, 67: 2058-2070.

Shusterman AJ, McDougal PG, Glasfeld A. 1997. Dry-column flash chromatography.

Journal of Chemical Education, 74 (10): 1222-1223.

Silva GN, Martins FR, Matheus ME, Leito SG, Fernandes PD. 2005. Investigation of anti-

inflammatory

and

antinociceptive

activities

of

Lantana

trifolia.

Journal

of

Ethnopharmacology, 100: 254-259.

Singleton VL, Orthofer R, Lamuela-Ravents RM. Analysis of total and other

oxidation substrates and antioxidants by means of Folin-Ciocalteu reagent. Methods in Enzymology , 299: 152-178.
Singleton VL, Rossi JAJr. 1965. Colorimetry of total phenolics with phosphomolybdic

phosphotungstic acid reagents. American Journal of Enology and Viticulture, 16, 144158.
Smyth EM, Burke A, FitzGerald GA. 2007. Autacoides derivados de lpidos: eicosanoides y

factor activador plaquetario. En: Brunton LL, Lazo JS, Parker KL (eds.), Goodman & Gilmans Las bases farmacolgicas de la teraputica. Undcima edicin. McGraw-Hill Interamericana Editores, Mxico, p. 653-670.
Swingle KF, Shideman FE. 1972. Phases of the inflammatory response to subcutaneous

implantation of a cotton pellet and their modification by certain anti-inflammatory agents. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 183 (1): 226-234.

89 -

REFERENCIAS

Tsai J-C, Huang G-J, Chiu T-H, Huang S-S, Huang S-C, Huang T-H, Lai S-C, Lee C-Y. 2011.

Antioxidant activities of phenolic components from various plants of Desmodium species. African Journal of Pharmacy and Pharmacology, 5 (4): 468-476.
Xu Z, Tang M, Li Y, Liu F, Li X, Dai R. 2010. Antioxidant properties of Du-zhong (Eucommia

ulmoides Oliv.) extracts and their effects on color stability and lipid oxidation of raw pork patties. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 58: 7289-7296.
Wang G-J, Chen Y-M, Wang T-M, Lee C-K, Chen K-J, Lee T-H. 2008. Flavonoids with iNOS

inhibitory activity from Pogonatherum crinitum. Journal of Ethnopharmacology , 118: 71-78.

Waterhouse AL. 2002. Supplement 6: Determination of total phenolics. In E. R. E.

Wrolstad (Ed.), Current Protocols in Food Analytical Chemistry. John Wiley & Sons. Inc. New York, pp. I1.1.1I1.1.8.

90 -

APNDICES

12. APNDICES
APNDICE 1 Resultados del anlisis fitoqumico preliminar (Domnguez, 1979) A. Alcaloides
RESULTADO Infusin Decoccin hojas hojas -

Reactivo De Dragendorff De Mayer De cido silicotngstico De Sonnenschain De Wagner

Precipitado Naranja Blanco o amarillento Blanco amarillento Amarillo o azul verde (grupo amino reductor) Caf naranja

Infusin corteza -

Decoccin corteza -

Extracto etanlico + -

B. Azcares reductores
RESULTADO Decoccin Infusin Decoccin corteza hojas hojas +++ (blanco) ++++ -

Reactivo De Fehling De Benedict

Precipitado Naranja a rojo ladrillo Naranja a rojo ladrillo

Infusin corteza + ++

Extracto etanlico ++++ +++

C. Cumarinas
RESULTADO Infusin hojas + -

Reactivo De Erlich Con NH4OH conc.

Coloracin terica Naranja Fluorescencia azul - violeta

Infusin corteza + -

Decoccin corteza + -

Decoccin hojas + -

Extracto etanlico +++ +

91 -

APNDICES

D. Flavonoides
Coloracin terica RESULTADO Decoccin Infusin corteza hojas -

Reaccin

Infusin corteza + + -

Decoccin hojas -

Extracto etanlico -

1. De Shinoda (HCl conc.) auronas o Roja chalconas adicin de Mg0 flavonas Naranja a rojo Flavonoles Roja Flavononas Magenta 2. Con NaOH al 10% Xantonas y Amarillo- rojo Flavonas Flavonoles Caf - naranja Chalconas Prpura- rojizo Antocianinas Azul

+ -

+ -

+ -

+ -

+ -

+ -

+ -

+ -

E. Glucsidos cardiacos
Coloracin terica De azul a violeta Roja poco estable Vara del naranja a rojo oscuro RESULTADO Infusin corteza + + Decoccin corteza + + Infusin hojas + + Decoccin hojas + + Extracto etanlico +++ +++

Prueba

De Kedde De Legal De Baljet

F. Glucsidos cianogenticos
Color terico de la mancha Rosa a rojo RESULTADO Decoccin Infusin corteza hojas -

Reaccin De Gignard

Infusin corteza -

Decoccin hojas -

Extracto etanlico -

92 -

APNDICES

G. Saponinas
Coloracin terica RESULTADO Decoccin Infusin corteza hojas

Reaccin De Liebermann Buchard Saponinas esteroidales Saponinas triterpenoides De Rosenthaler (saponinas triterpenoides)

Infusin corteza

Decoccin Extracto hojas etanlico

Azul o verde en la interfase Rosa, roja, magenta o violeta Violeta

(amarillo)

(amarillo)

+ (rojo) ++

H. Sesquiterpenlactonas
Coloracin terica Roja, violeta o rosa RESULTADO Decoccin Infusin Decoccin Extracto corteza hojas hojas etanlico -

Reaccin Con hidroximato frrico

Infusin corteza -

I. Taninos
Precipitado o color terico Precipitado blanco RESULTADO Decoccin Infusin Decoccin Extracto corteza hojas hojas etanlico +++ +++ +

Reactivo 1. Reactivo de gelatina 2. Reactivo de FeCl3 al 1% Derivados del cido glico Derivados del catecol Adicin de K4[Fe(CN)6] al 1% (compuestos fenlicos)

Infusin corteza -

Coloracin azul a negro Coloracin verde Coloracin azul

+ -

+ -

++ -

++ -

+++ -

93 -

APNDICES

J. Quinonas
Coloracin terica Roja que aparece en los primeros 2 minutos Roja RESULTADO Decoccin Infusin corteza hojas + +

Reaccin 1. Con NH4OH conc. (antraquinonas) 2. Con H2SO4 conc. (antraquinonas) 3. De Brntraguer Benzoquinonas Con H2O2 al 6% (derivados de antraquinonas)

Infusin corteza +

Decoccin Extracto hojas etanlico + +++

++

Roja Roja

+ +

94 -

APNDICES

APNDICE 2 Validacin estadstica del mtodo de cuantificacin de fenoles totales La mezcla de reaccin, es decir, la reduccin de los xidos de molibdeno presentes en el reactivo de FC por la quercetina y el cido glico, gener una meseta cuando absorbi la luz visible (Chun y Kim, 2004) y mostr su mxima en 760 5 nm, motivo por el cual se emple esta para la cuantificacin de los fenoles totales de las muestras (Figura 26).

Figura 26. Espectro de UV/Vis de la reduccin de MoO4+ a MoO3+ del reactivo de FC en medio bsico.

La curva tipo que se obtuvo usando cido glico como estndar se muestra en la figura 27 y como se puede observar la recta tiende a la linealidad hasta una concentraccin de 6.25 g/mL ya que despus de este punto de la curva de calibracin se genera una meseta (no mostrada). Como se puede apreciar en la figura 27, existe una ligera deplecin de las absorbencias en las concentraciones 1.56 y 2.08 g/mL, sin embargo, an consideran do estas concentraciones, la r2 es significativa. Los parmetros de desempeo de la correlacin entre la concentracin del cido glico como estndar y la absorbencia del MoO3+ se muestran en la tabla 7.

95 -

APNDICES

0.7 0.6 0.5

Absorbancia

0.4 0.3 0.2 0.1 0.0 -0.1 0 1 2 3 4 5 6 7

Concentracin de cido glico (ug/mL)

Figura 27. Curva de calibracin de los fenoles totales usando al cido glico como estndar

El mtodo es lineal, pero poco sensible ya que el ngulo de inclinacin de la pendiente (S) es de 17.4, y el I.C. 95%, b no incluye el cero por lo tanto si hay una correlacin entre las concentraciones trabajadas y la absorbencia obtenida, el I.C. 95%, a tampoco incluye el cero lo cual es razn suficiente para realizar el mtodo de las adiciones para corroborar si hay o no efecto de la matriz, pero debido a la cantidad de muestra requerida para llevar a cabo dicho propsito se opt por utilizar el mtodo que se describi anteriormente. De acuerdo a los valores de L.D., L.C. y L.d., el intervalo de trabajo en trminos de absorbencias es de 0.0750 a 0.5776 (Tabla 7).

96 -

APNDICES

Tabla 7. Parmetros de desempeo del mtodo para cuantificar los fenoles totales usando al cido glico como estndar Parmetro YB S r2 N ngulo de la pendiente Sy/x Sa Sb I.C. 95%, a I.C. 95%,b L.D. L.C. L.d. Syc* Valor -0.0516 0.0981 0.9888 26 17.4 0.0211 0.0078 0.0021 -0.0677<-0.0516<-0.0355 0.0938<0.0981<0.102 0.0117 0.1594 0.0750 0.5454<0.5615<0.5776

La curva tipo que se obtuvo usando a la quercetina se muestra en la figura 28 y como se puede observar la recta tiende a la linealidad hasta una concentraccin de 6.25 g/mL ya que despus de este punto de la curva de calibracin se genera una meseta (no mostrada). Los parmetros de desempeo de la correlacin entre la concentracin de la quercetina y la absorbencia del MoO3+ se muestran en la tabla 8.

97 -

APNDICES

1.2

1.0

0.8

Absorbancia

0.6

0.4

0.2

0.0 0 1 2 3 4 5 6 7

Concentracin de quercetina (ug/mL)

Grfica 28. Curva de calibracin de los fenoles totales usando a la quercetina como estndar

El mtodo para la cuantificacin de fenoles totales es lineal independientemente del estnadr utilizado, pero es ms sensible cuando se utiliza quercetina ya que el ngulo de inclinacin de S es de 22.2 mientras que cuando se utiliza cido glico es de 17.4, el I.C. 95%,
b

no incluye el cero, por lo tanto, hay una correlacin entre las concentraciones trabajadas y
95%, a

la absorbencia obtenida, el I.C.

no incluy al cero, lo cual es razn suficiente para

realizar el mtodo de las adiciones para corroborar si hay o no efecto de la matriz, pero debido a la cantidad de muestra requerida para llevar a cabo dicho propsito se opt por utilizar el mtodo que se describi anteriormente. De acuerdo a los valores de L.D., L.C. y L.d., el intervalo de trabajo en trminos de absorbencias es de 0.1469 a 1.0253, lo cual se tom en cuenta para que las absorbencias de las muestras cayeran en ese intervalo y los resultados fueran confiables (Tabla 8). Cabe destacar que el intervalo de trabajo en trminos de absorbencias, en ms amplio cuando se emplea a la quercetina como estndar, sin embargo, la mayora de las publicaciones reportan la cantidad de fenoles totales en base a equivalentes de cido glico.

98 -

APNDICES

Tabla 8. Parmetros de desempeo del mtodo para cuantificar los fenoles totales usando a la quercetina como estndar Parmetro YB S r2 N ngulo de la pendiente Sy/x Sa Sb I.C. 95%, a I.C. 95%,b L.D. L.C. L.d. Syc* Valor -0.0361 0.1661 0.9919 26 22.2 0.0305 0.0113 0.0031 -0.0594<-0.0361<-0.0128 0.1597<0.1661<0.1725 0.0554 0.2689 0.1469 0.9787<1.0020<1.0253

99 -

APNDICES

APNDICE 3 Validacin estadstica del mtodo de cuantificacin de flavonoides totales La quercetina (flavonol) a una concentracin de 10 g/mL exhibi su mximo pico de absorcin en los 255 nm, y desniveles en los 269, 301 y 371.8 nm, tal como lo indica la literatura. En tanto que la mezcla de reaccin, es decir, el complejo de coordinacin formado por la quercetina y el aluminio, mostr su pico mximo en los 440.4 nm, motivo por el cual se emple esta para la cuantificacin de los flavonoides totales de las muestras (Figura 29).

Figura 29. Efecto de la quelacin del alumnio sobre el espectro de UV/Vis de la quercetina. En rojo se observa el desplazameinto batocrmico y el efecto hipercrmico de los mximos de absorcin comparados con el espectro de la quercetina

La curva tipo que se obtuvo usando quercetina como estndar se muestra en la grfica 30 y como se puede observar, la recta es lineal en el intervalo de concentraciones trabajadas Los parmetros de desempeo de la correlacin entre en la concentracin del quercetina como estndar y la absorbencia del complejo formado se muestran en la tabla 9.

100 -

APNDICES

1.2

1.0

0.8

Absorbancia

0.6

0.4

0.2

0.0

-0.2 0 2 4 6 8

Concentracin de quercetina (ug/mL)

Grfica 30. Curva de calibracin de los flavonoides totales

El mtodo es lineal, pero poco sensible ya que el ngulo de inclinacin de S es de 20.9 y el I.C.
95%, b

no incluy al cero, por lo tanto, hay una correlacin entre las concetraciones
95%, a

trabajadas y la absorbencia obtenida, el I.C.

no incluy al cero, lo cual es razn

suficiente para realizar el mtodo de las adiciones para corroborar si hay o no efecto de la matriz, pero debido a la cantidad de muestra requerida para llevar a cabo dicho propsito se opt por utilizar el mtodo que se describi anteriormente. De acuerdo a los valores de L.D., L.C. y L.d., el intervalo de trabajo en trminos de absorbencias es de 0.0911 a 1.0767.

101 -

APNDICES

Tabla 9. Parmetros de desempeo del mtodo de cuantificacin de los flavonoides totales Parmetro YB S r2 N ngulo de la pendiente Sy/x Sa Sb I.C. 95%, a I.C. 95%,b L.D. L.C. L.d. Syc* Valor -0.0451 0.1464 0.9967 14 20.9 0.0227 0.0109 0.0024 -0.0689<-0.0451<-0.0213 0.1412<0.1464<0.1516 0.0230 0.1819 0.0911 1.0291<1.0529<1.0767

102 -

APNDICES

APNDICE 4 Validacin del mtodo de evaluacin del potencial antioxidante in vitro DPPH Al realizar el espectro de absorcin de luz visible del DPPH se obtuvo que el pico mximo, bajo nuestras condiciones de anlisis se encuentra en 514 nm, el cual est dentro de lo que reporta la literatura (Molyneux, 2004) (Figura 31).

Figura 31. Mximo de absorcin del radical estable DPPH a 514 nm.

103 -