Diagnstico de la TB con Resistencia a Frmacos Credibilidad de los Test de Susceptibilidad Mtodos Rpidos de Deteccin de Resistencias Jos L.

Cabrera, MD Alberto Mendoza, MD Lima, octubre del 2013

El camino lento para el diagnstico de la tuberculosis

Tiempo de procesos previo a PSR, Per 2009 (N=287 casos)

Dx TB

Comunidad
Da 0
Dx
MDR

EESS Primario

Lab local
Da 03

EESS Primario

Inicio Tto 1L Da 05

EESS Primari o

Lab Regional
Da 168

EESS Primario

EESS de Refer.

CERI

EESS Primario

Inicio Tto 2L
Da 251

Dx XDR

EESS Primari o

Lab. Nac.
Da 280

EESS Primario

EESS de Refe.

CERI

CERN

EESS Primario

Inicio Tto XDR

Da 305

Pruebas de laboratorio
Diagnstico de TB Baciloscopa concentrada y fluorescencia LED Cultivo en medio BACTEC 960/320 MGIT Cultivo MODS Xpert MTB/RIF Diagnstico de TB-MDR PSD Griess (nitrato reductasa) PSD MODS PSD Genotype MTBDRplus Complemento MODS Genotype

Igual sensibilidad y especificidad con la estrategia diagnstico el mismo da (front-loaded)

Lancet Infect Dis 2013; 13: 14754

Cultivo de Micobacteria
El mejor mtodo (gold standard) para el diagnstico de TB es el cultivo positivo de Mycobacterium tuberculosis en medio slido o lquido
Sensibilidad - 70% - 96% Alta Especificidad - 98%

Ventajas:

Diferenciacin de las especies (fenotpica) Evaluacin de nuevas drogas y/o esquemas teraputicos (ensayos clnicos) Tipificacin molecular de M. Tuberculosis y anlisis de virulencia La principal ventaja de la utilizacin de medios lquidos es la disminucin en el tiempo de deteccin del bacilo.

Cultivo medio lquido

Junio 2007: WHO recomienda el uso de medio lquido para cultivo y PS en pases de medios y bajos recursos
CDC, 1985; WHO, 2007

MGIT Ventajas
Los retrasos para DST pueden reducirse a 10 das en comparacin con 28-42 das como ocurre con los medios slidos convencionales MGIT es ms sensible para la deteccin de micobacteria y puede aumentar la deteccin de casos en 20 - 30% sobre medio slido

Uso en muestras paucibacilares (extrapulmonares)

India
De 164 muestras de LCR Positivas para TB ZN: 13 positivas (7,9%) LJ: 18 (10,9%) 38 das BACTEC 960: 49(29,8%) 18 das Adems BACTEC 960 encontr: 5 Micobacterias No TB 9 Criptococos 3 contaminantes

MODS (Mycroscopic Observation Drug Susceptibility)

PS Directa MODS
Fundamentos
Desarrollado y validado en Per (Caviedes et al. 2000) Microcultivo que imita a los cultivos automatizados BACTEC Medio liquido enriquecido en placas de 24 pozos Lectura con microscopio invertido (cultivos celulares) Diagnostica simultneamente MTB y resistencia a INH y RIF Mejor crecimiento de MTB en medio lquido Identificacin de cordones tpicos y exclusivos de MTB Aadiendo INH y RIF a concentraciones definidas se detecta su susceptibilidad.

N Engl J Med 355;15 www.nejm.org october 12, 2006

PS Directa MODS
Ventajas
Diagnostica simultneamente MTB y resistencia a INH y RIF. Identifica complejo M.tuberculosis: formacin de cordones Indicado en muestras pulmonares frotis (+), paucibacilares o (). Tambin muestras extrapulmonares (an no validado en Per). Ms rpido (7 das) y sensible (98%) que medios Ogawa, LJ y MBBacT. Ms rpido (7 das) a ms cruces menor tiempo de lectura Permite rescatar muestra para cultvo y PS convencional. Barato (14 soles) y es rutinario en 4 Laboratorios de Per Sensibilidad RIF: 100%, INH: 85%, DR: 89% (Moore et al, Lima) Sensibilidad RIF: 98% INH:94% MDR: 91% (Perea et al, Arequipa) Respaldado por la OMS en el 2010 (revisin sistemtica) Baja tasa de contaminacin: 1,8% (Perea et al, Arequipa) TB MODS kit: mejor estandarizacin y seguridad Validado antes y durante el tratamiento en Per No tiene patente libre distribucin: www.modsperu.org

PS Directa MODS
Desventajas
Demanda hasta 21 das para ser reportado como negativo Desarrollo de destreza de lectura del analista Requiere procesos y equipamiento convencional de Lab de TB Adems un microscopio invertido (ahora a menos de 1000 USD) Proceso manual: adecuado entrenamiento del personal Bioseguridad por medio lquido que utiliza

N Engl J Med 355;15 www.nejm.org october 12, 2006

 Video MODS

NaOHNALC Vortex y dejelo 15 minutes

PB S Llene tubo hasta 15ml

7H9 Centrifuga 15 min 3000g PANTA OADC

Decontaminacin de la muestra

MODS
isoniacida rifampicina sin droga sin droga 1 2 3 Control 4 negativ 5

900l/p ozo

Cultivo y prueba de susceptibilid ad directa

15

Tiempo hasta cultivo-positivo

100

% Positivo

13

26

50

MODS MBBacT LJ

0 0 10 20 30 40 50 60

Dias
Moore DAJ et al, NEJM 2006; 355 (15): 1539-50

Vietnam, 230 muestras de LCR de 156 pacientes con sospecha de Meningitis TB A todos: baciloscopa, MODS, BACTEC y LJ 57/137 casos confirmados de MTB MODS VIH positivos: VPP 100% VPN: 78,7% VIH negativos: VPP 100% y VPN 82,1% Tiempo promedio : MODS 6 das, MGIT 15,5 das, LJ 24 das

PLoS ONE 2(11): e1173.

PS Directa de Nitrato reductasa (Griess)

Fundamentos - Desarrollado y validado en Rusia; en Per desde el 2005 - Cultivo en medio LJ convencional con suplemento de nitrato - Aprovecha cambio de coloracin del reactivo de Griess a la reduccin de nitratos por el metabolismo de bacterias an invisibles - Lectura a 14, 21 y 28 das (validado en Per a los 28 das)

PS Directa de Nitrato reductasa (Griess)

Ventajas - Barato (15soles) y es rutinario en 2 Laboratorios de Per - Relativamente ms fcil de implementar en laboratorios que ya hacen cultivo en LJ (en Per hacen Ogawa) - Respaldado por OMS por su alta sensibilidad y especificidad: 98% (Asencios et al)

PS Directa de Nitrato reductasa (Griess)

Desventajas - Slo detecta resistencia a INH y RIF a partir de muestras de esputo de una cruz o ms (no FN) - Requiere procesos y equipamiento convencional de Lab. de TB ms centrifuga refrigerada (costosa) - Proceso manual: adecuado entrenamiento - Demanda ms tiempo: 28 das - No permite estudiar muestras extra-pulmonares - No identifica MTB, ni siquiera BAAR, puede haber falso positivos (solo color) - Mucho espacio en incubadora por cada muestra: 7 tubos LJ no apilables, produccin limitada.

PSD Genotype MTBDRplus

Fundamentos - Prueba molecular comercial: extraccin ADN, PCR multiplex e hibridacin, semiautomatizado (tcnica Line Probe Assay - LPA) - Detecta complejo MTB y mutaciones de resistencia de RIF e INH

PSD Genotype MTBDRplus

Ventajas - Indicado en muestras pulmonares frotis +,(versin 2.0 en frotis -) - Proceso dura 5 horas, operacionalmente 48 72 horas - Sensibilidad RIF: 99%, INH: 94%, MDR: 99% (Hilleman et al, SA) - Sensibilidad RIF: 100% INH:97% MDR: 98% (Asencios et al, Peru) - Implementado en INS desde el 2008 - Hay una versin para detectar XDR - Respaldado por OMS

PSD Genotype MTBDRplus

Desventajas - Slo evala resistencia a INH y RIF, no sirve para monitorear tratamiento - Infraestructura y equipamiento de laboratorio de biologa molecular - Entrenamiento sofisticado de analistas - Costos mayores por cada determinacin: S/. 178

Genotype MDRTBplus & MTBDRsl

Primers marcados con biotina

GenoScan

GT Blot 48

Flujo de Trabajo

Software BLOTRIX

Identificacin del Complejo M. tuberculosis y su resistencia a Rifampicina y/o Isoniacida usando el Genotype MTBDRplus

Validacin de la prueba Genotype MTBDR plus en muestras de esputo positivas y cultivos de esputo procedentes de la Red de Laboratorios de Salud Pblica del Per. Comparacin con el mtodo de proporciones en agar en placa. Resultados avalaron la expansin de esta prueba en Per

Asencios, et al. Rev Peru Med Exp Salud Publica 2012; 29: 92-98

Asencios, et al. Rev Peru Med Exp Salud Publica 2012; 29: 92-98

Xpert MTB/RIF
Fundamentos - Desarrollado por la compaa Cepheid - EEUU - Prueba automatizada: extraccin ADN, RTPCR, Hibridacin, lectura en un cartucho - Identifica complejo MTB y mutaciones de rPOB para rifampicina Ventajas - Resultado en 2 horas, entrenamiento fcil del personal - No requiere equipamiento del Lab de TB - Alta sensibilidad en muestras frotis positivas y 70% en frotis negativo cultivo + - Diagnostica simultneamente MTB y resistencia a y RIF (no TB-MDR) - Respaldado por OMS: cmo indicador de MDR en zonas de alta prevalencia y en VIH+

Xpert MTB/RIF
Desventajas - Alto costo de equipos (17000 USD), cartucho (17 USD) y mantenimiento (financiamiento) de equipos - No puede reemplazar a la baciloscopa y al cultivo: gran porcentaje de resultados negativos: Per 1,2 millones de SR y slo 35 mil casos positivos (3%) - Equipo de 4 cartuchos: 16 por jornada - No recupera baciloscopa para posteriores estudios - No evala isoniacida

Evolucin de la tuberculosis e implementacin de PSR Per 1990 - 2012

300
Tasa de morbilidad x 100 mil hab/ N casos XDR MODS, 2008

1400
GT, 1,225 2011

250

1200

1000 200 800 150

106.7 N de casos de MDR

600

100 400
Tasa de Morbilidad 84

50

XDR MDR

200

2008

1990

1991

1992

1993

1994

1995

1996

1997

1998

1999

2000

2001

2002

2003

2004

2005

2006

2007

2009

2010

2011

2012

INDICACIONES DE LAS PRUEBAS RAPIDAS EN PERU

MODS Diagnstico de resistencia a INH y RIF en personas con TB P Frotis (+) o (-) GRIESS Diagnstico de resistencia a INH y RIF en personas con TB P Frotis (+) GENOTYPE Diagnstico de resistencia a INH y RIF en personas con TB P Frotis (+) No diagnostica TB

Diagnstico de TB P No diagnostica TB en SR (VIH, no VIH, BAL, nios: cont. gstrico) Diagnstico de TB No diagnostica TB extrapulmonar: LCR, extrapulmonar pleura, peritoneo, orina, etc. (VIH) Monitoreo de No sirve para respuesta al monitorear tratamiento (podra tratamiento reemplazar a cultivo slido)

No diagnostica TB extrapulmonar

No sirve para monitorear tratamiento

Nmero de pruebas rpidas y casos MDR, Per 2000-2012

10000 9000 8000
MDR Griess MODS Genotype
884 728 779 1,204 1,198 1,191 1,120 1,126 1,109 1,191

1,400 1,225 1,200 8748

N de PS rpida

7000 6000 5000 4000 3000 2000

451

697

800

5237
600 400

1000
0

200
0

2002

2000

2001

2003

2004

2005

2006

2007

2008

2009

2010

2011

2012

N de casos TB MDR

1,000 6914

Qu pruebas usar para TB y TB-MDR?

1.
2.

3.
4.

5.

Griess debe ser descontinuada y reemplazada por Genotype MTBDRplus en Lima Ciudad y Lima Este. Usar Genotype en todo caso de TB P frotis positivo y riesgo de TB resistente y en cultivos positivos de Micobacterias Usar MODS en todo paciente con TB P con frotis negativo (30%) y frotis positivo sin factores de riesgo mayores de TB resistente MODS debe implementarse en laboratorio regionales y progresivamente en hospitales regionales o Institutos para aprovechar el diagnstico de TB P y TB EP Xpert MTB/RIF en regiones donde sea difcil disponer de laboratorios y personal entrenado: selva del Per

35

Propuesta: Complemento MODS & Genotype

GENOTYPE Solo baciloscopa positiva MODS Complementa con baciloscopa negativa y paucibacilares

No diagnostica tuberculosis (no Complementa diagnosticando bacilos viables) tuberculosis

Demora 3 das Costo 180 nuevos soles Laboratorio especializado Demora 7 a 14 das Costo 15 nuevos soles Laboratorio de TB convencional ms microscopio invertido

Recomendado en poblacin con riesgo de TB resistente y frotis positivo Aplicacin ms salubrista que clnica

Recomendado para el resto de pacientes: TB sin riesgo de TB resistente (BK+ o -) y TB con riesgo con frotis negativo. Aplicacin ms clnica que salubrista

Expansin pruebas de sensibilidad rpidas, Per 2013 -2015

Genotype /MODS
Tumbes 74.3 Piura 33.5 Amazonas 25.0

Genotype Loreto /MODS 132.7

Genotype/ MODS
DIRESA Lima

MODS 72.4

Cajamarca Lambayeque San Martin 15.2 50.6 Genotype La Libertad 81.4 /MODS MODS Ancash Hunuco Ucayali 88.5 53.4 Pasco 189.5 MODS 35.9

Genotype/MODS
Callao

Genotype/ .Lima Este

Junn Lima 64.8 Madre de Dios 212.2 Genotype 179.7 Cusco Callao Huancavelica 68.9 /MODS 284.2 22.7 MODS Apurmac Ica Puno 136.6Ayacucho27.8 36.3 43.4 ESTRATEGIA NACIONAL MODS
DE TBU
BAJO RIESGO MEDIANO RIESGO ALTO RIESGO

Provincia del Callao

Genotype /MODS

Genotype/ .Lima Ciudad

Genotype/MO DS .Lima Sur

Arequipa 77.5

Genotype
INS

MODS
Moquegua 123.7

MUY ALTO RIESGO

Estratificacin basada en Cuartiles.

Tacna 173.2

Genotype /MODS

Lima y Callao
ESN PCT A .Alarcn

Pruebas de Sensibilidad Convencionales

- Dcada 60s: Mtodos de referencia - Dcada 80s: BACTEC - Dcada 90s: Diversificacin de mtodos

Pruebas de Sensibilidad Convencionales

MEDIO SOLIDO MEDIO LIQUIDO

- Lectura macroscpica - Tiempo 21 a 28 das - Mtodos: - Cociente de resistencias - Concentraciones absolutas - Mtodo de las proporciones

- Lectura semiautomtica - Tiempo 5 a 13 das - Mtodos: - Bactec 460 (radiomtrico) - MGIT

Pruebas de Sensibilidad Convencionales

Aportan informacin tarda: nunca vigentes Ms reproducibles en pacientes NT No exacta correlacin in vivo (excepto para H-R) Ayuda diagnstica en todos los casos Interpretar adecuadamente

Frecuencia de aislamientos vs MIC

Frecuencia de aislamientos vs MIC

Pruebas de Sensibilidad Convencionales

Factores asociados
DEPENDIENTES DE LOS MEDICAMENTOS - Disolucin - Almacenamiento - pH, CO2 DEL INOCULO - Tamao - Dispersin - Viabilidad - Representatividad DEL CULTIVO - Tiempo de incubacin CONTROLES DE CALIDAD

Concentraciones crticas DPL y DSL

Las PS son confiables?

Los resultados de PS son confiables para isoniacida, rifampicina, fluoroquinolonas e inyectables de segunda lnea. Para el resto, la interpretacin debe ser realizada bajo un enfoque clnico laboratorial, dada la baja reproducibilidad de sus resultados. Aunque la resistencia a medicamentos detectada por la PS convencional refleja la ineficacia de un medicamento en el medio de cultivo (in vitro), esto no necesariamente corresponde clnicamente a la ineficacia del medicamento.

Muchas gracias

jcabrera@minsa.gob.pe