ExpoCiencias Nacional 2011 Mxico, Distrito Federal

Diseo de un biorreactor de inmersin temporal para la micropropagacin de Aztekium hintonii

Alan de Jess Jurez Gmez Enrique Joel Manjarrez Rodrguez Hctor Alan Barrn Len

rea: Medio ambiente Categora: Superior

Irapuato, Guanajuato, a 6 de octubre de 2011.

Sumario Aztekium hintonii es una especie endmica en peligro de extincin con propiedades medicinales y atractiva para los cactfilos. El objetivo del proyecto es micropropagar la especie Aztekium hintonii a travs del diseo y construccin de un biorreactor de inmersin temporal para repoblar y conservar su hbitat natural. Utilizar un biorreactor de Inmersin Temporal ofrece las ventajas de ser una tecnologa importante en la reduccin de la mano de obra y tiempo, en ofrecer bajos costos de produccin, automatizacin del proceso, permite controlar las condiciones de operacin todo esto en comparacin con el cultivo in vitro en medio solido y con biorreactores comerciales. Con los biorreactores diseados en el presente proyecto se obtuvo en un lote una produccin de biomasa del 73 % mayor comparado con el medio slido. Adems de tener la eficiencia de reactores comerciales, se logr construir dos prototipos de menor costo y con ms aplicaciones en distintas areas cientficas, dando soluciones a varias problemticas sin descuidar el objetivo principal del proyecto. Basados en los resultados obtenidos, se concluye que el biorreactor de inmersin temporal diseado es una solucin biotecnolgica para micropropagar de forma masiva el cactus Aztekium hintonii.

1. Introduccin Aztekium hintonii pertenece a la familia cactaceae, se desarrollan en regiones nativas ridas y semiridas donde las condiciones de alta temperatura y falta de agua son criticas. Tienen presencia de espinas, ausencia de hojas y son plantas suculentas. Esta especie es endmica del estado de Nuevo Leon y fue descubierta en 1992 (Glass & W. A. Fitz Maurice 1992), por lo que no habita en ningn otro lugar del mundo. Esta especie tiene importancia medicinal y es muy buscado por coleccionistas nacionales y extranjeros, de modo que las extraen de su hbitat natural causando que est en peligro de extincin.

La micropropagacin con medio solido es una tcnica biotecnolgica de cultivo in vitro aplicada a la propagacin vegetativa de plantas, con ventajas como tasas de crecimiento mayores que en condiciones naturales lo que permite obtener una gran cantidad de plantas en corto tiempo, la superficie necesaria para mantener gran cantidad de plantas es pequea, la obtencin de plantas libres de bacterias, hongos y virus, la posibilidad de producir plantas durante todo el ao. No obstante, esta tcnica presenta ciertas limitaciones ya que requiere gran cantidad de pequeos recipientes de cultivo, mano de obra calificada, una escasa posibilidad de automatizacin, la eficiencia de propagacin es limitada y son altos los costos de produccin.

Figura 1. Aztekium hintonii (Johansson C. 2007) Figura 2. Cultivo in vitro de A. hintonii en medio solido.

Un biorreactor es un sistema de cultivo dentro de un recipiente cuya funcin principal es proporcionar un ambiente controlado que permita alcanzar las condiciones ptimas para la micropropagacin.

ventajas mencionadas se deben principalmente a que se maximiza el rea de contacto del medio de cultivo con el explante, ya que se sumerge completo en el medio lquido.

Figura 3. Reactor de Inmersin Temporal comercial (RITATM).

Figura 4. Funcionamiento de un Biorreactor de Inmersin Temporal (Dupta, Ibaraki, 2006).

La Inmersin Temporal es un mtodo que consiste en humedecer de manera intermitente y por un corto periodo de tiempo el tejido de una planta con medio lquido seguido por el secado por gravedad, todo esto ocurre dentro de un biorreactor. Utilizar un biorreactor de Inmersin Temporal es la mejor alternativa para la solucin de los problemas del cultivo in vitro en medio solido, debido a que ofrece las ventajas de ser una tecnologa importante en el incremento considerable de la velocidad de produccin de biomasa en los explantes cultivados, reduccin de la mano de obra, ofrece bajos costos de produccin, automatizacin del proceso, permite controlar las condiciones de operacin y es suficiente para el establecimiento de un sistema prctico para la propagacin masiva de Aztekium hintonii. Todas las

Existen biorreactores comerciales que permiten micropropagar plantas y tienen una gran aplicacin en la biotecnologa, dichos reactores se venden solo en el extranjero con un alto costo, adems estos prototipos son desechables.

2. Problema Actualmente en Mxico existe una gran cantidad de cactceas en peligro de extincin, entre ellas se encuentra la especie Aztekium hintonii, esta sufre sobreexplotacin debido a que se utiliza de ornamento y de compuesto para frmacos, adems esta presenta poca viabilidad de sus semillas y una lenta velocidad de

crecimiento tomando 4 aos en crecer hasta 5 mm (Heller, 1965), es por esta razn que se deben aplicar tcnicas biotecnolgicas para lograr el rescate y conservacin de la especie Aztekium hintonii dichas tcnicas han permitido establecer un avance significativo de produccin a nivel laboratorio en cuanto a la micropropagacin de plantas, pero a pesar de sus ventajas este sistema presenta una gran limitante: el elevado costo por planta y esto se debe a que las etapas de produccin se realizan de forma manual, por lo que esta tcnica se aplica slo en especies que tienen un alto valor econmico. Existe tambin la problemtica de disear y construir un biorreactor de inmersin temporal que sea de bajo costo y con igual o mejor eficiencia que los prototipos comerciales. Adquirirlos en el mercado extranjero y su alto precio son motivos por los que no se ha implementado esta tecnologa en pases en vas de desarrollo. De aqu la importancia de identificar y desarrollar nuevas tecnologas que permitan reducir los costos y an ms los tiempos de produccin de las plantas.

3.1.3 Aclimatacin de los explantes de Aztekium hintonii en invernadero. 3.1.4 Disear e implementar automatizacin del biorreactor. la

4. Hiptesis La velocidad de crecimiento del Aztekium hintonii es mayor en un biorreactor de inmersin temporal en comparacin con la micropropagacin convencional in vitro, lo que permitir salvar y conservar la especie a travs de un proceso eficaz y rentable.

5. Justificacin del proyecto Utilizar la tecnologa de los Biorreactores de Inmersin Temporal para micropropagar la especie A. hintonii ofrece las siguientes ventajas en comparacin con el cultivo in vitro: Costos.- el consumo del sustrato es de manera eficiente ya que proporciona una mayor rea de contacto con el explante reduciendo el costo por planta. El diseo y construccin de un biorreactor propio implica una menor inversin comparada con prototipos comerciales que son desechables y de alto costo. Tiempo.la velocidad de crecimiento es mayor, por lo tanto se obtiene explantes de igual tamao en menor tiempo. Automatizacin.- reduce la mano de obra empleada en el proceso lo cual repercute en costos de operacin. Tambin permite que el proyecto sea reproducible debido a que el control del proceso esta supervisado por computadora y es

3. Objetivos. Micropropagar la especie Aztekium hintonii a travs del diseo y construccin de un biorreactor de inmersin temporal para repoblar y conservar su hbitat natural. 3.1 Objetivos especficos. 3.1.1 Disear y construir un biorreactor inmersin temporal de bajo costo y alta eficiencia. 3.1.2 Encontrar las condiciones de operacin ptimas en el biorreactor para obtener un proceso eficiente.

autnomo la mayor parte del tiempo. Control de los parmetros de operacin.permite que la micropropagacin sea ms eficiente ya que se proporcionan las condiciones ptimas para el desarrollo de los explantes. Tambin se pueden controlar algunas variables del proceso como el tiempo de inmersin y la frecuencia, el fotoperiodo y el flujo de CO2. Escalamiento.- el trabajar con medio lquido permite micropropagar muchas plantas en un mismo espacio, por lo tanto aumentar el volumen de operacin permitir producir ms explantes. Mejoramiento del porcentaje de enraizamiento y sobrevivencia en la etapa de aclimatacin.- el reactor permite cambiar y/o renovar la atmosfera interna cambiando los contenidos de O2 y CO2, lo cual repercute en el aspecto del desarrollo de la planta dando una preaclimatacin. La conjuncin de todos los aspectos que abarca el presente proyecto nos permite alcanzar nuestro objetivo principal de salvar y repoblar el hbitat natural de la especie A. hintonii, pero tambin aporta soluciones a problemticas en varios mbitos cientficos y mejora las tcnicas y reactores ya existentes. Todas las ventajas antes mencionadas son aprovechadas para disear un biorreactor que nos permita lograr nuestro objetivo, haciendo de ste un proyecto eficaz, rentable y con una recuperacin de la inversin en poco tiempo.

6. Metodologa 6.1 Proceso de Aztekium hintonii micropropagacin de

6.1.1 Desinfeccin de semillas Se utiliz un protocolo de desinfeccin para las semillas de A. hintonii que consiste en exponer a las semillas a varios lavados con alcohol 70%, Hipoclorito de sodio y Tween 20, seguido de enjuagues con agua destilada estril. 6.1.2 Cultivo in vitro de Aztekium hintonii Se colocaron 10 semillas por cada frasco con 20 mL de medio MS slido sin hormonas para lograr la produccin de brotes, todo esto se realiz bajo condiciones aspticas. Posteriormente, se traspasaron los brotes a medio MS slido suplementado con fitohormonas ANA y BA para obtener brotes diferenciados propagados en varios frascos de cultivo. 6.1.3 Diseo del reactor de inmersin temporal automatizado Se disearon dos tipos de biorreactores, de inmersin mecnica y de inmersin neumtica en base a las necesidades de la inmersin de los explantes, as como de su crecimiento. Se les equip con sistemas automatizacin a travs de microcontroladores. Tambin se diseo el diagrama de flujo que controla el proceso de automatizacin. 6.1.4 Produccin de biomasa de A. hintonii en el reactor El biorreactor se esteriliz en autoclave a 121C a 1 atm de presin durante 15 minutos. Se inocul el reactor con brotes de aproximadamente 1 cm longitud en condiciones de asepsia. Las condiciones de operacin del reactor fueron de: 600 h (produccin en lote), 25C, fotoperiodo de

16 h luz - 8 h oscuridad y un tiempo de inmersin de los explantes de 1 minuto cada 12 h. 6.1.5 Aclimatacin de los explantes Al final del lote de produccin, se descargaron los brotes crecidos en el biorreactor y se llevaron a aclimatar en condiciones de invernadero. Se utiliz un sustrato que consisti en una mezcla de sustratos como tierra de hoja seca, lombricomposta y tezontle. Se les dio un tratamiento de 4 semanas para observar su adaptacin al sustrato utilizado as como el enraizamiento de los cactus. En el anexo 1 se muestra un diagrama de flujo con la metodologa del proceso de micropropagacin de Aztekium hintonii.

H2O.- Agua, suministrada para elaboracin del medio. CH1.89N0.03O0.63.Composicin tomada de Catharanthus roseus. celular

O2.- Oxigeno obtenido al final de la reaccin. 5.2.2 Determinacin cinticos de parmetros

Para calcular la velocidad especfica de crecimiento () de la planta se utiliz un modelo para crecimiento vegetal (Catie, 1990). El clculo se realiz obteniendo los pesos hmedos de la biomasa de la planta Aztekium hintonii, los cuales se tomaron en 10 semanas de los que se obtuvo la velocidad especifica de crecimiento mxima (max).
ln max PF P0 t

6.2 Simulacin de la biomasa en el biorreactor

produccin

de

(2)

6.2.1 Reaccin general para la produccin de Aztekium hintonii Para el planteamiento del balance es importante considerar que la fuente de carbono es la sacarosa y la composicin celular del metabolito que se produce, que en este caso slo es biomasa del cactus. Se tom como base 1 mol de sacarosa para obtener los coeficientes de cada componente. C12H22O11 + NH4NO3 + H2O = CH 1.89 N 0.03 O 0.63 + O2 Dnde: C12H22O11.- Sacarosa, fuente de carbono. NH4NO3.- Nitrato de amonio, fuente de nitrgeno. (1)

Los explantes que se tomaron para los clculos se obtuvieron de cultivos in vitro en frascos de vidrio con 20 mL de medio MS slido, de los cuales se retir la biomasa para su obtener el peso hmedo. Se obtuvo el rendimiento de biomasa respecto al sustrato de acuerdo al balance estequiomtrico de la reaccin establecido. 6.2.3 Modelacin de la cintica de crecimiento de la biomasa y consumo de sustrato. El modelo que se utiliz para la simulacin de la produccin de biomasa fue el modelo de monod por lote, esta simulacin se realiz en el software comercial MathCad para una produccin por lote con las siguientes relaciones: (3)

(4) (5) Las ecuaciones describen el crecimiento de biomasa y consumo de sustrato con respecto al tiempo. 6.2.4 Clculo de los coeficientes de transferencia de masa slido gas (explante-CO2) y lquido slido (medio MS-explante) En el clculo de la transferencia de masa se plantearon dos sistemas: La difusin del medio en los explantes y la difusin del CO2 en los mismos, en los cuales se utilizaron modelos como el de Steinberger y Treyball (Lobo, 1997), adems de nmeros adimensionales tales como Reynolds (Re), Schmidt (Sc) y Sherwood (Sh).
Sh
Sc

Los coeficientes indican que por cada mol de sacarosa se producen 12 moles de biomasa, utilizando estos datos se obtiene el rendimiento de produccin celular con respecto al sustrato, el cual es 0.855 gB/gS, esto indica que la sacarosa se aprovecha en un 85% para producir biomasa de cactus y el 15% restante en otras rutas metablicas. Dicho rendimiento nos permite saber que el proceso que se est implementando es eficiente y que el aprovechamiento del sustrato permite la micropropagacin del cactus de manera eficaz. La siguiente tabla muestra los tiempos y pesos registrados de 10 ejemplares de A. hintonii para hacer el clculo de la velocidad mxima de crecimiento:

2.0 0.6 Re 0.5 Sc 0.33

(6)

DCO 2

(7)

ShDCO2 Lc
(8)
Tabla 1. Pesos de diferentes explantes tomados a lo largo de diez semanas.

7. Resultados En los anexos 2, 3, 4 y 5 se muestran los diagramas de control y los diseos de los biorreactores mecnico y neumtico. Se obtuvieron los coeficientes de cada componente de la reaccin como se describe a continuacin: C12H22O11 + 0.18 NH4NO3 0.33H2O (9)

Promediando los valores de , el resultado es 0.00367 h-1, esta es la velocidad a la que se produce biomasa y crecen los explantes. Los resultados de la simulacin con el software se muestran a continuacin:

= 12 CH 1.89 N 0.03 O 0.63 + 1.825 O2

Figura 5. Curva de crecimiento biomasa-sustrato vs tiempo. Tabla 2. Datos obtenidos de la simulacin en cultivo por lote.

La simulacin se hizo en un volumen de 2 L hasta las 600 h debido a que en este punto de tiempo la concentracin de sustrato estaba muy cercana a cero y ya no habra produccin celular. La biomasa obtenida en el lote es 22.819 g con un explante de peso inicial de 0.189 g y de la concentracin de sustrato final es 3.76 g/L. Si comparamos los resultados; en el mismo tiempo de 168 h (1 semana) obtenemos una produccin de biomasa 73% mayor en el cultivo en biorreactor comparado con el cultivo in vitro. Cabe mencionar que despus de dicho tiempo, el crecimiento de biomasa se dispara exponencialmente en el biorreactor, lo cual indica que la velocidad de produccin de masa celular incrementa aun ms. En la siguiente figura se puede apreciar el cambio en el aumento de la biomasa respecto al tiempo, mientras cmo se consume el sustrato del medio cultivo.

El coeficiente de transferencia de masa (k) del CO2 que se difunde hacia los explantes fue de 6.65114x10-3 m/s y los nmeros adimensionales utilizados para ste modelo fueron: Sc= 0.5123, Re=14.6378 y Sh= 3.8372. El coeficiente de transferencia de masa (k) del medio MS que se difunde hacia los explantes fue de 0.68 m/s y los nmeros adimensionales utilizados para ste modelo fueron: Sc= 1.0464X10-3, Re=41.9140 y Sh= 5.9862

8. Conclusiones Se determinaron los parmetros cinticos de acuerdo al modelo de Monod con modificaciones para crecimiento en plantas, con el cual a partir del balance de masa (12 mol biomasa/1 mol sacarosa) se determin la velocidad mxima de crecimiento (mx 0.00367 h-1) y el rendimiento biomasa/sustrato (YX/S 0.8557) el cual es muy grande lo que indica que la eficiencia del sistema es alta. En un lote de produccin de 600 h, con un volumen de operacin de 2L, se determin una produccin de biomasa del 73 % mayor

en el cultivo en biorreactor comparado en el medio slido. Los biorreactores diseados en este proyecto tienen la misma aplicacin en una gran variedad de especies de plantas, por esta razn se tiene una visin a futuro ms econmicamente rentable para el proyecto. La automatizacin del sistema nos permitir un proceso reproducible y rentable para tener mayor control de las variables de operacin as como un registro de funcionamiento del sistema. Basados en los resultados obtenidos, se concluye que el biorreactor de inmersin temporal diseado es una solucin biotecnolgica para micropropagar de forma masiva el cactus Aztekium hintonii para repoblar y conservar su hbitat natural.

controlar esto para evitar el error humano, poder realizar un historial de funcionamiento del sistema y realizar una interfaz a distancia para controlar el biorreactor, debido a esto el prximo paso en automatizacin es controlar el biorreactor a travs de una interfaz por internet.

10. Referencias Heller, R. (1965). Some aspects of the inorganic Nutrition of plant tissue cultures. In: White, P.R. and Grove, A.R. (Eds). Proceedings of an International Conference on Plant Tissue Culture. England. Sutta Gupta S. and Yasuomi Ibaraki. (2006) Plant Tissue Culture Engineering. Centre for Veterinary and Agrochemical Research, Tervuren, Belgium. Catie. (1990). Conceptos metodolgicos sobre investigacin y desarrollo de tecnologa para sistemas de produccin de cultivos. Volumen 2. Cidia. Turrialba, Costa Rica. Lobo R. (1997). Principios de Transferencia de Masa, Universidad Autnoma Metropolitana. Mxico, D.F. Stanbury, Whitaker & Hall (1998). Principles of Fermentation Technology, 2da. Edicin, editorial Butterworth Heinemann. Murashige, T and Skoog, F. (1962). A revised medium for rapid growt and bioassays with tobacco tissue cultures.

9. Futuras lneas de investigacin Tanto los biorreactores de inmersin neumtica y mecnica pueden escalarse a un volumen mayor de operacin lo que permitira un mayor nmero de plantas por lote en el biorreactor, de manera que aumentando las dimensiones del sistema se podr producir plantas a nivel industrial y competir en el mercado. Ambos biorreactores pueden utilizarse para propagar cualquier especie de planta econmicamente ms atractiva, se puede ofrecer un costo ms bajo en el mercado para productores independientes, invernaderos o agricultores; por lo que uan vez terminado el presente proyecto se planea micropropagar una especie que se comercialice la regin como la fresa. La automatizacin de los biorreactores en tiempo real y en lnea permite un mayor control y supervisin de las variables a

11. Anexos

Figura 6. Diagrama de flujo general del proceso de micropropagacin de A. hintonii.

Figura 7. Diseo del biorreactor de inmersin mecnica automatizado.

On/Inicio Medio en el tanque

Abrir vlvula de CO2 Despus de 12 horas Inmediatamente Cerrar vlvula de CO2 Activar Motor giro derecha (bajar)

Activar lmpara

Despus de 16 horas Despus de 8 horas Desactivar lmpara

Despus de 1 min. Activar Motor giro Izquierda (subir)

Off/Apagado Cerrar vlvula de CO2 Apagar motor Apagar lmparas

Figura 8. Diagrama de control del biorreactor de inmersin mecnica automatizado.

OFF

ON Microcontrolador

12 V

INDICADOR DE TEMPERATURA

Figura 9. Diseo del biorreactor de inmersin temporal neumtico.

On/Inicio
Medio en el tanque

Activar vlvula Activar compresor

Despus de 12 horas Despus de 1 min.

Activar lmpara
Despus de 16 horas

Desactivar vlvula Desactivar compresor

Desactivar lmpara

Despus de 8 horas

Off/Apagado

Apagar vlvula Apagar compresor Apagar lmpara

Figura 10. Diagrama de control del biorreactor de inmersin neumtica automatizado.