LABORATORIO DE MICROBIOLOGA CONTROL MICROBIOLGICO DE MATERIAS PRIMAS Y PRODUCTOS FARMACUTICOS NO ESTRILES __________________________________________________________________________________________________

Trabajo Prctico N 1 Introduccin Objetivo Fundamento Materiales Procedimiento Resultados Conclusiones Actividades adicionales Bibliografa
INTRODUCCIN Los productos no estriles son susceptibles de contaminarse con microorganismos tales como bacterias, mohos y levaduras durante el proceso de manufactura: pesada, fabricacin, llenado, almacenamiento, as como durante su uso. La contaminacin de los productos farmacuticos, puede tener el potencial de reducir o inactivar la actividad teraputica del principio activo y por ende representar un riesgo para la salud del paciente; adicionalmente la presencia de estos microorganismos dependiendo de su patogenicidad puede ocasionar infecciones o enfermedades que afecten al paciente o consumidor. Por otra parte, el deterioro microbiano podra conllevar a cambios en las caractersticas fsicas y qumicas que conduciran a que el producto deteriorado no sea apto para ser usado, afectando con ello la imagen del laboratorio productor. Es por ello, que las materias primas y los productos farmacuticos terminados, deben ser sometidos a un anlisis microbiolgico que demuestre que cumplen con las especificaciones establecidas por los organismos oficiales, para garantizar que los productos son adecuados para el uso al que estn destinados.

CONTROL MICROBIOLGICO DE MATERIAS PRIMAS Y PRODUCTOS FARMACUTICOS NO ESTRILES

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Este anlisis o control microbiolgico de las materias primas y de los productos o medicamentos no estriles, involucra la realizacin de dos tipos de ensayos: a. Recuentos microbianos, referidos bsicamente al recuento total de microorganismos aerobios y el recuento total de mohos y levaduras. b. Investigacin de microorganismos especficos: bacterias Gram negativas tolerantes a bilis, Escherichia coli, Salmonella, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Clostridium, y Candida albicans. OBJETIVO Al finalizar el trabajo prctico, el estudiante estar en capacidad, mediante la consulta bibliogrfica y la aplicacin de las tcnicas microbiolgicas, de realizar el control microbiolgico de materias primas y productos farmacuticos no estriles, utilizando metodologas oficiales (USP). FUNDAMENTO Estas pruebas se basan en la capacidad de determinar la presencia de microorganismos a travs del uso de medios de cultivo: nutritivos, de enriquecimiento, selectivos y/o diferenciales, capaces de permitir su recuperacin a partir de materias primas o productos no estriles y/o de evidenciar ciertas caractersticas bioqumicas, producto del metabolismo de los diferentes microorganismos a investigar. 1. Recuento de microorganismos aerobios totales. Recuento en placa (Mtodo del vaciado en placa o siembra en profundidad). MATERIALES Muestras a analizar (materias primas y/o medicamentos) Placas estriles Pipetas estriles de 1 mL y de 10 mL Propipetas Cintas indicadoras de pH Pipetas Pasteur Tubos de agar soya-casena fundido y enfriado a 45-50C Frascos de dilucin con buffer fosfato pH 7,2 Bao de Mara a 45-50C Estufa o incubadora a 32,5 2,5 C Contador de colonias PROCEDIMIENTO 1. Transferir 10 g o 10 mL de la muestra y aadirlos a un frasco de dilucin que contiene 90 mL de buffer fosfato pH 7,2 estril. Agitar el frasco vigorosamente (25 veces) o hasta homogenizar. Rotular 10-1.

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2. Con una pipeta Pasteur y con el uso de las tiras indicadoras de pH determinar el pH de la dilucin anterior. El mismo debe estar entre 6 y 8. 3. Transferir con una pipeta estril, 10 mL de la dilucin 10-1 a un frasco de dilucin con 90 mL de buffer fosfato pH 7,2 estril. Agitar. Rotular 10--2. 4. Transferir con una pipeta estril, 10 mL de la dilucin 10-2 a un frasco de dilucin con 90 mL de buffer fosfato pH 7,2 estril. Agitar. Rotular 10--3. 5. Con una pipeta estril, transferir porciones de 1 mL de la dilucin 10-1 a cada una de 2 placas de Petri estriles. 6. Con una pipeta estril, transferir porciones de 1 mL de la dilucin 10-2 a cada una de 2 placas de Petri estriles. 7. Con una pipeta estril, transferir porciones de 1 mL de la dilucin 10-3 a cada una de 2 placas de Petri estriles. 8. Verter en cada una de las placas, 15 mL de Agar Soya Casena, fundido y enfriado a 45C, mezclando cuidadosamente las muestras con el agar. Dejar solidificar e incubar en posicin invertida a 32,5 2,5 C por 3 a 5 das.

Esquema para el Recuento de Microorganismos Aerobios Totales.

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RESULTADOS Seleccionar aquellas placas con el nmero ms alto de ufc, pero menor de 250 ufc por placa. Contar el nmero de colonias en las placas seleccionadas usando el contador de colonias. Calcular el nmero de microorganismos viables por mL de muestra, expresado como unidades formadoras de colonias por mL (ufc/mL) (ver Anexo de notacin cientfica y diluciones). Anotar los resultados: Placa 1: __________ Placa 2: __________ Promedio: a las __________ seleccionadas:

Factor de dilucin correspondiente _____________________ Nmero de ufc/mL de muestra:

placas

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CONCLUSIONES __________________________________________________________________

2. Recuento Total de Mohos y Levaduras. Recuento en placa (Mtodo del vaciado en placas o siembra en profundidad) MATERIALES Muestras a analizar: (materias primas y/o medicamentos) Placas estriles Pipetas estriles de 1 mL y 10 mL Propipetas Cintas indicadoras de pH Pipetas Pasteur Tubos de agar Sabouraud Dextrosa fundido y enfriado a 45-50C. Frascos de dilucin con buffer fosfato pH 7,2 Mechero Bao de Mara a 45-50C Estufa o incubadora a 22,5 2,5 C Contador de colonias

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PROCEDIMIENTO Proceder de la misma forma descrita para el Recuento de Microorganismos Aerobios Totales, pero utilizando Agar Sabouraud Dextrosa, en vez de Agar Soya Casena, e incubar las placas (sin invertir) a 22,5 2,5 C por 5 a 7 das. RESULTADOS Seleccionar aquellas placas con el nmero ms alto de ufc, pero menor de 50 ufc por placa. Contar el nmero de colonias en las placas seleccionadas usando el contador de colonias. Calcular el nmero de microorganismos viables por mL de muestra, expresado como unidades formadoras de colonias por mL (ufc/mL) (ver Anexo de notacin cientfica y diluciones). Anotar los resultados: Placa 1: __________ Placa 2: __________ Promedio: a las __________ seleccionadas:

Factor de dilucin correspondiente _____________________ Nmero de ufc/mL de muestra:

placas

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CONCLUSIONES __________________________________________________________________

3. Investigacin de Microorganismos Especficos 3.a. Investigacin de bacterias Gram negativas tolerantes a bilis Pipetas de 10 mL Propipetas Placas estriles Cintas indicadoras de pH Pipetas Pasteur Caldo Soya Casena Caldo Mossel para Enriquecimiento de Enterobacterias (90mL) Estufa o incubadora a 22,5 2,5 C Estufa o incubadora a 32,5 2,5 C Asa de platino Agar Violeta Rojo Bilis Glucosa

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Mechero PROCEDIMIENTO 1. Transferir 10 g o 10 mL de la muestra y aadirlos a un baln o fiola que contiene 90 mL de Caldo Soya Casena (CSC) y agitar. 2. Determinar el pH de la dilucin anterior con el uso de una pipeta Pasteur y de tiras indicadoras de pH. El mismo debe estar entre 6 y 8. 3. Incubar a 22,5 2,5 C por un periodo de 2 a 5 horas. 4. Agitar la mezcla incubada (CSC) y transferir 10mL a un baln o fiola con 90 mL de Caldo Mossel para Enriquecimiento de Enterobacterias (CMEE). Incubar a 32,5 2,5 C por 24 a 48 horas. Aislamiento de bacterias Gram negativas tolerantes a bilis 5. Agitar la mezcla incubada (CMEE) y con el uso del asa hacer un aislamiento a partir del Caldo Mossel para Enriquecimiento de Enterobacterias al Agar Violeta Rojo Bilis Glucosa. Incubar a 32,5 2,5 C por 18 - 24 horas. Si no hay crecimiento, la muestra cumple los requisitos en cuanto ausencia de bacterias Gram negativas tolerantes a bilis.

3.b. Investigacin de Escherichia coli MATERIALES Pipetas de 10 mL y de 1 mL Propipetas Placas estriles Tiras indicadoras de pH Pipetas Pasteur Buffer fosfato pH 7,2 Caldo Soya Casena Caldo MacConkey Agar MacConkey
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Agar soya Casena Agar Triple Azcar Hierro (TSI) Asa y filamento de platino Mechero Equipo para coloracin de Gram Estufa a 32,5 2,5 C Estufa a 42 - 44 C PROCEDIMIENTO 1. Transferir 10 g o 10 mL de la muestra y aadirlos a un frasco de dilucin que contiene 90 mL de buffer fosfato pH 7,2 y agitar. 2. Determinar el pH de la dilucin anterior con el uso de una pipeta Pasteur y de tiras indicadoras de pH. El mismo debe estar entre 6 y 8. 3. Transferir con una pipeta estril, 10 mL de la mezcla anterior a un baln o fiola que contiene 90 mL de Caldo Soya Casena y agitar. 4. Incubar a 32,5 2,5 C por 18 a 24 horas. 5. Agitar la mezcla anterior (CSC) y transferir 1 mL a un baln o fiola con 100 mL de Caldo MacConkey (CMcC). Incubar a 42 - 44 C por 24 - 48 horas. Aislamiento de E. coli. 6. Agitar la mezcla incubada (CMcC) y con el uso del asa hacer un aislamiento a partir del Caldo MacConkey a una placa con Agar MacConkey. Incubar a 32,5 2,5 C por 18 - 72 horas. 7. El crecimiento de colonias indica la posible presencia de E.coli. Las colonias de coliformes en agar MacConkey son de color rojo ladrillo, eventualmente rodeadas de zonas de bilis precipitada. 8. Si no hay colonias tpicas, la muestra cumple los requisitos en cuanto a ausencia de coliformes. 9. Si hay colonias tpicas, transplantar una de ellas a un tubo con Agar Soya Casena inclinado. Incubar a 32,5 2,5 C por 18 - 24 horas. 10. Hacer una coloracin de Gram: E. coli es un bacilo Gram negativo. 11. Transferir el crecimiento de Agar Soya Casena a un tubo con agar TSI. Incubar a 32,5 2,5 C por 24 horas. Los cultivos tpicos de E. coli en agar TSI presentan el bisel y el taco amarillo, sin oscurecimiento y con formacin de gas.

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Lactosa positivo Bisel Taco

Lactosa negativo H2S positivo

Agar TSI (sin inocular) Glucosa positivo

12. Confirmar la presencia de E. coli por medio de pruebas bioqumicas adicionales como por ejemplo el Test del IMViC, o utilizando sistemas miniaturizados tales como API o MicroID. 3.c. Investigacin de Salmonella (gnero) MATERIALES Pipetas de 10 mL y de 1 mL Propipetas Placas estriles Tiras indicadoras de pH Pipetas Pasteur Buffer fosfato pH 7,2 Caldo Soya Casena Caldo de Enriquecimiento para Salmonella Rappaport Vassiliadis Agar Desoxicolato Lisina Xilosa (XLD) Agar Soya Casena Agar Triple Azcar Hierro (TSI) Asa y filamento de platino Mechero Equipo para coloracin de Gram Estufa a 32,5 2,5 C PROCEDIMIENTO 1. Transferir 10 g o 10 mL de la muestra y aadirlos a un frasco de dilucin que contiene 90 mL de buffer fosfato pH 7,2 y agitar. 2. Determinar el pH de la dilucin anterior con el uso de una pipeta Pasteur y de tiras indicadoras de pH. El mismo debe estar entre 6 y 8. 3. Transferir con una pipeta estril, 10 mL de la mezcla anterior a un baln o fiola que contiene 90 mL de Caldo Soya Casena (CSC) y agitar. 4. Incubar a 32,5 2,5 C por 18 a 24 horas.

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5. Agitar la mezcla incubada (CSC) y transferir 0,1 mL a un tubo con 10 mL de Caldo de Enriquecimiento para Salmonella Rappaport Vassiliadis (CESRV). Incubar a 32,5 2,5 C por 18 - 24 horas. Aislamiento de Salmonella 6. Agitar la mezcla incubada (CESRV) y con el uso del asa hacer un aislamiento en Agar Desoxicolato Lisina Xilosa. Incubar a 32,5 2,5 C por 18 - 48 horas. 7. Notar la presencia de colonias tpicas del gnero Salmonella: Colonias rojas con o sin.

8. Si no hay colonias tpicas, la muestra cumple los requisitos en cuanto a ausencia de Salmonella. 9. Si se encuentran colonias tpicas, transferir una de ellas a un tubo con Agar Soya Casena inclinado. Incubar a 32,5 2,5 C por 18 - 24 horas. 10. Hacer una coloracin de Gram: los miembros del gnero Salmonella, son bacilos Gram negativos. 11. Transferir el crecimiento de Agar Soya Casena a un tubo con agar TSI. Incubar a 32,5 2,5 C por 24 horas. Los cultivos tpicos de Salmonella en agar TSI presentan el taco amarillo (formacin de cido) y el bisel rojo (alcalino), con o sin oscurecimiento y/o con formacin de gas.

Bisel

Lactosa negativo H2S positivo Salmonella en agar TSI Glucosa positivo

Taco Agar TSI (sin inocular)

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12. Confirmar la presencia de Salmonella por pruebas bioqumicas convencionales y/o por sistemas miniaturizados tales como API o MicroID y mediante pruebas serolgicas. 3. d. Investigacin de Pseudomonas aeruginosa MATERIALES Pipetas de 10 mL Propipetas Placas estriles Tiras indicadoras de pH Pipetas Pasteur Buffer fosfato pH 7,2 Caldo Soya Casena Agar Soya Casena Agar Cetrimide Papel de filtro Reactivo Taxo N (p-aminodimetilanilina clorhidrato) Asa y filamento Mechero Equipo para coloracin de Gram Estufa o incubadora a 32,5 2,5 C PROCEDIMIENTO 1. Transferir 10 g o 10 mL de la muestra y aadirlos a un frasco de dilucin que contiene 90 mL de buffer fosfato pH 7,2 y agitar. 2. Determinar el pH de la dilucin anterior con el uso de una pipeta Pasteur y de tiras indicadoras de pH. El mismo debe estar entre 6 y 8. 3. Transferir con una pipeta estril, 10 mL de la mezcla anterior a un baln o fiola que contiene 90 mL de Caldo Soya Casena (CSC) y agitar. 4. Incubar a 32,5 2,5 C por 18 a 24 horas. Aislamiento de Pseudomonas aeruginosa. 5. Agitar la mezcla incubada (CSC) y con el uso del asa hacer un aislamiento a Agar Cetrimide. Incubar a 32,5 2,5 C por 18 - 72 horas. 6. Las colonias tpicas de Pseudomonas aeruginosa en Agar Cetrimide son pequeas, generalmente de color verdoso, con fluorescencia verdosa a la luz ultravioleta.

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7. Si no hay colonias tpicas, la muestra cumple el requisito en cuanto a ausencia de Ps. aeruginosa. 8. Si hay colonias tpicas, transferir una de ellas a un tubo de Agar Soya Casena inclinado. Incubar a 32,5 2,5 C por 18 - 24 horas. 9. A partir del Agar Soya Casena hacer una coloracin de Gram: la Ps. aeruginosa es un bacilo Gram negativo. 10. Realizar la prueba de oxidasa a partir del cultivo puro: En una placa de Petri colocar un disco de papel de filtro. Impregnar con el reactivo Taxo N y dejarlo secar en la estufa. Con una pipeta Pasteur estril con la punta cerrada, transferir una pequea cantidad del cultivo del tubo de agar inclinado, al papel de filtro. El desarrollo de un color rosado, casi prpura, se considera una prueba de oxidasa positiva.

Oxidasa positiva

Si la prueba de oxidasa es negativa, la muestra cumple el requisito en cuanto a ausencia de Ps. aeruginosa.

Oxidasa negativa

11. Si la prueba de oxidasa es positiva, la presencia de Ps.aeruginosa debe confirmarse por pruebas bioqumicas adicionales. 12. Realizar la prueba de crecimiento a 42 C:

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Inocular un tubo de Agar Soya Casena con el cultivo puro, e incubar en la estufa a una temperatura de 42 C por 24 72 horas. La Ps.aeruginosa es capaz de crecer a esta temperatura y es una prueba adicional para su identificacin. 13. Confirmar la presencia de Ps.aeruginosa por pruebas bioqumicas convencionales y/o por sistemas miniaturizados tales como API 3.e. Investigacin de Staphylococcus aureus. MATERIALES Pipetas de 10 mL Propipetas Placas estriles Tiras indicadoras de pH Pipetas Pasteur Buffer fosfato pH 7,2 Caldo Soya Casena Agar Manitol Sal Agar Soya Casena Plasma EDTA (para coagulasa) Caldo Cerebro Corazn Bao de Mara a 37 1 C Asa y filamento Mechero Equipo para coloracin de Gram Estufa o incubadora a 32,5 2,5 C PROCEDIMIENTO 1. Transferir 10 g o 10 mL de la muestra y aadirlos a un frasco de dilucin que contiene 90 mL de buffer fosfato pH 7,2 y agitar. 2. Determinar el pH de la dilucin anterior con el uso de una pipeta Pasteur y de tiras indicadoras de pH. El mismo debe estar entre 6 y 8. 3. Transferir con una pipeta estril, 10 mL de la mezcla anterior a un baln o fiola que contiene 90 mL de Caldo Soya Casena (CSC) y agitar. 4. Incubar a 32,5 2,5 C por 18 a 24 horas Aislamiento de Staphylococcus aureus 5. Agitar la mezcla incubada (CSC) y mediante un asa hacer aislamiento a Agar Manitol Sal. Incubar a 32,5 2,5 C por 18 - 72 horas.

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6. La posible presencia de colonias tpicas de S.aureus en Agar Manitol Sal, se observan como colonias amarillas o blancas, rodeadas por una zona amarilla.

7. Si no hay colonias tpicas, la muestra cumple el requisito en cuanto a ausencia de Staphylococcus aureus. 8. Si hay colonias tpicas, con ayuda de un filamento, transferir una de ellas a un tubo de Agar Soya Casena inclinado. Incubar a 32,5 2,5 C por 18 - 24 horas. 9. A partir del tubo de Agar Soya Casena, hacer coloracin de Gram: el S. aureus es un coco Gram positivo. Preparar un cultivo en Caldo Cerebro Corazn. Incubar a 32,5 2,5 C por 24 horas. 10. Realizar la prueba de coagulasa de la siguiente forma: En un tubo de Wassermann colocar 0,5 mL de Plasma EDTA (para coagulasa); aadir 2 gotas (0,1 mL) del cultivo del microorganismo cultivado en Caldo Cerebro Corazn. Incubar en bao de agua a 37 1 C, durante 4 horas. Examinar al cabo de este tiempo y luego peridicamente durante 24 horas, para comprobar la formacin de cogulos; cualquier grado de coagulacin, por pequeo que sea, se considera un resultado positivo. Si no se observa coagulacin, la muestra cumple el requisito en cuanto a ausencia de Staphylococcus aureus. Si se observa coagulacin confirmar la presencia de S. aureus por pruebas bioqumicas convencionales y/o por sistemas miniaturizados tales como API 3. f. Investigacin de Clostridium. MATERIALES Pipetas de 10 mL
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Propipetas Placas estriles Tubos estriles con tapa de rosca Tiras indicadoras de pH Pipetas Pasteur Buffer fosfato pH 7,2 Caldo Soya Casena Agar Columbia Agar Soya Casena Medio Reforzado para Clostridium Caldo de Carne Cocida Jarra Gaspak Sobre para anaerobiosis Bao de agua a 80 C Bao de hielo Asa y filamento de platino Mechero Equipo para coloracin de Gram Estufa o incubadora a 32,5 2,5 C PROCEDIMIENTO 1. Transferir 10 g o 10 mL de la muestra y aadirlos a un frasco de dilucin que contiene 90 mL de buffer fosfato pH 7,2 y agitar. 2. Determinar el pH de la dilucin anterior con el uso de una pipeta Pasteur y de tiras indicadoras de pH. El mismo debe estar entre 6 y 8. 3. Transferir con una pipeta estril, 2 porciones de 10 mL cada una de la mezcla anterior a dos tubos estriles con tapa de rosca. 4. Calentar una porcin a 80 C durante un periodo de 10 minutos y enfriar rpidamente en bao de hielo. No calentar la otra porcin. 5. Transferir 10 mL de cada una de las porciones anteriores (calentada y no calentada) a dos frascos de dilucin con 100 mL de Medio Reforzado para Clostridium respectivamente. 6. Incubar bajo condiciones de anaerobiosis a una temperatura de 32,5 2,5 C durante 48 horas. Aislamiento de Clostridium 7. Despus del periodo de incubacin, realizar los aislamientos con un asa de platino a partir de cada frasco, en Agar Columbia.

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8. Incubar en condiciones anaerbicas a una temperatura de 32,5 2,5 C durante 48 horas. 9. Transferir el crecimiento en Agar Columbia a un tubo con Caldo de Carne Cocida. Incubar a 32,5 2,5 C en condiciones de anaerobiosis de 24 - 48 horas. 10. A partir del tubo con Caldo de Carne Cocida, hacer coloracin de Gram. 11. El crecimiento anaerbico de bacilos Gram positivo (con o sin endosporas) que dan una reaccin de catalasa negativa indica la presencia de Clostridium. Si por el contrario no se detecta crecimiento anaerbico o la prueba de catalasa es positiva, el producto cumple con la ausencia de Clostridium. 12. Realizar la prueba de Catalasa, utilizando para ello cualquiera de los siguientes procedimientos: a) Transferir con ayuda de una pipeta Pasteur el crecimiento obtenido en Caldo de Carne Cocida a un tubo con 1 mL de perxido de hidrgeno al 3%. Una reaccin positiva es indicada por la aparicin de burbujas de oxgeno. b) Transferir con ayuda de un asa de platino el crecimiento obtenido en Caldo de Carne Cocida a un tubo de Agar Columbia inclinado, e incubar a 32,5 2,5 C en condiciones de anaerobiosis de 24 - 48 horas. Transfiera con ayuda de una pipeta Pasteur parte del crecimiento obtenido en Agar Columbia e inocule un tubo con 1mL de perxido de hidrgeno al 3%. Una reaccin positiva es indicada por la aparicin de burbujas de oxgeno. 3.g. Investigacin de Candida albicans. MATERIALES Pipetas de 10 mL Propipetas Placas estriles Tiras indicadoras de pH Pipetas Pasteur Buffer fosfato pH 7,2 Caldo Sabouraud Dextrosa Agar Sabouraud Dextrosa Asa y filamento de platino Mechero Estufa o incubadora a 32,5 2,5 C Lmina y laminilla

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PROCEDIMIENTO 1. Transferir 10 g o 10 mL de la muestra y aadirlos a un frasco de dilucin que contiene 90 mL de buffer fosfato pH 7,2 y agitar. 2. Determinar el pH de la dilucin anterior con el uso de una pipeta Pasteur y de tiras indicadoras de pH. El mismo debe estar entre 6 y 8. 3. Transferir con una pipeta estril, 10 mL de la mezcla anterior a un baln o fiola que contiene 100 mL de Caldo Sabouraud Dextrosa (CSD) y agitar. 4. Incubar a 32,5 2,5 C por 3 a 5 das. Aislamiento de Candida albicans 5. Agitar la mezcla incubada (CSD) y mediante un asa hacer aislamiento a AgarSabouraud Dextrosa. Incubar a 32,5 2,5 C por 24 - 48 horas. 6. Realizar una observacin al microscopio entre lmina y laminilla, empleando el objetivo 40-45X. 7. El crecimiento de colonias blancas en Agar Sabourud Dextrosa, puede indicar la posible presencia de Candida albicans. Confirmar la presencia de la misma a travs de las pruebas de identificacin o sistemas miniaturizados.

8. El producto pasa la prueba si no hay crecimiento en el Agar Sabouraud Dextrosa o si las pruebas de identificacin son negativas. La validez de los resultados de los ensayos descritos, depender de la demostracin de que las muestras bajo ensayo no presentan de por s, efectos inhibidores de la multiplicacin de los microorganismos que pudieran estar presentes en ella. Por consiguiente, para demostrar el efecto inhibidor de las muestras, se realiza un ensayo preliminar que no es ms que las pruebas de Validacin del producto, que consiste en inocular el Buffer fosfato pH 7,2; y los caldos de enriquecimiento en el momento en que se hace la preparacin de la muestra (tcnicas descritas anteriormente), con un inculo no mayor a 100 ufc/mL de cada uno de los microorga-

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nismos en investigacin (hacer cada microorganismo por separado), aadir la cantidad apropiada de muestra y proceder de la misma forma como se describi para el anlisis de la muestra sola. Cabe resaltar que el volumen de la suspensin del microorganismo a inocular no debe ser mayor del 1% del volumen del producto diluido.

RESULTADOS Anotar los resultados: __________________________________________________________________

__________________________________________________________________

CONCLUSIONES __________________________________________________________________ __________________________________________________________________

ACTIVIDADES ADICIONALES 1. Escoja un medio selectivo de los que Ud. utiliz en el trabajo asignado. Explique porqu fue seleccionado ese medio. 2. Qu significa el test del IMViC y cules microorganismos nos permite identificar? 3. Por qu en el medio agar TSI, se puede observar fermentacin de azcares y la produccin de H2S? 4. En qu caso se considera que una placa proveniente de un recuento de microorganismos es contable? 5. Seale si existe alguna (s) diferencia (s) entre el mtodo del recuento en placa por incorporacin y el mtodo del recuento en superficie. 6. Cundo se considera que un producto est deteriorado y cules son las causas?

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ANEXO
DA LUNES

*
10 mL o 10 g Recuento de Microorganismos totales
Incubar a 30 - 35

Segn tipo de muestra Inocular 10 mL en:

CSD

MRC

CSC

C. albicans

Incubar a 30 - 35 Clostridium S. aureus Ps. aeuriginosa E. coli Salmonella

Recuento de Mohos y Levaduras

Incubar a 20 25

Investigacin de Microorganismos Especficos

*
10 mL o 10 g CSC
Incubar a 20 - 25 25h

CMEE

CSD: Caldo Sabouraud Dextrosa MRC: Medio Reforzado para Clostridium CSC: Caldo Soya Casena CMEE: Caldo Mossel para Enriquecimiento de Enterobacterias

Incubar a 30 - 35

Prueba de Microorganismos tolerantes a bilis

* Ajustar pH

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REFERENCIAS Brock T.D. Madigan M.T. Martenko J.J. y Parker J. (Eds) Biologa de los microorganismos. 8 Edicin. Prentice Hall International. (1999). Prescott, L.M. y col. Microbiology. W.C. Brown Publishers. 4 Edicin. (1998). United States Pharmacopeia. Microbiological test. <61> Microbiological Examination of Nonsterile Products: Microbiological Enumeration Test. 32 ed. Rockville: USP; 2009. United States Pharmacopeia. Microbiological test. <62> Microbiological Examination of Nonsterile Products: Test for Specified Microorganisms. 32 ed. Rockville: USP; 2009. United States Pharmacopeia. General Informaction. <1111> Microbiological Examination of Nonsterile Products: Acceptance Criteria for Pharmaceutical Preparations And Substances for Pharmaceutical Use. 32 ed. Rockville: USP; 2009

De Castro Norma De Curtis Mara Luisa Enero 2002 Actualizado por: Garcs Alessandra Gutirrez Sofa Infante Wilson Saravia Katiuska Junio 2009