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Mtodo cromognico para la identificacin y/o recuento de Aeromonas, Pseudomonas y otras bacterias Gram-negativas con el empleo del medio

CromoCen AGN
BioCen, cdigo 4227

El mtodo incluye una fase de identificacin y enumeracin presuntiva con el empleo del medio cromognico CromoCen AGN para la deteccin y enumeracin de Aeromonas y Pseudomonas en muestras de alimentos. Posibilita, adems, la identificacin y/o recuento de E. coli, coliformes totales y Salmonella (no Typhi). Garantiza los resultados en 18-24 h y requiere la confirmacin adicional con las pruebas rpidas de oxidasa (para Aeromonas y Pseudomonas), indol y/o glutamato descarboxilasa para E. coli. Tipos de muestras que pueden ser procesadas por este mtodo: Todos los tipos de muestras de alimento en las que se sospeche la presencia de los microorganismos diana. Resumen de la aplicacin El medio combina el sustrato cromognico 5-bromo-4-cloro-3-indolil--D-galactopiransido (X-Gal) para la deteccin de actividad galactosidasa, presente tanto en Aeromonas, E. coli, como en el resto de los coliformes; con un sustrato (casena) para la deteccin de actividad proteoltica de diferentes especies de Aeromonas y Pseudomonas. La inclusin del sustrato cromognico 5-bromo-6-cloro-3-indolil--D-glucurnido (Magenta-GLR), posibilita la deteccin de actividad glucuronidasa caracterstica de E. coli y presente adems en algunas especies de Shigella (Shigella sonnei). La deteccin de especies de Salmonella se facilita en este medio por la inclusin de una fuente de carbono degradable por la mayora de ellas, adicionado como suplemento lquido (propilenglicol); a excepcin de Salmonella Typhi y Salmonella Paratyphi. La lactosa, contenida en la casena, constituye otra fuente de carbono que posibilita la diferenciacin de las especies que la degradan, mediante la observacin de la variacin de la coloracin de las colonias y del medio en presencia del indicador rojo neutro. La inclusin de tierra de diatomea en la formulacin, posibilita la mejor observacin de las caractersticas cromticas de las colonias, la deteccin de las reacciones de hidrlisis de la casena, y los elementos qumicos que contiene estimulan la produccin de pigmentos, en especial de Pseudomonas aeruginosa. La combinacin de nutrientes en el medio, conjuntamente con inhibidores para los microorganismos Gram-positivos, permite el adecuado crecimiento y recuperacin de los microorganismos de inters. Procedimiento El esquema general para el mtodo se presenta en los esquemas A, B y C. Siembra en placas e identificacin Los mtodos de siembra en el medio CromoCen AGN dependen del tipo de muestras a ensayar y el propsito (identificacin o recuento). Para la identificacin se recomienda la siembra por agotamiento del inculo en la superficie por estras y/o el mtodo de inundacin de la superficie. Para el recuento, se recomienda el mtodo de inundacin de la superficie. Es importante que el laboratorio reciba muestras que no hayan sufrido daos o cambios en su composicin y estado. Asegrese que el pH no disminuya a valores inferiores a 4,5 durante el proceso de preenriquecimiento (si se requiere para Aeromonas o Salmonella). El pH de alimentos cidos y acidificantes es ms estable en agua peptona buferada de doble concentracin. El mtodo de siembra por agotamiento del inculo en la superficie (por estras) consiste en sembrar un inculo con el objetivo de obtener colonias aisladas para su estudio. Se coloca la placa con el medio de cultivo CromoCen AGN sobre una superficie lisa. Se esteriliza a la llama un asa de nicrom, se enfra y se toma el inculo. Se levanta ligeramente la tapa de la placa de Petri y se va arrastrando el inculo desde un borde de la placa al otro realizando lneas rectas en zig-zag bien apretadas, avanzando hacia el centro. Se gira la placa en un ngulo de aproximadamente de 70 a 90 y se realiza el estriado entrecruzando los cuadrantes. En el ltimo cuadrante se realiza el zig-zag menos frecuente, es decir, con lneas ms separadas para garantizar el aislamiento de las colonias. Este mtodo puede hacerse flameando el asa al pasar de un cuadrante a otro, sobre todo si el inculo de partida est muy concentrado. El mtodo de siembra por inundacin de la superficie, se ejecuta distribuyendo homogneamente el inculo con ayuda de una esptula de Drigalsky. Coloque la placa sobre una superficie lisa. Levante ligeramente la tapa de la placa de Petri e inocule de 0,1 a 0,5 mL de la porcin de ensayo, en el centro de la placa con medio CromoCen AGN. Distribuya la muestra sobre toda la superficie con una esptula de Drigalsky estril (embeber en alcohol y flamear), girando esta ltima siempre en posicin totalmente horizontal con respecto al plano de la placa. Deje la placa en reposo por 510 min para que la muestra penetre en el lecho del agar.
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Aplicacin en muestras alimentos

Para Aeromonas: Se recomienda el enriquecimiento de las muestras sospechosas de Aeromonas en el medio Agua Peptona Alcalina, incubando a 35 2 C por 18-24 h. Para Pseudomonas: La identificacin se realiza inoculando directamente la muestra en la placa o a partir del enriquecimiento en cualquiera de los medios seleccionados. Incube el medio a 35 2 C durante 18-24 h. Para diferenciar Pseudomonas aeruginosa de otras especies de Pseudomonas productoras de pigmento pioverdina, se recomienda incubarlo a 42 2 C. Para E. coli y coliformes: El recuento se realiza a partir de la siembra de la muestra o sus diluciones directamente en la placa sin ningn paso previo de enriquecimiento. Incube el medio a 35 2 C durante 18-24 h. Para la identificacin y/o recuento de coliformes fecales, se recomienda incubarlo a 42 2 C. Para Salmonella: Incube la suspensin inicial para el pre-enriquecimiento no selectivo a 37 1 C durante 18 2 h procediendo luego al enriquecimiento selectivo. Para esto, transfiera 0,1 mL del cultivo obtenido a un tubo que contenga 10 mL de Caldo Rappaport-Vassiliadis con Soya (CRVS); transfiera 1 mL del cultivo obtenido a un tubo que contenga 10 mL de (Caldo Tetrationato (CTTN). Incube el CRVS inoculado a una temperatura de 41,5 C por 24 3 h y el CTTN, a 37 1 C durante 24 3 h. Tenga especial cuidado para que la temperatura de incubacin no exceda los 42,5 C. Con posterioridad a la incubacin, utilizando los cultivos procedentes de CRVS y CTTN, inocule con la ayuda del asa la superficie de la placa de Agar X.L.D. (medio selectivo), por agotamiento del inculo con el objetivo de obtener colonias aisladas. En caso de no contar con placas grandes, utilice dos placas pequeas, una a continuacin de la otra, utilizando la misma asa. Proceda de igual forma con el medio CromoCen AGN, sembrando por estriado (agotamiento del inculo) en las placas. Realice tantas rplicas como sean necesarias a partir de cada uno de los medios de enriquecimiento selectivo. Incube las placas invertidas a 35 2 C (X.L.D. y CromoCen AGN), agrpelas en no ms de 4 placas por columnas. Con posterioridad a la incubacin, examine las placas de ambos medios para determinar la presencia de colonias tpicas de Salmonella y las atpicas (sospechosas) que pudieran considerarse Salmonella. En el caso de muestras en las cuales no sea detectado crecimiento de colonias sospechosas en el medio CromoCen AGN, se proceder a ensayar las colonias sospechosas provenientes de X.L.D. con las pruebas bioqumicas establecidas en el estndar ISO 6579. De manera similar, se proceder a identificar las colonias que pudieran ser consideradas como atpicas en el medio CromoCen AGN. Algunos rganos regulatorios pueden exigir la confirmacin de E. coli por algunas pruebas adicionales a la deteccin de actividad -galactosidasa y -glucuronidasa, respuestas caractersticas en el medio CromoCen AGN. En este caso, la confirmacin de las colonias sospechosas de E. coli se puede ejecutar con la prueba de glutamato decarboxilasa y/o la prueba rpida de indol (positivas en ambos casos). Las cepas de Aeromonas de coloracin violeta sin halo transparente se confirman con la prueba de oxidasa (positivas) y las colonias violetas oxidasa negativas son confirmadas como coliformes totales. Incube la placa en una incubadora bacteriolgica a 35 2 C por 18-24 h. En la incubadora, coloque las placas en posicin horizontal, con la tapa hacia abajo, en columnas de no ms de 4 placas. Al finalizar la incubacin, observe el crecimiento y proceda a identificar el microorganismo. Luego de la incubacin, examine las placas para determinar la presencia de colonias tpicas de los microorganismos diana y las atpicas que pudieran considerarse dentro de estos microorganismos. Interpretacin CromoCen AGN: El crecimiento tpico de las especies de Aeromonas se observa como colonias de color verde y en su mayora presentan un halo transparente y amplio alrededor de las colonias, o como colonias de color violeta, oxidasa positivas, con o sin halo transparente amplio. Las especies de Pseudomonas, y en especial Pseudomonas aerugiosa, muestran coloracin de rosada a naranja, con o sin halo transparente alrededor de las colonias y fluorescencia azul verdosa (en su mayora). E. coli se identifica por las colonias de color violeta intenso, con halo violeta a su alrededor. Las bacterias del grupo coliformes producen colonias de color violeta de diferentes tonalidades -galactosidasa negativas. Salmonella (excepto Typhi y Paratyphi) se observan como colonias de coloracin rosada intensa con bordes rosados. Las colonias incoloras o con pigmentacin propia corresponden a otras bacterias Gram-negativas. Los microorganismos Gram-positivos resultan inhibidos en el medio. Agar X.L.D.: El crecimiento tpico de Salmonella en Agar X.L.D. son colonias con centro negro con un halo ligeramente transparente de color rojizo debido al cambio de color del indicador. El crecimiento de las variantes H2S negativas de Salmonella (ej: S. Paratyphi) son rosadas con centro rosa oscuro. Salmonella lactosa-positivas, en el medio X.L.D. son amarillas con o sin coloracin negra.

Ventajas Ms rpido. La identificacin de Aeromonas, Pseudomonas, E. coli y coliformes se realiza en un mximo de 24 h de manera simultnea y la de Salmonella spp. en un perodo mximo de 24 h posterior al enriquecimiento. La deteccin directa y simultnea de varias actividades enzimticas en un mismo medio eleva la exactitud del anlisis. Esto permite la identificacin presuntiva directa y la confirmacin con las pruebas serolgicas de Salmonella sin la confirmacin bioqumica, cuyos resultados no presentan diferencia con la identificacin por los mtodos tradicionales los cuales pueden extenderse hasta 90 h. Posibilidad de realizar los ensayos de serologa a partir de las colonias coloreadas en el medio sin necesidad de subcultivar en un medio de propsito general sin mostrar interferencias o falsas aglutinaciones. Ms fcil de utilizar. No necesita esterilizacin durante su preparacin. Disminucin de la carga de trabajo asociada al procesamiento de las muestras de alimentos.

Ms preciso. Sus Sensibilidad y Especificidad diagnsticas son superiores a las de los medios convencionales
destinados al mismo propsito para todos los microorganismos de inters.

Ms confiable. El contraste de colores no permite confusin.


Composicin y preparacin de los medios de cultivo y reactivos 1. Base de Medio CromoCen AGN Composicin: Agar-15 g/L; Mezcla cromognica-13,2 g/L; Bases nutritivas-13 g/L; pH 7,0 0,2 1.1 Preparacin: De acuerdo a la cantidad deseada, pese el polvo en proporcin de 41,2 g/L de agua destilada o desionizada. Adicione 10 mL del suplemento PLG (propilenglicol). Hierva hasta disolucin completa y distribuya. No esterilice en autoclave. 1.2 Preparacin de las placas del medio CromoCen AGN: Transfiera inmediatamente a un bao con temperatura de 44 a 47 C. Dispense el medio en placas y deje solidificar. Inmediatamente ante de su uso, seque las placas en posicin invertida en el horno a temperatura entre 35-55 C, por un tiempo suficiente hasta que la superficie del medio est seca. 2. Suplemento PLG Reactivo: propilenglicol Determinacin de las caractersticas organolpticas: Se ejecuta por simple evaluacin visual. Criterios de aceptacin: El reactivo debe ser incoloro, transparente, sin presencia de partculas. 3. Prueba Rpida de GAD Composicin del reactivo de la prueba rpida de glutamato descarboxilasa (GAD): Acido L-glutmico- 0,1 g; Cloruro de sodio- 9 g; Verde de bromocresol- 0,005 g; Tritn X-100- 0,3 mL; Agua destilada- 100 mL. 3.1 Preparacin: El reactivo debe tener el pH 3,5; tener color amarillo y estar transparente. Esterilice el reactivo por filtracin y envselo aspticamente en un frasco de vidrio de color mbar para su posterior almacenamiento en refrigeracin. Se ha comprobado una estabilidad satisfactoria del reactivo en dichas condiciones en un perodo de 5 meses de almacenamiento. 3.2 Procedimiento: Pique una colonia de inters y prepare una suspensin concentrada en 0,5 mL de solucin salina estril. A esta suspensin adale 0,2 mL del reactivo de GAD e incube a 35 2 C durante 10-13 h, observando cada 30 min. Cualquier cambio de color amarillo a verde o azul considrelo como reaccin positiva. Existen algunas cepas de E. coli que responden de manera ms rpida y por tanto su respuesta se observa en menor tiempo. 4. Prueba Rpida de indol Prueba de Arnold Weaver Medios de cultivo: Caldo de triptona (Agua de peptona) conteniendo triptfano. Composicin: Hidrolizado enzimtico de casena- 10,0 g; cloruro de sodio- 5,0 g. 4.1 Preparacin: Suspender 15 g en 1 L de agua destilada o desionizada, mezclar bien, distribuir y esterilizar a 121 C por 15 min. 4.2 Procedimiento: Inocule con gran abundancia un cultivo puro proveniente en cantidades de 0,4 mL de caldo de triptona (agua de triptona) conteniendo triptfano. Incube a 37 C durante 2 h. Agregue reactivo de Kovac y agite suavemente. Interpretacin: El color rojo en la capa reactiva indica formacin de indol. Almacenamiento del medio CromoCen AGN Mantenga el frasco con el medio deshidratado hermticamente cerrado en lugar seco, fresco, protegido de la luz, a temperatura de 15 a 30 C Se podr almacenar las placas listas para el uso por un perodo de 30 das a temperatura de 2 a 8 C.
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Para mayor informacin dirigirse a: Departamento de ventas: Ing. Carlos Prendes, tel. 8-81-70-24, e-mail: prendes@biocen.cu Asistencia tcnica: DrC Raisa Zhurbenko, tel. 047-68-2441, e-mail: raisa@biocen.cu Esquemas para la determinacin de los microorganismos diana. Esquema A. Deteccin e identificacin de Aeromonas por el mtodo cromognico con el medio CromoCen AGN Muestra en agua peptona alcalina (opcional, si es para recuento, no ejecutar) (Homogeneice). Incube a 35 2 C por 24 h. Inocule la placa de CromoCen AGN por agotamiento del inculo en la superficie (estras) o por inundacin de la superficie; 0,2-0,5 mL para muestras lquidas, directamente de la muestra o del cultivo en caldo, o con el tamao de muestra recomendado; o a partir de diluciones. Incube a 35 2 C por 18-24 h. Identifique las Aeromonas como colonias de color verde, con o sin halo transparente amplio, o colonias violetas con o sin halo transparente. Las colonias de color violeta sin halo son confirmadas para su reaccin positiva a la prueba de citocromo oxidasa.

Procese los resultados. Esquema B. Deteccin, identificacin y/o recuento de Pseudomonas, E. coli y coliformes por el mtodo cromognico con el medio CromoCen AGN. Prepare la muestra segn su origen y el mtodo de siembra a emplear. Para muestras slidas, suspenda la muestra en agua peptonada, agua peptonada tamponada, o segn proceda. De ser necesario, prepare diluciones seriadas segn los niveles de contaminacin esperados. Inocule la placa de CromoCen AGN por agotamiento del inculo en la superficie (estras) o por inundacin de la superficie con 0,2-0,5 mL para muestras lquidas, directamente de la muestra, caldos, o a partir de las diluciones seriadas. Incube a 35 2 C por 18-24 h. Para coliformes fecales o para diferenciar Pseudomonas aeruginosa de otras Pseudomonas (opcional) incube a 42 2 C por 18-24 h. Identifique y/o cuente las colonias diana segn se describe en el presente mtodo. Confirme si es necesario con las pruebas adicionales que se describen (GAD e Indol rpido para E. coli, o citocromo oxidasa para Pseudomonas). Procese los resultados.

Esquema C. Deteccin e identificacin de Salmonella por el mtodo cromognico con el medio CromoCen AGN