Laboratorio 8: Familia Enterobacteriaceae Mtodos de Identificacin Rpida

Biol: 3725L

Objetivos
Conocer los mtodos rpidos para la identificacin de bacterias (API 20E, Enterotubo II, Biolog y Vitek). Inocular un desconocido en varias pruebas bioqumicas
Tomar datos de las reacciones bioqumicas despus de 24 horas de inoculacin.

Caractersticas generales de la familia Enterobacteriaceae

Bacilos (o coco-bacilos) Gram negativos Catalasa positivos No producen esporas Temperatura ptima entre 32 45.5 C. Anaerobios facultativos. Algunos producen cpsula. Algunos fermentan lactosa. Pueden ser mtiles (flagelo). Oxidasa negativos Causantes de enfermedades nosocomiales. Patgenos humanos ms comunes. Flora normal del intestino de animales de sangre caliente.

Miembros de la Familia Enterobacteriaceae

Citrobacter sp. Enterobacter sp. Salmonella typhimurium Salmonella enteritidis Escherichia sp. Klebsiella sp. Morganella sp. Proteus sp. Shigella dysenteriae Yersinia pestis Providencia sp. Salmonella sp. Serratia sp. Shigella sp. Serratia marcescens Yersinia sp. Klebsiella
pneumoniae

Miembros de la Familia Enterobacteriaceae

Los gneros patognicos ms comunes se clasifican en tres grupos Coliformes: bacilo, Gram -, fermentan lactosa a gas y acido, microbiota normal, pueden ser patgenos oportunistas. No coliformes oportunistas: no fermentan lactosa. Patgenos verdaderos

Enfermedades
Gastrointestinales Tracto urinario Meningitis Septicemia Pneumonia

Modo de Transmicin Transmicin

Alimentos contaminados Persona a Persona Agua contaminada Contacto con animal Ruta Oral

Propiedades virulentas de E.coli

Enterohemorrgico Enterohemorr gico
Diarrea en humanos, bovinos, gatos y perros. Escherichia coli O157:H7 Clasificada de acuerdo a sus antgenos somticos (O) y flagelares (H). Tolerancia acdica (pH bajo) Tolerante a muchos antibiticos

Escherichia coli O157:H7

Causa principal de colitis hemorrgica o diarrea con presencia de sangre. Puede progresar a Sndrome Urmico Hemoltico.
Afecta riones

Puede causar Prpura Trombocitopenia Trombtica

Moretones Disminucin de plaquetas (trombocitos) Trombos (cogulos en los vasos sanguneos

Mtodos rpidos de identificacin de la Familia Enterobacteriaceae

Mtodos rpidos de identificacin

API 20E (Analytical Profile Index) Provee muchos resultados de una sola inoculacin. 20 microtubos con sustratos deshidratados (rehidratacin con suspensin de bacteria) Se pueden identificar 127 gneros y 550 spp. diferentes
Bacterias oxidasa-negativo Gram-negativo de la familia Enterobacteriaceae y otros Gram -

API 20E Incubar a 35-37C 18-24 hrs

API 20E
Provee lectura de 22 pruebas bioqumicas Utilizacin
Se genera anaerobiosis con aceite mineral estril en pruebas cuyas siglas estn subrayadas:
Ej. ADH, LDC, ODC, etc

Las pruebas marcadas con un recuadro inferior, se deben llenar completamente:

Ej. CIT,VP, etc.

Procedimiento de API 20E

Preparacin de la suspensin Inocule una colonia (2-3mm dimetro) del cultivo puro de su bacteria en solucin salina 0.85% Asegrese que la suspensin sea homognea.

Procedimiento de API 20E

Luego de hacer la suspensin inocular los microtbulos de API 20E Aadir 5 ml de agua en la bandeja de incubacin para proveer atmsfera hmeda.

Como llenar los microtbulos

Como se lee el API 20E?

Aminocidos analizados son (en orden) arginina, lisina y ornitina. Decarboxilacin: reaccin alcalina (cambio de color a rojo) Carbohidratos analizados son glucosa, manitol, inositol, sorbitol, ramanosa, sacarosa, melibiosa, amygdalina y arabinosa. Fermentacin: reaccin cida (cambio de color a amarillo) Produccin de H2S e hidrlisis de gelatina (cambio a color negro en todo el microtubo).

Interpretacin del API 20E

Apuntar los resultados en la tabla de tabulacin (1, 2, o 4 puntos para reacciones +, 0 puntos para reacciones -) . La prueba de oxidasa debe ser negativa. Tres pruebas son aadidas a la vez para dar un cdigo de 7 dgitos (profile index number), el cual es interpretado en el manual de cdigos.

Ventajas de API 20E

Rpido Eficaz Permite realizar numerosas pruebas a la vez

Desventajas de API 20E

Solo para microorganismos no fastidiosos. Cepas Gram negativas y oxidasa negativa. Bacterias de la Fam. Enterobacteriaceae. De encontrarse Salmonella o Shiguella spp., es necesario llevar a cabo pruebas serolgicas para confirmar la identificacin.

Resultados para diferentes miembros de la Familia Enterobacteriaceae

API 20E

Sistema de Enterotubo II
Identificar miembros de la familia Enterobacteriaceae, fermentadoras de glucosa y que son oxidasa negativa. (Salmonella, Yersinia, Escherichia etc.)

Algunas de las pruebas usadas en este sistema son: Simmon Citrate, Triple Sugar-iron agar, ureasa entre otros.

Sistema de Enterotubo II
Tubo con 12 compartimentos, cada uno con un medio de cultivo slido diferente. 15 pruebas estndar preformadas: Aerobia y anaerobias Se inocula con una aguja, que se pasa por el centro de los compartimentos Incubacin: 18 24 horas a 37C (oscuridad) Desventajas Poco preciso Riesgos de contaminacin de las pruebas Se diagnosticaban errneamente gneros de bacterias

Sistema Enterotubo II
Lectura
Observar cambios de color

Identificacin:
Estructurar un cdigo de 5 dgitos (Biocode) Consultar con el manual ENCISE (Enterobacteriaceae
Numerical Coding and Identification System for Enterotube)

Sistemas Computarizados
VITEK
Identificacin y/o determinacin de reaccin antibitica de bacterias y levaduras anaerobias (ms de 300 especies). 30 pozos con pruebas bioqumicas deshidratadas. Identificacin en 2 a 7 hrs. La automatizacin aporta mayor seguridad, suprimiendo las manipulaciones repetitivas. Una vez inoculada, queda hermticamente cerrada y por lo tanto es manipulable sin riesgo de contaminacin. No es necesario aadir ningn reactivo, lo cual evita cualquier riesgo de olvido o error.

Sistemas Computarizados
Inoculador / Sellador El cual permite la inoculacin de las tarjetas en pocos minutos. Incubador / Lector Asegura simultneamente la incubacin y la lectura de las tarjetas para una capacidad que vara de 32 a 480 tarjetas segn el modelo. Ordenador Efecta un control permanente de las operaciones en curso, memoriza los valores, trata e interpreta los resultados. Impresora

Sistemas Computarizados
BIOLOG: Identificacin de 1900 bacterias, levaduras y hongos en base a su capacidad enzimtica. Sistema de microplacas de 96 fosas cada una conteniendo una fuente nica de carbono, nutrientes bsicos y un indicador colorimtrico. El indicador colorimtrico que utiliza este sistema es una sal de tetrazolium que en su forma oxidada es incolora. Cuando el organismo es introducido en la gran variedad de sustratos de carbono en la microplaca se produce una huella con un patrn caracterstico. Los resultados bioqumicos de la muestra son ledos y guardados en segundos automticamente, eliminando la subjetividad visual de la interpretacin.

Sistemas Computarizados
BIOLOG: Posteriormente son comparados con la extensa base de datos para su identificacin final. Los resultados se interpretan y se registran automticamente. Especie identificada se exhibe en un monitor de la pc junto con su patrn de la reaccin.
Tambin una lista de 10 especies con los patrones relacionados ms cercanos y otra estadstica til.

La tecnologa de Biolog es tan sensible que puede detectar cultivos mezclados o contaminados.

Prctica

Prctica
De las colonias aisladas de la prctica de la semana anterior, se inocular aproximadamente 11 colonias (una en cada columna) y la primera columna representa el control negativo.
De MacConkey Gram negative De MSA Gram positive

1- SIM 2- Citrate 3-MacConkey 4- Glucose 5- EMB 6- Urea 7- Colilert 8- Control

1- Catalase 2- BEA 3- MSA 4- Glucose 5- Glucose 6.5%NaCl 6- Urea 7- Enterolert 8- Control

Instrucciones
Inocular de la misma colonia, cada fosa de las columnas de la placa.
Seguir instrucciones del instructor.

Incubar a 37C/24hrs. Observar sus resultados y anotarlos.

Posibles resultados
Medio Dextrosa Lactosa Bile Esculine Agar Manitol SIM Rojo Rojo Marrn claro Rojo Marrn claro Negativo Amarillo Amarillo Negro Amarillo Motilidad Turbidez difusa Produccin de H2S Negro Azul Rosado Fuschia Amarillo intenso = coliforme total Fluorescencia = E. coli Fluorescencia = Enterococcus sp. Colonias fusha = fermentador de Lactosa Verde metalico = E.coli Burbujas Positivo

Citrato Urea colilert Enterolert MacConkey EMB Catalase

Verde Rojo Amarillo claro No Fluorescencia Colonias claras (G-) Colonias oscuras (G-) No burbujas

Fermentacin de carbohidratos

Bile Esculin Agar

MSA
Fermentacin del mannitol.

SIM

Sulfide Indole

Motility

Simmons citrate

negativo

positivo

Urease