BIORREACTORES

Various types of fermentors have been designed by many researchers since the end of 1950's.

En la actualidad se encuentran desarrollados, entre otros, a escala industrial de produccin los procesos para obtencin de shikonina por cultivo de clulas de Lithospermun erythrohizon, puesto a punto por la Industrias Petroqumicas Mitsui,

as como la produccin de berberina

O O OCH

O-Glc-Glc OCH
3

OH

y biomasa de ginseng
Glc-Glc-O

Los procesos industriales requieren de tres puntos fundamentales:

Crecimiento eficiente en grandes volmenes Acumulacin de metabolitos secundarios en el cultivo Si el proceso implica bioconversin o produccin de enzimas, que esto ocurra en las condiciones de operacin del proceso

Es necesario ajustar algunos parmetros : Presin parcial de oxgeno Presin parcial de dixido de carbono pH Agitacin y mezclado densidad del cultivo Temperatura Iluminacin de ser necesario

Caractersticas

clulas microbianas

clulas vegetales dediferenciadas

consecuencias en el biorreactor

Tamao Clulas individuales Velocidad de crecimiento Densidad del inculo Sensibilidad al esfuerzo de corte Aireacin

2-10 mm pueden obtenerse Alta td 1-2 horas pequeo

10-200 mm forman agregados Baja td 2-5 das 5-20 %

Rpida sedimentacin, mayor sensibilidad al corte Rpida sedimentacin Largos procesos, problemas para mantener esterilidad Problemas de manipuleo. Dificulta la posibilidad de escalado Disminucin de la velocidad de agitacin Baja demanda de oxgeno, bajo KLa

no sensitivo

sensitivo/tolerante

alta

baja

agitacin

transferencia de oxgeno

Aumenta el rea de transferencia de oxgeno por la formacin de pequeas burbujas Retarda el escape de burbujas desde el lquido Previene la coalescencia de las burbujas de aire Disminuye el grosor de la interfase gas/lquido al crear un flujo turbulento

La agitacin como factor de transferencia de masa

Asegurar el suministro de nutrientes a nivel celular Prevenir la sedimentacin Asegurar la transferencia de gases Solubilizar componentes menos solubles de los medios

Diseos bsicos de biorreactores para mltiples propsitos

aire Tanque agitado

aire Columna de burbujas

aire air lift

Tanque agitado

Proporciones tpicas de un tanque agitado

Reactores de lecho fluido (columna de burbujas)

a) Reactor de lecho fluido b) Reactor de lecho fluido cnico

Dalton en 1978 dise un reactor de bajo esfuerzo de corte denominado air lift

Draft tube

Airlift - uses air sparging to pneumatically mix the media

Algunas variantes

Reactores de lecho fijo por goteo

Mini air lift invertido

Bolsas descartables

Comparison of Yield and Productivity for Cell Mass and Anthraquinones in Various Reactor Systems
flat blade turbine Perforated disk impeller Bubble column reactor

Shake flask

air-lift reactor

Wagner, F. In "Plant Tissue Culture and Its Bio-technological application" Ed. Barz, W. et al., p. 250 (1977). Springer-Verlag, Berlin Heidelberg.t reactor

PROCESS MONITORING AND CONTROL

Que parmetros controlar?

Temperatura pH Presin parcial de O2 Formacin de espuma

Ej. Produccin de alcaloides terpenoindlicos con cultivos celulares de Uncaria Tomentosa ua de gato en tanque agitado

Reactor

Batch

Biorreactores para el cultivo de races

Bioreactor de lecho de goteo con malla para inmovilizar a las races
Entrada de medio
Malla de inmovilizacin Adicin de nutrientes

Salida de aire

Aire

Aire

Reservorio

Bomba

Biorreactores para el cultivo de races

Bioreactor de lecho de niebla (nutrient mist reactor)

Filtro de aire
Bomba peristltica

Bomba de aire

Generador de niebla Intensidad On Off Condensador de niebla

Controlador

Cmara de cultivo

A nutrient mist reactor is substantially the same as aeroponic growth of plants as proposed by botanists

Growth of hairy roots in the 3 L MTR on the 16th day

Biorreactores para cultivo de otros rganos

Para cultivo de rganos

MTB

Centaurium erythraea shoot culture in mist trickling bioreactor after 21 days.

Modelos para clulas inmovilizadas

Operacin de Biorreactores

1.Batch:
Son sistemas cerrados que se caracterizan por cambiar las condiciones fisiolgicas y ambientales. No hay entrada ni salida de medio de cultivo.

Operacin de Biorreactores

2.Batch alimentado:
Estos sistemas operan adicionando medio fresco, pero sin remocin del existente. Son muy tiles cuando se requiere una elevada densidad celular en la etapa de iniciacin del proceso que implica un alto consumo de nutrientes, especialmente de fuente hidrocarbonada que suele funcionar como sustrato limitante.

Variante del batch alimentado:

2.1-Draw-fill o semicontnuo: Consiste en remover, al final de la operacin entre un 80 y un 90 % del cultivo y reemplazarlo por medio fresco.

De esta manera puede eliminarse el perodo lag, satisfacerse sencillamente la necesidad de contar con inculos de gran tamao y a su vez evitar la esterilizacin del reactor entre dos ciclos.

Operacin de Biorreactores

3.Continuo:
el caudal de entrada de medio fresco es igual al de salida de medio utilizado. Son utilizados en cultivos donde la velocidad de crecimiento celular es constante por lo que existe un suministro constante de nutrientes o para la remocin permanente de producto sobre todo en sistemas inmovilizados.

Operacin de Biorreactores

3.Continuo:
Este tipo de operacin presenta grandes inconvenientes con respecto al mantenimiento de las condiciones de asepsia del proceso, y se dificulta debido a la tendencia a formar agregados de las clulas vegetales en cultivo, la formacin de merengue y el lento crecimiento celular. Para su buena aplicacin se requiere del diseo de sistemas que permitan suplementar continuamente el medio de cultivo evitando la remocin de las clulas y as minimizar lo que se denomina lavado del cultivo. Una variante es la Perfusin que implica la remocin y suministro de medio dejando la biomasa ocluida en una malla.

Continuous Culture

Growth Batch Culture

10

15

20

25

Time (days)

Remocin de producto in situ

Lquido-lquido:
Compuestos inmiscibles en agua, como solventes orgnicos o lpidos (sistemas de dos fases agua-orgnico). Ejemplos: migliol, hexadecano, dodecano.

Slido-lquido:
La segunda fase es un material slido como resinas u otros absorbentes. Generalmente resinas como XAD, RP18, etc.

Requerimientos:
- Autoclavables - No txicos - Fcil separacin del producto de inters de la segunda fase - No modificacin del medio de cultivo - Permanencia de las clulas en la fase acuosa

Adaptaciones para la extraccin in situ del producto

Diagrama de un tanque de agitacin mecnica modificado para operar con remocin in situ del producto. 1: tanque; 2: malla de acero inoxidable para inmovilizar races; 3: sensor de oxgeno; 4: malla acero inoxidable; 5: medidor DO; 6: agitador; 7: lana de vidrio; 8: resina XAD-2; 9: filtro de vidrio; 10: generador de aire; 11: condensador; 12: marco de la malla

Tomado de: Hairy Roots, Culture and Application, 1997.

Adaptaciones para la extraccin in situ del producto

Un bioreactor de agitacin por lquido con loop externo

ROOTec Mist Bioreactor (RMB)

http://www.rootec.com/index.php?p=2

Ejemplo integrado

Ejemplo integrado

Produccin de shikonina por suspensiones celulares de Lithospermum erythrorhizon

Shikonina
Yamasaki Plant Photo Gallery

Planta entera
- La extraccin se realiza en plantas de aproximadamente 3 aos.

Suspensiones celulares
- 2,4-D estimula el crecimiento pero no la produccin. - Las bajas concentraciones de nitrgeno y la elicitacin inducen la produccin de shikonina.

Proceso para la produccin de shikonina a partir de clulas de Lithospermum erythrorhizon por Mitsui Petrochemical Ind.

Tomado de: Scraag. Plant Biotechnology, 1992.

Se utilizan fermentadores de agitacin mecnica y tambor rotatorio. La productividad de shikonina es 840 veces superior a la de planta entera.

Secuencia en la optimizacin de un proceso para la produccin de metabolitos secundarios

Seleccin de la planta por su contenido de metabolitos secundarios para iniciar cultivos in vitro Establecimiento de cultivos in vitro

Estabilizacin y seleccin de cultivos in vitro: velocidad de crecimiento, niveles de producto, liberacin al medio

Optimizacin de medio de cultivo para produccin por diseo factorial: nutrientes, precursores, elicitacin, liberacin y remocin in situ

Optimizacin en bioreactores: escalado Sistema de cultivo: batch, continuo, fed-batch, perfusin, en dos etapas. Extraccin y purificacin del producto

Esquema de un proceso completo para la produccin de un metabolito secundario por cultivo in vitro de clulas y rganos vegetales