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porosa del filtro. Una el filtro con la base con la ayuda del cierre, teniendo en cuenta no daar la membrana. Coloque aproximadamente un volumen de 20 mL de agua para diluciones estril y fltrela previamente. Agite vigorosamente la muestra unas 25 veces y tome posteriormente en un contenedor estril el volumen de la muestra de agua y fltrela conectando la bomba de vaco. Realice otro enjuague de aproximadamente 20 mL de agua para diluciones. Al terminar estos pasos, abra la unidad de filtracin y retire la membrana filtrante con ayuda de la pinza flameada. Coloque esta membrana sobre la superficie del medio m-CromoCen ENT teniendo especial cuidado en que no queden burbujas de aire entre la membrana y el medio. Realice los enjuagues del filtro con agua para diluciones tamponada estril, antes y despus de procesar cada una de las muestras. Coloque las placas en la incubadora a temperatura de 35 2 C en posicin horizontal, con la tapa hacia abajo, en columnas de no ms de 4 placas. Incube por un perodo de 18 a 24 h. Luego de la incubacin, examine las placas para determinar la presencia de colonias tpicas de Enterococcus o para su enumeracin. Interpretacin El crecimiento tpico de Enterococcus en el medio m-CromoCen ENT son colonias de color rosado claro a oscuro. Las colonias incoloras o con pigmentacin propia corresponden a otras bacterias Gram-positivas. Los microorganismos Gram-negativos resultan inhibidos en el medio. Ventajas
Identificacin directa. El uso de los medios de cultivo cromognicos y/o fluorognicos en los laboratorios
Ms rpido. La identificacin y/o recuento de Enterococcus se realiza en un perodo mximo de
de microbiologa dedicados al control de calidad de las aguas, introduce cambios en los criterios de identificacin de las muestras (son identificados directamente). Esto debe considerarse en las comparaciones con los estudios previos. 28 h. La deteccin directa de la actividad enzimtica en el medio eleva la exactitud del anlisis. Esto permite la identificacin directa (o con un mnimo de pruebas adicionales), cuyos resultados no presentan diferencia con la identificacin realizada por bioqumica tradicional.
Ms fcil de utilizar. Disminucin de la carga de trabajo asociada al procesamiento de las muestras. Ms preciso. Su Sensibilidad y Especificidad diagnsticas son superiores a las de los medios
convencionales destinados al mismo propsito para los microorganismos de inters.
revelador indica una prueba positiva. Si aparece un color amarillo o anaranjado, la prueba se considera negativa.
3. Prueba rpida de LAP (Leucina aminopeptidasa) Composicin: leucina--naftilamida-0,01 g; solucin salina-100 mL. 3.1 Preparacin: Aadir 0,01 g del sustrato leucina--naftilamida a 100 mL de solucin salina, esterilizar por filtracin y distribuir cantidades de 2 mL en tubos de ensayo estriles. Proteger de la luz.
3.2 Procedimiento: Prepare una suspensin densa a partir de un cultivo puro en solucin fisiolgica estril y e inocule los tubos que contienen el sustrato disuelto en solucin salina. Incube a 35-37 C durante 30 min, en aerobiosis. Adicione una gota del reactivo revelador N,N-dimetilaminocincaldehdo y deje a temperatura ambiente hasta 5 minutos. La prueba se realizar de forma alternativa si posee los discos LAP, adicionando los discos al tubo que contiene el sustrato disuelto en solucin salina. Interpretacin: -LAP Positivo: Disco y/o solucin de color rosado a rojo. -LAP Negativo: Disco y/o solucin de color amarillo o incoloro. Algunas cepas de Enterococcus, particularmente E. avium y E. raffinosus, pueden no producir LAPasa. 4. Agua para diluciones tamponada. 4.1 Solucin stock de buffer de fosfato Composicin: Dihidrgenofosfato de potasio (KH2PO4)- 34,0 g; Agua destilada-500 mL. 4.1.1 Preparacin Ajuste el pH de la solucin a 7,2 con el NaOH 1N y complete el volumen a 1000 mL con agua destilada. Esterilice en autoclave a 121C durante 15 min. 4.2 Solucin stock de MgCl2 Composicin: MgCl2 anhidro-38 g (o 81,1 g del hexahidratado); Agua destilada-1000 mL. 4.2.1 Preparacin Pesar la cantidad deseada y esterilizar en autoclave a 121 C durante 15 min. Almacene en refrigeracin ambas soluciones stock despus de la esterilizacin y maniplelas aspticamente. Solucin de trabajo final (pH 7,0 0,2): Aada 1,25 mL de la solucin stock de buffer fosfato y 5 mL de la solucin stock de MgCl2 para cada litro de agua destilada preparada. Mezcle bien, dispense en contenedores apropiados (frascos graduados o frascos de Erlenmeyer para el enjuague del filtro) y esterilice en el autoclave. Almacenamiento del medio m-CromoCen ENT Mantener el frasco con el medio deshidratado hermticamente cerrado en lugar seco, fresco, protegido de la luz, a temperatura de 15 a 30 C Se podr almacenar las placas listas para el uso por un perodo de 30 das a temperatura de 2 a 8 C, protegidas de la luz. Para mayor informacin dirigirse a: Departamento de ventas: Ing. Carlos Prendes, tel. 8-81-70-24, e-mail: prendes@biocen.cu Asistencia tcnica: DrC Raisa Zhurbenko, tel. 047-68-2441, e-mail: raisa@biocen.cu Diagrama A. Diagrama de flujo para la determinacin de Enterococcus en muestras de aguas. Muestra de agua Tomar en un contenedor estril muestras con el volumen a filtrar Enjuagar del filtro con el agua para diluciones tamponada estril (20 mL) Filtrar el volumen de la muestra Realizar el enjuague posterior (20 mL) Colocar la membrana filtrante en el medio m-CromoCen ENT Incubar las placas a 35 2 C durante 18-24 horas Identificar las colonias de Enterococcus (colonias de pequeo tamao (0,5-1 mm de ), de color rosado claro a oscuro) Ejecutar, de ser necesaria, la confirmacin de las colonias sospechosas de Enterococcus con la prueba PYR y/o la prueba LAP
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