UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

INGENIERA AGROINDUSTRIAL
DETERMINACIN DE LA CURVA DE CRECIMIENTO DE LEVADURA Sacharomyces cerevisae, APLICANDO EL MODELO DE GOMPERTZ
LABORATORIO DE BIOTECNOLOGA DE LOS PRODUCTOS AGROINDUSTRIALES

PROFESOR: ING. SNCHEZ GONZALES, JESS ALEXANDER CICLO: IX HORARIO: JUEVES 11-1PM

TRUJILLO-2012

Determinacin de la curva de crecimiento de levadura Sacharomyces cerevisae, aplicando el modelo de Gompertz

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INTEGRANTES

ALFARO LAYZA MASSIEL AROCA CASTILLO RONALD BANCES NEZ PEDRO CALDAS REYES PATRICIA CERQUN RODRGUEZ DIEGO COLLANTES ARANA LUIS ESQUIVEL PEREA VIRGINIA ESPINOZA ROMERO DIEGO GORDILLO SILVA CARLOS GUERRERO MEDINA NEIVER GUTIERREZ MARIN VIVIANA IZZIGA LUNA NARDY JARA PONTE ANVAL LEN PICN BRUCE LZARO HARO DANNY LUCAS FLORES YOVEN MARTNEZ SALDAA YURICO MNDEZ SOSA JIMMY MORALES NARVEZ CARLOS RODRGUEZ ANTICONA ROBERTO RODRGUEZ LEN ANDR SANTILLN HONORIO HILBAR VARGAS RAFAEL ANGIE

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DETERMINACIN DE LA CURVA DE CRECIMIENTO DE LEVADURA Sacharomyces cerevisae, APLICANDO EL MODELO DE GOMPERTZ

I.

INTRODUCCIN: La microbiologa predictiva de alimentos (MPA) es un rea multidisciplinaria emergente de la microbiologa de alimentos, que surge como alternativa a la necesidad de acortar tiempos de respuestas, reducir costos econmicos, reemplazar metodologas dispendiosas y disminuir la laboriosidad en los anlisis de la microbiologa clsica de alimentos. Es un rea multidisciplinaria ya que abarca distintas disciplinas como la microbiologa, matemtica, estadstica, informtica, bioqumica, etc., con el fin de desarrollar y aplicar modelos de simulacin que permitan predecir las respuestas de los microorganismos ante diversos factores medioambientales. La microbiologa predictiva se basa en la siguiente premisa: las respuestas de los microorganismos ante los cambios en los factores ambientales pueden ser reproducidas de forma controlada en el laboratorio, de esta forma, a travs de diversos modelos es posibles posible predecir cul ser el comportamiento de estos microorganismos cuando cambian las condiciones ambientales que les rodea.

Los modelos matemticos considerados en el mbito de la microbiologa predictiva se pueden clasificar segn distintos criterios, usos y finalidades. Existen modelos probabilsticos (que permiten estimar los lmites de crecimiento/no crecimiento o produccin/no produccin de toxina), modelos cinticos de crecimiento, de supervivencia o de inactivacin (para determinar el nmero de microorganismos en funcin del tiempo). Tras ajustar la curva de crecimiento microbiana mediante funciones matemticas (modelos primarios) y estudiar sus parmetros segn cambios en las condiciones ambientales (modelos secundarios), es posible modelizar el comportamiento microbiano en funcin de la temperatura, el pH, la actividad del agua y otros factores, independientemente del alimento y a partir de estos datos predecir lo que suceder durante el almacenamiento, procesado, etc.

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II.

OBJETIVOS Preparar medios de cultivo y manejar adecuadamente la autoclave. Confeccionar la grfica de crecimiento de levadura Sacharomyces cerevisae mediante el modelo de GOMPERTZ. Se conoci el modelo de Gompertz para el clculo de la curva de crecimiento de las levaduras. Identificar cada una de sus fases. Calcular el Tiempo de Generacin por el mtodo grfico.

III.

MARCO TERICO A) FORMULACIN DE MEDIOS DE FERMENTACIN La preparacin de medios para el desarrollo de procesos de fermentacin es una etapa fundamental para asegurar la productividad de los mismos. Donde los componentes de los medios constituyen los efectores externos de naturaleza qumica que desempean un rol esencial en los procesos ya que deben cumplir con los requerimientos del crecimiento y de formacin de productos y adems suministrar energa para la sntesis de metabolitos y para el mantenimiento celular. No obstante que los microorganismos varan considerablemente respecto de los nutrientes que pueden necesitar es posible efectuar la distincin de las siguientes categoras de componentes: a) Macronutrientes, agregados en cantidades de gramos por litro que estn representados por las fuentes de C, N, S, P, K y Mg. b) Micronutrientes o elementos trazas representados por las sales de Fe, Mn, Mo, Ca, Zn y Co que se agregan a los medios en cantidades de miligramos o microgramos por litro. c) Factores de crecimiento, que estn constitudos generalmente por componentes orgnicos suministrados en baja concentracin y que no son sintetizados ni metabolizados por las clulas, sino incorporados a estructuras celulares y de funcin

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metablica especfica, como vitaminas, algunos aminocidos, cidos grasos no saturados, etc. Los medios pueden clasificarse, considerando la naturaleza qumica de los componentes, en: Medios sintticos o medios qumicamente definidos. Medios complejos, en cuya composicin intervienen sustancias de origen animal o vegetal como peptonas, extracto de levadura, macerado de maz, harina de soja, etc. que aportan las sustancias fundamentales ya mencionadas, pero que son qumicamente indefinidas y de composicin variable B) CRECIMIENTO CELULAR Es importante conocer la cintica de crecimiento de los cultivos microbianos porque es necesario poder predecir cmo va a evolucionar un cultivo, cmo va a ir consumindose el substrato y cmo se va a ir acumulando el producto de una fermentacin. Sin conocer estos factores es muy imprudente iniciar el cultivo en un fermentador de 10.000 litros, por ejemplo, con el coste que ello supone, puesto que no podemos predecir qu va a pasar, cundo va a completarse el crecimiento, cmo se va a acumular el producto, etc. Las clulas aisladas cultivadas en un volumen finito de medio de cultivo apropiado van utilizando los nutrientes que tienen disponibles con la mayor eficiencia y rapidez que pueden, sintetizando sus propios componentes celulares y dividindose en cuanto han podido duplicar su masa y su material gentico. El tiempo que tarda una clula en hacer. Cada vez que transcurre un tiempo de generacin, el nmero de clulas se duplica, siguiendo, por tanto, un incremento exponencial. Si llamamos N0 al nmero de clulas inicial, y g al nmero de generaciones transcurridas, el nmero de clulas final (N) ser:

Llamando T al tiempo de generacin y t al tiempo de cultivo transcurrido, la ecuacin anterior puede transformarse en la siguiente:

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Las ecuaciones exponenciales son muy difciles de manejar grficamente, por ello es mejor transformarlas en algo ms simple, como puede ser una recta. Para transformar las ecuaciones anteriores en una recta, tomamos logaritmos en los dos trminos y resulta:

Esto es: el logaritmo del nmero de clulas crece linealmente con el tiempo a razn de una constante igual a ln2/T. Si el tiempo de generacin T es muy grande, el crecimiento tendr poca pendiente (ser lento) y si T es pequeo el crecimiento ser rpido.Esto es: el incremento en el nmero de clulas, en la biomasa de cultivo y en la acumulacin de metabolitos primarios, protenas, cidos nucleicos etc., es paralelo. Otra forma de representar la cintica es considerando el incremento en el nmero de clulas (dN) en un intervalo corto de tiempo (dt). En este caso, la ecuacin que describe la cintica es la siguiente:

Esto es: el incremento del nmero de clulas (dN) por unidad de tiempo (dt) es proporcional al nmero de clulas presentes en el cultivo (N). A la constante de proporcionalidad () se le denomina tasa de crecimiento y puede considerarse algo as como la probabilidad de que una clula se divida en un tiempo determinado la transformacin de esta ecuacin en una recta (tomando logaritmos) rinde lo siguiente:

Esto es: el incremento del logaritmo del nmero de clulas aumenta linealmente con el tiempo siendo la constante de proporcionalidad . Comparando esta ecuacin con la similar presentada ms arriba, podemos concluir que = ln2/T y, por consiguiente, que T = ln2/. Es decir, que hay una correlacin inversa entre el valor de la tasa de crecimiento () y el tiempo de generacin.

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Estas ecuaciones nos permiten predecir cul ser el nmero de clulas, masa celular, etc. despus de un cierto tiempo de cultivo (t) si conocemos ; o bien, poder calcular la tasa de crecimiento a partir de medidas experimentales del incremento en el nmero de clulas, biomasa, etc.

Figura 1. Crecimiento celular El grfico representa la variacin de la biomasa (o nmero de clulas, etc.) de un cultivo (lnea roja) a lo largo del tiempo. En este cultivo, se va consumiendo un substrato cuya concentracin (lnea azul) decrece de forma proporcional al crecimiento de la biomasa. C) CINTICA DEL CRECIMIENTO DE BIOMASA Una fermentacin aerbica tipo batch o discontinua puede ser considerada como un sistema cerrado. En el tiempo inicial el medio de cultivo estril dentro del fermentador se inocula con microorganismos y la incubacin se da bajo condiciones fisiolgicas ptimas. En el transcurso de toda la fermentacin, solo se adiciona oxgeno (en forma de aire), un agente antiespumante, y un cido o base para el control del pH, con el fin de garantizar las condiciones ptimas de operacin que permitan obtener una alta concentracin celular. La composicin del medio de cultivo, la concentracin de biomasa, y la concentracin del metabolito cambia constantemente como resultado del metabolismo celular. En el transcurso de la fermentacin hay 4 fases de crecimiento, por las cuales pasa el microorganismo a travs el tiempo, como se muestra en la figura 4: fase lag, fase exponencial, fase estacionaria y fase de muerte (Snchez, 2003).

Figura 2. Curva de crecimiento de los microorganismos. Fase Lag o de adaptacin: tambin llamada fase de latencia. Cuando las clulas son transferidas de un medio a otro, no hay inicialmente un incremento en el nmero de clulas. Durante esta fase los microorganismos se toman un tiempo para adaptarse a su nuevo ambiente fisicoqumico y en ocasiones se sintetizan nuevas enzimas o componentes estructurales (Snchez, 2003; Duarte, 1998). La duracin de esta fase puede variar dependiendo del crecimiento de las clulas en el inculo, el cual debe tener una edad tal que la mayor parte de las clulas que contiene deben encontrarse en fase exponencial y metablicamente activas (Barrera, 2004). Es recomendable utilizar inculos entre aproximadamente 5 y 10% del volumen total del reactor con el fin de reducir el tiempo de latencia (Soto, 2004). Fase Exponencial o log: Al finalizar la fase lag, las clulas se han adaptado a las nuevas condiciones de crecimiento. En este punto las clulas se reproducen sin limitacin de sustancias nutritivas a velocidad mxima. El crecimiento de las clulas se puede describir cuantitativamente como la duplicacin del nmero de clulas o biomasa por unidad de tiempo. A travs de esta fase las clulas alteran el medio constantemente tomando los sustratos y excretando los productos metabolizados. El crecimiento permanece constante durante esta fase. La velocidad de crecimiento es independiente de la concentracin de sustrato mientras exista sustrato en el medio y se correlaciona con la velocidad de crecimiento especfico y la concentracin de clulas x [clulas/ mL] segn la ecuacin nmero 1.
(1)

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La velocidad de crecimiento especfico , es generalmente una funcin de tres parmetros: la concentracin del sustrato limitante S , la tasa de crecimiento mxima max , y la constante especifica de sustrato s K , en cuya concentracin se obtiene la mitad de la mxima velocidad especfica de crecimiento ( = 0.5 mx. ). Esta relacin puede ser expresada por medio de la ecuacin de Monod (2):
(2)

La velocidad mxima de crecimiento especfico max es de considerable importancia a nivel industrial, debido a que es en este punto donde se obtiene el valor mximo de a niveles de saturacin de sustrato, relacionando la dependencia de los microorganismos con las condiciones del fermentador, donde a medida que aumenta la densidad de poblacin decrece la concentracin del sustrato limitante del crecimiento, causando un descenso de . Fase estacionaria: ocurre cuando se agota una sustancia nutritiva y el sustrato se ha metabolizado, cuando se han formado sustancias txicas o ha ocurrido un cambio de condiciones como pH, temperatura y concentracin de oxgeno disuelto. El crecimiento celular desciende lentamente o para completamente y en el caso en el que aun pueda estar ocurriendo crecimiento, este se contrarresta por la rapidez de muerte o lisis celular. La biomasa incrementa slo gradualmente o permanece constante durante la fase estacionaria, aunque la composicin de las clulas puede cambiar (Snchez, 2003; Duarte, 1998). Fase de muerte: tambin llamada fase de decaimiento. En esta fase la reserva de energa de las clulas se ha acabado, debido a condiciones de inanicin o como consecuencia del metabolismo de mantenimiento de algunas clulas. El tiempo entre la fase estacionaria y la fase de muerte depende del microorganismo y el proceso utilizado (Snchez, 2003; Duarte, 1998). D) CONSUMO DE SUBSTRATOS LA LEVADURA Sacchharomyces cerevisiae La levadura Sacchharomyces cerevisiae es capaz de asimilar una gran variedad de monosacridos. Tambin puede hidrolizar y consumir algunos carbohidratos mayores, como la sacarosa, maltosa, rafinosa, maltotriosa y pectina, pero carece de las enzimas necesarias para utilizar la lactosa, el glucan y el almidn. Estos ltimos

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substratos deben ser desdoblados previamente, ya sea por hidrlisis cida y calor (pH 2.5), o por la actividad de enzimas exgenas de origen microbiano o vegetal: lactasa, glucanasa, a y b-amilasas o glucoamilasa. En los mostos de procesos industriales, las concentraciones de carbohidratos fermentables fluctan

generalmente entre 6-12% (p/v). Los carbohidratos asimilados son degradados y oxidados durante el catabolismo a travs del ciclo de la Gluclisis (o va Embden-Meyerhof-Parnas). La levadura aprovecha la energa liberada de cada mol de glucosa: para formar dos moles de ATP y los usa en la etapa anablica. El ciclo se estabiliza al reducir finalmente dos moles de NAD+, mientras forma los productos de la fermentacin. Adems de la fuente de carbono, la levadura requiere que el medio de cultivo tenga fuentes apropiadas y suficientes de otros macronutrientes: N, O, H, S y P; de micronutrientes: Na, K, Ca, Mg, Mn y Fe; de elementos traza y de vitaminas. Se ha observado un mejor aprovechamiento del nitrgeno cuando sus fuentes son aminocidos libres o pptidos pequeos, en comparacin con las protenas, porque las proteasas de la levadura tienen actividad limitada. La velocidad de consumo de substrato limitante (fuente de carbono) est ligada directamente a la velocidad de crecimiento de la levadura. Al entrar en la clula, el substrato tiene tres destinos: para funciones de mantenimiento, para crecimiento microbiano y para la formacin de productos excretados. En un cultivo sumergido discontinuo (cintica) la cintica de consumo de substrato limitante se representa as:

Dnde:

qs: Velocidad especfica de consumo de substrato m: Tasa de mantenimiento

Velocidad de consumo de substrato para el crecimiento microbiano:

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Velocidad de consumo de substrato para la formacin de los productos ligados al crecimiento microbiano:

E) CRECIMIENTO DE LA LEVADURA El proceso de reproduccin normal de Saccharomyces cerevisiae es asexual (mitosis) y se llama gemacin. En ste se observa la formacin de yemas o blastosporas que dan origen a nuevas clulas haploides al crecer. Slo en condiciones crticas se combinan dos clulas para formar un cigoto diploide, y despus de la reduccin de cromosomas (meiosis) se forman 4 esporas sexuales (ascosporas) que al germinar producen nuevas clulas haploides. Saccharomyces cerevisiae es anaerobia facultativa, por lo que se obtiene un mayor rendimiento de biomasa en aerobiosis que en anaerobiosis. El cultivo aerobio es importante durante la propagacin del inculo, llamado tambin cultivo semilla El cultivo principal se realiza en condiciones anaerobias o microaerfilas El valor de la velocidad especfica de crecimiento microbiano (m) en anaerobiosis flucta entre: 0.13 y 0.408 h-1. El rendimiento aproximado de biomasa con respecto al consumo de substrato en estas condiciones es:

Y el de produccin de ATP es de:

F) CRECIMIENTO Y SNTESIS DEL PRODUCTO EN PROCESOS INDUSTRIALES.

Hay dos tipos fundamentales de productos metablicos: primarios y secundarios. Un metabolito primario es el que se forma durante la fase primaria del crecimiento del microorganismo, mientras que un metabolito secundario es el que se forma cerca del final de la fase de crecimiento, frecuentemente cerca de, o en la fase estacionaria del crecimiento. Las diferencias entre un metabolito primario y un metabolito secundario se ilustran en la imagen de la izquierda.

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Metabolitos primarios microbianos.

Un proceso microbiano tpico, en el que el producto se forma durante la fase primaria del crecimiento, es el alcohol (etanol) obtenido por fermentacin*. El etanol es un producto del metabolismo anxico de la levadura y de algunas bacterias y se forma como parte del metabolismo de la energa. Debido a que el crecimiento slo puede tener lugar si puede producirse energa, la formacin de etanol tiene lugar en paralelo con el crecimiento. Metabolitos secundarios microbianos.

Un tipo ms complejo de productos industriales es aquel en el que el producto deseado no se produce durante la fase primaria del crecimiento sino durante la fase estacionaria. Los metabolitos producidos durante la fase estacionaria se denominan metabolitos secundarios y son algunos de los metabolitos ms comunes y ms importantes de inters industrial. Mientras que el metabolismo primario es generalmente similar en todas las clulas, el metabolismo secundario presenta claras diferencias entre un organismo y otro. Las caractersticas reconocidas del metabolismo secundario son: Cada metabolito secundario slo lo forman relativamente pocos organismos. Los metabolitos secundarios, aparentemente no son esenciales para el crecimiento y la reproduccin. Con frecuencia, los metabolitos secundarios se producen como un grupo de estructuras estrechamente relacionadas. Con frecuencia es posible obtener una espectacular superproduccin de metabolitos secundarios, en tanto que los metabolitos primarios, ligados como estn al metabolismo primario, usualmente no se pueden superproducir de una manera tan espectacular.

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G) MEDIO DE CULTIVO. La produccin de levadura, requiere adems de unas condiciones ambientales ptimas, de una variedad de nutrientes esenciales y vitaminas (Gmez, 2003). Los nutrientes existentes en los medios de cultivo dan a la clula microbiana todos los ingredientes requeridos para que produzca ms clulas semejantes a ella misma (Ramrez y Pedroza, 2001). Por lo tanto, es conveniente considerar un diseo de medio de fermentacin que genere las mejores garantas de crecimiento, el mejor desarrollo para el microorganismo y el mximo rendimiento de produccin. El medio debe satisfacer los requerimientos nutricionales y ambientales del microorganismo, adems de las restricciones tcnico-econmicas para minimizar los costos de separacin y purificacin. La determinacin de los requerimientos nutrimentales, ambintales y la composicin, dependen de la estequiometra de crecimiento y formacin de producto (Duarte, 1998). En la Figura 3, se muestran los requerimientos bsicos de nutrientes para los microorganismos y las formas comunes de satisfacerlos en los cultivos

Figura 3. Requerimientos nutrimentales para los medios de cultivo

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Los medios se clasifican de acuerdo a la naturaleza de los componentes, en: 1) medios sintticos o tambin llamados medios qumicamente definidos y 2) medios complejos, en cuya composicin intervienen sustancias de origen animal y vegetal, como peptonas, extracto de levadura, macerado de maz, harina de soya, de pescado, de sangre, extracto de carne, entre otros, que aportan las sustancias fundamentales (macro y micronutrientes) (Ramrez y Pedroza, 2001). La formulacin del medio tiene que ver con los aspectos cuantitativos, estableciendo las concentraciones y cantidades de cada componente. Para promover el crecimiento celular son requeridos factores esenciales en los medios de cultivo como ciertos aminocidos y vitaminas (Ramrez y Pedroza, 2001). En el caso de la clula de levadura, para su desarrollo sta requiere de nutrientes como el nitrgeno (sales de amonio, sulfato de amonio y urea), fsforo (fosfato diamnico y cido fosfrico), magnesio (sales de magnesio), potasio, calcio, azufre, hidrocarburos y trazas de hierro, zinc, cobre, manganeso y molibdeno (Guilliermond, 1920; CNMA, 1998). En cuanto a las vitaminas son necesarias la biotina, inositol, cido pantotenoico y tiamina (Asenjo, 1995; CNMA, 1998). Para la fabricacin industrial de levadura de panadera las principales materias primas son el cultivo puro de levadura y la melaza de caa que constituye la principal fuente de carbono del medio de cultivo, debido a su alto contenido de azcares fermentables (45 a 55% en peso) en forma de sacarosa, glucosa y fructosa (CNMA, 1998). A nivel de laboratorio S. cerevisiae se cultiva en medios complejos que aportan a la clula los nutrientes necesarios para su crecimiento, entre los que se destacan YM, Goering y Van Soest y el de Pell y Pschofield. Sin embargo, la composicin de los medios de cultivo debe ser constantemente adaptada a los procesos de fermentacin (Ramrez y Pedroza, 2001).

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IV. MATERIALES Y METODOLOGA A. MATERIALES Y EQUIPOS Materiales Sacarosa Harina de soya fosfato de amonio Tiosulfato de sodio cido fosfrico cido ctrico Agua destilada Levaduras Fleshman

Equipo: Microscopio Cmara de Neubauer. Bioreactor Balanza analtica. Cocina.

Otros: Lmina cubreobjetos Jeringa de carga Baln Vaso de precipitacin

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B. METODOLOGA Procedimientos

Clculos En primer lugar se procedi hacer los clculos el medio de cultivo, tomando en cuenta las necesidades de la levadura Sacharomyces Cerevisae y teniendo en cuenta que la levadora se trat de calcular un medio lo ms natural posible. Preparacin del medio de cultivo (ver en Anexos) Se procedi a pesar los materiales necesarios en base a nuestros clculos, para la preparacin el medio de cultivo los cuales son los siguientes: 200g de sacarosa 100g de harina de soya 8.117g fosfato de amonio pentahidratado 8.96g Tiosulfato de sodio 469g cido fosfrico 800g agua destilada En un recipiente se combin los materiales, la harina de soya fue agregada poco apoco y paralelamente se fue removiendo con el fin de que no quedase ningn grumo por la harina de soya. Enseguida se procedi a medir los grados Brix del medio, el cual fue de 20 Brix y con un pH de 6.2, se ajust el pH con cido ctrico hasta que llegase a un pH de 5. Luego esta solucin se puso en un baln de vidrio con un corcho en la boca, el cual tena un pequeo orificio para el termmetro.

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Paralelamente en una olla se puso a calentar agua hasta que llegue a una temperatura de 50C. A esta temperatura de 50C recin se puso el baln conteniendo el medio de cultivo, y se sigui calentando hasta que la solucin dentro del baln llegase a 80 C y se conserv a esta temperatura por 15min con el fin de pasteurizar el medio de cultivo. Luego se dej enfriar el medio de cultivo hasta 30C. Activacin de las levaduras Se hizo una solucin de 20 brix, con el fin de activar la levadura en polvo. Se adiciono la levadura en polvo, se removi y se dej reposar por unos minutos. Despus de algunos minutos se not rpidamente el crecimiento y la

activacin de la levadura, puesto que la levadura la espuma que daba la levadura (CO2) rebos el vaso de precipitacin donde se estaba preparando el medio de cultivo. Luego se hizo un recuento en la cmara de neubauer, pero no se pudo contabilizar pues eran demasiadas. Motivo por lo cual se procedi a hacer una dilucin de 1/10 para que la concentracin llegara 107 levaduras/mL esto de acuerdo a las indicaciones del docente. Crecimiento de las levaduras en el birreactor Luego que se lleg a enfriar medio de cultivo a 30C recin se agreg las el 10% de levaduras en funcin al medio. En seguida se agreg esta solucin al birreactor, el cual estaba en constante agitacin. Seguidamente por un lapso de 2 horas se extrajo muestra cada 15

minutos. La primera muestra extrada con una jeringa fue vertida en la

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cmara de Neubauer sobre una laminilla y luego fue colocada en el microscopio Luego procedimos con un aumento de 40X se realiz el conteo respectivo de clulas Pasada ya las 2 horas las se iniciaron a extraer las muestras cada 30 minutos. Despus de unas horas el crecimiento de la poblacin aumento considerablemente por ello se consider realizar una dilucin 10 -1. Finalmente se procede a realizar la respectiva curva de crecimiento para la produccin de levadura.

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V.

RESULTADOS DETERMINACIN DE LA CURVA DE CRECIMIENTO DE LEVADURA Sacharomyces cerevisae , APLICANDO EL MODELO DE GOMPERTZ

TABLA 1. Datos de los nmeros de levaduras de Sacharomyces cerevisae, tomadas al azar MEDIDAS 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 79 132 16 17 16 25 25 22 25 24 27 27 41 40 42 NMEROS DE LEVADURAS AL AZAR 88 120 20 23 14 19 26 18 21 28 28 25 43 41 46 73 81 22 18 15 7 23 17 28 21 23 26 40 37 35 77 75 13 12 17 12 24 20 25 29 25 22 38 46 39 83 101 13 16 9 26 22 21 24 24 27 32 35 43 47 TOTAL 400 509 84 86 71 89 120 98 123 126 130 132 197 207 209 PROMEDIO VOLUMEN 80 101.8 16.8 17.2 14.2 17.8 24 19.6 24.6 25.2 26 26.4 39.4 41.4 41.8 0.000004 0.000004 0.000004 0.000004 0.000004 0.000004 0.000004 0.000004 0.000004 0.000004 0.000004 0.000004 0.000004 0.000004 0.000004 DILUCIN 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 MUESTRA ORIGINAL 20000000 25450000 42000000 43000000 35500000 44500000 60000000 49000000 61500000 63000000 65000000 66000000 98500000 103500000 104500000

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TABLA 2. Determinacin de los parmetros de crecimiento de levaduras Sacharomyces cerevisae del medio de cultivo.

MUESTRAS 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

TIEMPO (h) 0.166667 0.333333 0.500000 0.666667 0.833333 1.000000 1.166667 1.333333 1.500000 2.000000 2.500000 3.000000 3.500000 4.000000 4.500000

MUESTRA ORIGINAL N 20000000 25450000 42000000 43000000 35500000 44500000 60000000 49000000 61500000 63000000 65000000 66000000 98500000 103500000 104500000

LOG( N/N0)(UFC/g) 0 0.104657791 0.322219295 0.33243846 0.249198357 0.347330015 0.477121255 0.389166084 0.48784512 0.498310554 0.511883361 0.51851394 0.692406235 0.713910354 0.718086295

TABLA 3. Parmetros para clculo de grfica de Gompertz a b c mximo G

0.676447 0.706306 1.095409

0.74098544 -0.2681135 0.93543968

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Figura 4. Determinacin de la Curva de Crecimiento de la Sacharomyces cerevisae aplicando modelo de Gompertz

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0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0.0000000.5000001.0000001.5000002.0000002.5000003.0000003.5000004.0000004.5000005.000000 -0.1 Tiempo (horas) y = 0.2099ln(x) + 0.3749 R = 0.9256

Log( N/N0)(UFC/g)

Figura 5. Tiempo (horas) vs Log (UFC/g) en Sacharomyces cerevisae

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Segn Ventanas (2000); nos cuenta que el desarrollo de los microorganismos puede representarse mediante una grfica que corresponde a una funcin matemtica relativamente compleja. El estudio de estas funciones matemticas tiene gran inters desde el punto de vista microbiolgico, ya que puede servir para predecir el crecimiento de los microorganismos, y de este modo saber mediante un simple clculo matemtico, con un ordenador, la evolucin que tendran los microorganismo de inters en un producto determinado. De hecho, se est haciendo un considerable esfuerzo para disear y validar los modelos matemticos que permiten establecer el desarrollo microbiano y que son de gran valor a la hora de tomar decisiones respecto al diseo de instalaciones y procesos, adquisicin de equipos o caractersticas de los productos. Una de las frmulas ms ampliamente utilizadas es la ecuacin de Gompertz. As mismo; en la Figura 4 podemos observar los resultados arrojados por STATISTICA validados para el modelo de Gompertz; donde, el valor de a es igual a 0.676 nos indica el numero inicial de microorganismos viables. El valor de b nos indica una velocidad de crecimiento relativa de 0.706 en unidades de 1/horas a la velocidad mxima de crecimiento en las condiciones trabajadas. La diferencia entre el nmero inicial y el recuento mximo que se puede alcanzar en el medio est indicado por el valor c que es 1.095.

Segn

Hernndez (2008), nos dice que la curva de crecimiento de un

microorganismo representa el comportamiento de su crecimiento a travs del tiempo. Con base en ella, se determina cuando se produce la mayor cantidad de

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biomasa o de metabolitos (primarios o secundarios). Si hacemos un contraste entre la curva de la figura 1 obtenida en el software statistica 7; y la curva de crecimiento extrada de bibliografa (Figura 5); observamos que la fase de latencia que present la levadura no fue tan marcada, casi imperceptible, esto se debe a que la levadura presente en el inculo entr al biorreactor en una fase logartmica, esto porque se puso a la levadura en un medio con sustrato (azcar) y a la misma temperatura que se trabaj en el biorreactor para que vaya adaptndose antes de ser vertido en el reactor. En un proceso de obtencin de biomasa la fase de mayor importancia es la fase logartmica, pues de la velocidad de cmo se de sta dependen factores como el costo. En la figura 4 se aprecia que la mayor pendiente de la curva de crecimiento, es decir la mxima velocidad de crecimiento de la levadura Saccharomyces cerevisiae se da entre los tiempos de 0.5 y 1 horas, es decir el mayor crecimiento se dio entre los 30 min y 60min. Segn Scragg (1996), nos dice que la fase lag, es un tiempo de aparente no crecimiento, el cual se da en nuestro caso para la primera 0.5 hora, pero estudios bioqumicos demuestran actividad metablica, indicando que las clulas estn en proceso de adaptacin a las condiciones ambientales y que un nuevo crecimiento comenzar, eventualmente. Existe, luego, una fase de aceleracin transitoria cuando el inculo comienza a crecer que es seguida, rpidamente, por una fase de crecimiento exponencial, esta fase exponencial se aprecia a un tiempo de 4 horas aproximadamente, ya que luego comienza a decaer. Esta fase final del ciclo, es la fase de muerte, cuando la velocidad de crecimiento ha cesado. Y segn el mismo autor, la mayora de los procesos biotecnolgicos por lotes se detiene antes de esta fase, debido a la disminucin en el metabolismo y a la lisis celular.

Segn

Hidalgo (2003), nos recalca que los azcares fermentables por las

levaduras son la principal fuente de alimentacin carbonadas, especialmente la glucosa y la fructosa como azucares mayoritarios, sirviendo de base para la sntesis de los compuestos que necesitan, as como tambin de fuente de energa para atender sus funciones vitales como en el caso de la prctica que se le aadi

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soya que es un alimento con alto contenido de nitrgeno; adems de fsforo, azufre y amonio que se apoy de compuestos qumicos tales como el cido

sulfrico, fosfato de amonio y tiosulfato de sodio. As el autor nos dice que en medios muy pobre, con menos de 10 gramos/litro, la velocidad es muy lenta, acelerando hasta concentraciones de 20 gramos/ litros, donde a partir de este valor la velocidad se mantiene hasta los 200 gramos/ litro. Despus de esta cantidad la velocidad de fermentacin decrece a medida que la concentracin aumenta, cesando totalmente a partir de los 600 gramos/litro por la elevada presin osmtica presente en el medio. Esto se nota en la experimentacin ya que segn la curva de crecimiento, existe un punto en el cual el crecimiento aumenta la velocidad de crecimiento y otro punto en el cual este se detiene. Segn Doran (1998), nos afirma que una de las condiciones que se tiene que tener en cuenta en el biorreactor para el crecimiento de la biomasa es el aporte de oxgeno, y si analizamos lo que se dio en nuestra practica podemos decir que este fue continuo para ayudar al aporte de estas (levaduras) y para evitar la fermentacin y as conllevar a la produccin de alcohol y CO 2. El autor tambin expresa que este aporte de oxigeno adems de evitar la fermentacin, sirve para mantener las clulas uniformemente distribuidas en todo el volumen del cultivo a fin de prevenir la sedimentacin o la flotacin, mantener constante y homognea la temperatura.

Segn IICA (1989), la biomasa de microorganismos es una excelente fuente de nutrientes (protenas, grasa, vitaminas, minerales y otros factores). Por lo tanto, siempre ha existido un inters de incorporarla al sistema alimentario humano tanto en forma directa como indirecta (a travs de animales). Entre ellas, es la proveniente de levaduras la que posiblemente se ha estudiado con mayor profundidad. Por lo dicho se puede afirmar que no solo es un proceso previo a la fermentacin de un vino, cerveza o cualquier bebida alcohlica el hecho de poner en un biorreactor un inculo de levaduras con el fin de aumentar el nmero de clulas y hacer ms factible la fermentacin alcohlica; si no es un proceso que

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puede manejarse a nivel alimentario con el fin de obtener una fuente rica en protenas como lo son las levaduras, para ello se necesitara produccin de grandes cantidades de biomasa en cortos tiempos. Todo esto se podra llevar a cabo evaluando los mejores parmetros de temperatura, pH y nutrientes que necesitan las levaduras. VI. CONCLUSIONES

Se prepar un medio de cultiv basado en soja, azcar rubia y dems componentes y se manej adecuadamente la autoclave. Se confeccion la grfica de crecimiento de levadura Sacharomyces cerevisae mediante el modelo de Gompertz, obteniendo el modelo matemtico de y=0.2099Ln(x)+0.3749, con un R2 de 0.9256, un valor alto que se acerca a uno, lo cual nos indica un ndice de confianza aceptable. En las cuadros 1 y 2 se puede observar cmo va creciendo la levadura hasta llegar a un valor donde se tiende a hacerse constante, lo cual nos indica que ha llegado a su punto mximo de crecimiento.

Se conoci un poco ms acerca del mtodo de Gompertz en el crecimiento de levadura Sacharomyces cerevisae. Se identific sus fases, las cuales se pueden apreciar en la Figura 1. Curva de crecimiento microbiano, utilizando el mtodo de Gompertz, las cuales son:Fase Lag: Del Punto inicial hasta la interseccin del punto 0.0-0.1. Fase exponencial: Desde el segundo punto (0.0-0.1) hasta la lectura del punto 13. Fase Estacionaria: Desde el punto 13 hasta el punto 15 donde tiene una tendencia a mantenerse constante. Fase Muerte: No se determin dado que solo se obtuvo hasta Fase Estacionaria.

Se

calcul

el

tiempo

de

generacin

mediante

el

modelo:

y=0.2099Ln(x)+0.3749; donde Y= Log (N/No) X=tiempo.

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VII.

BIBLIOGRAFA

ASENJO A. (1995). Microbiologa de las fermentaciones industriales. (7 ed.). Zaragoza: Editorial Acribia. DORAN, P. (1998) .Principios De Ingeniera De los Bioprocesos. Edit.Acribia. S.A Zaragoza- Espaa. DUARTE P. (1998). Biotecnologa de la fermentacin, Primera Edicin, Editorial Acriba S.A., Zaragoza (Espaa). GOMEZ E. (2003), ASPECTOS BSICOS DE BIOTECNOLOGA. Instituto Tecnolgico y de Estudios Superiores de Occidente, A HERNNDEZ, A. (2008). Microbiologa Industrial. Hidalgo J. (2003) Tratado de etnologa Editoria: Mundi-Prensa Libros S.A., Mxico. IICA (1989). Oportunidades de las biotecnologas Agropecuarias en Amrica Central. Programa II; Generacin y Transferencia de Tecnologa. RAMREZ O. PEDROZA M. (2001). Evaluacin De Parmetros Cinticos Para La Sacharomyces Cerevisiae Utilizando Agua De Coco Como Sustrato, San Jos, Costa Rica. SANCHEZ A. (2003). Las biotecnologas: desafos y promesas Investigaciones Biolgicas. La Habana.. SCRAGG, A.(1996). Biotecnologa. Edit. El Manual Moderno. Mxico D.F. VENTANAS, J. (2000). Tecnologa del jamn Ibrico: Delos sistemas tradiciones a la explotacin racional del sabor y el aroma. Ediciones Mundi-Prensa. Madrid. Espaa.

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ANEXOS
ANEXO 01.Diseo de un medio de cultivo

Reaccin general A C12H22O11 +BO2 +C NH3 Donde:

Levadura

C3.72H6.11O1.95N0.61 +D CO2 +E H2O 90.5g 10g 100g (90%) (10%)

Si: 100g sacarosa 100g levadura 10,4 (NH3)102,6g (O2) Para el diseo de un medio se necesita de ciertos componentes tales como Macronutrientes (CHONPS) y Micronutrientes (P y S) teniendo Materiales. Harina de soya (100g) Fuente. P 0.61g Mg 0.27g S 0.42 Zn 0.5g Protena 43g Protena Sacarosa (azcar rubia) Fosfato de amonio Acido fosfrico Tiosulfato de sodio 200g 20Brix (NH3)4 PO4 163g/mol H3PO4 98g/mol Na2S2O3 164g/mol

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Requerimientos Macronutrientes Fosforo (P) Azufre (S) Amonio (NH3) Sacarosa Oxigeno Micronutrientes Zinc (Zn) Magnesio (Mg)

4g 4g 10.4g 200g 102.6g 5mg 5mg

Dnde: la harina de soya se completa los requerimientos de Zn (5mg), de P(faltara 3,39g), de Mg se completa , de S (falta 3,5g) y del NH3 ( faltara 2.g) Entonces calculamos para completar: NH3

Azufre

Fosforo gP Entonces nos faltara 3,39-1.905=1.485g P

Finalmente nuestras molculas para el medio de cultivo serian.

200g sacarosa 100g harina de soya 8.117g fosfato de amonio 8.96g tiosulfato de sodio 469g Buffer

800g H2O

El cual se encontrara en agitacin constante

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Figura 6. Materiales para el diseo del medio de cultivo

Figura 7. Harina de Soya para el medio de cultivo

Figura 8. Pesado de la Harina de Soya.

Figura 9. Pesado de los materiales

Figura 10. Preparacin del Medio de Cultivo

Figura 11. Medio de Cultivo

Figura 12. Medio de cultivo 2 Litros

Figura 13. Medicin de la temperatura del medio de cultivo

Figura 14. Medio de Cultivo en Coccin.

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Figura 13. Pesaje del Cultivo para la medicin de Levaduras

Figura 14. Medio de Cultivo

Figura 15. Materiales para el conteo de Levaduras Sacharomyces cerevisae

TUTORIAL MICROBIOLOGA PREDICTIVA GOMPERTZ

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UNT

Model is: YA=a*exp(-exp(b-c*TA))

OK , OK

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UNT

OK

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UNT

Summary: Parameter estimates

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