INTRUDUCCION

El espectrofotmetro constituye una herramienta fundamental en el laboratorio clnico. Ms del 90% de las determinaciones que se realizan en Qumica Clnica tienen como paso final la lectura de una absorbancia o una transmitancia. El correcto desempeo de los espectrofotmetros es entonces determinante, en ltima instancia, de la calidad analtica de los resultados que emite el laboratorio. El objetivo de esta gua consiste en que el bioqumico cuente con los materiales necesarios para la evaluacin del funcionamiento del espectrofotmetro, y de esta manera, pueda verificar si los parmetros fotomtricos se encuentran dentro de los rangos de aceptabilidad establecidos de acuerdo a las normativas internacionales. Se debern llevar registros que certifiquen dichos controles. Los estndares de calidad del instrumental debern cumplirse y por el contrario si algn parmetro estuviera fuera de rango, es conveniente realizar la reparacin del instrumento a travs de un servicio tcnico acreditado y luego volver a verificar el buen funcionamiento.

OBJETIVOS: Reforzar el aprendizaje del uso del espectrofotmetro. Realizar espectro de absorcin de sustancias puras: soluciones de azul de metileno. Realizar una curva de absorbancia vs concentracin. Determinar la concentracin de una muestra problema de azul de metileno.

PRACTICA N2

ESPECTROFOTOMETRIA

FUNDAMENTO: La espectrofotometra comprende una serie de tcnicas analticas usadas para anlisis cualitativo y cuantitativo. Una radiacin electromagntica se puede describir como un flujo de partculas llamadas fotones, o bien como una onda propagndose en el espacio. De esta ltima descripcin se toma el concepto de longitud de onda, definindolo como la distancia entre dos mximos consecutivos de la onda. Esta es inversamente proporcional a la energa de la misma, de tal manera que el espectro de radiaciones electromagnticas abarca un amplio rango de energas, las de menor energa son las ondas de radio y las de mayor energa son las llamadas radiacin gamma.

Las molculas tienen un estado energtico que se puede alterar por la absorcin de radiacin electromagntica a determinada longitud de onda, lo que se puede medir para realizar un estudio cualitativo o cuantitativo. Las principales ventajas de la espectrofotometra son: Sensibilidad relativa elevada. Facilidad para realizar mediciones rpidas. Grado de especificidad relativamente elevado. Para obtener la mxima sensibilidad en una determinacin debe conocerse la longitud de onda de mayor absorcin de la sustancia analizada, que no deber coincidir con una alta absorcin de otras sustancias presentes en la reaccin. Cuando una radiacin electromagntica de intensidad I atraviesa un medio homogneo, parte de la radiacin es absorbida por la muestra y otra parte es transmitida con una intensidad i, de tal manera que se define transmitancia de una muestra como la relacin entre la radiacin transmitida i versus la intensidad luminosa incidente I, multiplicado x 100: % T = i x 100 I La absorbancia es una medida de la cantidad de Energa luminosa incidente absorbida por una sustancia en solucin. Est relacionada con Transmitancia por medio de:

A = - Log T A = log (100 / %T) La Ley de Lambert y Beer expresa que la absorbancia de una solucin es directamente proporcional al camino recorrido por la radiacin electromagntica y a la concentracin de la solucin. A = abc A: absorbancia absortividad especfica de cada soluto distancia recorrida por el haz de luz en cm concentracin de la solucin La absortividad es la constante de proporcionalidad que nos permite igualar la ecuacin, sus unidades dependern de b y c, ya que la absorbancia no tiene unidades; si b est en centmetros y c en moles por

litro, la absortividad estar en litros / mol centmetro y se denomina coeficiente de absorcin molar (E). Requerimientos para poder aplicar la Ley: - La medicin del % de T es realizada con luz monocromtica - La medicin del % de T es realizada a una regin de absorcin del componente a estudiar. - La referencia es elegida de tal manera que C=0 cuando T= 100% o A= 0% - La naturaleza de la solucin debe ser tal que su transmisin responda a variaciones de C. Espectrofotmetro Los aparatos de medida de la absorcin de la radiacin electromagntica se denominan espectrofotmetros y pueden representarse de forma sencilla mediante el siguiente esquema:

La luz procedente de la fuente se hace pasar a travs del monocromador, que la desdobla en haces monocromticos. El colimador tiene una rendija de ajuste variable, y segn su abertura se obtiene luz de una determinada longitud de onda. La longitud de onda que se desee utilizar se selecciona variando la posicin del monocromador. La luz que sale del colimador se hace pasar por la solucin y luego incide sobre el fototubo, donde se detecta. La seal se enva a un registrador, el cual puede ser la escala de un galvanmetro calibrado.

Calibracin del espectrofotmetro Prender el equipo llevando la llave hacia arriba. Esperar 15 minutos para que los circuitos alcancen temperatura. Elegir la longitud de onda deseada con el selector. Verificar 0% de T. Se realiza en modo transmitancia y colocando un cuerpo negro en reemplazo del tubo Ajustar con el blanco el 0% de absorbancia trabajando con la tapa cerrada. Reemplazar el blanco de reactivos por la muestra a analizar y leer el valor correspondiente de absorbancia. Espectro de absorcin Consiste en un grfico que representa el % T o la Absorbancia en funcin de la Longitud de onda a la cual se realiza la medicin, para un amplio rango de longitudes de onda y para una misma concentracin c de la muestra. Permite determinar las longitudes de onda ptimas de absorcin y las concentraciones adecuadas de trabajo. Pasos para realizar un espectro de absorcin: Prender el equipo y dejar estabilizar. Seleccionar la longitud de onda. Ajustar 100 % T o 0 % A con el Blanco de reactivos. Reemplazar el blanco por la muestra y leer absorbancia. Seleccionar una nueva longitud de onda y repetir las operaciones. Graficar Absorbancia vs longitud de onda y seleccionar aquella donde la A sea mxima. Curva de calibracin Absorbancia vs Concentracin Permite determinar la concentracin de una muestra incgnita

Preparar unas muestras de concentracin conocida y creciente utilizando los mismos diluyentes y reactivos que se emplear en la preparacin de la muestra incgnita. Medir la absorbancia de estas muestras. Medir la absorbancia de la muestra problema. Graficar Absorbancia vs concentracin. Si la sustancia cumple con la Ley de Lambert y Beer el grfico ser una recta y ser posible sacar un factor ya que la pendiente de la recta ser la misma en todos los puntos. As se podr calcular la concentracin de la muestra problema. Si la sustancia no cumple la Ley, el grfico ser una curva y se extrapolar dentro de un rango apropiado para calcular el valor de la muestra problema. El azul de metileno es un compuesto qumico aromtico heterocclico con la frmula molecular C16H18N3SCl. Tiene muchos usos en una gama de diferentes campos, como la biologa y la qumica. A temperatura ambiente se presenta como un slido inodoro, polvo de color verde, oscuro, que produce una solucin de color azul cuando se disuelve en agua. La forma hidratada tiene 3 molculas de agua por molcula de azul de metileno. El azul de metileno no debe confundirse con el azul de metilo, otra histologa mancha, nuevo azul de metileno, ni con las violetas de metilo utilizados a menudo como indicadores de pH. La Denominacin Comn Internacional de azul de metileno es el cloruro de metiltioninio. El azul de metileno fue preparado por primera vez en 1876 por el qumico alemn Heinrich Caro.

MATERIALES: - Balanza Analtica - Pipetas - Fiola De 100ml - Propipeta - Beaker - Espectrofotmetro - Baguetas - Luna De Reloj - Probeta - Embudo De vidrio.

EXPERIMENTO N 1.- Espectro de absorcin de Azul de metileno: Para elaborar una curva de absorcin se prepara el siguiente sistema: A partir de una solucin de azul de metileno al 1% prepara una dilucin 1: 10.

Coloque un tubo de lectura 5ml aproximadamente de esta dilucin y leer la absorbancia y transmitancia de la solucin entre un rango de 400 a 600nm en intervalo de 50nm.note sus resultados.

Graficar utilizando papel milimetrado las densidades pticas en funcin de las longitudes de onda y determinar el pico d mxima absorcin del azul de metileno, el cual corresponde al mayor valor de la densidad ptica.

EXPERIMENTO N 2.- Preparacin de una curva de calibracin: Preparar un experimento de la siguiente manera: A partir de la solucin stock de azul metileno prepare una dilucin 1:10. Y prepare una batera de tubos como se indica en una tabla: Agite los tubos cuidadosamente y lea los tubos al punto mximo de absorcin hallado en el experimento N 2. Hallar la concentracin de la muestra problema. Graficar en un papel milimetrado los resultados, disponiendo las concentraciones en el eje de abscisas y las densidades pticas (D.O) en el eje de ordenadas, luego trazar una recta a travs de los puntos obtenidos experimentalmente.

CONCLUSIN: Se ha llegado a la conclusin de que la espectrofotometra es un mtodo analtico indirecto porque se basa en la medicin de la absorbancia o transmitancia de las radiaciones; es de gran utilidad en la actualidad para la identificacin de un analito en una muestra problema. La espectrofotometra es el mtodo ms usado, debido a que es sencillo, especfico y sensible.-