"Variacin morfomtrica y cdigo de barras de ADN del grupo Hericthys bartoni" Clave SIP 20121320 (mediano plazo) Hctor

Omar Meja Guerrero ENCB Resumen Los cclidos de la tribu Heroini (incluyendo al gnero Herichthys) han experimentado una larga y problemtica historia nomenclatural y taxonmica. Estudios moleculares recientes han permitido recuperar el gnero Herichthys como un grupo monofiltico que incluye dos grandes grupos: el grupo de especies asociadas a Herichthys cyanogutattus (H. cyanogutattus, H. deppii, H. minckleyi, H. carpintis y H. tamasopoensis) y el grupo de especies asociadas a Herichthys bartoni (H. bartoni, H. labridens, H. steindachneri y H. pantostictus). En este sentido llama la atencin que los diferentes haplotipos de H. labridens son recuperados como polifilticos, lo cual sugiere la existencia de un complejo de especies. Debido a la gran diversidad morfolgica que presenta el grupo de especies asociadas a H. bartoni ha sido difcil tener una clara definicin del nmero de especies y las relaciones filogenticas que guardan entre s. Adems la presencia de simpatra sugiere la posible formacin de hbridos como se ha documentado en otras especies de cclidos. Por estas razones, en este trabajo se abord el estudio de este complejo de especies a travs de un anlisis de morfometra geomtrica y de cdigo de barras de ADN para determinar el nmero real de especies que lo componen.

Introduccin Los ambientes acuticos pueden exhibir una gran variabilidad espacial o temporal en parmetros biticos y abiticos del sistema, razn por la cual muchas especies de peces pueden exhibir diferencias morfolgicas muy marcadas entre hbitats contrastantes (Langerhans et al., 2003). En particular, los cclidos son conocidos por su espectacular radiacin adaptativa y alta plasticidad fenotpica, lo cual los convierte en excelentes modelos en estudios ecolgicos y evolutivos. (Klingenberg et al. 2003). No obstante, tal nivel de variacin se traduce en una taxonoma muy inestable, la cual se ha caracterizado en los ltimos aos por cambios nomenclaturales en muchos grupos y por una definicin imprecisa de los lmites que existen entre las especies. En virtud de lo anterior, en los aos recientes se han propuesto distintas alternativas para tratar con los problemas antes mencionados, una de naturaleza gentica (Cdigo de barras de ADN) y una que evala la variacin morfolgica tradicional desde una perspectiva diferente (Morfometra Geomtrica).

El cdigo de barras de ADN est basado en la premisa de que una secuencia corta estandarizada puede distinguir individuos de una misma especie en base a que la variacin interespecfica sobrepasa la variacin intraespecfica (Hebert et al., 2003). Estudios pilotos desarrollados en distintos grupos como hormigas, murcilagos, aves, mariposas, crustceos, araas y peces han permitido certificar la efectividad de esta aproximacin. De esta manera, protocolos de cdigo de barras de ADN se han implementado en otros grupos

como plantas, macroalgas, hongos, protistas y bacterias (Hajibabaei et al., 2007). Los cdigos de barra de ADN estn compuestos esencialmente de secuencias cortas de ADN de algunos individuos de un gran nmero de especies. En el caso particular de los animales esta regin corresponde al extremo 5 de la subunidad I del Citocromo c oxidasa (COI) del DNA mitocondrial (aproximadamente 650 pb) (Ward et al. 2005).

Tradicionalmente la morfometra fue la aplicacin de mtodos estadsticos multivariados a variables cuantitativas de longitud, amplitud y altura. El mayor problema con estas aproximaciones es que las distancias lineales estn estrechamente correlacionadas con el tamao (lo que trajo como consecuencia el desarrollo de mtodos de correccin) (Adams et al. 2004). No obstante, los distintos mtodos de correccin arrojan diferentes resultados, adems de que es difcil determinar la homologa entre distancias lineales, ya que muchas distancias (la amplitud mxima por ejemplo) no estn definidas por puntos homlogos. Adems, el mismo conjunto de medidas de distancia puede obtenerse a partir de dos formas completamente distintas, ya que la localizacin de las distancias entre s no se incluyen en el conjunto de datos (Adams et al. 2004). Por lo anterior, los investigadores se abocaron al desarrollo de tcnicas que permitieran describir la forma sin todos los inconvenientes antes mencionados, una aproximacin llamada morfometra geomtrica (Bookstein, 1991; Adams et al. 2004). Esta aproximacin parte de la obtencin de variables biolgicamente definibles en dos o tres dimensiones llamadas landmarks. El anlisis directo de

estas variables sera inadecuado ya que los efectos de la variacin en la posicin, orientacin, y escala de los especmenes est presente. Por tanto, la variacin no atribuida a la forma debe ser removida antes del anlisis de dichas variables. Una vez removida esta variacin, las variables se convierten en descriptores de la forma que pueden ser utilizados para realizar anlisis estadsticos entre muestras diferentes (Adams et al. 2004). Para ello, los especmenes se escalan al centroide de la figura (el cual es una medida de la extensin de las seales alrededor de su centro de gravedad), posteriormente las configuraciones escaladas se sobreponen para tener el centro de la figura en campo comn (girando al ajuste ptimo segn el criterio de los mnimos cuadrados y proyectando una tangente lineal sobre la figura) (Klingenberg et al. 2003). Finalmente, se utiliza el mtodo de la placa delgada (thin plate analysis) para trazar la deformacin de un objeto a otro (Bookstein 1991). Las diferencias en la forma se pueden describir en trminos de las deformaciones en las rejillas que presentan los objetos, de tal forma que los parmetros que describen estas deformaciones sern utilizadas para determinar las posibles diferencias en la forma a travs de estadsticos multivariados (Adams et al. 2004). Objetivo El objetivo general de este proyecto es analizar la variacin morfomtrica y realizar un anlisis filogentico de un fragmento de la subunidad I de la Citocromo oxidasa mitocondrial (DNA barcode) de las especies contenidas en el grupo Herichthys bartoni.

Metas cumplidas El presente trabajo fue programado para realizarse en dos etapas anuales. Como parte del proyecto se planificaron 4 metas particulares, identificacin del material biolgico, amplificacin de un fragmento de aproximadamente 650 pb del gen COI mitocondrial, marcaje de puntos anatmicos de referencia (landmarks) en los ejemplares y anlisis de los datos generados. En el primer ao del proyecto se concretaron las metas 1 y 2 al 100%, mientras que las metas 3 y 4 fueron cumplidas al 100% en este perodo, incluyendo la titulacin de la alumna de maestra Yatzil Len Romero y la publicacin de dos artculos en revistas de circulacin internacional ISI. Materiales y Mtodo Los ejemplares analizados en este estudio fueron colectados en 28 localidades del complejo Pnuco- Tames (Perodo 2009- 2011) con ayuda de un equipo de electropesca; los individuos fueron preservados en alcohol al 70%, identificados a partir de los caracteres diagnsticos descritos por Taylor y Miller (1983) y depositados en la Coleccin Nacional de Peces Dulceacucolas Mexicanos de la Escuela Nacional de Ciencias Biolgicas. Adems, se aadieron 27 localidades del mismo complejo con ejemplares de colectas anteriores al ao 2009 preservados en formol, esto con la finalidad de tener bien representada el rea de distribucin y el espectro de variacin morfolgica del grupo. El tamao total de la muestra analizada para el estudio de morfometra geomtrica consisti de 543 ejemplares, de los cuales 328 estuvieron preservados en formol y 215 en alcohol al 70 %.

Cdigo de barras de ADN Para la generacin del cdigo de barras de ADN se extrajo tejido muscular de la parte lateral derecha de los ejemplares fijados en alcohol. A los ejemplares fijados en formol no se les tomo muestra de tejido muscular, ya que este mtodo de preservacin provoca la degradacin del ADN. Este proceso fue realizado para un subconjunto de 63 de los 215 ejemplares preservados en alcohol procurando tener muestras de toda la distribucin geogrfica del taxn. Se emplearon muestras de tejido de H. pantostictus (19 ejemplares), H. steindachneri (10 ejemplares), H. bartoni (6 ejemplares) y H. labridens (28 ejemplares). Se amplific un fragmento de aproximadamente 650 pb de la Citocromo oxidasa I mitocondrial con los iniciadores F1 y R1 diseados por Ward et al. (2005). Los productos de amplificacin fueron secuenciados en ambos sentidos y estas secuencias fueron utilizadas para generar una secuencia consenso. Las secuencias generadas fueron utilizadas para construir una filogenia por medio de un anlisis de parsimonia en el programa TNT (Goloboff et al. 2008) y por medio de mtodos bayesianos en el programa Mr. Bayes 3.0b4 (Ronquist y Hulsenbeck 2003) utilizando como grupos externos dos especies del gnero Paraneeotroplus (P. fenestratus y P. maculicauda) y una del gnero Theraps (T. intermedius). Anlisis de la variacin morfolgica por mtodos de morfometra geomtrica Cada ejemplar de las localidades analizadas fue medido en su longitud patrn y fotografiado por la vista lateral izquierda con una cmara fotogrfica con resolucin de 3 Megapixeles. Para minimizar el error de digitalizacin de los

landmarks cada ejemplar fue sealado con alfileres entomolgicos destacando los puntos que no pudieran distinguirse con facilidad en la imagen. Las fotografas fueron digitalizadas en el programa tpsdig Rohlf (2004) en donde se marcaron 25 landmarks para el cuerpo y 15 landmarks para la cabeza segn lo sugerido por Trapani (2003) y Genner (2007). Los datos fueron divididos en subgrupos de acuerdo con los grupos genticos resultantes del anlisis filogentico (Len-Romero et al. 2012). Cada conjunto de datos fue corregido para eliminar el efecto alomtrico asociado al crecimiento por medio de un anlisis de regresin multivariada de forma (utilizando como variable dependiente las coordenadas Procrustes y como variable independiente el tamao del centroide). Las distancias Procrustes resultantes fueron utilizadas como un descriptor del nivel de diferencia en la forma del cuerpo y la cabeza entre los grupos, en donde la significancia en las distancias obtenidas fue evaluada a travs de una prueba de permutacin con 10,000 rplicas (Elmer et al. 2010). Finalmente, los residuales obtenidos fueron utilizados en un anlisis de variables cannicas y de funcin discriminante en el programa MorphoJ 1.03C (Klingenberg 2011). Resultados El anlisis de morfometra geomtrica considerando las cuatro especies del grupo no permiti la definicin de grupos discretos (datos no mostrados). A pesar de lo anterior, el anlisis filogentico permiti recuperar la existencia de tres grupos genticos bien soportados. El grupo I est conformado por todos los

haplotipos de H. bartoni y algunos haplotipos de H. labridens, el grupo II por los haplotipos de H. steindachneri y finalmente el grupo III por los haplotipos de H. pantostictus y el resto de los haplotipos de H. labridens (Len-Romero et al. 2012), de tal forma que los datos morfomtricos fueron comparados al interior de cada grupo. Grupo gentico I El anlisis de funcin discriminante permiti definir que entre los individuos identificados como H. bartoni y H. labridens existen diferencias significativas entre la forma de la cabeza y el cuerpo.

Grupo gentico II En virtud de que este grupo gentico est constituido exclusivamente por ejemplares de H. steindachneri de diferentes localidades y tomando en consideracin que el anlisis filogentico soporto la monofilia de los diferentes haplotipos no fue realizado ningn anlisis adicional. Grupo gentico III El anlisis de funcin discriminante permiti definir que entre los individuos identificados como H. pantostictus y H. labridens existen diferencias significativas en la forma del cuerpo pero no as en la forma de la cabeza.

Comparacin entre las poblaciones de H. labridens de los grupos I y III Como se menciono anteriormente, los diferentes haplotipos de H. labridens fueron recuperados como polifilticos. En el caso particular del grupo de los cclidos es muy comn el desarrollo de convergencias o paralelismos evolutivos, es decir, el desarrollo de morfologas similares a partir de bases genticas diferentes (Salzburger 2009). La determinacin en taxonmica en este y grupo est

fundamentada

principalmente

caracteres

morfomtricos

mersticos

extremadamente plsticos, es por ello que todos los individuos de H. labridens han sido considerados como parte de una misma especie a pesar de la amplia distribucin y variacin en la coloracin que presentan. En este estudio se encontr que los individuos de H. labridens pertenecientes a los grupos genticos I y III muestran pequeas diferencias en la forma de la cabeza y del cuerpo, lo cual aunado a los resultados derivados del anlisis filogentico y a los resultados del anlisis de endemicidad que indican la presencia de dos reas de endemismo bien definidas en esta regin del Ro Pnuco (Len-Romero et al. 2012) permiten establecer que los individuos actualmente reconocidos como H. labridens constituyen en realidad dos especies diferentes, H. labridens especie restringida a la laguna de la media luna y a la cuenca del ro verde y una nueva especie que presenta una distribucin ms amplia aunque aloptrica con H. labridens que est siendo descrita.

Conclusiones La reconstruccin filogentica permiti recuperar tres grupos genticos bien soportados, lo cual se traduce en que slo H. steindachneri sea recuperada como un grupo monofiltico, H. labridens es recuperada como un grupo polifiltico y H. bartoni y H. pantostictus son recuperadas como grupos parafilticos.

El anlisis de morfometra geomtrica indica que en el grupo gentico I se reconocen dos formas del cuerpo, una perteneciente a H. bartoni y otra correspondiente a H. labridens, en tanto que no existen diferencias en lo que a la forma de la cabeza se refiere. En el grupo gentico II slo se recupera una forma del cuerpo, aunque en lo que se refiere a la forma de la cabeza cada localidad presenta una forma nica. En el grupo gentico IIl los ejemplares identificados como H. labridens y H. pantostictus presentan la misma forma, con excepcin de una localidad del estado de Hidalgo identificado como H. labridens que posee una forma nica.

Los morfotipos reconocidos en H. labridens corresponden a dos linajes distintos que evolucionaron de manera independiente a partir de ancestros hipotticos diferentes, producto probablemente de presiones selectivas

similares en ambos ambientes Literatura citada Adams D, J. Rohlf J y D. D. Slice. 2004. Geometric morphometrics: ten years of progress following the revolution. Italian Journal of Zoology 71: 5-16. Bookstein F. 1991. Thin-Plate Splines and the Atlas Problem for Biomedical Images. Processing in Medical Imaging. 511: 326-342. Elmer KR, Lehtonen TK, Kautt AF, Harrod C, Meyer A. 2010. Rapid sympatric ecological differentiation of crater lake cichlid fishes within historic times. BMC Biology 8: 60. Genner M., P Nichols, G. Carvalho, R. Robinson, P. Shaw y G. Turner. 2007. Reproductive isolation among deep-water cichlid fishes of Lake Malawi differing in monochromatic male breeding dress. Molecular Ecology 16,: 651662.

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