A Dupla Hlice

Glaucius Oliva

Centro de Biotecnologia Molecular Estrutural Instituto de Fsica de So Carlos Universidade de So Paulo

Onde, O Que e Como aconteceu ...

Cavendish Laboratory, Cambridge University, UK Department of Classical Physics, Biophysics Unit, Kings College, London Cal-Tech, Pasadena, USA Talvez a maior descoberta da histria da Biologia

A Dupla Hlice do DNA

Como aconteceu... Uma novela envolvendo Francis Crick, James Watson, Maurice Wilkins, Rosalind Franklin, Linus Pauling e outros mais.

Os atores ...

Li nus Paul i ng

Marcos Histricos
1868 Friedrich Miescher purifica nova substancia no material nuclear de clulas, chamada de nuclena 1889 Richard Altmann isola o componente noproteico da nucleina e chama de cido nucleico 1895 Albrecht Kossel descobre que a nuclena continha purinas e pirimidinas 1909 Phoebus Lavene descobre D-ribose na nucleina 1929 mesmo autor descobre 2-deoxi-D-ribose

 1943 Erwin Schrdinger apresenta o conceito de Genes como os componentes chave das clulas vivas De acordo com os paradigmas da poca, assume que os genes seriam uma classe especial de proteinas

Marcos Histricos ...

=>

1944 Oswald Avery : o DNA o portador da informao gentica

transforma cepas de pneumococos no-virulentos em virulentos pela transferncia de DNA.

1949 Erwin Chargaff

1. 2. 3. 4. A composio de bases do DNA varia entre as espcie Amostras de DNA isoladas de diferentes tecidos da mesma espcie tem a mesma composicao de bases A composio de bases do DNA numa dada espcie no muda com a idade do organismo, estado nutricional ou mudanas ambientais Em TODOS os DNAs celulares, no importa qual a espcie, o nmero de bases Adenina=Timina (A=T) e no. de Guanina=Citosina (G=C).

O incio da saga ...

1944/5 Maurice Wilkins, ento no Projeto Manhattan em Berkeley/USA, l o livro de Schrdinger, se interessa pelo tema, depois l os papers de Avery e assume que o DNA era o trasmissor da hereditariedade 1947 vai p/ Londres trabalhar com John Randall na rcem-criada Unidade de Biofsica do Kings College e escolhe DNA como tema 1950 Recebe uma pequena quantidade de DNA muito puro de Rudolph Signer, um bioqumico suio. Realiza os primeiros experimentos de difrao com Fibras de DNA

Luz visvel utilizada na descrio visual da natureza

Microscpio ptico

Com o microscpio tico foi possvel elucidar a estrutura celular dos organismos vivos

Dualidade Onda-Partcula: Einstein:

E = h
Raios-X

de Broglie: Eltrons

h p=

Microscpios Eletrnicos (de transmisso e varredura) permitiram visualizar as estruturas subcelulares os virus

Biologia Moderna = Biologia Molecular

Todos os eventos associados Vida ocorrem a nvel molecular

Funo Biolgica

Estrutura Macromolecular

Raios-X

Difrao: o experimento do lago

detetor

! (r )

T.F.

! ! ! ! 2i S r G( S ) = (r ) e dV
onda total espalhada

densidade eletrnica

Porque utiliza-se raios-X ? o exemplo dos barcos

Como medir a separao d entre dois barcos na gua, se estamos distantes?

Provocando ondas na gua, com comprimento de onda

>> d

d
Em molculas, a distncia entre tomos da ordem de 1 a 2, portanto utiliza-se radiao eletromagntica com comprimento de onda desta magnitude, ou seja, RAIOS-X

Raios-X em Tubos Selados

(o estado da arte poca dos fatos, 1950)

O incio da saga ...

1950 Maurice Wilkins, que no tinha experincia em cristalografia, realiza os primeiros experimentos de difrao com Fibras de DNA Jan-1951 Rosalind Franklin, cristalgrafa, contratada como ps-doc por Randall para trabalhar no grupo do Kings College => problemas

Difrao de Raios-X por Fibra de DNA

(fotos obtidas por Wilkins, Gosling e Stokes Kings College)

DNA tipo A
(desidratado e quase-cristalino)

Do outro lado do Atlntico...

1951 - Linus Pauling, do CalTech, props em a estrutura em hlice alfa para as proteinas Utilizou poucos dados experimentais (difrao de fios de cabelo) e MUITO bom-senso qumico com o uso de modelos moleculares

Pauling tambm estava trabalhando com a estrutura do DNA, inicialmente sem dados experimentais.

E Francis Crick, onde estava?

Crick , fsico formado em Londres, era estudante de doutorado no Cavendish Laboratory, trabalhando na estrutura cristalina da hemoglobina Em 1951, com 35 anos, ainda fazia seu doutorado. Brilhante, tinha excepcional manejo terico da cristalografia. Frequentemente divergia seu foco de trabalho sobre outros temas de outros estudantes/pesquisadores do Cavendish. Orientado por Max Perutz, tinha problemas com Sir Lawrence Bragg

James Watson, o polmico catalisador...

Watson, bilogo americano, interessou-se pelo tema da gentica durante a graduao(Univ. Chicago), ao ler o livro de Schrdinger Doutorou-se em 1949 (Univ. Purdue), trabalhando com fagos. Muito inteligente, nem um pouco chegado ao hardwork, conseguiu uma bolsa para estudar bioqumica de cidos nucleicos em Copenhagen, onde chega em meados de 1950. Em Abril/1951, com 23 anos, vai para Npoles acompanhando seu supervisor, para estgio em Instituto de Biologia Marinha Por acaso, assiste a palestra de Wilkins em um congresso de Estrutura de Macromoleculas, que acontecia em Npoles. Retorna a Copenhagen, ouve sobre a descoberta da hlice-alfa por Pauling, interessa-se pela tcnica de Cristalografia de Proteinas No Outono de 1951 j estava no Cavendish, inicialmente para trabalhar com mioglobina sob a superviso de John Kendrew. Conhece Crick e em poucos dias j esto cpmversando sobre hereditariedade, e gentica.

A Histria ...
Longas conversas com Crick sobre a possivel estrutura helicoidal para o DNA Com autorizao informal de Bragg, comeam a trabalhar na busca de uma estrutura para o DNA, usando o mtodo de Pauling de construo de modelos. O problema inicial decidir sobre o nmero de fitas na hlice e quas grupos estariam para o lado de dentro da hlice Wilkins havia dito a Francis que o diametro da hlice deveria acomodar mais de uma fita

A fita de DNA

Os graus de liberdade de rotao no modelo

A primeira tentativa... Uma tripla hlice, com os fosfatos voltados para dentro
Crick faz clculo terico fundamental sobre a difrao de hlices, inspirado em manuscrito preliminar de V. Vand Watson vai assistir a seminrio de Rosalind Franklin no Kings College como olheiro... No anota nada, e ao tentar relembrar dados de memria, erra por uma ordem de magnitude a quantidade de gua presente nas fibras de DNA de Franklin Com base nesta informao, decidem por uma tripla hlice Para obter a regularidade requerida por uma hlice, colocam os fosfatos para o interior Utilizam ions Mg++ para compensar as cargas negativas dos fosfatos no interior da hlice

Modelo com fosfatos no interior da hlice

Tripla hlice, com os fosfatos voltados para dentro ... Um fiasco

Em Dez/1951 O grupo do Kings chamado para ver o modelo de tripla hlice em Cambridge Rosalind Franklin imediatamente identifica erros: o empacotamento no compativel com a quantidade de gua nas fibras por ela obtida Ions Mg++ preferem molculas de gua como coordenantes. Informam Randall, reclama com Bragg, que proibe Crick de continuar no tema Modelos moleculares so mandados p/ o Kings College Crick volta para sua hemoglobina e Watson comea a trabalhar com Virus do Mosaico do Tabaco (TMV) Pelos prximos 9 meses nada acontece em Cambridge em relao a DNA

A arrancada final...
Em Setembro/1952 Peter Pauling vai para Cambridge fazer doutorado com John Kendrew e passa a ser assediado por Watson com perguntas sobre se Linus tinha resultados com a estrutura do DNA Dezembro/1952 Linus Pauling manda carta p/ Peter Pauling dizendo que tinha um modelo para o DNA

Fevereiro de 1953 ... quando tudo aconteceu

Em Fev/1953 chega o manuscrito do paper de Linus Pauling sobre seu modelo para o DNA: uma tripla hlice com os fosfatos no interior!!! Para acertar as cargas faz os fosfatos protonados no interior, no percebendo que isto remove o caracter cido do DNA Este erro primrio de Pauling estimula Watson e Crick a retomar o tema com vigor. Watson vai ao Kings contar do paper de Linus Pauling. V, pela primeira vez, a foto do B-DNA !!! Wilkins conta que Rosalind acha que as bases esto para dentro

Difrao de Raios-X por Fibra de DNA

(fotos obtidas por Rosalind Franklin Kings College)

DNA tipo B
(hidratado e pouco cristalino)

A foto com um X a assinatura de estruturas em hlices As reflexes do X indicam que a periodicidade da hlice ~34 A reflexo axial indica dimetro da hlice da ordem de 20

Fevereiro de 1953 ... quando tudo aconteceu

Watson conta do B-DNA para Bragg que autoriza retomarem o tema Por 10 dias ainda tentam modelo com fosfatos para o interior com os parmetros do B-DNA Resolvem tentar com o backbone para fora. fcil fazer um modelo do corrimo em dupla fita para o exterior da hlice Baseados na forma tautomrica errada das bases propem um modelo com as bases iguais fazendo pares. Jerry Donohue, um cristalgrafo de molculas pequenas, excelente em qumica orgnica, imediatamente identifica o erro

No final do ms de fevereiro ...

No dia 28 de Fevereiro Watson faz modelos das bases em carto, agora na forma tautomrica correta Apenas brincando com os cartes, na tentativa de identificar possiveis modos de interao, percebe que os pares A-T e C-G formavam ligaes de hidrognio, resultando em pares de dimenses quase identicas Imediatamente percebe que este tipo de pareamento satisfaz as regras de Chargaff sobre as propores de A=T e C=G nas clulas. Imediatamente percebe que poderia explicar o mecanismo de replicao das fitas.

No dia 28/2/1953 ...

Quando Crick chega, percebe eixo de ordem-2 relacionando as ligaes Conclue que as fitas deveriam ser anti-paralelas

 Mais alguns dias e eles tinham o modelo completo

 O modelo explica perfeitamente o mecanismo de duplicao da molcula de DNA

Maro de 1953... A notcia se espalha

O grupo do Kings College vai a Cambridge ver o modelo Rosalind ento mostra todos os seus dados cristalogrficos que inquestionavelmente mostram que o backbone deveria estar para fora Linus Pauling visita Cambridge e aprova o modelo Em 2/Abril/1953 mandam o paper para a revista Nature

Os Premios Nobel de 1962

MEDICINA The prize was awarded jointly to: FRANCIS HARRY COMPTON CRICK , JAMES DEWEY WATSON and MAURICE HUGH FREDERICK WILKINS for their discoveries concerning the molecular structure of nuclear acids and its significance for information transfer in living material. QUMICA The prize was divided equally between: MAX FERDINAND PERUTZ and SIR JOHN COWDERY KENDREW for their studies of the structures of globular proteins

Os Premios Nobel de Linus Pauling

1954 Nobel Laureate in Chemistry for his research into the nature of the chemical bond and its application to the elucidation of the structure ofcomplex substances. 1962 Nobel Laureate in Peace Campaigner especially for an end to nuclear weapons tests.

O Fluxo da Informao Gentica

O Cdigo Gentico