Chapter: IPPIA

AISLAMIENTO DE BACTERIAS LACTICAS CON ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA EN ALIMENTOS REGIONALES

Silvia Chai
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Ctedra de Bioqumica de los alimentos. Facultad de Ingeniera Universidad Nacional de Jujuy-Argentina. Martiarena esq. Italia San Salvador de Jujuy 4600 silrech@hotmail.com

Patricia Castellano1, Mara Gimenez 2, Manuel Lobo 3, Norma Samman 4 Resumen Metaboltos producidos por bacterias lcticas (BAL) son utilizados como bioconservantes y
para mejorar el valor nutricional de alimentos. El objetivo del trabajo fue aislar BAL, de alimentos de la regin andina de Jujuy, productoras de compuestos bioactivos. Las sustancias antimicrobianas producidas por microorganismos Gram (+), catalasa (-) aislados de una gran variedad de alimentos crnicos, lcteos y vegetales regionales, fueron testeadas frente a Listeria inocua, Clostridium perfringens y Lactobacillus plantarum CRL 691 mediante pruebas de difusin en agar. De 91 alimentos muestreados se aislaron 123 colonias de las cuales 7 presentaron propiedades antagnicas. stas provenan de acelga, espinaca; queso de cabra y carne y salame de llama. Se estudi la forma de aplicacin, concentracin del inculo y viabilidad de las bacterias productoras, en carne de llama fresca picada y papas andinas con cscara, precocidas y envasadas al vacio. Las cepas autctonas aisladas podran emplearse como conservantes naturales de alimentos. Palabras claves: bacterias lcticas, bioconservantes, regin andina

Abstrac Metabolites produced by lactic acid bacteria (LAB) are used as biopreservatives and in order
to improve the nutritional value of food. The objective was to isolate BAL from food of the Andean region of Jujuy, producer of bioactive compounds. The antimicrobial substances produced by Gram (+), catalase (-) isolated from a variety of regional meat, dairy and vegetables foods were tested against Listeria innocua, Clostridium perfringens and Lactobacillus plantarum CRL 691, by agar diffusion tests. From 91 sampled food, 123 colonies were isolated, 7 of them showed antagonistic properties. They came from chard, spinach, goat cheese and meat and salami of Llama. It was studied the form of application, inoculums concentration and the viability of producing bacteria in fresh minced llama meat and Andean potatoes with shell, precooked and vacuum packed. Autochthonous strains isolated could be used as natural food preservatives.

Index Terms Andean region, biopreservation, lactic acid bacteria

1 2

Patricia Castellano, CERELA. CONICET. Chacabuco 145 Tucumn Argentina Mara Gimenez, Ctedra de Bioqumica de los Alimentos. Facultad de Ingeniera. Universidad Nacional de Jujuy. malejandragimenez@hotmail.com 3 Manuel Lobo. Ctedra de Bioqumica de los Alimentos. Facultad de Ingeniera. Universidad Nacional de Jujuy. mlobo@fi.unju.edu.ar 4 Norma Samman, Ctedra de Bioqumica de los Alimentos. Facultad de Ingenieria. Universidad Nacional de Jujuy. nsamman@fi.unju.edu.ar

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INTRODUCCIN
La biopreservacin es un mtodo de conservacin usado para ampliar el tiempo de vida til de los alimentos y asegurar la inocuidad de los mismos a travs de la incorporacin de microorganismos y/o sus metaboltos [24]-[23]-[8]-[14]-[21]-[25]-[26]. Las bacterias lcticas son los microorganismos ms usados en la biopreservacin de alimentos. Se encuentran en mucosas de seres humanos y animales, en alimentos y otras plantas [20]. Son consideradas GRAS (Generally regarded as safe) por la FDA (Food and Drug Administration) [21]. Han sido empleadas durante milenios para la elaboracin de producto fermentados, otorgndoles sabor y textura caractersticos, adems de mejorar su valor nutritivo [10]-[8]. Dentro del grupo de bacterias lcticas los gneros productores de antimicrobianos son Lactococcus, Streptococcus, Lactobacillus, Leuconostoc,

Bifidobacterias y Pediococcus [18], adems de Enterococcus [13]-[7]. Otro gnero fuera de este grupo como Bacillus [19], tambin produce bacteriocinas. Los productos metablicos de las BAL son cido lctico, diacetil, acetoina, y en especial inhibidores proteicos llamados bacteriocinas [17]-[23], capaces de controlar patgenos y microorganismos causantes de deterioro [10]. Las bacteriocinas son pptidos antimicrobianos que no influyen o tienen poca influencia en la flora intestinal pues son inactivadas por las proteasas digestivas, son tolerantes a ph y calor y tienen un amplio espectro antimicrobiano. Por esto pueden contribuir a reducir el uso de conservantes qumicos y el tiempo o la intensidad de calor en los tratamientos [10]. Los efectos bactericidas son ejercidos contra la mayora de las bacterias Gram (+) y algunas Gram (-). Entre las cepas (Gram +) patgenas reportadas, se encuentran Staphilococcus aureus, Listeria monocytogenes, Clostridium perfringens, Bacillus cereus y entre las Gram (-) E coli y Salmonella [2]. Tambin tienen efecto contra microorganismos causantes de deterioro como Pseudomonas frugi, [19]-[10]-[17]. Estudios anteriores ensayaron el agregado de cepas productoras de antimicrobianos a sistemas de alimentos vegetales en base a zucchini , [11], porotos [4], productos crnicos, salchichas cocidas [16] y hamburguesas [5]. La aplicacin de bacteriocinas a los alimentos se realiza agregando la bacteriocina purificada o semipurificada obtenidas a partir del cultivo agregando la cepas productoras
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Chapter: IPPIA y favoreciendo la produccin de la bacteriocina [10], tambin se menciona la formacin de un fermento para agregar al alimento [23]. El mtodo que ofrece mayores ventajas es el que agrega la cepa productora, costo y aspectos jurdicos se minimizan [10]. En la metodologa a seguir en el agregado de bacteriocinas purificadas, deben tenerse en cuenta los factores que intervienen en su accin [1]. Cuando la bacteriocina es agregada al sistema alimentario puede precipitar, interactuar con los componentes del alimento y hasta inactivarse [10]. Las bacterias lcticas pueden producir bacteriocinas aun en condiciones desfavorables para la fermentacin [6], en condiciones de refrigeracin por ejemplo. En este caso se conseguira biopreservar alimentos sin modificar las propiedades fisicoqumicas y organolpticas del mismo [10]. Este trabajo tiene como objetivo aislar bacterias cido lcticas productoras de antimicrobianos para ensayar la produccin de bacteriocinas en alimentos autctonos de la regin andina de la provincia de Jujuy.

MATERIALES Y METODOS
Muestreo Se recolect una gran variedad de vegetales cosechados del campo, en mercados municipales y puestos callejeros. Las especies andinas muestreadas fueron papas, yacon, choclo, oca, maz; adems de acelga, remolacha, pimiento, apio, hiervas aromticas, espinaca, lechuga crespa, lechuga repollada, durazno, manzana, pera, cuaresmillo, brcoli y durazno seco. Entre los alimentos de origen animal se muestreo distintos cortes de carne de llama recin faenada, carne a la venta en mercados municipales y salame de llama casero, tambin leche y queso de cabra sin pasteurizar de pequeos productores de la regin.

Preparacin de las muestras Las verduras de hoja se procesaron segn [12] hasta la obtencin del jugo filtrado. Para el resto de vegetales y frutas se sigui la metodologa de [9], se homogenizan 40 g con 100 ml de agua peptona. Los quesos de cabra frescos se procesaron segn el mtodo usado por [3], 10 g en 100 ml de solucin fisiolgica. La carne se proces realizando un homogenato mezclando 25 g del alimentos con 225 ml de agua peptonada al 0,1% y 0,85%

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Chapter: IPPIA de cloruro de sodio. En el caso de leche y carne fresca las muestras se mantuvieron 7 das refrigeradas a 4 C para realizar un segundo muestreo.

Medios de cultivo y condiciones para el aislamiento Para los homogenatos vegetales se utiliz agar MRS, LaPTg y Garvie. Para leche, quesos, carne y salame los medios de cultivos usados fueron agar MRS y LapTg. Las placas fueron cultivadas durante 24 a 48 h en microaerofilia a 30C. Las cepas de BAL fueron reactivadas en caldo MRS. Listeria innocua se cultivo en caldo Tripticasa soya TBS con 0,5% de extracto de levadura.

Caracterizacin primaria de LAB aisladas Se repicaron 2 a 5 colonias de cada placa en los correspondientes caldos de cultivo para incubar 24 horas y examinar al microscopio (Olimpus CX41RF) la coloracin de Gram. Se realiz la prueba de catalasa (H2O2 30 vol.) con el objeto de identificar presuntivamente BAL [22]. Todas las cepas se crio-conservaron [15]; hasta su uso.

Preparacin de los sobrenadantes libres de clulas Las cepas crioconservadas se activaron en caldos de cultivo, se incubaron a 30 C en tres repiques sucesivos, el ltimo de 16 a 18 h. Se centrifugaron a 10.000 rpm durante 30 minuntos a 4C en centrifuga refrigerada (Combi 51-AR), para obtener el sobrenadante libre de clulas (SLC). Se tomo parte del sobrenadante y se ajusto el pH a 6,5 con NaOH 2 N. Posteriormente se esteriliz por filtracin (0,22 m).

Cepas indicadoras Se emplearon como cepas indicadoras Listeria inocua y Lactobacillus plantarum CRL 691 aportadas por el CERLA, Tucumn, Argentina y Clostridium perfringens aislada de papas andinas precocidas, en nuestro laboratorio.

Deteccin de actividad inhibitoria Se utiliz el test de spot en agar modificado por [15]. Todas las cepas aisladas fueron testeadas frente a Listeria innocua, Clostridium perfringens, Lactobacillus
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Chapter: IPPIA plantarum CRL 691 y las mismas cepas de BAL aisladas para conocer probables antagonismos. Las cepas sensibles utilizadas como indicadoras se activaron en los medios correspondientes para realizar un csped con 10 ml de agar blando al 0,75% [5]. Luego se tomaron 5 l de cada SLC y se colocan en la placa distante unos 3 cm entre ellos. Despus de 2 horas de reposo se incub a 30C durante 24 h.

Condiciones de viabilidad de cepas productoras Del total de cepas productoras analizadas se seleccionaron dos: CJ64 para carne y CJ24 para papas andinas. Se pesaron 10 g de carne picada estril y 10 g de pur de papas andinas esterilizadas. Se inocularon las bolsas con 107 ufc/g de alimento de cada cepa productora. Las bolsas se cerraron al vaco (90%) y se conservaron refrigeradas a 4C y a 10C en cmaras frigorficas. Se realizaron recuentos de BAL a 0, 4, 14, 21 y 32 das de almacenamiento.

RESULTADOS Aislamiento de BAL Como se muestra en la Tabla 1, de 64 muestras de vegetales se aislaron 105 colonias pequeas, blancas, en su mayora cocos de 0,5 a 1mm de dimetro. Del ellas, 40 colonias correspondieron a bacterias Gram (+) y catalasa (-). En comparacin con el resto de los alimentos estudiados en este trabajo, las frutas y verduras mostraron el menor nmero de BAL aisladas. Estos resultados coinciden con los obtenidos por otros autores [22] en el que muestra a los vegetales como una fuente pobre de BAL y [4] que aisl BAL de porotos. Entre los vegetales de hoja, acelga, lechuga crespa, remolacha y espinaca fueron los que presentaron la mayor cantidad de aislamientos. Esto puede deberse a que presentan mayor probabilidad de contaminarse con suelo, agua de riego y materia fecal. Se aislaron 25 colonias caractersticas de BAL (Tabla 1) de 9 muestras de carne fresca de llama, 18 de ellas resultaron Gram (+) y catalasa (-). En el cuadro 1 se observa que los porcentajes ms altos corresponde a carne, salame de llama, consideradas como fuente natural de BAL [26] y queso a pesar de que fueron frescos. En el caso de leches las muestras se refrigeraron para favorecer el desarrollo de BAL.

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TABLA 1: AISLAMIENTO DE BACTERIAS LCTICAS AUTCTONAS.
Vegetales Acelga Remolacha Pimiento Apio Yacon Oca Papa Maz Hiervas aromticas Espinaca Lechuga crespa Lechuga repollada Durazno Manzana Pera Cuaresmillo Brocoli Duraznos secos Choclo Total Carne, leche y quesos Carne de llama Productos crnicos Queso Leche Total N de muestras 5 4 2 4 2 5 9 2 4 5 7 6 2 1 2 1 1 1 1 64 N de aisladas 18 10 2 3 4 2 5 1 3 20 12 4 3 2 2 6 4 2 2 105 colonias N de cepas Gram (+) Catalasa (-) 10 6 2 11 5 1 3 2 40

9 4 8 6 27

25 22 31 24 102

18 20 26 19 83

GRAFICO 1: REPRESENTACIN PORCENTUAL DE BAL POR TIPO DE ALIMENTO

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Chapter: IPPIA Deteccin de actividad inhibitoria Se lograron aislar 7 cepas de BAL autctonas de la regin de Quebrada y Puna de la provincia de Jujuy con propiedades antagnicas contra Listeria innocua, de las mismas solo 2, CJ21 y CJ24, presentaron inhibicin contra Clostridium perfringens (Tabla N 3). El origen de las cepas se presenta en la Tabla 2, contndose con BAL de alimentos vegetales y animales, fermentados y naturales.
TABLA 2. ORIGEN DE LAS CEPAS PRODUCTORAS
Cepa productora Origen CJ21 y 24 Salame de llama CJ40 Acelga CJ44 y 46 Espinaca CJ64 Carne de llama CJ66 Queso de cabra

En la Figura 1 se observan los halos de inhibicin. En el rea superior de la placa se testearon los SLC neutralizados y en la inferior los SLC sin neutralizar de las mismas cepas.
FIGURA 1: ACTIVIDAD INHIBITORIA DE BAL CONTRA LISTERIA INNOCUA

Listeria innocua inhibida por cepas CJ40, CJ44, CJ46, CJ64 y CJ66

Los resultados no muestran grandes diferencias entre los dimetros de los halos, indicando que su poder inhibitorio no se debe a la produccin de cido lctico, salvo en una sola cepa (CJ40) contra Listeria innocua. Para determinar la presencia o no de bacteriocinas, los SLC deben someterse a pruebas para descartar la produccin de H2O2 y la susceptibilidad de estos compuestos a proteasas. Como las cepas CJ21 y CJ24 se aislaron de salame de llama, una de ellas se empleo para las pruebas de viabilidad en papas andinas ya que Clostridium perfringens se encontr
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Chapter: IPPIA en papas andinas precocidas envasadas al vaco en trabajos anteriores. CJ64 se emple en carne debido al poder inhibitorio que presento ante Listeria innocua, gnero aislado de carnes y leches.

Viabilidad de las cepas Para examinar el crecimiento de las cepas de BAL (CJ24 y CJ64) en los sistemas alimentarios se escogieron las temperaturas de 4 y 10C ya que los alimentos estudiados se mantendrn refrigerados o a temperatura ambiente en la regin de donde son originarios. En la figura 2 se observa el crecimiento de las cepas ensayadas.
FIG 2: CRECIMIENTO DE CJ64 EN CARNE Y CJ24 EN PAPA

A 4 C los recuentos de CJ24 y CJ64 fueron inferiores llegando a 3

108 UFC/g en

papa y carne. CJ64 tiene un mayor desarrollo en carne que CJ24 en pur de papa a10C. Estos ensayos demostraron la viabilidad de las cepas ensayadas en ambos alimentos.

Conclusiones
Se consigui aislar BAL de productos regionales con actividad antagnica. En estudios posteriores se testearan en productos elaborados con papas andinas envasadas al vacio y productos frescos elaborados con carne de llama. Se comprob que las cepas seleccionadas crecieron en las condiciones dadas en los sistemas de alimentos realizados en el laboratorio. En prximos estudios se tendrn como objetivos la caracterizacin de las cepas productoras y las sustancias inhibitorias.

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TABLA 3: ACTIVIDAD INHIBITORIA DE CEPAS AUTCTONAS (mm de halo)

Cepas productoras CJ6 (8-8) (12-12) (10-10) (3-3) (4-4) (12-15) (10-15) (12-14) (10-10) (12-12) (12-12) (7-7) (9-0) (10-10) (10-10) CJ21 CJ24 CJ40 CJ44 CJ46 CJ4

Cepas sensibles

CJ64 (13-13) (11-11)

CJ66 (10-9)

Listeria inocua

CRL 691

CJ6

CJ8

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CJ28

CJ 33,34,36,37,38,39,41

CJ 54,56,60,66,67,69,70,71,73,74,75,77,79,81

(8-15) (6 - 11) (11-11) (10-12)

CJ 67,70,71,74

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