Escuela Nacional de Ciencias Biolgicas

BIOQUMICA GENERAL Solis Romero Mara Dolores, Medrano Oliver Elizabeth. 4QV2 Seccin 2.

Precipitacin, Separacin y Punto Isoelctrico de Protenas

Introduccin
Una protena tiene mltiples grupos cido-base, lo que hace que sus propiedades de solubilidad dependan de la concentracin de sal, polaridad del disolvente, pH y temperatura. Diferentes protenas tienes diferentes propiedades se solubilidad, por lo que cuando una protena es soluble, otras precipitan. Concentracin de sales. Resultados

I. Separacin de protenas por precipitacin con sales (salting out).

Tabla 1. Salting out Filtrado 1 Precipitado 1 Filtrado 2 Precipitado 2 Biuret + + Interpretacin Ausencia de Protenas Presencia de protenas Ausencia de Protenas Presencia de protenas

La solubilidad de una protena es sensible a la concentracin de sal. La concentracin de sal se expresa en trminos de fuerza inica. La solubilidad de una protena a baja fuerza inica generalmente aumenta con la concentracin de sal. A altas fuerzas inicas, la solubilidad de las protenas disminuye, ste fenmeno es conocido como Salting Out. Esto se da bsicamente por la competencia por las molculas de agua que forman parte de la capa de solvatacin. Solventes orgnicos.

Imagen 1. Salting out.

II. Precipitacin por efecto del pH y de solventes.

Tabla 2. PP por efecto del pH y solvente. Tubo No. 1 2 Clara de 3.0 3.0 huevo 1:3 HCl 0.1N 1.0 NaOH 1.0 0.1N Reg. acetatos 0.1M pH 4.7 Sol. Obs. ligeramente Transparente *Imagen 2 turbia Etanol 96 3.0 3.0 Obs. El pp. se Se observan *Imagen 3 volvi dos fases homogneo. 3 3.0 -

El uso de solventes miscibles en agua, actan como buenos precipitantes de protenas, ya que tienen menor poder de disolver estas protenas. Efectos de pH

Las protenas tienen generalmente muchos grupos ionizables, los que tienen una variedad de pK. Cada protena tiene un pH caracterstico al cual las cargas positivas se encuentran en igual cantidad a las cargas negativas, a ste pH se le conoce como punto isoelctrico (pI) el cul puede ser conocido a travs del isoelectroenfoque. En el pI las protenas tienen una solubilidad mnima y son insensibles al salting in (fenmeno por el cual la concentracin de sal aumenta la solubilidad de la protena). La solubilidad se incrementa cuando el pH se aleja del pI Cristalizacin.

1.0 pp homogneo (turbidez) 3.0 Se observan tres fases.

Cuando la protena se encuentra en un razonable estado de pureza, esta puede ser cristalizada. Esto se hace elevando la solucin la solucin a una saturacin de la protena, punto en el cuales utilizan los mtodos de precipitacin ya mencionados.

Objetivos - Observar el efecto que producen algunos agentes fisicoqumicos sobre la solubilidad de las protenas. - Determinar el punto Isoelctrico de la insulina, basndose en sus propiedades de solubilidad a diferentes valores de pH.

Imagen 2.pp por efecto del pH. despus de adicionar el solvente.

Imagen 3.

Escuela Nacional de Ciencias Biolgicas

BIOQUMICA GENERAL Solis Romero Mara Dolores, Medrano Oliver Elizabeth. 4QV2 Seccin 2.

III. Precipitacin por metales pesados.

Tabla 3. pp Metales pesados
Tubo Clara de huevo HgCl2 5% AgNO3 5% Pb(CH3COO)2 5% BaCl2 5% NaCl 5% H2O Obs 1 1.0 0.25 pp(+) 2 1.0 0.25 pp(+) 3 1.0 0.25 pp(+) 4 1.0 0.25 5 1.0 0.25 6 1.0 0.25 -

[Acetato] = pH = 4.76 + log pH= 3.699 3.7 Tubo 2. cido actico: 0.15 mL Acetato: 0.10 mL Insulina: 0.15 mL pK = 4.76 Vf = 0.15+0.10+0.15 = 0.4 mL [cido actico] = [Acetato] = pH = 4.76 + log pH= 4.936 4.94

Imagen 4. pp metales pesados.

Discusin
*Experiencia 1: la prueba resulta positiva para el precipitado 1 y 2 debido a que en l se encuentran protenas (al agregar la sal liberamos el agua unida a la protena por puentes de hidrogeno lo cual provoca la precipitacin) En los filtrados la prueba resulta negativa debido a que las protenas se encuentran disueltas en el medio acuoso porque tienen la capacidad de formar puentes de hidrogeno con el agua. *Experiencia 2: el tubo 1 tiene una carga neta positiva debido a su pH bajo por lo cual la protena va a incrementar sus reacciones electrostticas entre molculas vecinas lo cual va a promover la precipitacin. El tubo 2 tiene una carga neta negativa por su pH alto, por lo cual la protena no se ver influida y no precipitara. El tubo 3 al tener el pH ms cercano al punto isoelctrico de la albumina (4.9) no se da el efecto del

IV. Determinacin del punto Isoelctrico

Tabla 4. Determinacin del pI Tubo 1 2
CH3COOH 0.2M

3 0.05 0.20 6U pp (+)

4 0.01 0.24 6U -

5 0.00 0.25 6U -

0.23 0.02 6U -

0.15 0.10 6U pp (++)

Na(CH3COO) Insulina pH Obs.

Imagen 5. Determinacin del pI

Clculos
Frmula: pH = pK + log M

La adicin de un solvente orgnico (etanol) produce agregados de molculas proteicas que tienden a precipitar debido a que el etanol presenta una constante dielctrica menor a la del agua, produce un incremento en las fuerzas de atraccin entre cargas opuestas y una disminucin en el grado de ionizacin de los radicales de las protenas, y en consecuencia una disminucin en la solubilidad de sta. Experiencia 3: en los tubos 1,2 y 3 se form un precipitado debido a que ocurri una desnaturalizacin provocada por el cloruro de mercurio, el nitrato de plata y el acetato de plomo respectivamente los cuales modificaron la estructura de la protena disminuyendo su estabilidad.

Tubo 1. cido actico: 0.23 mL Acetato: 0.02 mL Insulina: 0.15 mL pK = 4.76 Vf = 0.23+0.02+0.15 = 0.4 mL [cido actico] =

Escuela Nacional de Ciencias Biolgicas

BIOQUMICA GENERAL Solis Romero Mara Dolores, Medrano Oliver Elizabeth. 4QV2 Seccin 2.

Conclusiones
La albumina es una protena simple soluble en agua. Es parte importante de la alimentacin y est presente en la clara de huevo, la leche, el plasma sanguneo, etc. En esta prctica conocimos la importancia que tienen las concentraciones de sales para purificar una protena (a mayor cantidad de puentes de hidrogeno mayor solubilidad por lo tanto a mayor concentracin de sal precipitaran ms las protenas). Comprendimos tambin el efecto que tiene el pH y su carga neta en la precipitacin de las protenas (a mayor carga neta mayor precipitacin). Tambin conocimos como al agregar metales pesados podemos desnaturalizar a las protenas provocando su precipitacin.

Bibliografa QUESADA Mora Silvia Manual de experimentos para bioqumica Costa Rica 2007, editorial universidad estatal a distancia, 26-34pp. VOET, Pratt Fundamentos de bioqumica 2 edicin, Madrid Espaa 2007, editorial medica panamericana, 97-108pp. http://www.um.es/molecula/prot06.htm http://www.angelfire.com/scifi/anarkimia/Biolog ia/tecnicas/solubilidades_de_protenas.htm Preguntas extras IMPORTANCIA DE LAS PROTENAS DE ACUERDO A SU FUNCIN:
*FUNCIN DEFENSIVA: crean los anticuerpos y regulan los factores contra agentes extraos o infecciones. *FUNCION ENZIMATICA: son las ms especializadas y numerosas. Actan como biocatalizadores acelerando las reacciones qumicas del metabolismo. *FUNCIN CONTRCTIL: contraccin de los msculos travs de la miosina y actina. *FUNCIN ESTRUCTURAL: forman tejidos de sostn y relleno que confieren elasticidad y resistencia a rganos y tejidos como el colgeno del tejido conjuntivo fibroso, reticulina y elastina elastina del tejido conjuntivo elstico. *FUNCIONES DE TRANSPORTE: la hemoglobina y la mioglobina, protenas transportadoras del oxgeno en la sangre en los organismos vertebrados y en los msculos respectivamente.