ensayo sensible para detectar defectos del comportamiento en la enfermedad de Parkinson modelo

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Drosophila

Ronit Shaltiel-Karyo , Dan Davidi , Yotam Menuchin , Moran Frenkel-Pinter , 1 Mira MarcusKalish , 2 John Ringo ,3 Ehud Gazit , 1, * y Daniel Segal 1, 4, *
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Abstracto
La enfermedad de Parkinson es un trastorno neurodegenerativo comn con la patologa de la -sinuclena agregacin en los cuerpos de Lewy. Actualmente, no hay un tratamiento disponible que detiene el progreso de la enfermedad. Por lo tanto, la necesidad de modelos animales para seguir -sinuclena agregacin es crucial. Drosophila melanogaster se ha investigado extensivamente como un buen modelo gentico para la enfermedad, con un fenotipo cognitivo defectuoso de la capacidad de subida. El ensayo para la capacidad para trepar se ha demostrado como una herramienta eficaz para la seleccin de nuevos agentes teraputicos para la enfermedad de Parkinson. Sin embargo, debido a limitaciones de muchos el ensayo, hay una clara necesidad de desarrollar una prueba de mejor comportamiento. Corte, un comportamiento estereotipado, ritualizada de Drosophila , implica motor complejo y funciones sensoriales en ambos sexos, que son controlados por gran nmero de neuronas, por lo que el comportamiento observado durante el cortejo deben ser sensibles a los procesos de enfermedades en el sistema nervioso. Se utiliz una serie de rasgos comunes observados en el noviazgo y encuentros y un comportamiento adicional de rasgos no sexuales analizados utilizando una herramienta de minera de datos. Hemos encontrado defectuoso comportamiento de las moscas modelo masculino de Parkinson que fueron probados con hembras vrgenes, visibles a una edad mucho ms joven que los defectos de escalada. Llegamos a la conclusin de que este es un ensayo mejorado el comportamiento de las moscas modelo de Parkinson.
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1. Introduccin
Enfermedad de Parkinson (EP) es un trastorno neurodegenerativo progresivo, caracterizado por la deposicin de fibrillas de amiloide en los cuerpos de Lewy (lbs) en la substantia nigra pars compacta, lo que lleva a la prdida de neuronas dopaminrgicas (DA), las neuronas y a los sntomas motores severos [ 1 - 4 ]. sinuclena ( -syn), una protena de 140-amino-cido, es el componente principal de la LB [5 , 6 ]. Dado que la agregacin de la protena en el cerebro ha sido implicado como una etapa fundamental en el desarrollo de la EP, una trayectoria para la actual bsqueda de drogas se centra en detener o modificar el patrn de -syn deposicin en el cerebro [ 7 ].

Sin ningn frmaco disponible actualmente que las detenciones o ralentiza la progresin de la enfermedad, terapia trata la disfuncin motora, y sus la eficacia disminuye conforme progresa la enfermedad [ 8 ]. Por lo tanto, el desarrollo y la caracterizacin de los modelos animales puede ser prometedora para la deteccin y el ensayo de nuevos frmacos que se dirigen a los patgenos proceso en s ms que los sntomas de la PD [ 9 ]. La mosca de la fruta Drosophila melanogaster es un organismo til para el estudio de los mecanismos de enfermedades neurodegenerativas humanas, incluyendo PD [ 10 ]. A pesar de las diferencias notables entre Drosophila y humanos, muchos genes y vas de sealizacin se conservan entre ellos [ 11 ]. Feany y Bender [ 12 ] informaron de una Drosophila modelo de PD que expresa humano normal -syn, as como cepas que expresan cada una de las dos protenas mutantes (A30P y A53T) asociados con la enfermedad de Parkinson familiar en todas Drosophila neuronas; la Drosophila genoma hace no contienen una clara -syn homlogo [ 12 ]. Moscas transgnicas que expresan -syn panneurally agregados de pantalla, sufren la prdida de neuronas DA, y exhibir los defectos del aparato locomotor [12 ]. Ellos son valiosos para la deteccin de drogas y pruebas [ 13 ], as como para la identificacin de genes y procesos celulares relevantes para la patognesis PD, muchas de las cuales son conservadas evolutivamente [ 11 ]. A pocos fenotipos se han detectado en la EP modelos de mosca [ 11 ], pero slo tres fenotipos comunes en las moscas que expresan -syn [ 12 ]. Los dos primeros son (i) la acumulacin de -syn, que se detect con anti- -syn anticuerpo, y (ii) prdida de neuronas DA en el cerebro, detectado con anti-TH anticuerpo, que reconoce especficamente estas neuronas en secciones de parafina o todo el montaje cerebro [ 12 , 14 - 16 ]. El tercer fenotipo es el resultado del comportamiento de la disfuncin del sistema nervioso, dependientes de la edad defectos de locomocin. Este ltimo se deduce claramente usando un ensayo simple: mientras que las moscas normales trepar por un tubo vertical (geotaxis), -syn-expresin de moscas tienden a permanecer en la parte inferior [ 12 , 13 ]. En comparacin con los de tipo salvaje moscas, las moscas transgnicas con expresin panneural de -syn desarrollar disfuncin locomotriz a una edad relativamente temprana. Este fenotipo de comportamiento se ha demostrado en el pasado por nuestro grupo y otros como una herramienta eficaz para la deteccin de nuevas terapias para la DP [ 12 , 13 , 17 , 18 ]. El cortejo en Drosophila es un comportamiento estereotipado, ritualizada, que requiere los hombres a ser atltico y de responder rpida y adecuadamente a las hembras. Esta actividad representa para la mayora de las interacciones entre los individuos adultos y es rico en contenido, estructura compleja y robusta en la ejecucin [ 19 ]. Una mosca masculina puede llevar a cabo el ritual de cortejo entero inmediatamente al encontrarse con una mujer virgen, aunque fue criado en aislamiento completo de huevo a adulto [ 20 ]. En estas acciones complejas, los sistemas nerviosos macho y hembra funcionar para generar un comportamiento

sexual. Cortejo masculino consiste visual, quimiosensorial, auditivas y seales mechanosensory [ 21 ]. El ritual de cortejo implica la orientacin del macho hacia la hembra, la hembra serenata con una cancin de amor especfico de la especie (vibracin del ala), lamer los genitales de la hembra, y de intentar cpula [ 21 , 22 ]. Desde cortejo implica muchos elementos neurales y motor [ 23 ], que podra ser afectada por la expresin de -syn. Aqu se demuestra una disminucin general de las respuestas de comportamiento de hombres moscas transgnicas que expresan A30P -syn en el cerebro [ 12 ], cuando estos machos se aparean con hembras vrgenes. Esto puede servir potencialmente como una novela, ensayo ms sensible para estudiar los dficits locomotores en Drosophila .
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2. Mtodos
2,1. Cepas y Crianza

Se utilizaron tres cepas de Drosophila : elav-GAL4, UAS- -syn A30P y Oregon-R (tipo salvaje). Las moscas fueron criadas en harina de maz, melaza nivel medio a 25 C. Las cruces se realizaron con hembras vrgenes recogido no ms de ocho horas despus de la eclosin a 25 C o 18 horas despus de la eclosin a 18 C. Cruces se realizaron a 29 C. Descendiente del adulto ( F 1 ) a partir de los cruces se recogieron hasta 9 das despus del comienzo de su eclosin a 25 C con el fin de evitar la descendencia de la prxima generacin ( F 2 ).
2,2. Cruces

Mujer vuela llevando el controlador de elav-Gal4 en su cromosoma X se cruzaron con machos portadores de la UAS -regulado -syn A30P transgn localizado en el cromosoma 2 (proporcionado amablemente por el profesor Mel Feany). Todos los F 1 progenie expres -syn A30P en el sistema nervioso, que nos da un modelo para la enfermedad de Parkinson.
2,3. Locomotor (Escalada) Ensayo

5 frascos, cada uno con 10 moscas que expresan -syn A30P o 10 moscas Oregon-R fueron analizados por el comportamiento locomotor. Los viales se golpea suavemente sobre la mesa y dej en reposo durante 18 segundos. El nmero de moscas que se subi al menos un cm se registr. En total, se utilizaron 100 moscas, la mitad expresar -syn A30P y media de tipo salvaje moscas Oregon.
2,4. Cortejo Ensayo

Las moscas utilizadas para el ensayo de noviazgo se guardaban en una caja opaca. Teniendo en cuenta la periodicidad de diel Drosophila comportamiento de

cortejo [ 24 ], el ensayo se llev a cabo el cortejo entre las 9 : 00 y 15 : 00. Un varn de 6 das de edad, virgen (Oregon-R o -syn A30P) se coloc con un 6 das de edad, Oregon-R virgen femenino en una cmara transparente cilndrico ( r = 1,5 cm, h = 0,5 cm) durante 10 minutos o hasta que se produjo la cpula. La interaccin entre las moscas se registr mediante un microscopio digital y ms tarde se analiz la actividad sexual usando un software de nuevo desarrollo denominado " Drosophila anlisis ", que permite contar el nmero de veces que una mosca se acopla en cada elemento y registrar el tiempo que pasa en cada combate de comportamiento.Grabamos cortejo de 56 parejas, 28 -syn A30p varones y 28 varones Oregon-R. Las siguientes caractersticas esenciales del cortejo masculino se midieron: (i) la orientacin, (ii) las vibraciones del ala, (iii) lamer, y (iv) intentaron copular, nosotros tambin registr la ocurrencia de la cpula [ 25 ].Adems, se registr un nuevo parmetro de comportamiento, los encuentros no sexuales (NSES), los encuentros entre los machos y hembras que no hayan dado lugar a la actividad sexual. NSE es una medida de la actividad general. Para medir la capacidad de respuesta a la hembra de forma ms directa, se calcul un "ndice objetivo sexual" (SFI): SFI = 1 / (NSE + 1).
2,5. Escalada Ensayo

Actualmente, el ensayo slo del comportamiento de Pd moscas del modelo es la prueba de la escalada.Por lo tanto, se realiz esta prueba tambin. Las moscas transgnicas que expresan el mutante -syn A30P en su sistema nervioso se utilizaron para el experimento. La habilidad de escalar las moscas se monitoriz dos veces, en el da 6 (cuando las moscas fueron seis das de edad) y al da 21.
2,6. Anlisis estadstico

Los datos fueron categorizados como 9 parmetros para cada mosca como "condicin de salud" como un parmetro Boolean [ 26 ]. Se utiliz asociacin algoritmo regla de aprendizaje, que revela todos los "si entonces" las reglas que cumplan los umbrales predeterminados del usuario, para determinar cmo los valores de la "condicin de salud" sobre el terreno (la variable dependiente) se ven afectados por los valores de otros campos. El anlisis se realiz utilizando una herramienta de minera de datos WizWhy [27 ] para identificar las reglas subyacentes que explican la variable dependiente-la condicin de salud.WizWhy revela todo lo positivo y lo negativo "si entonces" las reglas de los datos y un conjunto de condiciones necesarias y suficientes ("si y slo si" las reglas). Adems, el algoritmo identifica, en base a las normas extrados, los casos inesperados que se desvan de las reglas y las predicciones emitidas para nuevos casos. El Resumen de reglas se muestra en la Tabla 1 .

Tabla 1 Anlisis de datos minera. Un "si y slo si" la regla, compuesto por seis condiciones, se haya celebrado utilizando WizWhy 4,02. Factor de mejora de 2,8 (en relacin a la prediccin aleatoria) se observ.
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3. Resultados
3,1. Cortejo Ensayo

La actividad sexual se normaliz a considerar Oregon-R vuela comportamiento ideal (100% de la actividad sexual). Dado que varias parejas copulado en menos de 10 minutos, que normaliz las 4 siguientes parmetros de medicin para cada pareja, dividindolo en el tiempo total, destacando rpidas machos copulando. Tiempo de la orientacin revel una media de 56,6% en Oregon-R y 41,3% en -syn A30P presentacin de una actividad orientacin 73% de las moscas mutantes relativas a Oregon-R (41.3/56.6 * 100). Del mismo modo, Oregon-R tiempo de vibracin fue del 21,5% y -syn A30P vibrar el 17,2% del tiempo total con el 80% de la actividad normal. Licking valores y el "intento de cpula" (multiplicado por 100 y dividido por el tiempo total) fueron de 3,4 y 0,4 para Oregon-R y las moscas mutantes, respectivamente. Por lo tanto, -syn A30P moscas mostraron una actividad del 59% y el 50,7% lamiendo intentado cpulas (ATCs) la actividad relativa a Oregon-R moscas. Dado que la cpula es binaria, no se calcul el promedio de cpulas por experimento pero resumi las cpulas totales que se produjeron en el 28 Oregon-R vuela comparado con el 28 -syn A30P vuela. La suma de cpula fue de 11 cpulas en las moscas Oregon-R y 8 cpulas en la -syn A30P, lo que resulta en un menor nmero de cpulas 27,3% en las moscas de la DP. Curiosamente, los dos grupos diferan en los encuentros no sexuales (NSES). En A30p -syn moscas, significa NSE tena 33 aos, y en Oregon-R moscas, NSE medio fue de 21. Aqu notamos la presencia de NSE principalmente antes de inicio de cualquier actividad sexual, por lo que no dividimos los valores medidos por el tiempo total. Para el ndice de enfoque sexual, SFI, Oregon-R-machos realizaron 36% mejor que A30P -syn machos ( Figura 1 (a) ). Como se puede observar en los resultados, -syn machos A30P realiza menos actividad sexual (hasta 50% de reduccin relativa de Oregon R-actividad) en todos los parmetros sexuales ( Figura 1 (a) ).

Figura 1 La actividad sexual de Drosophila vuela. Moscas de control (se muestra en gris oscuro) se ponen como muestra 100% de actividad sexual. PD moscas del modelo se muestra en gris claro. (A) el comportamiento de cortejo se midi con 5 parmetros comunes: la orientacin, la vibracin, lamiendo, ... Para comparacin adicional, todos los parmetros de las seis caractersticas se resumi y se normalizaron para cada grupo. Mientras que cada parmetro es suficiente para distinguir entre los dos grupos, se encuentra la diferencia global como una ratificacin de los resultados ( Figura 1 (b) ). Desde las seis actividades conductuales no son estrictamente independientes, la suma de puntuacin representa mejor el comportamiento sexual en general, y el resultado sugiere que los A30p -syn hombres fueron daados en el enfoque sexual, capacidad para seguir las hembras, y la coordinacin ( Figura 1 (b) ).
3,2. Escalada Ensayo

La locomocin (escalada) de ensayo, comnmente utilizado para evaluar el comportamiento de las moscas que expresan protenas amiloidognicas en el cerebro [ 28 - 30 ], se utiliz para evaluar la disfuncin neural causado a la recta debido a la expresin del mutante A30P -syn en el sistema nervioso . Monitoreamos la capacidad de subida de las moscas a la edad de 6 das, la edad de moscas a prueba en el ensayo de cortejo. Como puede verse en la Figura 2 , no se detectaron diferencias entre Oregon-R moscas (control) y A30P -syn moscas como se esperaba en este modelo. Medicin adicional llevado a cabo a la edad de 21 das revel una significativa disfuncin locomotriz de moscas PD, lo que refleja un 28% de reduccin en la capacidad para trepar ( Figura 2 ). Nuestros resultados no indican una diferencia significativa entre los dos grupos antes de 21 das (datos no mostrados), como se inform anteriormente [ 12 , 13 ].

Figura 2

Capacidad ascensional. Dos clases de moscas, cada uno con 5 tubos de 10 moscas, se analizaron mediante el ensayo de escalada. Moscas de control (se muestra en gris oscuro) se ponen como muestra 100% capacidad para trepar. PD modelo mosca se presenta en color gris claro. Los resultados muestran la ...
3,3. Anlisis estadstico

En base a los resultados obtenidos en el ensayo de noviazgo, se utiliz un software de minera de datos para desarrollar un conjunto de reglas ("si entonces" reglas "y si y slo si" las reglas) como una herramienta de diagnstico. A medida que cada mosca macho representa una matriz de nmeros, describiendo 8 parmetros en lo que respecta a las 6 actividades sexuales, se estableci una matriz de dos dimensiones. Elegir estado de salud como la variable dependiente, se utiliz WizWhy 4,02 para el anlisis, ya que (i) permite combinar conjuntos de datos de anlisis, (ii) se refiere a todo el conjunto de datos sin modificacin de datos o desatencin, (iii) es menos sensible a overfitting (en pequeos conjuntos de datos), y (iv) se ha demostrado que revelar todo "si entonces", y un conjunto de condiciones necesarias y suficientes ("si y slo si" las reglas), cada uno con su nivel de significacin [ 31]. El software utiliza la asociacin algoritmo de aprendizaje de reglas para el clculo de las correlaciones que existen entre la nica variable independiente, o combinacin de varios parmetros, la funcin objetivo (la variable dependiente), es decir, para cuantificar la contribucin de cada uno de los 8 parmetros a la decisin si una mosca dada es A30P -syn (por enfermedad) o WT (sano). El "si y slo si" regla de una lista de siete condiciones (ver Tabla 1 ). Nuestro anlisis revel que si al menos una de las siete condiciones se cumple para una mosca dado, era sano con una probabilidad del 82,1%. Sin embargo, si ninguna de las siete condiciones sostiene, haba 82,1% de probabilidad de que la mosca lleva -syn mutacin A30P ( Tabla 1 ). As, hemos sido capaces de predecir el estado de salud del 82,1% (46 de 56 parejas) de las moscas. 10 moscas (17,9%) no sigue el conjunto de reglas, que conduce a un factor de mejora de 2,8 (0.5/0.179) en comparacin con la prediccin al azar ( Tabla 1 ).
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4. Discusin
Drosophila se ha utilizado ampliamente como modelo para las enfermedades cerebrales humanos, principalmente debido a la simplicidad de los experimentos, junto con la similitud a los seres humanos.Drosophila tiene un sistema nervioso central que contiene rdenes de magnitud menos clulas neuronales y gliales que en sistemas nerviosos centrales de vertebrados, sin embargo comparten los mismos tipos de sistemas de neurotransmisores tales como GABA, glutamato, dopamina, serotonina y acetilcolina, y que son capaces de tener un comportamiento complejo, incluyendo pantallas sexual, el comportamiento social y el aprendizaje [ 32 ].

En este informe, presentamos un ensayo de conducta alternativa, empleando pares de cortejo, el seguimiento de los dficits de comportamiento en la -syn modelo mosca A30P y compararlo con el ensayo de escalada bien establecido. Cortejo en Drosophila se estudi y se describe en detalle [ 20 , 33 -36 ], pero a lo mejor de nuestro conocimiento, esta es la primera vez que se caracteriza en un modelo de mosca PD. Se analizaron cinco componentes esenciales del ritual de cortejo del macho y sugerir una nueva actividad, NSE, y su inversa, SFI. En todos los rasgos, las moscas macho PD peor desempeo.Sorprendentemente, NSE fue los ms representados en las caractersticas de la si-y slo si-reglas, componen 4 de las 7 condiciones derivadas. Esto sugiere que las -syn A30p machos mutantes son menos sensibles a las mujeres que estn Oregon-R varones. Se necesitan ms estudios para explorar la relacin entre el cortejo y el enfoque sexual en varones moscas modelo DP. Cuando se compara con el ensayo de escalada bien establecido, bien informado como una medida del comportamiento conveniente para determinar el dao neurolgico y el envejecimiento en Drosophilamoscas [ 12 , 13 ], el cortejo es un comportamiento ms complejo de ensayo. En el cortejo, el macho de la hembra debe seguir de cerca y participar en varios comportamientos coordinados, lo que es fsicamente ms exigente que la escalada simple y que involucra a todos los sentidos, tal como se describe previosly. Adems, el cortejo anomala es evidente a una edad mucho ms temprana que la deficiencia de escalada. Mientras que a la edad de 5-10 das el macho vuela PD tribunal mximo, se necesitan aproximadamente tres semanas para la aparicin del fenotipo grave escalada en ellos ( Figura 2 ). Por otro lado, el ensayo proporciona una puntuacin escalada binario, pasa o falla, mientras que el cortejo se debe evaluar cuantitativamente. Nuestros resultados sugieren inmediatamente un experimento de seguimiento, la evaluacin del comportamiento con el ensayo de cortejo en eclosin diversas edades posteriores. A fin de cuentas, este ensayo conductual proporciona una mejor evaluacin de la patologa PD disfuncin, y puede permitir la evaluacin de la disfuncin dopaminrgica antes de la prdida de neuronas dopaminrgicas, a pesar de los dficits neuronales que subyacen a esta exactas fenotipo conductual es necesario determinar en estudios de seguimiento. Curiosamente, en el caso de X frgil, otro trastorno del cerebro modelado en Drosophila , McBride et al. [ 37 ] demostraron que los antagonistas de litio o mGluR podra rescatar varios aspectos del comportamiento, incluyendo deterioros de cortejo. Esto fue seguido por estudios en el modelo de ratn y ahora estudios clnicos en los pacientes afectados [ 38 , 39 ]. Por lo tanto, las deficiencias de comportamiento durante el cortejo en la mosca de modelo de enfermedad puede ser un ensayo importante y relevante para la deteccin de drogas.
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Contribucin de los autores

R. Shaltiel-Karyo y Davidi D. contribuyeron igualmente a este trabajo.

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Reconocimiento
Este trabajo fue apoyado en parte por una beca de la Fundacin de la Enfermedad de Parkinson.