PDF

PRCTICAS DE ANLISIS INSTRUMENTAL
Isabel Sierra, Damin Prez, Sonia Morante Yolanda Prez, Ruth Ballesteros, Alfredo Snchez
PRCTICAS DE ANLISIS INSTRUMENTAL
Servicio de Publicaciones
Reservados todos los derechos. Ni la totalidad ni parte de este libro, incluido el diseo de la cubierta, puede reproducirse o transmitirse por ningn procedimiento electrnico o mecnico, incluyendo fotocopia, grabacin magntica o cualquier almacenamiento de informacin y sistemas de recuperacin, sin permiso escrito del AUTOR y de la Editorial DYKINSON, S.L.
Copyright by Universidad Rey Juan Carlos Servicio de Publicaciones Los Autores Madrid, 2008 Editorial DYKINSON, S.L. Melndez Valds, 61 - 28015 Madrid Telfono (+34) 91 544 28 46 - (+34) 91 544 28 69 e-mail: info@dykinson.com http://www.dykinson.es http://www.dykinson.com
ISBN: 978-84-9849-189-0 Depsito Legal:
Preimpresin realizada por los autores
Impreso por:
NDICE
ndice
NDICE 9 PRLOGO 13 SEGURIDAD Y NORMAS DE TRABAJO 17 PRCTICAS

I. ESPECTROSCOPA DE ABSORCIN UV-Vis 25
1. Determinacin de hierro en cemento 29 2. Anlisis de una mezcla de dos compuestos 37 3. Aplicaciones cualitativas de la espectroscopia de absorcin UV-Vis 43
II. ESPECTROSCOPA DE ABSORCIN EN EL IR 49

4. Aplicaciones cualitativas de la espectroscopia de IR 53 5. Identificacin de carbohidratos en cereales para desayuno 61
III. ESPECTROSCOPA DE ABSORCIN ATMICA 67

6. Determinacin de cobre en aleaciones metlicas 71 7. Determinacin de manganeso en acelga 79 8. Efecto de la llama y disolvente en la determinacin de magnesio 85
IV. REFRACTOMETRA 91
9. Identificacin y control de pureza de aceites vegetales comestibles 95 10. Determinacin de parmetros de calidad en alimentos 101
V. POLARIMETRA 107
11. Determinacin de sacarosa en leche condensada 109 12. Determinacin de almidn en arroz 117 13. Estudio de la reaccin de inversin de la sacarosa 123
Prcticas de Anlisis Instrumental
ndice
VI. POTENCIOMETRA 131

14. Determinacin de la acidez en vinos 135 15. Determinacin de cido ascrbico en un preparado farmacutico 141 16. Determinacin de estao en aleacin de estao y plata 147
VII. CROMATOGRAFA EN CAPA FINA 153

17. Identificacin de aspartamo y sus productos de hidrlisis en bebidas 155 18. Identificacin de cidos orgnicos en zumos y vinos 159
VIII. CROMATOGRAFA LIQUIDOS DE ALTA EFICACIA 165

19. Determinacin de paracetamol y cido acetil saliclico en preparado farmacutico 171 20. Determinacin de cafena, aspartamo y cido benzoico en bebidas 177 21. Determinacin de aniones en aguas residuales 183 22. Determinacin de fluoruros en pasta de dientes 189 23. Determinacin de sodio en slices 195
IX. CROMATOGRAFA DE GASES 201

24. Determinacin de impurezas en bebidas alcohlicas destiladas 205 25. Aplicaciones cualitativas y cuantitativas de la cromatografa de gases 211
ANEXO 219 BIBLIOGRAFA 225
10
PRLOGO
Prlogo
PRLOGO
La Qumica Analtica es un rea de la ciencia con gran impacto en la vida cotidiana. Es una disciplina genrica y su desarrollo posibilita grandes avances en muchas reas como la Medicina, Biotecnologa, Ciencia de los Materiales, Ciencia Forense, Ingeniera, Medio Ambiente, Tecnologa de los Alimentos, etc. De ah, que actualmente, se considera que el objeto de la Qumica Analtica es toda la materia. En este contexto, el objetivo principal de esta obra es que el alumno entienda la importancia actual de la Qumica Analtica y la forma en que se trabaja, a travs de la realizacin de experimentos prcticos relacionados con el anlisis de muestras orgnicas e inorgnicas mediante el uso de instrumentos analticos modernos. Se pretende pues, motivar el inters del alumno por el anlisis qumico moderno. Adems, puesto que las prcticas de laboratorio han sido siempre una herramienta bsica para el aprendizaje de la Qumica, otros objetivos bsicos de esta obra son que el alumno se familiarice con el material de un laboratorio de Anlisis Instrumental, que aprenda el fundamento de las tcnicas analticas instrumentales ms importantes y que sepa aplicar estos conocimientos para la resolucin de problemas analticos sencillos. La presente obra pretende tambin ser una aportacin til para profesores que tienen que poner en marcha un curso prctico de Anlisis Instrumental, ya que incluye una serie de experimentos prcticos que abarcan las principales tcnicas analticas instrumentales que se estudian de manera habitual en los programas de asignaturas del rea de Qumica Analtica de diversas titulaciones de Ciencias (Qumica, Farmacia, Biologa, Ciencias de la Salud, etc) e Ingeniera. La obra constituye una recopilacin de una serie de prcticas, todas ellas comprobadas experimentalmente, que son perfectamente realizables por parte del alumno. Las prcticas se agrupan en nueve bloques, en funcin del tipo de tcnica utilizada. Inicialmente, en cada bloque de prcticas se hace un breve repaso a los fundamentos bsicos de la tcnica (espectroscopa UV-Vis, espectroscopa de IR, espectroscopa de AA, refractometra, polarimetra, potenciometra, cromatografa en capa fina, cromatografa de lquidos de alta eficacia y cromatografa de gases). A continuacin, para cada tcnica se proponen dos, tres o ms prcticas. La mayora de stas son aplicaciones cuantitativas de las tcnicas, en las que se analizan muestras reales (alimentos, productos farmacuticos, muestras ambientales, materiales inorgnicos, etc), siendo por tanto, el tratamiento de la muestra una etapa importante en el desarrollo de la prctica. Otras prcticas son aplicaciones cualitativas de las tcnicas y en algunos casos se estudian determinados aspectos tericos de la tcnica, con objeto de que el alumno profundice en los mismos. Antes de realizar cualquier tipo de trabajo en el laboratorio, el alumno debe leer con detenimiento y atencin el apartado dedicado a la Seguridad y Normas de trabajo en el laboratorio, que incluye consideraciones generales que los alumnos deben
13
Prlogo
conocer de antemano a la hora de trabajar en un laboratorio (normas bsicas de seguridad, manipulacin de reactivos y material, desecho de residuos, etc). Cada prctica comienza con una introduccin terica con la que se pretende hacer ver al alumno la importancia de la Qumica Analtica en el mundo real y en otras reas de la Ciencia. Posteriormente, se enumeran los objetivos bsicos que se pretende que los alumnos alcancen con la realizacin de la prctica. Seguidamente, se indican los materiales, instrumentos y reactivos necesarios para la realizacin de la misma. El apartado dedicado al procediendo experimental comienza con una serie de precauciones que el alumno debe tener en cuenta, con objeto de evitar accidentes innecesarios o errores en los resultados obtenidos. Despus, se indican las disoluciones necesarias y el modo de prepararlas, los pasos necesarios para el tratamiento de la muestra y finalmente los pasos a seguir para llevar a cabo la medida con la tcnica empleada. Cada prctica se acompaa de numerosas fotografas que facilitan las explicaciones sobre el tratamiento de la muestra, manejo del equipo, etc. Finalmente, en cada prctica se describen los resultados que los alumnos deben obtener en la misma y los posibles comentarios o tratamientos estadsticos que deben realizar. Adems, se formulan una serie de cuestiones para comprobar la asimilacin de los conocimientos terico-prcticos por parte de los alumnos. Sacar un libro a la luz es siempre un trabajo en equipo, por este motivo quisiera expresar mi ms sincero agradecimiento a los coautores del mismo: Damin Prez, Sonia Morante, Yolanda Prez, Ruth Ballesteros y Alfredo Snchez. Una parte muy importante de este libro se debe a su gran esfuerzo en la puesta a punto de las prcticas. Tambin agradecer Carmen Garrido y Santiago Gmez por su ayuda inestimable en el desarrollo de algunas de prcticas y a Gabriel Pastor por la realizacin de alguna figura. Tambin agradecer al resto de compaeros del Departamento de Qumica Inorgnica y Analtica de la ESCET el que nos hayan soportado durante el proceso de desarrollo del mismo y a nuestros familiares y amigos por todas las horas que les hemos robado para escribirlo.
Isabel Sierra Alonso Profesora Titular de Qumica Analtica de la URJC
14
SEGURIDAD Y NORMAS DE TRABAJO
Seguridad y normas de trabajo
SEGURIDAD Y NORMAS DE TRABAJO

El trabajo en cualquier laboratorio de Qumica lleva asociado un riesgo, que ser ms o menos importante dependiendo del tipo de prctica a realizar. Por ello, es necesario trabajar siempre bajo las mximas condiciones de seguridad, conociendo en todo momento los potenciales accidentes que pueden producirse en el desarrollo de la prctica y el modo de actuacin en caso de emergencia. As mismo, es imprescindible conocer y cumplir de manera estricta las normas generales de trabajo en un laboratorio, ya que de esta manera se evitar o minimizar el riesgo de accidentes.
1. Normas generales
Nunca se debe trabajar solo en el laboratorio ni realizar experimentos distintos a los previstos en la prctica que se est realizando. Ser obligatorio el uso de bata larga y con mangas que deber estar en todo momento abrochada para proteger de salpicaduras. Tambin ser obligatorio el uso de gafas de seguridad (las graduadas no protegen de manera adecuada los ojos) y evitando el uso de lentillas (que agravaran las lesiones oculares en caso de accidente). En algunas ocasiones ser necesario el uso de guantes. Llevar el pelo recogido y evitar pulseras o colgantes que puedan engancharse en los montajes. Est prohibido ingerir alimentos y bebidas en el laboratorio. Nunca se debe fumar en el laboratorio. Antes de empezar a trabajar en el laboratorio hay que conocer la situacin de la puerta de emergencia, los extintores, la ducha, el lavaojos y el equipo de primeros auxilios. Cuando se realicen operaciones con riesgo potencial, las personas que no intervengan en ellas y que estn situadas en las proximidades deben estar perfectamente informadas del mismo. Una vez finalizada la prctica se guardaran los materiales limpios y los reactivos. Se limpiar el lugar de trabajo y deber asegurarse de la desconexin de aparatos y de que todas las llaves (agua, gas, vacio, ...) estn cerradas. Lavarse bien las manos al finalizar el trabajo en el laboratorio.

2. Manipulacin de reactivos y material de laboratorio

2.1. Identificacin de sustancias peligrosas
Las sustancias qumicas, en funcin de su peligrosidad, se clasifican en: explosivas, comburentes, extremadamente inflamables, fcilmente inflamables, inflamables, muy txicas, txicas, nocivas, irritantes, nocivas, corrosivas, peligrosas para el medio ambiente, cancergenas, mutagnicas, teratognicas y alegnicas. En el
17

envase original de cualquier reactivo es posible encontrar uno o varios pictogramas que indican el tipo de peligrosidad del producto. Por ello, antes de manejar cualquier reactivo, es imprescindible interpretar esta informacin, para conocer el riesgo inherente a su uso, tomar las precauciones adecuadas y saber actuar en caso de accidente. Tambin encontramos en los envases una serie de frases que nos indican riesgos especficos del producto (frases R) y consejos de seguridad (frases S). Cualquier producto qumico presente en un lugar de trabajo debe contener informacin sobre el riesgo inherente a su uso, esta informacin aparecer en forma de ficha de seguridad, en la que aparece, entre otra, la siguiente informacin: - Identificacin de la sustancia y composicin - Identificacin de los peligros y primeros auxilios - Manipulacin y almacenamiento - Propiedades fsicas, qumicas, estabilidad y reactividad - Informaciones toxicolgicas
2.2. Recomendaciones generales en el manejo de reactivos

En la manipulacin de sustancias qumicas se evitar el contacto con la piel, la inhalacin de los posible vapores y la ingestin. La apertura de los frascos que contienen sustancias qumicas debe realizarse lenta y cuidadosamente, evitando salpicaduras. La friccin que se produce al abrir la tapa puede producir chispas y explosiones. No introducir pipetas en los envases originales de reactivos. Calcular la cantidad que se va a necesitar y trasvasarla a un vaso de precipitados, sosteniendo el recipiente por el lado de la etiqueta. Nunca se debe devolver el reactivo sobrante al recipiente original. En el caso de reactivos slidos, es imprescindible utilizar esptulas perfectamente limpias. Todas las disoluciones preparadas deben estar etiquetadas de forma correcta. Cuando se prepare una disolucin de un cido concentrado, siempre se deber aadir, lentamente y con precaucin, el cido sobre el agua. Se debe conocer la reactividad de los productos qumicos utilizados. Aadir los reactivos con todas las precauciones posibles. Cuando se realizan mezclas, estudiar de antemano las posibles incompatibilidades de los productos, evitando accidentes por reacciones violentas o desprendimiento de gases txicos. Utilizar la vitrina con campana extractora siempre que sea posible, y obligatoriamente si se trabaja con reactivos que emiten vapores txicos, nocivos o irritantes, o en la reaccin hay desprendimiento de gases txicos. Los reactivos qumicos deben mantenerse alejados de mecheros y otras fuentes de calor. Para el calentamiento de lquidos inflamables nunca se debe utilizar un mechero.

18

Los envases de los productos qumicos deben mantenerse siempre cerrados, para evitar su paso al ambiente del laboratorio por evaporacin, o bien accidentes por vertido accidental. Solo se abrirn cuando sea necesario. Evitar que ocurran derrames utilizando embudos para el transvase de lquidos. Avisad inmediatamente al profesor ante cualquier derrame de un producto qumico, para su limpieza inmediata. Si el producto es txico, inflamable o corrosivo interrumpir el trabajo en el puesto de trabajo.
2.3. Recomendaciones generales en el manejo de material de laboratorio

Antes de utilizar cualquier material de vidrio debe verificarse su buen estado. No llevar material de vidrio en los bolsillos de la bata. Cuando se realizan montajes de vidrio se deben seguir las siguientes recomendaciones: a) evitar que el material quede tensionado, b) utilizar soportes y abrazaderas adecuadas, c) usar grasa de silicona en todas las uniones esmeriladas y tapones de vidrio para evitar que las piezas queden unidas y d) los matraces de fondo redondo han de ser introducidos en los baos de forma lenta y progresiva. Nunca se debe calentar en recipientes no destinados para tal fin. El vidrio que se emplee debe ser especfico para aguantar altas temperaturas. Tampoco se calentar nunca recipientes cerrados hermticamente. Evitar quemaduras con material de vidrio caliente utilizando pinzas y guantes adecuados. En cuanto a la manipulacin de pipetas, est terminantemente prohibido pipetear con la boca. Para aspirar fluidos con la pipeta hacer uso de peras de caucho u otros sistemas de succin (propipetas). El material de laboratorio se debe limpiar con agua y detergentes, y debe ser aclarado con abundante agua corriente y, finalmente, con pequeas cantidades de agua destilada (para eliminar los iones que quedan en el material despus de lavar con agua corriente).

Aparatos especiales: Aparatos con llama: Los equipos con llama deben disponer de un sistema de seguridad que permita el corte de suministro de gas en caso de emergencia. Se debe trabajar siempre bajo una campana de extraccin. Baos: Los baos no se deben llenar hasta el borde. Utilizar soportes para asegurar la estabilidad del bao. Se deber utilizar un sistema de control de temperaturas.
19

Estufas: Siempre que se trabaje con vapores inflamables, utilizar estufas de seguridad. Cuando se caliente sustancias voltiles se deber emplear un sistema de extraccin localizada, filtros y un sistema de condensacin para la retencin de los mismos. Utilizar un sistema de control de temperaturas. Centrfugas: La carga de la centrfuga debe estar repartida de forma simtrica. Los equipos no deben permitir su funcionamiento cuando la tapa este abierta. Los equipos no deben permitir la apertura de la tapa cuando an se encuentren en movimiento.
Autoclaves: Los equipos deben disponer de un manmetro. Los aumentos y descensos de presin se deben realizar de forma lenta y progresiva. 2.4. Recomendaciones generales para el manejo de residuos
Los papeles impregnados con reactivos qumicos y los guantes no se pueden tirar a la papelera. Depositarlos en un recipiente destinado a tal fin (slidos). No mezclar en los mismos recipientes trapos, papeles o similares impregnados con productos qumicos incompatibles. No se debe verter ningn tipo de residuo al desage. Los residuos lquidos deben almacenarse en recipientes adecuados para tal fin (disolventes halogenados, disolventes no halogenados, cidos, bases, disoluciones acuosas, aceites y especiales). Estos recipientes estarn debidamente etiquetados y se situarn en una zona especfica de almacenamiento con un sistema de extraccin de vapores. Nunca se dejarn abiertos los recipientes para el almacenamiento de residuos, ni se llenarn hasta rebosar.
3. Actuacin en caso de accidente

En caso de sufrir un accidente es importante conservar la calma, avisar de forma inmediata al profesor y seguir estas instrucciones bsicas:
3.1 Incendios
20 Dar la alarma inmediatamente. En caso de pequeos incendios, utilizar mantas o arena (nunca agua) y si es la ropa la que se prende emplear adems la ducha de seguridad. Retirar inmediatamente, si es posible, los reactivos que se encuentren cerca del fuego. Escoger adecuadamente el tipo de extintor. Todo el personal del laboratorio debe conocer el funcionamiento de estos equipos. Cuando se tenga que evacuar el laboratorio, hacerlo de forma ordenada y tranquila, cerrando todas las puertas al salir.
3.2. Quemaduras trmicas

Lavar la zona afectada con abundante agua para enfriarla, no quitar la ropa que se encuentre pegada a la piel. No romper las ampollas. Si la quemadura es grave no suministrar al accidentado ni bebida ni alimento. Acudir al mdico.
3.3. Salpicaduras
Lavarse con abundante agua durante 10 15 min, empleando si es necesario la ducha de seguridad. Si la salpicadura se ha producido en los ojos lavarse con un lavaojos durante 15 20 minutos. Quitarse la ropa afectada por el producto. Acudir al mdico con la etiqueta o ficha de seguridad del producto.
3.4 Ingestin e inhalaciones

En caso de ingestin de un producto qumico no provocar el vmito, salvo indicacin expresa, especialmente si el producto es corrosivo. No se recomienda ingerir sustancia alguna tras la ingestin de un producto qumico. En caso de inhalacin de vapores de un producto txico o corrosivo, llevar rpidamente a la persona afectada a un lugar con aire fresco. Recopilar informacin (etiqueta o ficha de seguridad) sobre el producto ingerido y acudir con ella rpidamente al mdico. En caso de duda consultar al servicio de informacin toxicolgica.
3.5 Vertidos
Abrir las ventanas del laboratorio. Poner en marcha las vitrinas con campana extractora con las guillotinas subidas. Apagar los aparatos con llama. Si el vertido es importante, evacuar el laboratorio y no permitir la entrada al recinto evacuado hasta asegurarse que la concentracin ambiental del contaminante no presenta riesgo alguno. El vertido se deber eliminar en funcin de la naturaleza del mismo: Mercurio: Absorber con polisulfuro de calcio, azufre o amalgamantes. Lquidos inflamables: Absorber con carbn activo. No emplear serrn. cidos: Neutralizar con productos comercializados para la absorcin y neutralizacin. En su defecto emplear bicarbonato de sodio.
21

Bases: Neutralizar con productos comercializados para la absorcin y neutralizacin. En su defecto emplear agua de pH ligeramente cido.
3.6 Fuga de gases

Cuando la fuga de gas se ha producido en una instalacin fija, cerrar las llaves de las botellas conectadas a la misma. Comunicar al responsable del laboratorio para que ponga en marcha las actuaciones de emergencia adecuadas. Si la fuga de gas se produce en una botella cerrar la llave siempre que sea posible. Utilizar un equipo de proteccin adecuado para trasladar la botella a un espacio abierto y una vez en el exterior, controlar la botella hasta su total vaciado.
3.7. Electrocucin
Cortar inmediatamente la alimentacin elctrica del aparato causante de la electrocucin. No acercase antes a la vctima. Retirar al accidentado una vez asegurado el corte del suministro elctrico. No suministrarle alimentos ni bebidas.
22
PRCTICAS
Espectroscopa de absorcin UV-Vis Fundamento terico
I. ESPECTROSCOPA DE ABSORCIN UV-Vis Fundamento terico

La espectroscopa de absorcin UV-Vis es una tcnica instrumental que se basa en la absorcin de radiacin electromagntica por parte de los analitos en la zona ultravioleta y visible del espectro. Cuando la radiacin de esta zona del espectro incide sobre un compuesto, si esta tiene la energa adecuada, ser absorbida por el analito y se producir la promocin de un electrn a un nivel electrnico superior, se dice que la molcula ha pasado a un estado excitado de mayor energa (Figura 1). Los parmetros que se utilizan para describir este proceso son la transmitancia (T) y la absorbancia (A): T = I/I0 A = - log 10 T = log (I0/I) donde I0 e I son la intensidad inicial y final del haz de radiacin, antes y despus del proceso de absorcin.
Niveles vibracionales Niveles vibracionales
E
Nivel Electrnico 2 Nivel Electrnico 2
Absorcin
E
Nivel Electrnico 1 Nivel Electrnico 1
Estado Fundamental
Estado Excitado
Figura 1. Proceso de absorcin de radiacin UV-Vis. Por tanto, la absorcin selectiva de radiacin de determinadas longitudes de onda, , por parte del analito permite obtener el espectro de absorcin caracterstico del mismo (representacin grfica de la variacin de A frente a ) que proporciona informacin sobre su composicin y estructura (Figura 2).
0.4
198 nm 240 nm
N OH
0.3
Absorbancia
0.2
0.1
0.0
-0.1 200 250 300 350 400 450 500
(nm)
Figura 2. Espectro de absorcin UV-Vis de la 8-hidroxiquinolena en agua.
25

Para la medida de la absorbancia de la radiacin por parte de los analitos y la obtencin de espectros caractersticos se utiliza un aparato llamado espectrofotmetro. En los aparatos ms sencillos de haz simple, llamados as porque utilizan un nico haz de luz, la radiacin procedente de una fuente continua pasa a travs de un monocromador, que selecciona una banda estrecha de longitudes de onda. A continuacin, la radiacin atraviesa la disolucin de la muestra problema situada en el interior de una cubeta (de plstico, vidrio o cuarzo) y la intensidad de la radiacin emergente no absorbida se mide en el detector (Figura 3).
I0 I Detector
Fuente
Selector de
Disolucin problema
Figura 3. Esquema de un espectrofotmetro de UV-Vis de haz simple. La espectroscopa de absorcin UV-Vis se emplea muy frecuentemente para el anlisis cuantitativo. La determinacin de la concentracin de analito presente en una muestra se basa en el cumplimiento de la ley de Lambert-Beer, que establece una relacin de proporcionalidad directa entre absorbancia (A) y concentracin de especies absorbentes (C): A = abC La constante a (absortividad) es la capacidad intrnseca del analito para absorber a una determinada longitud de onda y sus unidades dependern de las unidades empleadas para b (camino o paso ptico, distancia recorrida por la radiacin a travs del medio absorbente) y C. Si el camino ptico se expresa en cm (normalmente b = 1 cm) y la concentracin en g/L, la absortividad tiene unidades de L.g-1.cm-1. Sin embargo, si el camino ptico se expresa en cm y la concentracin en mol/L, la absortividad tiene unidades de L.mol-1.cm-1 y se denomina absortividad molar (). El primer paso que se sigue en cualquier anlisis cuantitativo mediante espectroscopa de absorcin UV-Vis es la seleccin de la longitud de onda de medida, que normalmente ser la de mxima absorbancia ya que: a) en las proximidades del mximo de absorcin la ley de Lambert-Beer se cumple mejor, ya que en esta zona la absorbancia es prcticamente constante y, b) la sensibilidad del anlisis es mxima, es decir, se obtiene la mxima absorbancia para una concentracin dada de analito. Una vez seleccionada la longitud de onda ptima se prepararn disoluciones patrn del analito de concentracin creciente y conocida (Figura 4) y se mide su absorbancia a la longitud de onda ptima. 26
Figura 4. Disoluciones patrn del analito de concentracin creciente y conocida.
Con las absorbancias obtenidas se construye una recta de calibrado representando estos valores frente a las concentraciones de las distintas disoluciones patrn del analito medidas (Figura 5). El ajuste por el mtodo de mnimos cuadrados permite obtener la ecuacin de la mejor lnea recta que pase por los puntos (cuya pendiente ser a o ). Finalmente, se medir la absorbancia de la disolucin problema de la muestra y se determinar su concentracin utilizando la recta de calibrado. .
1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0
A disolucin problema C analito en disolucin problema
Abs
4 C (ppm)
10
Figura 5. Ejemplo de una recta de calibrado para espectroscopa de absorcin UV-Vis.
27
Espectroscopia de absorcin UV-Vis - Determinacin de hierro en cemento
Prctica 1. DETERMINACIN DE HIERRO EN CEMENTO MEDIANTE ESPECTROSCOPA UV-Vis 1.1. Introduccin

El hierro es un elemento qumico de nmero atmico 26 y smbolo Fe. Este metal de transicin es el cuarto elemento ms abundante en la corteza terrestre, representando un 5%. Se encuentra en la naturaleza formando parte de numerosos minerales, entre ellos muchos xidos, y raramente se encuentra libre. El hierro es un componente importante en algunos tipos de cemento. Se denomina cemento a un aglutinante o aglomerante hidrulico que, mezclado con agregados ptreos (grava o arena) y agua, crea una mezcla uniforme, manejable y plstica capaz de fraguar y endurecer al reaccionar con el agua. Aunque existen distintos tipos de cemento, el Portland es el ms utilizado como ligante para la preparacin del hormign. Fue preparado por primera vez en el ao 1824 por el albail ingls Joseph Aspdin que le dio este nombre por su semejanza en su aspecto con las rocas encontradas en Portland, una isla del condado de Dorset. Las materias primas para la produccin de este cemento son minerales que contienen xidos de calcio, silicio, aluminio, hierro y magnesio, principalmente. A partir del cemento Portland se obtienen otros especiales con caractersticas diferentes a causa de variaciones en el porcentaje de los componentes que lo forman, entre estos cabe destacar el cemento Portland frrico (cemento rico en hierro que se obtiene introduciendo cenizas de pirita o minerales de hierro en polvo), el cemento blanco (de color blanco-grisceo debido a la falta del hierro), el cemento puzolnico (mezcla de cemento Portland con puzolana y yeso), el cemento siderrgico (mezclas con ceniza de carbn proveniente de las centrales termoelctricas, escoria de fundiciones o residuos obtenidos calentando el cuarzo), el cemento de fraguado rpido (que se caracteriza por iniciar el fraguado a los pocos minutos de su preparacin con agua) y el cemento aluminoso (que se produce a partir, principalmente, de la bauxita con impurezas de xidos de hierro, titanio y silicio). El hierro en la naturaleza puede presentarse en dos estados de oxidacin Fe(II) o Fe(III). En el cemento, se encuentra normalmente en estado oxidacin Fe(III). La concentracin de Fe(III) en el cemento vara segn el tipo de cemento observndose que una mayor concentracin de hierro en el cemento provoca una coloracin ms oscura del mismo. Los mtodos para la determinacin de hierro son muy diversos pudindose determinar por mtodo gravimtricos, volumtricos o mediante el empleo de diversas tcnicas instrumentales espectromtricas o cromatogrficas. En la presente prctica se llevar a cabo la determinacin de hierro en distintos tipos de cemento mediante espectroscopa de absorcin UV-Vis. Para asegurarnos que todo el hierro est en el estado de oxidacin +3 calcinaremos la muestra como etapa previa a su extraccin.
29
1.2. Objetivos
1. Realizar el tratamiento de una muestra real como etapa previa al anlisis. 2. Aprender el manejo de un espectrofotmetro UV-Vis. 3. Determinar del contenido de hierro en una muestra de cemento.
1.3. Aparatos y material

Cubeta espectrofotomtrica de vidrio Matraces aforados de 50, 250 y 1000 mL Placa calefactora Placa filtrante porosa n 4 Pipeta Pasteur con tetina de goma Varilla de vidrio Vasos de precipitados de 100 y 250 mL Balanza analtica Mufla Probeta de 50 mL Pipetas de 5 y 10 mL Kitasatos de 500 mL Embudo de vidrio Vidrio de reloj o pesasustancias Crisol de porcelana Espectrofotmetro de UV-Vis
1.4. Reactivos
cido clorhdrico Cloruro de hierro(III) hexahidratado Agua destilada Muestras de cemento
1.5. Procedimiento experimental

1.5.1. Precauciones a tener en cuenta:
a) Antes de calcinar la muestra de cemento est debe estar perfectamente molida. b) Tenga cuidado de no quemarse al extraer la muestra de cemento de la mufla emplee pinzas y guantes adecuados. c) Realice la extraccin del hierro de la muestra en la campana extractora, debido a la toxicidad de los gases que se desprenden. d) Tome la cubeta espectrofotomtrica por los lados traslcidos, evitando dejar restos de grasa o suciedad en la celda que podran afectar a la lectura de la absorbancia. e) Asegrese que antes de introducir la cubeta espectrofotomtrica en el equipo se encuentra perfectamente limpia y seca, ya que de lo contrario al tratarse de disoluciones que contienen cido pudieran daar el equipo. 30
1.5.2. Preparacin de disoluciones:

Disolucin de cido clorhdrico (1:1). Se toman 25 mL de cido clorhdrico comercial y se transfieren a un matraz aforado de 50 mL y se completan con agua destilada hasta el enrase. Disolucin de cido clorhdrico al 1 % (v/v) A partir del cido clorhdrico comercial se tomar el volumen correspondiente que se transferir a un matraz aforado de 1000 mL y se enrasar con agua destilada. Disolucin madre de hierro(III) 6.25 10-3 M. Se pesan 1,6888 g de FeCl3 6 H2O, se aaden 25 mL de HCl (1:1) y unos 100 mL de disolucin de cido clorhdrco al 1 %. Una vez disueltos, se transfiere la disolucin a un matraz aforado de 1000 mL y se enrasa con cido clorhdrico al 1%.
1.5.3. Determinacin de hierro:

1.5.3.1. Extraccin del hierro en la muestra
Se colocan 1,5 g de cemento en un crisol de porcelana. Este crisol se introduce en una mufla (Figura 1.1) y se procede a la calcinacin a 950 C durante 24 horas. Transcurrido este tiempo, se saca el crisol de la mufla y se transfiere a un vaso de precipitados al que se le aaden 20 mL de HCl (1:1) y se calienta la muestra durante 10 minutos agitando con una varilla de vez en cuando (tenga cuidado de no llevar a sequedad la muestra, realice esta operacin en campana extractora debido a la toxicidad de los gases que se desprenden). Figura 1.1. Mufla para calcinacin del cemento. la
Transcurrido este tiempo se procede al filtrado de la disolucin en caliente con un sistema de succin a vaco empleando un kitasato y una placa filtrante con poro del nmero cuatro. El slido se lava con una disolucin caliente de cido clorhdrico al 1 %. Despus de filtrar y lavar el slido, se transfiere el filtrado y las aguas de lavado a un matraz aforado de 250 mL. Lavar bien el kitasato con la disolucin de cido clorhdrico al 1 % para arrastrar los restos de disolucin que puedan quedar adheridos en las paredes del mismo. Finalmente, enrasar el matraz con la disolucin de cido clorhdrico al 1 %. Una alcuota de 10 mL de esta disolucin se transfiere a un matraz aforado de 50 mL y se enrasa con la disolucin de cido clorhdrico al 1 %.
31
Espectroscopia de absorcin UV-Vis - Determinacin de hierro en cemento 1.5.3.2. Preparacin de la recta de calibrado
Se prepararan seis disoluciones de 50 mL que contengan alcuotas de 0, 2, 4, 6, 8 y 10 mL de la disolucin de hierro de 6.25 10-3 M y se enrasaran con la disolucin de cido clorhdrico al 1 %. Se agitarn manualmente los matraces con la finalidad de homogeneizar las disoluciones.
1.5.3.3. Anlisis espectrofotomtrico

En la Figura 1.2 se muestra el espectrofotmetro de UV-Vis que se va a emplear en esta prctica.
(a)
(b)
Figura 1.2. (a) Espectrofotmetro de UV-Vis. (b) Detalle del compartimento de medida. Inicialmente se debe seleccionar la longitud de onda a la que se van a realizar las medidas. Para ello, utilizando una disolucin patrn de hierro de concentracin intermedia registrar el espectro de absorcin en el intervalo de longitudes de onda comprendido entre 250 y 800 nm. Para realizar esto: (a) (b) Abrir el men Scan haciendo doble click en el icono. En el men Scan para obtener el espectro, en primer lugar en el icono Set up se eligen las siguientes condiciones de medida (Figura 1.3):

Start: 800 nm Stop: 250 nm Scan controls: medium

Y mode: Absorbance Y min: 0 Ymax: 1
32
Figura 1.3. Detalle de la pantalla de seleccin de las condiciones de medida. Presionar OK para salir del men Set up.
(c)
Llenar con cido clorhidrico al 1% la cubeta de medida hasta la marca que lleva impresa, empleando una pipeta Pasteur (Figura 1.4). Es muy importante coger siempre la cubeta por los lados traslcidos. Secar suavemente con papel si hay gotas por la parte exterior de la cubeta e introducirla en el compartimento de medida (Figura 1.2b), de manera que los dos lados transparentes de la cubeta queden hacia los lados abiertos del soporte metlico. Cerrar la puerta del compartimento de medida.
Lmite de llenado
Figura 1.4 Detalle de la cubeta espectrofotomtrica de medida. 33

(d) (e) (f) Hacer click sobre Zero para ajustar a cero la absorbancia del blanco (si el valor de absorbancia no se ajustara a cero, hacer click una o dos veces ms sobre Zero). Sacar la cubeta del compartimento de medida y vaciarla. Llenar la cubeta de medida con la disolucin patrn de hierro (aclarara previamente dos veces con dicha disolucin) siguiendo las indicaciones dadas en el apartado (c), introducirla en el compartimento de medida y hacer click sobre Start para registrar el espectro. Con ayuda del ratn se puede deslizar el cursor a lo largo de la curva de absorcin obtenida. En la parte inferior derecha de la pantalla, aparecer el correspondiente valor de y de absorbancia para cada punto. De acuerdo con el espectro obtenido elegir una longitud de onda ptima de trabajo. Pintar el espectro obtenido (Print) y sobre l apuntar los valores (, A) de los mximos de absorcin.
(g)
(h)
Una vez seleccionada la longitud de onda a la que se realizarn las medidas, se proceder a medir la absorbancia de cada una de las disoluciones patrn de hierro y de la disolucin problema. Para ello: (i) (j) (k) Cerrar el men Scan y abrir con doble click sobre el icono correspondiente el men Simple Reads. Seleccionar la longitud de onda que se ha elegido para preparar la curva de calibrado haciendo click en Set up. Corregir para esa longitud de onda el valor de absorbancia del blanco (cido clorhdrico 1%) con Zero. A continuacin realizar tres lecturas de la absorbancia para cada una de las disoluciones patrn preparadas, en orden creciente de concentraciones, y para la disolucin problema, apuntando la absorbancia en cada una de ellas.
1.6. Resultados
1. Construir una recta de calibrado con los datos de absorbancia obtenidos a partir de las disoluciones patrn preparadas. Obtener los valores de la ordenada en origen, pendiente y coeficiente de correlacin de dicha recta. 2. A partir de la ecuacin de la recta de calibrado y de la medida de absorbancia en la disolucin problema, obtener la concentracin de hierro y Fe2O3 en la muestra de cemento analizada, expresada en % en peso. 3. Con los datos obtenidos por los distintos grupos de trabajo del laboratorio, realizar un tratamiento estadstico de los resultados (media, desviacin estndar y desviacin con relacin a la media), despus de haber eliminado previamente los datos discordantes. 4. Comentar los resultados obtenidos en cuanto al contenido de Fe2O3 y compararlos con datos buscados en bibliografa sobre distintos tipos de cemento. 34
1.7. Cuestiones
1. Por qu se debe calcinar la muestra antes de proceder a extraer el hierro con
la disolucin de cido clorhdrico (1:1)? 2. Qu problemas podran presentarse si la longitud de onda seleccionada para realizar las medidas no es la correcta?
35
Espectroscopia de absorcin UV-Vis Anlisis de una mezcla
Prctica 2. ANLISIS DE UNA MEZCLA DE DOS COMPUESTOS MEDIANTE ESPECTROSCOPA UV-Vis 2.1. Introduccin
La espectroscopa de absorcin UV-Vis permite el anlisis de mezclas de sustancias absorbentes, teniendo en cuenta que la absorbancia total de una disolucin a una longitud de onda dada es igual a la suma de las absorbancias de los componentes individuales presentes en la disolucin: Amezcla = Xb[X] + = Yb[Y] + = Zb[Z] . En el caso de una mezcla de dos componentes X e Y cuyos espectros solo se solapan un poco en algunas regiones, se seleccionar la longitud de onda 1, donde la especie X es la que ms contribuye al valor de la absorbancia de la mezcla, y la longitud de onda 2, donde la especie Y es la que ms contribuye al valor de la absorbancia de la mezcla. Para llevar a cabo la determinacin, se mide la absorbancia de la mezcla problema a cada una de las longitudes de onda seleccionadas (A mezcla (1) y A mezcla (2)) y se calculan ambas concentraciones utilizando las siguientes expresiones: Amezcla (1) = AX (1) + AY(1) Amezcla (2) = AX (2) + AY (2) Estas expresiones solo sern vlidas si los dos componentes de la mezcla no interaccionan entre si, y la exactitud en la determinacin ser mayor cuando exista gran diferencia entre las de las seleccionadas. Los indicadores cido-base son sistemas cido-base cuyas especies tienen diferentes colores dependiendo de su estado de protonacin. Entre los indicadores cido-base ms utilizados cabe destacar la fenoftalena, que normalmente se utiliza como indicador qumico en su transicin de incolora a rosa en el intervalo de pH 8,09,6, y el azul de bromofenol, que vira en el intervalo de pH 3.0-4.6 de amarillo a azul.
Br
OH
Br
Azul de bromofenol
Fenoftalena
En la presente prctica se determinar el contenido de fenoftalena y azul de bromofenol en una mezcla de ambos compuestos en medio alcalino mediante espectroscopa de absorcin UV-Vis
37
2.2. Objetivos
1. Aprender el manejo de un espectrofotmetro de UV-Vis. 2. Determinar la composicin de una mezcla de dos compuestos mediante espectroscopa de absorcin UV-Vis.

Cubeta espectrofotomtrica de vidrio Pipetas de 5 y 10 mL Matraces aforados de 100, 250, 500 y 1000 mL Varilla de vidrio Pipeta Pasteur con tetina de goma Vidrio de reloj o pesasustancias Vasos de precipitados de 100 y 250 mL Espectrofotmetro de UV-Vis Balanza analtica Granatario
2.4. Reactivos
Hidrxido de sodio Agua destilada Mezcla problema Fenolftalena Azul de bromofenol

a) Tome la cubeta espectrofotomtrica por los lados traslcidos, evitando dejar restos de grasa o suciedad en la celda que podran afectar a la lectura de la absorbancia. b) Asegrese que antes de introducir la cubeta espectrofotomtrica en el equipo se encuentra perfectamente limpia y seca, ya que de lo contrario al tratarse de disoluciones que contienen base pudieran daar el equipo.

Disolucin de hidrxido de sodio al 1 % (p/v). Se pesan 10 g de hidrxido de sodio comercial en un vaso de precipitados y se disuelven con unos 100 mL de agua destilada. Una vez disueltos se transfieren a un matraz aforado de 1000 mL y se completan con agua destilada hasta el enrase. Disolucin madre de azul de bromofenol 10-3 M. Se pesan 0,1670 g de azul de bromofenol en balanza analtica. Se disuelven en unos 100 mL de disolucin de hidrxido de sodio al 1 %. Una vez disueltos se transfieren a un matraz aforado de 250 mL y se completan con disolucin de hidrxido de sodio al 1 % hasta enrase. 38

Disolucin madre de fenolftalena 10-3 M. Se pesan 0,1590 g de fenolftalena en balanza analtica. Se disuelven en unos 100 mL de disolucin de hidrxido de sodio al 1 %. Una vez disueltos se transfieren a un matraz aforado de 500 mL y se completan con disolucin de hidrxido de sodio al 1 % hasta enrase.
2.5.3. Anlisis de una mezcla de dos compuestos:

2.5.3.1. Preparacin de las rectas de calibrado
Se prepararan seis disoluciones patrn de 100 mL del azul de bromofenol que contengan alcuotas de 0, 1, 2, 4, 6, 8 y 10 mL de la disolucin madre de azul de bromofenol 10-3 M y se enrasaran con la disolucin de hidrxido de sodio al 1 %. Se agitarn manualmente los matraces con la finalidad de homogeneizar las disoluciones. Se prepararan seis disoluciones patrn de 100 mL de fenolftalena, que contengan alcuotas de 0, 1, 2, 4, 6, 8 y 10 mL de la disolucin madre de fenolftalena 10-3 M y se enrasaran con la disolucin de hidrxido de sodio al 1 %. Se agitarn manualmente los matraces con la finalidad de homogeneizar las disoluciones.

(a)
(b)
Figura 2.2. (a) Espectrofotmetro de UV-Vis. (b) Detalle del compartimento de medida. Inicialmente se debe seleccionar la longitud de onda a la que se van a realizar las medidas. Para ello, utilizando una disolucin patrn de azul de bromofenol y de fenolftalena de concentracin intermedia registrar el espectro de absorcin de ambos compuestos en el intervalo de longitudes de onda comprendido entre 300 y 700 nm. Para realizar esto:
39

(a) (b) Abrir el men Scan haciendo doble click en el icono. En el men Scan para obtener el espectro, en primer lugar en el icono Set up se eligen las siguientes condiciones de medida (Figura 2.3):

Start: 700 nm Stop: 300 nm Scan controls: medium

Y mode: Absorbance Y min: 0 Y max: 1
Figura 2.3. Detalle de la pantalla de seleccin de las condiciones de medida. Presionar OK para salir del men Set up. (c) Llenar con hidrxido de sodio al 1% la cubeta de medida hasta la marca que lleva impresa, empleando una pipeta Pasteur (Figura 2.4). Es muy importante coger siempre la cubeta por los lados traslcidos. Secar suavemente con papel si hay gotas por la parte exterior de la cubeta e introducirla en el compartimento de medida (Figura 2.2b), de manera que los dos lados transparentes de la cubeta queden hacia los lados abiertos del soporte metlico. Cerrar la puerta del compartimento de medida.
Lm ite de llenado
Figura 2.4 Detalle de la cubeta espectrofotomtrica de medida.
40

(d) (e) (f) Hacer click sobre Zero para ajustar a cero la absorbancia del blanco (si el valor de absorbancia no se ajustara a cero, hacer click una o dos veces ms sobre Zero). Sacar la cubeta del compartimento de medida y vaciarla. Llenar la cubeta de medida con la disolucin patrn azul de bromofenol (aclarara previamente dos veces con dicha disolucin) siguiendo las indicaciones dadas en el apartado (c), introducirla en el compartimento de medida y hacer click sobre Start para registrar el espectro. Con ayuda del ratn se puede deslizar el cursor a lo largo de la curva de absorcin obtenida. En la parte inferior derecha de la pantalla, aparecer el correspondiente valor de y de absorbancia para cada punto. Pintar el espectro obtenido (Print) y sobre l apuntar los valores (, A) de los mximos de absorcin. A continuacin, llenar la cubeta de medida con la disolucin patrn fenoftalena siguiendo las indicaciones dadas en el apartado (c), introducirla en el compartimento de medida y hacer click sobre Start para registrar el espectro. Pintar el espectro obtenido (Print) y sobre l apuntar los valores (, A) de los mximos de absorcin. A la vista de los espectros obtenidos, elegir las dos longitudes de onda ptimas de trabajo (1 y 2).
(g)
(h) (i) (j) (k)
Una vez seleccionadas las longitudes de onda a la que se realizarn las medidas, se proceder a medir la absorbancia de cada una de las disoluciones patrn y de la mezcla problema. Para ello: (l) (m) (n) Cerrar el men Scan y abrir con doble click sobre el icono correspondiente el men Simple Reads. Seleccionar una de las longitudes de onda elegidas para realizar las medidas (1) haciendo click en Set up. Corregir para esa longitud de onda el valor de absorbancia del blanco (disolucin de hidrxido de sodio al 1 %) con Zero. A continuacin realizar tres lecturas de la absorbancia para cada una de las disoluciones patrn de azul de bromofenol y de fenolftalena, en orden creciente de concentraciones, y para la mezcla problema proporcionada por el profesor, apuntando la absorbancia de cada una de ellas. Finalmente, seleccionar la otra longitud de onda elegida para realizar las medidas (2) en Set up, corregir para esa longitud de onda el valor de absorbancia del blanco (disolucin de hidrxido de sodio al 1 %) con Zero y realizar tres lecturas de la absorbancia para cada una de las disoluciones patrn de azul de bromofenol y de fenolftalena, en orden creciente de concentraciones, y para la mezcla problema proporcionada por el profesor, apuntando la absorbancia de cada una de ellas.
(o)
41
2.6. Resultados
1. Calcular la absortividad molar para azul el bromofenol y para la fenolftalena a cada a partir de la ley de Lambert-Beer. 2. Calcular, en moles/L, la concentracin de azul de bromofenol y de fenolftalena en la mezcla problema. 3. Con los datos obtenidos por los distintos grupos de trabajo del laboratorio, realizar un tratamiento estadstico de los resultados (media, desviacin estndar y desviacin con relacin a la media), despus de haber eliminado previamente los datos discordantes.
2.7. Cuestiones
1. Qu diferencias podramos encontrarnos si las disoluciones de azul de bromofenol y de fenolftalena se hubiesen enrasado con disolucin de cido clorhdrico al 1%? 2. Qu problemas podran presentarse si la longitud de onda seleccionada para realizar las medidas no es la correcta? 3. Por qu no coincide exactamente el valor calculado para la concentracin de fenolftalena y de azul de bromofenol con respecto al esperado tericamente?
42
Espectroscopa de absorcin UV-Vis Aplicaciones cualitativas
Prctica 3. APLICACIONES CUALITATIVAS DE LA ESPECTROSCOPA UV-Vis 3.1. Introduccin

Las aplicaciones cualitativas de la espectroscopa UV-Vis son limitadas por lo que la identificacin inequvoca de una sustancia mediante el uso exclusivo de esta tcnica suele ser imposible. Sin embargo, para disoluciones simples que tienen un solo analito es posible detectar la presencia de determinados grupos funcionales. Para poder interpretar el espectro de absorcin en el UV-Vis de un compuesto orgnico hay que tener en cuenta el tipo de transiciones electrnicas posibles cuando dicho compuesto absorbe esta radiacin. En esta zona del espectro electromagntico pueden darse cuatro tipos principales de bandas de absorcin que se deben a las transiciones electrnicas: *, n *, * y n *. Los distintos tipos de transiciones pueden identificarse por la zona del espectro en la que aparecen (), por sus intensidades relativas () y, en algunos casos, por los desplazamientos observados al variar el disolvente. Para los compuestos orgnicos, son las transiciones de electrones n o al estado excitado * las que resultan de mayor inters con fines cualitativos (Figura 3.1), ya que estas transiciones requieren longitudes de onda entre los 200 y 700 nm. Ambas transiciones requieren de la existencia de un grupo funcional que aporte los orbitales (grupo cromforo). En la Tabla 1 del Anexo se da una lista de grupos cromforos comunes y la localizacin aproximada de sus mximos de absorcin.
O
n *
Electrn excitado
Figura 3.1. Representacin esquemtica de las transiciones * y n * del grupo carbonilo.
Es preciso destacar que, a diferencia de las transiciones n *, para las transiciones * la posicin de la max es prcticamente independiente de la naturaleza de los tomos que intervienen y que estas bandas suelen aparecer en la zona del UV lejano, zona del espectro poco accesible. Por otro lado, la de las bandas de absorcin asociadas a las transiciones n * suele ser baja, mientras que los valores de para las transiciones * son altos. Otra diferencia importante, se encuentra en el efecto de la polaridad del disolvente. As, un aumento en la polaridad del disolvente produce un desplazamiento hacia ms grandes (hipsocrmico o hacia el azul) de las bandas n * y un desplazamiento hacia ms pequeas (batocrmico o hacia el rojo) de las bandas *.
43
3.2. Objetivos
1. Identificar los distintos tipos de bandas en el espectro de absorcin UV-Vis de un compuesto orgnico como la acetona. 2. Determinar el valor de la absortividad molar () en el/los mximos de absorcin para un compuesto orgnico como la acetona. 3. Entender la importancia de la seleccin del tipo de disolvente y su efecto en el desplazamiento de los mximos de absorcin.

Cubeta espectrofotomtrica de vidrio Pipetas de 5 y 10 mL Vasos de precipitados de 100 y 250 mL Espectrofotmetro de UV-Vis Matraces aforados de 50 y 100 mL Pipeta Pasteur con tetina de goma
3.4. Reactivos
Acetona Dimetilformamida Etanol Hexano Agua destilada

a) Tome la cubeta espectrofotomtrica por los lados traslcidos, evitando dejar restos de grasa o suciedad en la celda que podran afectar a la lectura de la absorbancia. b) Asegrese que antes de introducir la cubeta espectrofotomtrica en el equipo se encuentra perfectamente limpia y seca, ya que de lo contrario al tratarse de disolventes orgnicos pudiera daarse el equipo.

Disolucin de acetona 0,5 M en hexano. Se toman con una pipeta 3,7 mL de acetona y se transfieren a un matraz aforado de 100 mL. Completar con hexano hasta el enrase. 44

Disolucin de acetona 0,5 M en etanol. Se toman con una pipeta 3,7 mL de acetona y se transfieren a un matraz aforado de 100 mL. Completar con etanol hasta el enrase. Disolucin de acetona 0,5 M en agua. Se toman con una pipeta 3,7 mL de acetona y se transfieren a un matraz aforado de 100 mL. Completar con agua hasta el enrase. Disolucin de acetona 0,5 M en dimetilformamida. Se toman con una pipeta 3,7 mL de acetona y se transfieren a un matraz aforado de 100 mL. Completar con dimetilformamida hasta el enrase.
3.5.3. Identificacin de las bandas de absorcin y efecto del disolvente:

(a)
(b)
Figura 3.2. (a) Espectrofotmetro de UV-Vis. (b) Detalle del compartimento de medida. Inicialmente se registrar el espectro de absorcin para la acetona en el intervalo de longitudes de onda comprendido entre 190 y 800 nm que es el intervalo de longitudes de onda en el que aparecen las bandas asociadas a los principales grupos funcionales. Para realizar esto: (a) (b) Abrir el men Scan haciendo doble click en el icono. En el men Scan para obtener el espectro, en primer lugar en el icono Set up se eligen las siguientes condiciones de medida (Figura 3.3):

Start: 800 nm Stop: 190 nm Scan controls: medium Y mode: Absorbance

Y min: 0 Y max: 1
45
Figura 3.3. Detalle de la pantalla de seleccin de las condiciones de medida. Presionar OK para salir del men Set up.
(c)
Llenar con hexano la cubeta de medida hasta la marca que lleva impresa, empleando una pipeta Pasteur (Figura 3.4). Es muy importante coger siempre la cubeta por los lados traslcidos. Secar suavemente con papel si hay gotas por la parte exterior de la cubeta e introducirla en el compartimento de medida (Figura 3.2b), de manera que los dos lados transparentes de la cubeta queden hacia los lados abiertos del soporte metlico. Cerrar la puerta del compartimento de medida.
Lmite de llenado
Figura 3.4 Detalle de la cubeta espectrofotomtrica de medida.
46

(d) (e) (f) (g) Hacer click sobre Zero para ajustar a cero la absorbancia del blanco (si el valor de absorbancia no se ajustara a cero, hacer click una o dos veces ms sobre Zero). A continuacin hacer click sobre Baseline para realizar la correccin de la absorbancia debida al disolvente. Sacar la cubeta del compartimento de medida y vaciarla. Llenar la cubeta de medida con la disolucin de acetona 0,5 M en hexano (aclararla previamente dos veces con dicha disolucin) siguiendo las indicaciones dadas en el apartado (c), introducirla en el compartimento de medida y hacer click sobre Start para registrar el espectro. Con ayuda del ratn se puede deslizar el cursor a lo largo de la curva de absorcin obtenida. En la parte inferior derecha de la pantalla, aparecer el correspondiente valor de y de absorbancia para cada punto. Pintar el espectro obtenido (Print) y sobre l apuntar los valores (, A) de los mximos de absorcin. Proceder de la misma manera con las disoluciones de acetona 0,5 M en etanol y acetona 0,5 M en agua, utilizando etanol y agua, respectivamente, para hasta ajustar a cero la absorbancia del blanco y realizar la correccin del disolvente. Por ltimo, registrar el espectro para la disolucin de acetona 0,5 M en dimetilformamida, antes y despus de realizar la correccin de la absorbancia debida al disolvente (dimetilformamida).
(h)
(i) (j) (k)
3.5.4. Determinacin de la absortividad molar:

3.5.4.1. Preparacin de las rectas de calibrado
Preparar seis disoluciones patrn, de 50 mL, que contengan alcuotas de 0, 1, 2, 4, 6, 8 y 10 mL de la disolucin de acetona 0,5 M en hexano y se enrasaran con hexano. Se agitarn manualmente los matraces con la finalidad de homogeneizar las disoluciones.

Una vez identificadas las bandas de absorcin en el espectro de la acetona en hexano y seleccionadas las longitudes de onda de los mximos de absorcin, procedemos a la determinacin del valor de la absortividad molar () a dichas longitudes de onda. Para ello: (l) (m) Cerrar el men Scan y abrir con doble click sobre el icono correspondiente el men Simple Reads. Seleccionar la longitud de onda que se ha elegido para realizar las medidas haciendo click en Set up.
47

(n) Corregir para esa longitud de onda el valor de absorbancia del blanco (hexano) con Zero. A continuacin realizar tres lecturas de la absorbancia para cada una de las disoluciones patrn preparadas, en orden creciente de concentraciones.
3.6. Resultados
1. A la vista del espectro de absorcin obtenido para la acetona en hexano, identifica el tipo de transicin electrnica correspondiente a cada una de las bandas observadas en el mismo. 2. Qu ocurre con los mximos de absorcin de las bandas observadas en el espectro cuando pasamos de hexano a etanol y de etanol a agua? 3. Qu ocurre cuando se registra el espectro de absorcin de la acetona disuelta en dimetilformamida, antes y despus de ajustar la absorbancia a cero con el blanco? 4. Calcular el valor de para la acetona en hexano, a las longitudes de onda seleccionadas. 5. Comentar los resultados obtenidos en cuanto al valor de para la acetona en hexano, a las longitudes de onda seleccionadas, y compararlos con datos encontrados en bibliografa.
3.7. Cuestiones
1. Qu es un desplazamiento hipsocrmico? Y un desplazamiento batocrmico? Qu tipos de transiciones podemos diferenciar en base a estos tipos de desplazamiento como consecuencia a un aumento en la polaridad del disolvente? 2. Qu es la longitud de corte de un disolvente?. Cul es esta longitud de onda para la dimetilformamida?
48
Espectroscopa de absorcin en el IR Fundamento terico
II. ESPECTROSCOPA DE ABSORCIN EN EL INFRARROJO Fundamento terico

Las tcnicas espectroscpicas de anlisis se basan en el hecho de que los compuestos, por aplicacin de radiacin electromagntica, absorben energa en cantidades discretas llamadas cuantos o fotones. La absorcin de energa provoca en dicho compuesto una transicin de niveles energticos desde el estado fundamental de mnima energa (M) a un estado excitado (M*). La diferencia de energa entre ambos estados es igual a h, siendo la frecuencia de la radiacin absorbida: M + h M* La representacin de la absorbancia (A) o transmitancia (T) de la radiacin incidente en funcin de su longitud de onda, frecuencia o nmero de onda recibe el nombre de espectro. El tipo de espectroscopa esta determinada por la regin del espectro electromagntico a la que corresponda la radiacin aplicada. As, la regin infrarroja (IR) del espectro est comprendida entre la zona del visible y de las microondas. En un espectro de IR (Figura 1) habitualmente se representa %T frente a nmero de onda (cm-1).
100
Transmitancia (%)
80
60
40
20 3600
3200
2800
2400
2000
-1
1600
1200
800
Nmero de Onda (cm )
Figura 1. Espectro de absorcin IR.
Cuando la radiacin electromagntica incide sobre una molcula, el efecto producido en la misma depende del tipo de radiacin incidente. As, la radiacin IR estimula el movimiento vibracional de las molculas cuando la absorben. Para entender esto, podemos imaginar un enlace como un resorte que conecta los dos tomos en una molcula. Cuando esos resortes vibran, slo pueden hacerlo con ciertas frecuencias y, por tanto, las molculas slo pueden tener ciertos niveles de energa vibracional. Estas vibraciones pueden ser descritas por la ley de Hooke, es decir, la frecuencia de vibracin es directamente proporcional a la fuerza del enlace ( f ) e inversamente proporcional a las masas de los tomos enlazados (m1 y m2):
~ = frecuencia de vibracin en nmeros de onda
(m + m2 ) ~ =k f 1 m1m2
k =constante f = constante de fuerza m1, m2 = masa de los tomos
49

Una molcula poliatmica posee muchos enlaces, por lo tanto es de esperar que presente un gran nmero de vibraciones y, como consecuencia, de absorciones en el IR. En concreto, una molcula no lineal que contenga n tomos puede sufrir 3n-6 modos normales de vibracin y si es lineal 3n-5. Las vibraciones en las que varan las distancias entre los tomos pero no los ngulos de enlace se llaman vibraciones de tensin y pueden ser simtricas o asimtricas (Figura 2). Aquellas en las que por el contrario son los ngulos de enlace los que cambian se denominan vibraciones de flexin (tijereteo, balanceo, aleteo y torsin).
Tensin simtrica
Flexin simtrica en el plano (movimiento de tijera)
Flexin simtrica fuera del plano (movimiento de torsin)
Tensin asimtrica
Flexin asimtrica en el plano Flexin asimtrica fuera (movimiento de balanceo) del plano (movimiento de aleteo)
Figura 2. Modos normales de vibracin en una molcula. Existen distintos tipos de instrumentos para la medida de la absorcin de radiacin en el IR, aunque los ms utilizados actualmente son los espectrmetros de IR de transformada de Fourier (FTIR). En estos instrumentos se detectan todas las longitudes de onda y se miden de forma simultnea, lo cual explica que se les denomine instrumentos multiplex. Adems, permiten realizar medidas de longitud de onda de manera rpida con elevada sensibilidad y precisin (Figura 3). Requieren una fuente de radiacin continua en el infrarrojo (fuente lser de dixido de carbono, por ejemplo), un detector sensible a este tipo de radiacin y un interfermetro, para descomponer el espectro en trminos de potencia radiante en funcin de la longitud de onda.
50
3 2
Figura 3. Espectrmetro de IR, (1) fuente lser, (2) espejos, (3) detector, (4) lugar donde se coloca la muestra. Para llevar a cabo un anlisis mediante espectroscopa de IR es muy importante una manipulacin adecuada de la muestra, ya que esta etapa suele ser la ms difcil y la que requiere ms tiempo. Pueden realizarse espectros de infrarrojo de gases, slidos y lquidos. El espectro de un lquido puede obtenerse directamente del lquido puro o empleando una disolucin del mismo en un disolvente apropiado. En muestras de lquidos puros se utilizan dos discos o pastillas de NaCl o KBr entre las que se deposita una gota de la muestra. A continuacin, las pastillas se montan con cuidado en el soporte (Figura 4), el cual se coloca en el espectrmetro para realizar la medida.
Figura 4. Soporte desmontable para la colocacin de pastillas para anlisis de IR.
51

Para muestras slidas o lquidas en disolucin se utilizan celdas especiales en las que se introduce el compuesto disuelto. Las muestras de slidos pueden prepararse como disoluciones (al igual que en el caso de los lquidos), emulsiones o dispersiones slidas en KBr. Las emulsiones se preparan mezclando una pequea cantidad de la muestra slida con un par de gotas de aceite mineral (nujol). Una gota de esa pasta se utiliza para preparar una muestra, tal como se ha descrito para las muestras de lquidos puros. Este mtodo presenta el inconveniente de que el aceite tiene absorciones en algunas regiones del espectro IR, lo que debe de ser tenido en cuenta a la hora de analizar el espectro obtenido. En el caso de las dispersiones slidas, se prepara una mezcla del producto con KBr compuesto por partculas de grano muy fino. La mezcla se tritura con ayuda de un mortero. Una pequea cantidad se introduce en una prensa (Figura 5), donde se fabrica un pequeo disco o pastilla transparente, la cual se monta en un soporte Figura 5. Prensa para la obtencin adecuado y se introduce en el de pastillas para anlisis mediante espectrmetro. espectroscopa de IR. La espectroscopa de IR es una tcnica verstil que permite llevar a cabo tanto determinaciones cualitativas como cuantitativas. La regin del espectro ms utilizada para realizar estas medidas es el IR medio (4.000 a 400 cm-1). Para llevar a cabo la identificacin de un compuesto orgnico a partir de su espectro de absorcin en el IR se debe, en primer lugar, estudiar la zona que abarca la radiacin comprendida entre 4.000 y 1.200 cm-1 (regin de frecuencias de grupo), que permitir determinar que grupos funcionales se encuentran presentes en la molcula. A continuacin, se comparar el espectro del compuesto a identificar con espectros de compuestos puros que contienen esos mismos grupos funcionales. Para esto es muy til comparar la regin de la huella dactilar, entre 1.200 y 400 cm-1, puesto que pequeos cambios en la estructura de una molcula producen cambios importantes en el aspecto de esta zona del espectro.
52
Espectroscopa de IR Aplicaciones cualitativas
Prctica 4. APLICACIONES CUALITATIVAS DE LA ESPECTROSCOPA DE INFRARROJO 4.1. Introduccin

Cuando una muestra se somete a radiacin electromagntica de la zona infrarroja (IR) del espectro, si la frecuencia de la radiacin electromagntica incidente es igual a una de las frecuencias de vibracin de las molculas de dicha muestra, se producir una absorcin de energa, pasando las molculas a un nivel vibracional superior. Por tanto, si se analiza la radiacin que emerge al realizar un barrido con radiacin IR de distintas frecuencias y se representa el porcentaje de radiacin transmitida (% T) o absorbida (% A) frente al nmero de onda (cm-1) se obtiene el espectro de absorcin en el IR para dicho compuesto. Debido al elevado nmero de absorciones que presenta una molcula orgnica, se puede afirmar que no hay dos molculas que presenten un espectro de absorcin en el IR absolutamente idntico. Es por ello, que esta tcnica se utiliza para identificar compuestos por comparacin de su espectro, por ejemplo, con los espectros de molculas conocidas recogidos en una base de datos informatizada. Aunque, en principio, el espectro de absorcin en el IR de una molcula de tamao medio es complicado, los grupos funcionales presentes en la misma tienen frecuencias de vibracin caractersticas y sus bandas de absorcin aparecen en posiciones determinadas del espectro (regin de frecuencias de grupo). El estudio de estas bandas permite hacer estimaciones sobre qu grupos funcionales es probable que estn presentes o ausentes en la molcula analizada. Las bandas caractersticas de los grupos funcionales ms importantes aparecen en la Tabla 2 del Anexo. Estas tablas de correlacin servirn como punto de partida para el proceso de identificacin de un compuesto, pero por si solas no permitirn el establecimiento inequvoco de la identidad o estructura del mismo. En un espectro de absorcin en el IR, se conoce como zona de la huella dactilar a la zona que est comprendida entre 1.200 a 600 cm-1, pues es la zona de mayor complejidad del espectro en la que aparecen un gran nmero de bandas. Pequeas diferencias en la estructura y composicin de una molcula dar lugar a grandes cambios en la distribucin de los picos de absorcin en esta zona del espectro. Por lo tanto, un gran parecido en la regin de la huella dactilar de los espectros de dos compuestos constituye una evidencia casi segura de su identidad. En cualquier caso, ser la combinacin de la espectroscopa de IR con otras tcnicas, como el anlisis elemental, la espectrometra de masas y la espectroscopa de resonancia magntica nuclear, lo que permitir una identificacin inequvoca del compuesto. En la presente prctica se tratar de identificar las bandas de absorcin presentes en los espectros de IR de distintos compuestos orgnicos.
53
4.2. Objetivos
1. Realizar la preparacin muestras lquidas para su anlisis por espectroscopa de absorcin en el IR. 2. Aprender el manejo de un espectrmetro de FTIR. 3. Identificar los diferentes tipos de bandas que aparecen en los espectros de IR de algunos orgnicos.

Pastillas de KBr Pipeta Pasteur con tetina de goma Espectrmetro de FTIR Soporte para pastillas de IR
4.4. Reactivos
Acetofenona Hexano N, N-dimetilanilina Tolueno

a) Las pastillas nunca deben de tocarse con los dedos, nicamente por los bordes, y deben de manejarse con cuidado debido a su fragilidad. b) La limpieza de las pastillas se efecta con acetona, frotndolas suavemente con un trozo de papel impregnado en dicho disolvente. Nunca emplear agua, pues disolver inmediatamente las pastillas ya que son de KBr. c) No realizar ninguna operacin en el ordenador del espectrmetro, aparte de las indicadas en la prctica. Para cualquier problema avisar inmediatamente al profesor de prcticas. El espectrmetro es un instrumento que debe de ser manejado con el mximo cuidado.
4.5.2. Identificacin de las bandas de absorcin:

4.5.2.1. Preparacin de las muestras
Para preparar la muestra, se deposita una gota de la misma sobre un disco o pastilla de KBr y, a continuacin, se coloca una segunda pastilla sobre la primera. La gota de muestra depositada forma una pelcula entre ambas y las mantiene adheridas.
54

Seguidamente, las pastillas se colocan con cuidado en el soporte, el cual se coloca en el espectrmetro para realizar la medida (Figuras 4.1 y 4.2). (a) Muestra pipeteada a extender sobre el disco de KBr Pastilla de KBr (b) Segunda pastilla de KBr Muestra
Pastillas de KBr unidas por la tensin superficial
(c) Radiacin infrarroja incidente Figura 4.1. Preparacin de una muestra lquida para espectroscopa de IR. (a) Aplicacin de la muestra sobre la pastilla de KBr. (b) Se juntan las dos pastillas de KBr. (c) Colocacin de las pastillas en el espectrmetro de IR. Radiacin infrarroja transmitida
Figura 4.2. Soporte desmontable para la colocacin de pastillas para anlisis mediante espectroscopa de IR.
55
Espectroscopa de IR Aplicaciones cualitativas 4.5.2.2. Anlisis espectromtrico

En la Figura 4.3 se muestra el espectrmetro de FTIR que se utilizar en la presente prctica.
Figura 4.3. Espectrmetro de FTIR.
Registrar el espectro de IR para la acetofenona, hexano, tolueno y N, Ndimetilanilina. Antes de empezar, comprobar que el ordenador del espectrmetro est encendido y el programa EZ OMNIC iniciado (si no es as consultar con el profesor de prcticas). Para la adquisicin de un espectro proceder como se indica a continuacin: (a) Hacer clic sobre Collect en el men principal y, seguidamente, en el men desplegable hacer clic sobre Experiment Setup. En ese momento aparece una pantalla como la que se muestra en la Figura 4.4 y se eligen las condiciones de medida: No. of scans: 32 Resolution: 4 Final Format: % Transmitance Collect background before every sample
56
Figura 4.4. Detalle de la pantalla de seleccin de condiciones de medida. (b) Hacer doble clic sobre Col.Smp y, seguidamente, pulsar OK. En ese momento en la pantalla aparecer un mensaje como el que se observa en la Figura 4.5, pulsar OK. En este momento el equipo realizar un background (o blanco) que luego restar al espectro de la muestra.
Figura 4.5. Detalle de la pantalla antes de realizar el background. (c) Cuando el equipo ha terminado de realizar el background en la pantalla aparece un mensaje como el que se muestra en la Figura 4.6. Colocar la muestra en el
57

espectrmetro, cerrar el compartimiento de medida y pulsar OK. En ese momento el espectrmetro empezar a adquirir los datos.
Figura 4.6. Detalle de la pantalla despus de realizar el background. (d) (e) Al terminar el proceso, el programa nos preguntar si queremos que nos enve el espectro hacia la ventana 1, hacer clic en Yes. Hacer clic sobre Analyze en el men principal y, seguidamente, en el men desplegable hacer clic sobre Find peaks. Cuando todos los picos estn sealados pulsar Replace y el nuevo espectro remplazar al anterior. Finalmente, hacer clic sobre Print para imprimir el espectro. Para analizar la siguiente muestra, retiramos del instrumento el soporte con la pastilla y se contina a partir del apartado (b). Una vez realizadas todas las medidas se cierra el programa y se apaga el ordenador, pero nunca se apaga el equipo de infrarrojo.
(f) (g) (h)
4.6. Resultados
1. Identificar en los espectros obtenidos para la acetofenona, hexano, tolueno y N, N-dimetilanilina, las bandas debidas a los distintos grupos funcionales presentes cada compuesto.
58
4.7. Cuestiones
1. Por qu es necesario realizar un background o blanco antes de proceder a analizar cada una de las muestras? 2. Es posible diferenciar por espectroscopa de IR el 2-butanol del 1-butanol?. Por qu? 3. A partir de los espectros mostrados en la Figura 4.7, identifica cual corresponde al ciclohexano y cual al benzaldehdo. Seala las bandas de IR correspondientes a los grupos funcionales ms caractersticos. (a)
Transmitancia (%)
80
60
40
20
(b)
4000
3500
3000
2500
2000
-1
1500
1000
500
nmero de onda (cm )
80
Transmitancia (%)
60
40
20
0 3500
3000
2500
2000
1500
-1
1000
500
nmero de onda (cm )
Figura 4.7. Espectros de IR para el ciclohexano y benzaldehdo.
59
Espectrocopa de IR - Identificacin de carbohidratos en cereales
Prctica 5. IDENTIFICACIN DE CARBOHIDRATOS EN CEREALES PARA DESAYUNO MEDIANTE ESPECTROSCOPA DE INFRARROJO 5.1. Introduccin
Los carbohidratos son el nutriente mayoritario en los cereales para desayuno (entre el 75-90 %). Estos nutrientes proceden principalmente de los cereales a partir de los que estn elaborados (maz, trigo, avena, arroz, etc) y de los azcares aadidos (sacarosa, jarabe de glucosa, miel, caramelo, etc), siendo la cantidad de azcares aadidos muy variable entre las distintas marcas comerciales. Se trata principalmente de carbohidratos complejos (almidn) que se absorben lentamente y proporcionan energa durante un periodo de tiempo prolongado y, en menor medida, de azcares sencillos como la sacarosa (azcar comn), glucosa y fructosa (Figura 5.1).
CHO H HO H H OH H OH OH CH2OH HO HO H CH2OH O H H OH CH2OH
HOH2C HO H H H CH2OH H OH O OH H O H H OH OH CH2OH H O
Glucosa
Fructosa
CH2OH H H O CH2OH H H O OH H O OH H H OH OH CH2OH O H O H OH OH H H H CH2OH H H O OH H O OH H H OH CH2OH
Sacarosa
O H O H OH CH2 H OH O H OH H OH H H
Almidn Figura 5.1 Estructura de los carbohidratos estudiados en esta prctica. En los espectros de infrarrojo (IR) de los carbohidratos las bandas de absorcin ms caractersticas, asignadas a la vibracin de tensin de los enlaces C-O y C-C, se localizan en la regin entre 1.200 y 950 cm-1. As, la banda ms intensa aparece a 1.062, 1.147 y 1.032 cm-1 para la fructosa, galactosa y glucosa, respectivamente. Tambin se observan las bandas debidas a las vibraciones de tensin y flexin de los enlaces C-H en los rangos de 2.800-3.000 y 1.450-1.500 cm-1, respectivamente. La banda correspondiente a la vibracin de tensin del enlace O-H aparece en el rango de 3.500-3.200 cm-1 como una banda ancha e intensa. En la presente prctica se identificarn los diferentes tipos carbohidratos presentes en cereales para desayuno a partir de la posicin de bandas que aparecen en sus espectros de IR.
61
5.2. Objetivos
1. Realizar la preparacin de una muestra slida para su anlisis por espectroscopa de absorcin en el IR. 2. Aprender el manejo de un espectrmetro de FTIR. 3. Identificar los diferentes tipos de bandas que aparecen en los espectros de IR de algunos carbohidratos. 4. Identificar los principales carbohidratos constituyentes de diferentes tipos de cereales para desayuno a partir de las bandas de absorcin que aparecen sus espectros de IR.

Mortero o molinillo elctrico Pesasustancias Prensa Espectrmetro de FTIR Soporte para pastillas de IR Balanza analtica
5.4. Reactivos
Bromuro de potasio Nitrgeno lquido Muestras de cereales para desayuno

a) Las pastillas nunca deben de tocarse con los dedos, nicamente por los bordes, y deben de manejarse con cuidado debido a su fragilidad. b) La limpieza de las pastillas se efecta con acetona, frotndolas suavemente con un trozo de papel impregnado en dicho disolvente. Nunca emplear agua, pues disolver inmediatamente las pastillas ya que son de KBr. c) No realizar ninguna operacin en el ordenador del espectrmetro, aparte de las indicadas en la prctica. Para cualquier problema avisar inmediatamente al profesor de prcticas. El espectrmetro es un instrumento que debe de ser manejado con el mximo cuidado. d) Se debe extremar el cuidado en el manejo del nitrgeno lquido ya que puede ocasionar quemaduras graves.
62
5.5.2. Identificacin de carbohidratos:

Triturar los cereales para desayuno en un mortero o molino hasta obtener partculas de grano muy fino. En el caso de cereales con un elevado contenido en azcar, congelarlos antes mediante la adicin de nitrgeno lquido. Preparar una mezcla de los cereales molidos con la sal (KBr) en proporcin 1:1. La mezcla se tritura y homogeniza bien con ayuda de un mortero. Una pequea cantidad se introduce en una prensa para obtener un disco transparente o pastilla, la cual se coloca en un soporte adecuado y se introduce en el espectrmetro de FTIR (Figura 5.2).
(a)
(b)
Figura 5.2. (a) Prensa para la obtencin de las pastillas para anlisis mediante espectroscopa de IR. (b) Soporte desmontable para la colocacin de pastillas para anlisis mediante espectroscopa de IR.
5.5.2.2. Anlisis espectromtrico

Registrar el espectro de IR para la glucosa, fructosa, sacarosa y almidn as como para los distintos cereales para desayuno suministrados por el profesor. En la Figura 5.3 se muestra el espectrmetro de FTIR que se utilizar en la presente prctica. Antes de empezar, comprobar que el ordenador del instrumento est encendido y el programa EZ OMNIC iniciado (si no es as consultar con el profesor de prcticas).
63
Figura 5.3 Espectrmetro FTIR. Para la adquisicin de un espectro proceder como se indica a continuacin: (a) Hacer clic sobre Collect en el men principal y, seguidamente, en el men desplegable hacer clic sobre Experiment Setup. En ese momento aparece una pantalla como la que se muestra en la Figura 5.4 y se eligen las condiciones de medida tal y como aparecen en la Figura 5.4: No. of scans: 32 Resolution: 4 Final Format: % Transmitance Collect background before every sample
Figura 5.4. Detalle de la pantalla de seleccin de condiciones de medida. 64

(b) Hacer doble clic sobre Col.Smp y, seguidamente, pulsar OK. En ese momento en la pantalla aparecer un mensaje como el que se observa en la Figura 5.5 y pulsar OK. En este momento el equipo realizar un background (o blanco) que luego restar al espectro de la muestra.
Figura 5.5. Detalle de la pantalla antes de realizar el background. (c) Cuando el equipo ha terminado de realizar el background en la pantalla aparece un mensaje como el que se muestra en la Figura 5.6. Colocar la muestra en el espectrmetro, cerrar el compartimiento de medida y pulsar OK. En ese momento el espectrmetro empezar a adquirir los datos.
Figura 5.6 Detalle de la pantalla despus de realizar el background.
65

(d) (e) Al terminar el proceso, el programa nos preguntar si queremos que nos enve el espectro hacia la ventana 1, hacer clic en Yes. Hacer clic sobre Analyze en el men principal y, seguidamente, en el men desplegable hacer clic sobre Find peaks. Cuando todos los picos estn sealados pulsar Replace y el nuevo espectro remplazar al anterior. Finalmente, hacer clic sobre Print para imprimir el espectro. Para analizar la siguiente muestra, retiramos del instrumento el soporte con la pastilla y se contina a partir del apartado (b). Una vez realizadas todas las medidas se cierra el programa y se apaga el ordenador, pero nunca se apaga el equipo de infrarrojo.
(f) (g) (h)
5.6. Resultados
1. Identificar las bandas pertenecientes a los enlaces C-H y O-H en el espectro de IR obtenido para la glucosa (Tabla 2 Anexo). 2. Comparar los espectros obtenidos para la glucosa y fructosa e identificar en dichos espectros las bandas pertenecientes al enlace C=O. 3. Comparar los espectros obtenidos para los patrones (glucosa, fructosa, sacarosa y almidn) con el obtenido para los cereales de desayuno analizados. Cul de estos carbohidratos est presente mayoritariamente en los cereales? 4. Comparar los espectros obtenidos para los distintos cereales para desayuno analizados y a partir de la intensidad de la banda observada entre 3.000 y 3.600 cm-1 intentar deducir cual es el que presenta mayor contenido en carbohidratos.
5.7. Cuestiones
1.
A que puede atribuirse la elevada intensidad que presentan las bandas que se observan en los espectros obtenidos para los cereales de desayuno en torno a 2.900 y 2.850 cm-1?
66
Espectroscopa de absorcin atmica Fundamento terico
III. ESPECTROSCOPA DE ABSORCIN ATMICA Fundamento terico

La espectroscopa de absorcin atmica (AAS) es una tcnica instrumental que se basa en la absorcin de radiacin, en las regiones UV, Vis e IR del espectro electromagntico, por parte de tomos o iones elementales en estado gaseoso. Los espectros atmicos se originan de las transiciones electrnicas entre orbitales atmicos y producen lneas de absorcin delgadas (tpicamente del orden de < 0,01 nm), a diferencia de lo que ocurre en los espectros de absorcin molecular UV-Vis. En la Figura 1 se muestra un esquema de un espectrofotmetro de absorcin atmica de llama (FAAS), que es uno de los ms utilizados.
Lmpara de Ctodo Hueco I0 Llama I Monocromador Combustible Oxidante Dispositivo de medida Disolucin problema Detector Amplificador
Figura 1. Esquema de un espectrofotmetro de FAA de haz sencillo. Para llevar a cabo un anlisis con este instrumento, la disolucin problema se aspira y se nebuliza en forma de aerosol en una llama larga y delgada, que se encuentra a una temperatura entre 1.700 y 2.800 C. El lquido se evapora, y se produce la atomizacin (separacin de tomos) del analito en la llama. El camino ptico de la llama suele ser de 10 cm y el ancho de 2 a 3 mm. La forma de la llama permite pasar la radiacin incidente a travs de un suministro continuo de la muestra atomizada. Al pasar la radiacin que proviene de la fuente por la llama se reduce su intensidad de I0 a I. Entonces, un detector (por lo general un tubo fotomultiplicador) mide la intensidad de la radiacin incidente. La absorbancia viene dada por log (I0/I) que, de acuerdo con la ley de Lambert-Beer, se relaciona con la concentracin de analito en la muestra. Puesto que los anchos de banda en espectroscopa atmica son muy pequeos, es de especial importancia que la fuente sea capaz de producir radiacin de longitud de onda adecuada y con el menor ancho de banda posible. Esto se consigue mediante el uso de fuentes de lneas como, por ejemplo, una lmpara de ctodo hueco (Figura 2).
Figura 2. Lmpara de ctodo hueco. 67

As, por ejemplo, una lmpara de ctodo hueco de sodio, en la que los tomos de sodio se excitan con una descarga elctrica, podra utilizarse para determinar este elemento en una muestra. Mediante un monocromador es posible seleccionar una lnea de emisin de la lmpara y eliminar la mayor parte de emisin posible procedente de la llama. Se requiere, por tanto, una lmpara diferente para determinar cada elemento, aunque en la actualidad existen en el comercio lmparas multielementales con ms de un elemento en el ctodo. La atomizacin suele ser, por lo general, la etapa crtica en los anlisis mediante AAS, ya que de ella depende la precisin de las medidas, la sensibilidad analtica y el grado de interferencias. La mayor parte de los espectrofotmetros de llama utilizan un mechero de flujo laminar (Figura 3) en el que el combustible, oxidante y muestra se mezclan antes de su introduccin en la llama. La disolucin problema se introduce mediante un nebulizador neumtico haciendo pasar una fuerte corriente de oxidante por el extremo de un capilar, por el que se aspira la disolucin.
Figura 3. Mechero de flujo laminar. La combinacin ms frecuente de combustible-oxidante es acetileno-aire, aunque para atomizar elementos de alto punto de ebullicin (elementos refractarios), es preferible utilizar oxigeno u xido nitroso como agente oxidante, ya que se alcanzan temperaturas de hasta 3.100 C. Si la llama es relativamente rica en combustible se aumenta la sensibilidad, mientras que si la llama es pobre en combustible es ms caliente. La llama tiene un perfil como el que se muestra en la Figura 4, con Cono ms externo una zona de combustin primaria, una zona interconal y una zona de Regin interconal combustin secundaria. Es en la zona interconal donde habitualmente se Zona de combustin primaria realizan las medidas, aunque la altura en la llama en la cual se observa la mxima absorcin atmica depender del elemento que se mida y de los caudales de muestra, de combustible y de oxidante. Figura 4. Regiones de la llama. 68

En espectroscopa de absorcin atmica son frecuentes las interferencias, las cuales pueden ser de dos tipos: espectrales y qumicas. Se presentan interferencias espectrales cuando la seal del analito se solapa con seales debidas a otros elementos o molculas que hay en la muestra o con seales debidas a la llama. La espectroscopa atmica debe incorporar, por tanto, una correccin de fondo para distinguir la seal del analito de la absorcin, emisin y dispersin ptica de la matriz de la muestra o de la llama. Esta correccin puede hacerse mediante una fuente continua, una lmpara de deuterio por ejemplo, y consiste en pasar la radiacin emitida por dicha lmpara a travs de la llama, alternando con la lmpara de ctodo hueco. La radiacin procedente de la lmpara de ctodo hueco es absorbida por el analito y absorbida y dispersada por el fondo, mientras que la procedente de la lmpara de deuterio solo es absorbida y dispersada por el fondo. La diferencia entre ambas absorbancias es la debida al analito. Sin embargo, las interferencias qumicas son las ms comunes y se producen cuando durante la atomizacin ocurren diversos procesos qumicos que alteran la absorcin del analito. Entre las interferencias qumicas cabe destacar la formacin de compuestos poco voltiles que disminuyen el grado de atomizacin del analito. Estas interferencias pueden evitarse adicionando a la muestra agentes liberadores, que interaccionan con el interferente evitando as que ste lo haga con el analito, o agentes protectores que forman con el analito especies estables voltiles. La espectroscopa de absorcin atmica es una tcnica muy sensible que permite la determinacin cuantitativa de un gran nmero de elementos. Sin embargo, la absorcin que se observa en los espectrofotmetros de llama puede variar de forma importante de un equipo a otro, utilizando incluso el mismo tipo de muestra. Esto es debido a la influencia de numerosas variables como la temperatura de la llama, la sensibilidad del detector, etc. Debido a esto, para obtener resultados fiables es necesario el calibrado de los equipos mediante el uso de patrones. Para ello suele recurrirse al mtodo de la adicin estndar ya que permite contrarrestar, parcialmente o por completo, las interferencias qumicas y espectrales producidas por la matriz de la muestra. Este mtodo (Figura 5) consiste en adicionar cantidades conocidas de analito a la disolucin problema. A partir del aumento de seal producido se deduce cunto analito haba en la disolucin problema de la muestra.
1 0,9 0,8 0,7 Concentracin de analito en la disolucin 0,6 problema 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 -3 -2 -1-0,1 0 Abs
C analito aadido
Figura 5. Ejemplo de una recta de calibrado por el mtodo de la adicin estndar.
69
Espectroscopa de AA - Determinacin de cobre en aleaciones metlicas
Prctica 6. DETERMINACIN DE COBRE EN ALEACIONES METLICAS MEDIANTE ESPECTROSCOPA DE ABSORCIN ATMICA 6.1. Introduccin
El cobre es un elemento qumico de nmero atmico 29 y smbolo Cu. Es uno de los metales ms importantes industrialmente. De coloracin rojiza es dctil, maleable y buen conductor de la electricidad. Es posible que el cobre haya sido el metal ms antiguo empleado, pues se han encontrado objetos de cobre del 8700 a.C. En la mayora de sus compuestos presenta estados de oxidacin bajos, siendo el ms comn el +2. Expuesto al aire, el color rojo salmn inicial se torna rojo violeta por la formacin de xido de cobre (I) (Cu2O) para ennegrecerse, posteriormente, por la formacin de xido de cobre (II) (CuO). Existen diversas aleaciones metlicas basadas en cobre, entre las que cabe destacar el bronce y el latn. El bronce es el nombre con el que se denominan toda una serie de aleaciones metlicas que tienen como base el cobre, entre un 3-20 % de estao y proporciones variables de otros elementos como zinc, aluminio, antimonio y fsforo. Por su elevado calor especfico, el mayor de todos los slidos, se emplea en aplicaciones de transferencia de calor. Presenta una buena ductilidad y buena resistencia al desgaste y la corrosin. Actualmente, se emplea en aleaciones conductoras del calor y en bateras elctricas, principalmente. El latn es una aleacin de cobre y zinc. Es ms duro que el cobre, es dctil y puede forjarse en planchas finas. Su maleabilidad vara segn la composicin y la temperatura, y es distinta si se mezcla con otros metales, incluso en cantidades mnimas. Algunos tipos de latn son maleables nicamente en fro, otros slo en caliente, y algunos no lo son a ninguna temperatura. Las aplicaciones de los latones abarcan los campos ms diversos, desde el armamento, pasando por la ornamentacin, hasta los tubos de condensador y terminales elctricos. Puesto que las propiedades de los latones y bronces pueden variar en funcin de su contenido en cobre, la determinacin de este metal en estas aleaciones adquiere especial inters. As, este metal puede determinarse por mtodos gravimtricos, volumtricos o mediante el empleo de diversas tcnicas instrumentales tales como la espectroscopa de absorcin molecular UV-Vis o la espectroscopa de absorcin atmica (AAS). En esta prctica se pretende determinar el contenido de cobre en una aleacin metlica (muestra de bronce o de latn). Para ello, previamente se deber realizar una disolucin cida de la muestra. Posteriormente, el cobre se determinar en la disolucin problema obtenida mediante lectura de la absorbancia en un espectrofotmetro de absorcin atmica. utilizando una llama de acetileno-aire.
71
6.2. Objetivos
1. Realizar el tratamiento de una muestra real como etapa previa al anlisis. 2. Aprender el manejo de un espectrofotmetro de absorcin atmica. 3. Determinar el contenido de cobre en muestras de bronce y latn.

Kitasato de 500 mL Placa filtrante de poro n 4 Pipeta Pasteur con tetina de goma Varilla de vidrio Vidrio de reloj o pesasustancias Balanza analtica Goma adaptadora Sistema de succin a vaco Lmpara de ctodo hueco de cobre Matraz aforado de 50, 100, 250 y 1000 mL Pipetas de 1, 2, 5 y 10 mL Probeta de 50 mL Vasos de precipitados de 100, 250 mL Embudo de vidrio Estufa Placa calefactora Espectrofotmetro de absorcin atmica
6.4. Reactivos
cido ntrico Nitrato de cobre(II) trihidratado Agua Milli-Q Acetona Muestra de bronce Muestra de latn

6.5.1. Precauciones a tener en cuenta en la prctica:
a) La disolucin de la muestra debe realizarse en campana extractora debido a la produccin de vapores nitrosos de color marrn que son altamente txicos. b) Una vez finalizada la prctica, el residuo slido generado se desechar al recipiente de residuos slidos. c) Al finalizar, la prctica. la placa filtrante se lavar con cido ntrico comercial, para eliminar restos de precipitado, y despus con abundante agua destilada. Estas operaciones deben realizarse con el sistema de succin a vaco. d) El equipo de absorcin atmica debe manejarse con mucha precaucin, por emplear gases explosivos como el acetileno, atendiendo en todo momento a las indicaciones del profesor. Evitar el contacto visual con la llama y lmparas. 72

Disolucin cido ntrico al 1 % (v/v). Disolver 10 mL de cido ntrico comercial en agua Milli-Q. Enrasar con agua Milli-Q hasta 1000 mL. Disolucin de cobre 1.000 ppm (p/v). Disolver 0,9602 g de nitrato de cobre(II) trihidratado en 50 mL de disolucin de cido ntrico al 1 %. Transferir la disolucin a un matraz aforado de 250 mL y enrasar con disolucin de cido ntrico al 1 %. Disolucin de cobre 100 ppm (p/v). Transferir 10 mL de la disolucin de cobre(II) de 1.000 ppm a un matraz aforado de 100 mL y enrasar con la disolucin de cido ntrico al 1 %.
6.5.3. Determinacin de cobre:

6.5.3.1. Disolucin de la muestra
Pesar en una balanza analtica del orden de 1 g de bronce o de latn (anotar el peso exacto). Si la muestra de bronce o de latn no es en polvo y se encuentra en trozos slidos, stos se debern lavar con acetona para eliminar restos de materia orgnica que puedan contener. Posteriormente, se secar en la estufa durante unos instantes para eliminar la acetona. La disolucin de la muestra (Figura 6.1a) se lleva a cabo en un vaso de precipitados de 250 mL, adicionando sobre ella 10 mL de agua destilada y 15 mL de HNO3 comercial. Se calienta la muestra a 100 C en una placa calefactora para completar la disolucin de la misma. Concluido el proceso se obtiene una disolucin de color azul (la disolucin de la muestra debe realizarse en campana extractora debido a la produccin de vapores nitrosos de color marrn que son altamente txicos, Figura 6.1b).
(a)
(b)
Figura 6.1. (a) Proceso de disolucin de la muestra. (b) Detalle de los vapores nitrosos.
73

En las muestras de latn la disolucin azul se transfiere directamente a un matraz aforado de 100 mL. Se arrastran los posibles restos que queden en el vaso de precipitados con disolucin de cido ntrico al 1 % y se enrasa el matraz aforado con disolucin de cido ntrico al 1 %. En el caso de las muestras de bronce se observar la aparicin de un precipitado de color blanco en la disolucin azul resultante. El precipitado se eliminar por filtracin con placa filtrante del n 4 y con sistema de succin a vaco (Figura 6.2). El filtrado se lavar con disolucin de cido ntrico al 1 % en caliente. Una vez filtrada la disolucin se transfiere a un matraz aforado de 100 mL. El kitasato se lavar con disolucin de cido ntrico al 1 % y se transferirn las aguas de lavado al matraz aforado de 100 mL, enrasando con disolucin de cido ntrico al 1 %.
Figura 6.2. Filtracin de la disolucin de la muestra de bronce.
A partir de las disoluciones problema de bronce y latn obtenidas se prepararn las disoluciones de trabajo I y II, para ello deberemos realizar las siguientes diluciones: Disolucin de trabajo I: Tomar 1 mL de la disolucin problema y trasferirlo a un matraz aforado de 100 mL, completndose con disolucin de cido ntrico al 1%. Disolucin de trabajo II: Se toman 5 mL de la disolucin de trabajo I y se trasfieren a un matraz aforado de 100 mL, enrasndose con disolucin de cido ntrico al 1 %. Esta disolucin de trabajo II ser la que empleemos para realizar la medida en el espectrofotmetro.
6.5.3.2. Preparacin de las disoluciones patrn Curva analtica

A partir de la disolucin de cobre(II) 100 ppm se toman 0, 1, 2, 3, 4 y 5 mL que se transfieren a matraces aforados de 50 mL, completndose los matraces con disolucin de cido ntrico al 1 %.
74
Espectroscopa de AA - Determinacin de cobre en aleaciones metlicas Mtodo de adicin estndar

A partir de la disolucin de cobre(II) 100 ppm se toman 0, 0,4, 0,8, 1,2, 1,6, 2 mL que se transfieren a matraces aforados de 100 mL. Se aaden en cada matraz 2 mL de la disolucin de trabajo I y se completan los matraces con disolucin de cido ntrico al 1 %.
6.5.3.3. Anlisis espectrofotometrico

En la Figura 6.3a se muestra el espectrofotmetro de absorcin atmica que se utilizar en la prctica.
(a)
(b)
Figura 6.3. (a) Espectrofotmetro de absorcin atmica. (b) Detalle de las vlvulas de ajuste del caudal del combustible y oxidante. A continuacin se indican los pasos a seguir para poder llevar a cabo las medidas en el instrumento: (a) Encender el equipo de absorcin atmica. (b) Cargar el mtodo de trabajo adecuado. (c) Encender la lmpara de ctodo hueco de cobre. (d) Alinear el mechero de flujo laminar con respecto al haz de radiacin (Figura 6.4). Figura 6.4. Alineacin del mechero con respecto al haz de radiacin.
75

(e) Abrir los gases combustible (acetileno) y oxidante (aire) y encender el mechero presionando durante unos segundos el botn de encendido. Encender la campana extractora. (f) Ajustar la estequiometra de la llama, es decir, el caudal de acetileno y aire hasta conseguir una llama oxidante (Figura 6.3b). (g) Introducir el capilar del nebulizador (Figura 6.5) en una disolucin patrn de cobre. Ajustar la proporcin acetileno-aire y la altura del haz de radiacin con respecto a la llama hasta conseguir la mxima absorbancia. (h) Introducir el capilar del nebulizador en la disolucin patrn de concentracin cero (blanco) y ajustar a cero la absorbancia presionando simultneamente las teclas alt y read .
Figura 6.5. Introduccin de la disolucin patrn.
(i) Proceder con la lectura de las disoluciones patrn de cobre, en orden creciente de concentraciones, en el espectrofotmetro de absorcin atmica. Anotar las lecturas de absorbancia de cada una de las disoluciones medidas. (j) Finalmente, se introducirn las disoluciones de trabajo II de bronce o latn y se anotarn los valores de su absorbancia.
6.6. Resultados
1. Construir las rectas de calibrado con los datos de absorbancia obtenidos a partir de las disoluciones patrn preparadas. Obtener los valores de la ordenada en origen, pendiente y coeficiente de correlacin de dichas rectas. 2. Determinar el % en peso de cobre que contiene la muestra de latn o bronce, utilizando los dos mtodos de calibrado. 3. Con los datos obtenidos por los distintos grupos de trabajo del laboratorio, realizar un tratamiento estadstico de los resultados (media, desviacin estndar y desviacin con relacin a la media), despus de haber eliminado previamente los datos discordantes. 4. Comentar los resultados obtenidos en cuanto al diferente % de cobre obtenido de las muestras de bronce y latn analizadas.
76
6.7. Cuestiones
1. Inicialmente, la disolucin que se obtiene al disolver la muestra es verde. Sin embargo, al finalizar el proceso de disolucin sta es de color azul, a que se debe este cambio de color? 2. Por qu se debe lavar el precipitado de estao con disolucin de cido ntrico en caliente?. Cul es el precipitado de estao que se forma?
77
Espectroscopa de AA - Determinacin de manganeso en acelga
Prctica 7. DETERMINACIN DE MANGANESO EN ACELGA MEDIANTE ESPECTROSCOPA DE ABSORCIN ATMICA 7.1. Introduccin
Los minerales son nutrientes indispensables para el buen funcionamiento del organismo humano ya que su carencia puede provocar serios problemas de salud. En cuanto a su funcin, muchos de ellos actan como cofactores de enzimas para controlar la presin osmtica de fluidos celulares y el pH, o como parte constitutiva de algunas macromolculas Los minerales abundan en todos los alimentos, sin embargo, en alimentos de origen vegetal su contenido depende en gran medida de las caractersticas de cada especie y de las condiciones de cultivo (composicin del suelo y agua utilizada). La perdida de minerales en los procesos tecnolgicos es muy pequea en comparacin con otros nutrientes como las vitaminas. Debido a que son hidrosolubles, la mayor parte de las prdidas de minerales se producen por lixiviacin en cualquier etapa que exista un contacto del alimento con agua (principalmente durante el escaldado y la coccin). Sin embargo, tambin se producen prdidas importantes por separaciones fsicas que tienen lugar durante la preparacin de los alimentos ya que, en muchos casos, su distribucin en los mismos no es homognea. Un ejemplo caracterstico es la perdida de minerales que se produce durante la molienda de los cereales, pelado de frutas, etc. El manganeso es un microelemento, esencial para todas las formas de vida. En el organismo humano est presente en distintas enzimas que participan en la sntesis de las grasas y participa en el aprovechamiento de ciertas vitaminas. Aunque su presencia en los alimentos es pequea, abunda en alimentos como pescados y crustceos, cereales integrales y legumbres. En otros alimentos como la acelga su distribucin no es homognea pudiendo llegar a ser seis o ms veces superior el contenido en la hoja que en el tallo o penca. La determinacin de manganeso en los alimentos puede llevarse a cabo por mtodos gravimtricos, volumtricos o mediante el empleo de diversas tcnicas instrumentales tales como la espectrofotometra de absorcin molecular UV-Vis o la espectrofotometra de absorcin atmica. En esta prctica se pretende determinar el contenido de manganeso en acelga, diferenciado entre el contenido de manganeso en hoja y en tallo. Para ello, previamente se deber realizar una mineralizacin por va seca de muestra. Posteriormente, el manganeso se determinar mediante lectura de la absorbancia de la disolucin problema resultante en un espectrofotmetro de absorcin atmica utilizando una llama de acetileno-aire.
79
7.2. Objetivos
1. Realizar el tratamiento de una muestra real como etapa previa al anlisis. 2. Aprender el manejo de un espectrofotmetro de absorcin atmica. 3. Determinar el contenido de manganeso en acelga.

Matraz aforado de 50 y 100 mL Pipetas de 1, 2, 5 y 10 mL Probeta de 50 mL Vasos de precipitados de 100, 250 mL Embudo de vidrio Crisol de porcelana Goma adaptadora Placa calefactora Tijeras Lmpara de ctodo hueco de Mn Kitasato de 500 mL Placa filtrante de poro n 4 Pipeta Pasteur con tetina de goma Varilla de vidrio Vidrio de reloj o pesasustancias Balanza analtica Estufa Mufla Sistema de succin a vaco Espectrofotmetro de absorcin atmica
7.4. Reactivos
cido clorhdrico Sulfato de manganeso(II) tetrahidratado Agua destilada Muestra de acelga

a) La disolucin de la muestra calcinada debe realizarse en campana extractora debido a la produccin de vapores txicos. b) Para evitar confusiones identifique claramente todas las disoluciones que vaya preparando. c) Al finalizar, la prctica la placa filtrante se lavar con cido ntrico comercial y despus con abundante agua destilada. Estas operaciones de lavado deben realizarse con el sistema de succin a vaco. d) El equipo de absorcin atmica debe manejarse con mucha precaucin, por emplear gases explosivos como el acetileno, atendiendo en todo momento a las indicaciones del profesor. Evitar el contacto visual con la llama o las lmparas. 80

Disolucin de cido clorhdrico 1:1 (v/v). Se toman 25 mL de cido clorhdrico comercial, se transfieren a un matraz aforado de 50 mL y se completa con agua destilada hasta el enrase. Disolucin de cido clorhdrico al 1 % (v/v). Se toman 10 mL de cido clorhdrico comercial, se transfieren a un matraz aforado de de 1000 mL y se completa con agua destilada hasta el enrase. Disolucin de manganeso 5.000 ppm (p/v). Disolver 1,8011 g de sulfato de manganeso (II) tetrahidratado en 50 mL de disolucin de cido clorhdrico al 1 %. Transferir la disolucin a un matraz aforado de 100 mL y enrasar con disolucin de cido clorhdrico al 1 %. Disolucin de manganeso 50 ppm (p/v). Transferir 1 mL de la disolucin de manganeso de 5.000 ppm (p/v) a un matraz aforado de 100 mL y enrasar con la disolucin de cido clorhdrico al 1 %.
7.5.3. Determinacin de manganeso:

7.5.3.1. Preparacin de la muestra
Trocear la muestra de acelga con unas tijeras y separar las hojas del tallo. Introducir en un crisol de porcelana, aproximadamente, 10g de las hojas y en otro 10g del tallo (anotar el peso exacto, Pi) y secar la muestra en estufa a 105 C hasta peso constante (Pf). Pesar en un crisol de porcelana en torno a 1,5 g de hojas secas o 2 g de tallo seco (anotar el peso exacto). Calcinar la muestra a 440 C durante 24 horas hasta su reduccin a cenizas. Transferir las cenizas resultantes a un vaso de precipitados, aadir 20 mL de HCl (1:1) y calentar durante 10 minutos agitando con una varilla de vidrio de vez en cuando (tenga cuidado de no llevar a sequedad la muestra, realice esta operacin en campana). Filtrar con placa filtrante del n 4 y sistema de succin a vaco (Figura 7.1), lavando el con la disolucin de cido clorhdrico al 1 % en caliente.
Figura 7.1. Filtracin disolucin de la muestra.
de
la
81

Una vez filtrada, la disolucin se transfiere a un matraz aforado de 100 mL. Lavar el kitasato con la disolucin de cido clorhdrico al 1 % y transferir los lquidos de lavado al matraz aforado de 100 mL, enrasando con disolucin de cido clorhdrico al 1 %. Esta disolucin ser la que empleemos para realizar la medida en el espectrofotmetro.
7.5.3.2. Preparacin de las disoluciones patrn Curva analtica

A partir de la disolucin de manganeso(II) 50 ppm (p/v) se toman 0, 1, 2, 3, 4 y 5 mL que se transfieren a matraces aforados de 50 mL, completndose los matraces con disolucin de cido clorhdrico al 1 %.
Mtodo de adicin estndar

A partir de la disolucin de manganeso(II) 50 ppm se toman 0, 1, 2, 3, 4 y 5 mL que se transfieren a matraces aforados de 100 mL. Se aaden en cada matraz 4 mL de la disolucin problema de hojas de acelga o 10 mL de la disolucin problema de tallo de acelga. Finalmente, se completan los matraces con disolucin de cido clorhdrico al 1 %.
7.5.3.3. Anlisis espectrofotometrico

En la Figura 7.3a se muestra el espectrofotmetro de absorcin atmica que se utilizar en la prctica.
(a)
(b)
Figura 7.3. (a) Espectrofotmetro de absorcin atmica. (b) Detalle de las vlvulas de ajuste del caudal del combustible y oxidante.
82

A continuacin se indican los pasos a seguir para poder llevar a cabo las medidas en el instrumento: (a) Encender el equipo de absorcin atmica. (b) Cargar el mtodo de trabajo adecuado. (c) Encender la lmpara de ctodo hueco de manganeso. (d) Alinear el mechero de flujo laminar con respecto al haz de radiacin (Figura 7.4.a). (e) Abrir los gases combustible (acetileno) y oxidante (aire) y encender el mechero presionando durante unos segundos el botn de encendido. Encender la campana extractora. (f) Ajustar la estequiometra de la llama, es decir, el caudal de acetileno y aire hasta conseguir una llama oxidante (Figura 7.3.b). (g) Introducir el capilar del nebulizador (Figura 7.4.b) en una disolucin patrn de manganeso. Ajustar la proporcin acetileno-aire y la altura del haz de radiacin con respecto a la llama hasta conseguir la mxima absorbancia. (h) Introducir el capilar del nebulizador en la disolucin patrn de concentracin cero (blanco) y ajustar la absorbancia a cero presionando simultneamente las teclas alt y read .
. (a) (b) Figura 7.4. (a) Alineacin del mechero con respecto al haz de radiacin. (b) Introduccin de la disolucin patrn.
83

(i) Proceder con la lectura de las disoluciones patrn de manganeso, en orden creciente de concentraciones, en el espectrofotmetro de absorcin atmica. Anotar las lecturas de absorbancia de cada una de las disoluciones medidas. (j) Finalmente, se introducir la disolucin problema de la muestra de acelga.
7.6. Resultados
1. Determinar el contenido de agua en % en peso (humedad) en las hojas y tallo de acelga. 2. Construir las rectas de calibrado con los datos de absorbancia obtenidos a partir de las disoluciones patrn preparadas. Obtener los valores de la ordenada en origen, pendiente y coeficiente de correlacin de dichas rectas. 3. Utilizando las dos mtodos de calibrado, determinar el % en peso de manganeso en las hojas y tallo de acelga. Expresar los resultados sobre sustancia hmeda y sobre sustancia seca. 4. Con los datos obtenidos por los distintos grupos de trabajo del laboratorio, realizar un tratamiento estadstico de los resultados (media, desviacin estndar y desviacin con relacin a la media), despus de haber eliminado previamente los datos discordantes. 5. Comentar los resultados obtenidos en cuanto al diferente contenido en manganeso en la hoja y tallo de la muestra de acelga analizada.
7.7. Cuestiones
1. Qu error cometeramos si la acelga analizada tuviera gran cantidad de arena? 2. Por qu se debe secar la acelga hasta peso constante antes de calcinarla? 3. Cul es el objetivo de calcinar la acelga a 440 C?
84
Espectroscopa de AA - Efecto de llama y disolvente en determinacin de Mg
Prctica 8. EFECTO DE LA LLAMA Y DISOLVENTE EN LA DETERMINACIN DE MAGNESIO MEDIANTE ESPECTROSCOPA DE ABSORCIN ATMICA 8.1. Introduccin
La seleccin adecuada del combustible y oxidante, as como la proporcin de mezcla de ambos, adquiere especial importancia en espectroscopa de absorcin atmica de llama (FAAS), puesto que de ello depende que la atomizacin de la muestra sea o no adecuada. Por lo general, el combustible y oxidante se mezclan en proporciones estequiomtricas, aunque para determinados analitos puede ser necesaria una llama rica o pobre en combustible. Por otro lado, hay que tener en cuenta que las llamas solo son estables en ciertos intervalos de caudal en los que la velocidad de combustin se iguala al caudal de la mezcla combustible-oxidante. Este caudal, que depender del tipo de combustible y oxidante, se controla en el instrumento, por lo general, mediante vlvulas de aguja y su medida se realiza mediante un rotmetro. La combinacin ms frecuente de combustible-oxidante es acetileno-aire, sin embargo, el uso de esta llama limita la temperatura mxima de trabajo a unos 2.400 C. Debido a esto, para atomizar elementos refractarios es preferible utilizar xido nitroso en vez de aire, ya que en estas condiciones es posible alcanzar temperaturas de hasta unos 3.100 C. El tipo de combustible y oxidante utilizado, adems de la proporcin en la que se mezclan, influye de manera importante en el aspecto y tamao relativo de las distintas regiones de la llama. As por ejemplo, en llamas de acetileno-xido nitroso la regin interconal, ampliamente utilizada en espectroscopa, puede alcanzar varios centmetros de altura. Puesto que cada analito presenta mxima absorbancia en una zona concreta de la llama, para obtener la mxima sensibilidad analtica es muy importante realizar las medidas en la zona adecuada de la llama. Otra variable que permite incrementar de manera importante la absorbancia de los analitos en FAAS es el tipo de disolvente empleado, puesto que esta aumenta en presencia de disolventes orgnicos como alcoholes de bajo peso molecular, steres y cetonas. Este efecto se atribuye, principalmente, al aumento de la eficacia del nebulizador y a la evaporacin ms rpida de este tipo de disolventes. Hay que tener en cuenta que cuando se utilizan disolventes orgnicos se han de emplear relaciones combustible-oxidante menores, para compensar la presencia de la sustancia orgnica aadida. El inconveniente de esto es que las mezclas pobres en combustible producen llamas de menor temperatura y, como consecuencia, aumenta la posibilidad de interferencias qumicas. En la presente prctica se estudiar el efecto de la relacin combustibleoxidante, de la altura de la llama y del tipo de disolvente en la determinacin de magnesio mediante FAAS.
85
8.2. Objetivos
1. Aprender el manejo de un espectrofotmetro de absorcin atmica. 2. Entender la importancia de la proporcin combustible-oxidante en la llama y de la altura en la llama a la que se realizan las medidas en las determinaciones mediante FAAS. 3. Conocer el efecto que provoca el tipo de disolvente en la sensibilidad del mtodo.

Matraz aforado de 50, 100 y 250 mL Pipeta Pasteur con tetina de goma Vasos de precipitados de 100 y 250 mL Vidrio de reloj o pesasustancias Balanza analtica Pipetas de 1 y 5 mL Varilla de vidrio Embudo de vidrio Lmpara de ctodo hueco de magnesio Espectrofotmetro de absorcin atmica
8.4. Reactivos
Nitrato de magnesio(II) hexahidratado Agua Milli-Q Etanol

a) El equipo de absorcin atmica debe manejarse con mucha precaucin, por emplear gases explosivos como el acetileno, atendiendo en todo momento a las indicaciones del profesor. Evitar el contacto visual con la llama y lmparas.

Disolucin de magnesio 1.500 ppm (p/v) en agua. Disolver 1,5750 g de nitrato de magnesio hexahidratado en agua Milli-Q. Una vez disuelto transferir la disolucin a un matraz aforado de 100 mL y enrasar con agua Milli-Q. Disolucin de magnesio 1.500 ppm (p/v) en etanol. Disolver 1,5750 g de nitrato de magnesio hexahidratado en etanol. Una vez disuelto transferir la disolucin a un matraz aforado de 100 mL y enrasar con etanol. Disolucin de magnesio 6 ppm (p/v) en agua. Tomar 1 mL de la disolucin de magnesio 1.500 ppm en agua, transferir a un matraz aforado de 250 mL y enrasar con agua Milli-Q. 86

Disolucin de magnesio 6 ppm (p/v) en etanol. Tomar 1 mL de la disolucin de magnesio 1.500 ppm en etanol, transferir a un matraz aforado de 250 mL y enrasar con etanol.
8.5.3. Determinacin de magnesio:

8.5.3.1. Preparacin de las disoluciones patrn
A partir de cada una de las disoluciones de magnesio de 6 ppm (p/v) se toman 0, 1, 2, 3, 4, y 5 mL que se transfieren a matraces aforados de 50 mL, completndose los matraces con agua o etanol (para evitar confusiones etiquete todas las disoluciones que vaya preparando).

En la Figura 8.1 se muestra el espectrofotmetro de absorcin atmica que se utilizar en la prctica.
2 1 3
(a)
(b)
Figura 8.1. (a) Espectrofotmetro de absorcin atmica. (b) Detalle de: (1) vlvula de ajuste del caudal, (2) mando de ajuste de la altura del mechero, (3) rotmetro. A continuacin se indican los pasos a seguir para poder llevar a cabo las medidas en el instrumento: (a) (b) (c) (d) Encender el equipo de absorcin atmica. Cargar el mtodo de trabajo adecuado. Encender la lmpara de ctodo hueco de magnesio. Alinear el mechero de flujo laminar con respecto al haz de radiacin (Figura 8.2.a).
87

(e) Abrir los gases combustible (acetileno) y oxidante (aire) y encender el mechero presionando durante unos segundos el botn de encendido. Encender la campana extractora.
Efecto de la estequiometra de la llama

(a) Mediante la vlvula (1), ajustar la proporcin de acetileno en la llama hasta conseguir en el rotmetro (3) una lectura de 1,5 (Figura 8.1). (b) Introducir el capilar del nebulizador (Figura 8.2.b) en la disolucin en blanco (agua) y ajustar la absorbancia a cero presionando simultneamente las teclas alt y read.
(a)
(b)
Figura 8.2. (a) Alineacin del mechero con respecto al haz de radiacin. (b) Introduccin de la disolucin patrn. (c) Proceder con la lectura de la absorbancia para la disolucin patrn de magnesio de 0,24 ppm en agua. (d) Repetir los pasos indicados en los apartados (b) y (c) ajustando previamente la proporcin de acetileno en la llama hasta conseguir en el rotmetro lecturas de 1, 0,5 y 0,25. (e) Repetir los pasos indicados en los apartados (a) y (d), utilizando la disolucin patrn de magnesio de 0,24 ppm en etanol, despus de ajustar la absorbancia a cero con etanol.
Efecto de la altura de la llama

(a) Una vez ajustada la estequiometra de la llama a su valor ptimo, ajustar la altura del mechero con el mando (2) hasta conseguir una lectura en la escala de 20 mm (Figura 8.1). 88

(b) Introducir el capilar del nebulizador (Figura 8.2.b) en la disolucin en blanco (agua) y ajustar la absorbancia a cero presionando simultneamente las teclas alt y read. (c) Proceder con la lectura de la absorbancia para la disolucin patrn de magnesio de 0,24 ppm en agua. (d) Repetir los pasos indicados en los apartados (b) y (c) ajustando previamente la altura del mechero hasta conseguir en la escala lecturas de 15, 10, 7,5, 5 y 0 mm. (f) Repetir los pasos indicados en los apartados (a) y (d), utilizando la disolucin patrn de magnesio de 0,24 ppm en etanol, despus de ajustar la absorbancia a cero con etanol.
Efecto del disolvente

(a) Teniendo en cuenta los resultados obtenidos en los apartados anteriores, ajustar en el equipo la proporcin acetileno-aire y la altura del haz de radiacin con respecto a la llama para conseguir la mxima absorbancia cuando se utiliza agua como disolvente (Figura 8.1). (b) Introducir el capilar del nebulizador (Figura 8.2.b) en la disolucin en blanco (agua) y ajustar la absorbancia a cero presionando simultneamente las teclas alt y read. (c) Proceder con la lectura de las disoluciones patrn de magnesio en agua, en orden creciente de concentraciones, en el espectrofotmetro de absorcin atmica. Anotar las lecturas de absorbancia de cada una de las disoluciones medidas. (d) Finalmente, teniendo en cuenta los resultados obtenidos en los apartados anteriores, ajustar en el equipo la proporcin acetileno-aire y la altura del haz de radiacin con respecto a la llama para conseguir la mxima absorbancia cuando se utiliza etanol como disolvente (Figura 8.1). (e) Repetir los pasos (a) (c) utilizando las disoluciones patrn de magnesio en etanol, despus de ajustar la absorbancia a cero con etanol. Anotar las lecturas de absorbancia de cada una de las disoluciones medidas.
8.6. Resultados
1. Representar grficamente la variacin de la absorbancia frente a la proporcin de acetileno en la llama (lectura en el rotmetro) para la disolucin de magnesio en agua y en etanol. 2. Representar grficamente la variacin de la absorbancia frente a la altura de llama para la disolucin de magnesio en agua y en etanol. 3. Construir una recta de calibrado con los datos de absorbancia obtenidos a partir de las disoluciones patrn preparadas. Obtener los valores de la ordenada en origen, pendiente y coeficiente de correlacin de dicha recta.
89
8.7. Cuestiones
1. Cmo se afectaran las lecturas de absorbancia si la estequiometra de la llama no se hubiese ajustado convenientemente? 2. Qu disolvente permite obtener una mayor sensibilidad de calibracin? 3. La altura en la llama a la que se observa la mxima absorcin variar si lo que vamos a determinar es cromo en vez de magnesio?
90
Refractometra Fundamento terico
IV. REFRACTOMETRA Fundamento terico

La refractometra es una tcnica instrumental ptica que se basa en la medida del ndice de refraccin (). Este parmetro puede utilizarse para caracterizar un analito, ya que existen muy pocas sustancias que tengan idnticos a una temperatura y longitud de onda dada. Por tanto su conocimiento, junto con el de otros parmetros (punto de fusin, ebullicin, ...) es de gran utilidad para identificar una sustancia o comprobar su pureza. Adems, la medida del ndice de refraccin puede llevarse a cabo de manera rpida y sencilla, requiere una pequea cantidad de muestra y no es una tcnica destructiva. Cuando un rayo de luz pasa de un medio a otro de distinta densidad experimenta un cambio de direccin. Este fenmeno recibe el nombre de refraccin y es debido a la distinta velocidad de la luz en ambos medios, como consecuencia de su distinta interaccin con los tomos y molculas de los mismos (Figura 1).
i
M edio A
M ed io B r
Figura 1. Refraccin de un haz de luz al pasar de un medio A a otro B. La relacin entre los senos de los ngulos de incidencia (i) y de refraccin (r) del haz de luz al pasar de un medio A (vaco) a otro medio B se denomina ndice de refraccin absoluto () que, segn la ley de Snell, es igual al cociente de las velocidades del haz de luz en ambos medios (c y vB, velocidades en el vaco y en el medio B, respectivamente):
seni c = = 0 sen r v B B
siendo 0 la longitud de onda de la radiacin incidente en el vaco y B la longitud de onda en el medio B cuyo ndice de refraccin es . El es un nmero sin dimensiones mayor que la unidad 1 ya que c > , al ser siempre el segundo medio ms denso que el vaco. Cuando el segundo medio es el agua, el 1,333 utilizando la lnea D del sodio y realizando la medida a temperatura ambiente. Para otros lquidos orgnicos los valores de oscilan entre 1,3 y 1,7.
91

Las variables ms importantes a la hora de determinar el son la temperatura y la longitud de onda de la radiacin incidente, parmetros que han de controlarse estrictamente y especificarse siempre. El de una sustancia vara con la longitud de onda, aunque de manera no lineal. Se suele medir en la regin visible del espectro y, para obtener mediciones precisas, es necesario el uso de luz monocromtica. Una fuente muy utilizada es la lmpara de descarga de sodio que emite un doblete amarillo intenso (lnea D) a 589,0 y 589,6 nm. Tambin pueden utilizarse en trabajos de rutina fuentes de luz blanca (lmpara de tungsteno), pero en este caso se requieren prismas para separar la radiacin amarilla, eliminando las de las dems longitudes de onda. En cuanto a la temperatura, esta es otra variable importante a controlar, ya que se sabe que el de la mayora de los lquidos disminuye aproximadamente 0,00045 unidades al aumentar un C la temperatura. Este efecto est relacionado con la disminucin de la densidad y de la constante dielctrica del medio con el aumento de la temperatura. As, para hacer las medidas del elevada precisin (cuatro cifras decimales) la muestra debe mantenerse a temperatura constante, con una variacin no superior a 0,2C. Los instrumentos que se utilizan para la medida del reciben el nombre de refractmetros y pueden ser de distintos tipos, aunque la mayora se basan en la medida del ngulo lmite. Entre estos cabe destacar el refractmetro de Abbe (Figura 2).
Figura 2. Refractmetro de Abbe. Este instrumento, consta de dos prismas P1 y P2 que estn articulados, de manera que una pequea cantidad de muestra puede colocarse entre ambos (Figura 3). La luz reflejada por un espejo penetra en el prisma de difusin (P1), atraviesa la muestra y entra en el prisma de refraccin (P2). El ngulo () con el que emerge el rayo lmite del prisma de refraccin depende del de ste (valor conocido), de la longitud de onda utilizada y del de la muestra. El rayo lmite es el rayo ms tangencial que puede entrar en P2 y se denomina as porque establece el lmite entre las porciones de luz y sombra del campo visual en el ocular. Cuando el refractmetro utiliza luz blanca, para evitar que aparezca un lmite borroso y colorido entre los campos iluminado y 92

oscuro, debido a las diferencias entre los ndices de refraccin para la luz de distintas longitudes de onda, se emplean dos prismas, llamados primas compensadores o de Amici, que se colocan uno encima del otro enfrente del ocular. Mediante una escala graduada proyectada en la parte superior del prisma de refraccin P2 que puede observarse a travs del ocular, es posible medir el ngulo . Para facilitar la lectura, en la mayora de los instrumentos la escala est graduada en unidades de hasta 0,001 unidades y con el amplificador se puede determinar la siguiente cifra decimal.
Figura 3. Detalle de los prismas P1 y P2 del refractmetro y fuente de radiacin. La refractometra es una tcnica que puede utilizarse con fines cualitativos y cuantitativos. El es una constante fsica ampliamente utilizada en la identificacin de sustancias y como criterio de pureza. Para su determinacin se necesitan una pocas gotas de muestra, aunque para obtener medidas seguras a partir de la cuarta cifra decimal es importante realizar un calibrado peridico del instrumento y controlar estrictamente la temperatura. Para la calibracin suele utilizarse el agua (D25 = 1,33250). Por otro lado, la medida del permite llevar a cabo anlisis cuantitativos en disoluciones que contienen un nico analito ya que en estos casos el es directamente proporcional a la concentracin:
- 0 = k . C
donde es el ndice de refraccin de la disolucin, 0 es el ndice de refraccin del disolvente, C es la concentracin expresada, por lo general, en g/100 mL y k es una constante de proporcionalidad. Para conocer el valor de la constante de proporcionalidad se construye una recta de calibrado con disoluciones patrn representando - 0 frente a la concentracin de dichas disoluciones. Tambin es posible el anlisis cuantitativo de mezclas binarias homogneas de constituyentes conocidos.
93
Refractometra - Identificacin y control de pureza de aceites vegetales
Prctica 9. IDENTIFICACIN Y CONTROL DE PUREZA DE ACEITES VEGETALES COMESTIBLES MEDIANTE REFRACTOMETRA 9.1. Introduccin
Los aceites y grasas vegetales comestibles son aquellos obtenidos a partir de frutos de vegetales (aceituna, coco, palma, ) o de diversas semillas oleaginosas (girasol, soja, maz, colza, cacahuete, palmiste, etc). Las caractersticas y composicin del fruto o semilla oleaginosa son muy diferentes. La aceituna contiene un elevado porcentaje de agua y un bajo porcentaje de protena, mientras que en las semillas ocurre lo contrario. Sin embargo, en ambos casos el contenido de lpidos (glicridos, cidos grasos libres, fosfolpidos, esteroles, etc) es elevado. El grado de instauracin de los cidos grasos es una caracterstica fundamental en los aceites y grasas vegetales. As, por ejemplo, la grasa de semillas de palma (palmiste) contiene un elevado porcentaje de cidos grasos saturados, mientras que los aceites de lino, girasol, oliva, maz o soja presentan un elevado contenido en cidos grasos insaturados. En cuanto al tipo de cidos grasos insaturados, el aceite de oliva es rico en oleico y los aceites de maz, soja y girasol los son en linoleico. Existen una serie de parmetros e ndices que sirven para caracterizar tecnolgicamente las grasas y aceites vegetales comestibles, entre los que cabe destacar: la t de formacin de humo y t de inflamacin (ndices relacionados con la calidad para la fritura), el ndice de perxido (relacionado con el grado de oxidacin), el punto de fusin (relacionado con el contenido en cidos grasos saturados), el ndice de Reichert-Meissl (mide cidos voltiles esterificados), ndice de acetilo (mide los grupos OH libres en los glicridos), ndice de saponificacin (menor cuanto ms largos son los cidos grasos componentes de los glicridos) y, finalmente, el ndice de yodo e ndice de refraccin (relacionados, ambos, con el grado de instauracin). El ndice de refraccin () de un aceite depende de su composicin en cidos grasos y aumenta con la instauracin y la longitud de la cadena. De ah, que este parmetro pueda utilizarse para la identificacin del mismo. Esto es debido a que cada sustancia va a presentar un caracterstico que va a depender, nicamente, de la temperatura de medida y de la longitud de onda de la radiacin empleada. Por otro lado, la medida del es empleada para comprobar si el aceite ha sufrido o no alteraciones o adulteraciones. Si un aceite no presenta su ndice de refraccin caracterstico, puede ser que sea una mezcla de varios aceites, o que se encuentre mezclado con otras sustancias que hayan podido alterarlo o adulterarlo. En la presente prctica se determinar el ndice de refraccin de distintas muestras de aceite, con el objeto de identificarlas y detectar posibles alteraciones o adulteraciones en las mismas. Para ello se utilizar un refractmetro de Abbe.
95
9.2. Objetivos
1. Entender el fundamento de la refractometra. 2. Aprender el manejo de un refractmetro de Abbe. 3. Identificar, a partir de la medida del ndice de refraccin, diferentes tipos de aceite y detectar adulteraciones en los mismos.

Pipeta Pasteur con tetina de goma Refractmetro de Abbe
9.4. Reactivos
Acetona Agua destilada Muestras de aceite

a) Es muy importante que se tenga especial cuidado con el prisma principal del refractmetro. Se deben evitar posibles araazos, ralladuras y la corrosin del pulido del vidrio ptico. Se recomienda limpiar bien el prisma despus de cada trabajo. b) Se debe comprobar siempre que la temperatura del prisma principal permanece estable y que no oscila durante la medicin. c) Siempre se debe anotar el valor de temperatura junto con la medida del ndice de refraccin, ya que ste se ve afectado por la temperatura.
9.5.2. Identificacin y control de pureza:

9.5.2.1. Medida del ndice de refraccin
En la Figura 9.1 se muestra el refractmetro que se utilizar en la prctica. Antes de medir el ndice de refraccin de las muestras se debe comprobar si el refractmetro se encuentra correctamente calibrado. Para ello debemos proceder tal y como se describe a continuacin: 96

(a) Abrir y separar los prismas principal y secundario. Para ello se ha de girar el mando (1) para la apertura y cierre de los prismas (Figura 9.1). Cuando se gira este mando, el prisma secundario se puede separar aproximadamente 1 cm, lo que permite abrir totalmente los prismas.
3 2
Figura 9.1. Refractmetro Abbe, (1) mando para la apertura y cierre de los prismas, (2) mando de medida, (3) mando de compensacin de color, (4) tornillo de calibracin. (b) Limpiar bien la superficie del prisma principal empleando un papel ligeramente mojado con el disolvente de lavado (Figura 9.2). En este caso utilizaremos acetona.
Figura 9.2. Detalle de los primas principal y secundario una vez separados. (c) Situar unas gotas de agua destilada en la superficie del prisma principal, volver a unir los prismas y cerrar girando el mando (1).
97

(d) Mirando por el ocular, mover el mando de medida (2) despacio hasta situar la lectura de la escala en la proximidad de la medida del ndice de refraccin del agua a 20 C (1,3330). (e) En el campo de visin aparecer una lnea horizontal de separacin borrosa y coloreada (Figura 9.3), prxima a la interseccin de las rectas cruzadas. Mover el mando de compensacin del color (3) hasta conseguir una lnea ntida de separacin sin color. (f) Cuando la lnea ntida de separacin coincida con la interseccin de las rectas cruzadas, comprobar que la lectura del ndice de refraccin coincide con el que aparece en la Tabla 3 del Anexo, en funcin de la temperatura a la que se est realizando la medida.
Figura 9.3. Campo de visin y escala.
(g) En el caso de que la lectura coincida con la de la tabla se puede proceder a la medida del ndice de refraccin de las muestras de aceite. (h) En el caso de que no coincida, ajustar la escala a la medida correcta del ndice de refraccin que aparece en la Tabla 3 del Anexo. Mover el tornillo de calibracin (4) en uno u otro sentido hasta ajustar la lnea de separacin de campos en el centro de la interseccin de las lneas cruzadas (Figura 9.3). Una vez calibrado el equipo, se comienza con la medida del ndice de refraccin de cada una de las muestras de aceite proporcionadas. Para ello, proceder del siguiente modo: (i) Abrir y separar los prismas principal y secundario, limpiarlos perfectamente y depositar dos o tres gotas de aceite en el centro de la superficie del prisma principal. Volver a unir los prismas y cerrar girando el mando (1). Esperar durante 1 minuto antes de proceder con la lectura. (j) Mirando por el ocular, girar despacio el mando de medida (2) hasta que la lnea de separacin horizontal aparezca en el campo de visin. 98

(k) Girar el mando de compensacin de color (3) para conseguir que la lnea horizontal aparezca lo ms ntida posible y sin color. Una vez conseguido, ajustar con el mando de medida (3) la lnea horizontal con la interseccin de las lneas cruzadas (Figura 9.3). (l) Tomar la medida del ndice de refraccin que aparece en la escala. Junto con esta medida es importante anotar la temperatura a la que ha sido tomada la misma (Figura 9.4). (m) Realizar cada medida por triplicado, repitiendo los pasos del (i) al (l) anotando junto a cada medida la temperatura que aparezca en la pantalla digital del termmetro.
Figura 9.4. Termmetro pantalla digital.
con
9.6. Resultados
1. Empleando la frmula que se indica a continuacin, calcular el ndice de refraccin del aceite a la temperatura de referencia (normalmente 20 C 25C):
Lc = L + F (T Tref )
Lc: ndice de refraccin corregido. F: Factor de correccin (0,000365 para aceites) T: Temperatura a la que ha sido realizada la lectura. Tref: Temperatura de referencia. 2. Con los datos obtenidos identificar los aceites problema y detectar que muestras se encuentran adulteradas (ver Tabla 4 del Anexo).
9.7. Cuestiones
1. De qu otras formas podramos diferenciar distintos tipos de aceites vegetales? 2. Qu problemas pueden presentarse si no se tuviera en cuenta la temperatura a la que se est realizando la determinacin del ndice de refraccin? 3. El ndice de refraccin de un aceite sirve para comprobar si un aceite ha sido alterado o adulterado?. De qu formas suele adulterarse un aceite?
99
Refractometra Determinacin de parmetros de calidad en alimentos
Prctica 10. DETERMINACIN DE PARMETROS DE CALIDAD EN ALIMENTOS MEDIANTE REFRACTOMETRA 10.1. Introduccin
La miel es la sustancia natural dulce producida por la abeja, Apis mellifera, a partir del nctar de plantas. Existen diferentes tipos de miel dependiendo de su origen y forma de elaboracin, la cual puede presentarse en forma lquida, pastosa o cristalizada. La humedad en la miel es un parmetro de importancia por estar relacionada con la calidad y conservacin del producto en el tiempo, adems de con la zona geogrfica de procedencia de la misma. El porcentaje de agua en la miel no debe superar el 21 %, ya que de lo contrario puede haber peligro de fermentacin del producto durante el almacenamiento del mismo, por el desarrollo de determinadas levaduras. El mtodo oficial para determinar la humead de la miel se basa en la medida del ndice de refraccin () a 20 C mediante el refractmetro de Abbe. Otros mtodos alternativos para la determinacin de humedad en alimentos son el mtodo de Karl Fischer, el mtodo gravimtrico de secado, el mtodo por destilacin azeotrpica, etc La mantequilla es una grasa alimenticia obtenida de la nata o grasa de leche o de la mezcla de nata con leche completa, sometida al batido y amasado. Es una emulsin de agua en grasa, lo que quiere decir que contiene finas gotitas de agua dispersas homogneamente en su estructura. La mantequilla contiene entre un 15-20 % de agua y un 80-85 % de grasa. Al igual que el resto de los alimentos, la mantequilla debe pasar por un control de calidad antes de su comercializacin que comprende una serie de exmenes ente los que se encuentra la determinacin del punto de fusin, ndice saponificacin, ndice de acidez, ndice de yodo, ndice de refraccin, .... La determinacin del da una idea, de una forma directamente proporcional, del grado de insaturacin y de la longitud de los cidos grasos presentes en la mantequilla. Esto es importante para el control de calidad de la misma, pues se prohbe la adicin a la mantequilla de grasas o aceites vegetales o animales, distintos de las grasas de leche. Para mantequillas de buena calidad, los valores de D40 se encuentran entre 1,4530 y 1,4553. Otro mtodo alternativo para la deteccin de dichas adulteraciones, ya sea con grasas de origen vegetal o animal, es el anlisis del perfil de triglicridos y esteroles por cromatografa de gases. En la presente prctica se utilizar un refractmetro de Abbe para la determinacin del ndice de refraccin en muestras de miel y mantequilla. Este parmetro se utiliza de manera habitual para el control de calidad de estos alimentos, lo que ser necesario para certificar si estos productos son adecuados o no para su comercializacin y consumo.
101
10.2. Objetivos
1. Entender el fundamento de la refractometra. 2. Aprender el manejo de un refractmetro de Abbe. 3. Determinar el ndice de refraccin en diferentes alimentos como parmetro de calidad de los mismos.

Cristalizador de 250 mL Pipeta Pasteur con tetina de goma Probeta de 50 mL Vidrio de reloj o pesasustancias Refractmetro de Abbe Granatario Placa calefactora Varilla de vidrio Vasos de precipitados de 50 mL
10.4. Reactivos
Acetona Agua destilada Muestra de miel Muestra de mantequilla

a) Es muy importante que se tenga especial cuidado con el prisma principal del refractmetro. Se deben evitar posibles araazos, ralladuras y la corrosin del pulido del vidrio ptico. b) Limpiar bien el prisma despus de cada medida utilizando acetona. c) Se debe comprobar siempre que la temperatura del prisma principal permanece estable y que no oscila durante la medicin. d) Siempre se debe anotar el valor de temperatura junto con la medida del ndice de refraccin, ya que ste se ve afectado por la temperatura.
10.5.2. Determinacin de parmetros de calidad:

Se pesan en torno a 4 g de mantequilla en un vidrio de reloj. Mediante una esptula, se introduce la mantequilla en un vaso de precipitados de 50 mL. En un cristalizador de 250 mL se aaden 50 mL de agua. Se introduce el vaso que contiene la 102

mantequilla en el interior del cristalizador y se coloca encima de una placa calefactora. Se calienta a 60 C durante unos 20 min (Figura 10.1).
Figura 10.1. Montaje para fundir la mantequilla.
10.5.2.1. Medida del ndice de refraccin

En la Figura 10.2 se muestra el refractmetro que se utilizar en la prctica. Antes de medir el ndice de refraccin de las muestras se debe comprobar si el refractmetro se encuentra correctamente calibrado. Para ello debemos proceder tal y como se describe a continuacin: (a) Abrir y separar los prismas principal y secundario. Para ello se ha de girar el mando (1) para la apertura y cierre de los prismas (Figura 10.2). Cuando se gira este mando, el prisma secundario se puede separar aproximadamente 1 cm, lo que permite abrir totalmente los prismas.
3 2
Figura 10.2. Refractmetro Abbe, (1) mando para la apertura y cierre de los prismas, (2) mando de medida, (3) mando de compensacin de color, (4) tornillo de calibracin.
103

(b) Limpiar bien la superficie del prisma principal empleando un papel ligeramente mojado con el disolvente de lavado (Figura 10.3). En este caso utilizaremos acetona.
Figura 10.3. Detalle de los primas principal y secundario una vez separados. (c) Situar unas gotas de agua destilada en la superficie del prisma principal, volver a unir los prismas y cerrar girando el mando (1). (d) Mirando por el ocular, mover el mando de medida (2) despacio hasta situar la lectura de la escala en la proximidad de la medida del ndice de refraccin del agua a 20 C (1,3330). (e) En el campo de visin aparecer una lnea horizontal de separacin borrosa y coloreada (Figura 10.4), prxima a la interseccin de las rectas cruzadas. Mover el mando de compensacin del color (3) hasta conseguir una lnea ntida de separacin sin color. (f) Cuando la lnea ntida de separacin coincida con la interseccin de las rectas cruzadas, comprobar que la lectura del ndice de refraccin coincide con el que aparece en la Tabla 3 del Anexo II, en funcin de la temperatura a la que se est realizando la medida. 104
Figura 10.4. Campo de visin y escala.

(g) En el caso de que la lectura coincida con la de la tabla se puede proceder a la medida del ndice de refraccin de las muestras de aceite. (h) En el caso de que no coincida, ajustar la escala a la medida correcta del ndice de refraccin que aparece en la Tabla 3. Mover el tornillo de calibracin (4) en uno u otro sentido hasta ajustar la lnea de separacin de campos en el centro de la interseccin de las lneas cruzadas. Una vez calibrado el equipo, se comienza con la medida del ndice de refraccin de cada una de las muestras de mantequilla y miel proporcionadas. Para ello proceder del siguiente modo: (i) Abrir y separar los prismas principal y secundario, limpiarlos perfectamente y depositar dos o tres gotas de muestra en el centro de la superficie del prisma principal. Volver a unir los prismas y cerrar girando el mando (1). Esperar durante 1 minuto antes de proceder con la lectura. (j) Mirando por el ocular, girar despacio el mando de medida (2) hasta que la lnea de separacin horizontal aparezca en el campo de visin. (k) Girar el mando de compensacin de color (3) para conseguir que la lnea horizontal aparezca lo ms ntida posible y sin color. Una vez conseguido, ajustar con el mando de medida (3) la lnea horizontal con la interseccin de las lneas cruzadas. (l) Tomar la medida del ndice de refraccin que aparece en la escala. Junto con esta medida es importante anotar la temperatura a la que ha sido tomada la misma (Figura 10.5). (m) Realizar cada medida por triplicado, repitiendo los pasos del (i) al (l) anotando junto a cada medida la temperatura que aparezca en la pantalla digital del termmetro.
Figura 10.5. Termmetro pantalla digital.
con
En el caso de la muestra de mantequilla la determinacin del ndice de refraccin se llevar a cabo a 40 C, para lo que se calentar previamente los prismas del refractmetro a esta temperatura mediante un bao de circulacin de agua.
105
Refractometra - Determinacin de parmetros de calidad en alimentos
10.6. Resultados
1. Empleando la frmula que se indica a continuacin, calcular el ndice de refraccin de la muestra de miel a la temperatura de referencia:
Lc = L + F (T Tref )
Lc: ndice de refraccin corregido. F: Factor de correccin (0,0023). T: Temperatura a la que ha sido realizada la lectura. Tref: Temperatura de referencia (20 C). 2. Con los datos obtenidos para el ndice de refraccin de la miel a 20 C y de mantequilla a 40 C, determinar si las muestras analizadas cumplen con las especificaciones impuestas por ley (ver Tabla 5 del Anexo).
10.7. Cuestiones
1. Qu es el ndice de refraccin de una sustancia? 2. Qu problemas pueden presentarse si no se tuviera en cuenta la temperatura a la que se est realizando la determinacin del ndice de refraccin? 3. Por qu es importante termostatizar el refractmetro antes de realizar la medida del ndice de refraccin en la mantequilla?
106
Polarimetra Fundamento terico
V. POLARIMETRA Fundamento terico

Existen numerosas sustancias capaces de provocar la rotacin del plano de una radiacin polarizada. Se dice que esas sustancias son pticamente activas y se caracterizan por su asimetra molecular o cristalina. El ngulo de rotacin del plano de la radiacin polarizada () varia mucho de un compuesto a otro y la rotacin puede ser hacia la derecha (compuestos dextrgiros, +) o hacia la izquierda (compuestos levgiros, -). Para un compuesto dado, el ngulo de rotacin depende del nmero de tomos o molculas en la trayectoria de la luz, por consiguiente de la concentracin de la disolucin, y de la longitud del recipiente que contiene la disolucin. Tambin depende de la longitud de onda de la radiacin y de la temperatura. La polarimetra se basa en la medida de ngulo de rotacin de una sustancia a una nica longitud de onda, generalmente a 589 nm, la lnea D de la lmpara de sodio. La ley de Biot establece la relacin existente entre la concentracin de la disolucin de dicha sustancia y el ngulo de rotacin observado: = []D20 . l . C donde []D20 es la rotacin ptica especfica de dicha sustancia a 20 C utilizando la lnea D de emisin del sodio, C es la concentracin en g/mL y l es el camino ptico (dm). La rotacin ptica se suele medir con un instrumento denominado polarmetro (Figura 1) que consta de una fuente de radiacin monocromtica, un filtro o prisma que acta de polarizador de la radiacin utilizada, un tubo para la muestra, un prisma analizador y un detector (que puede ser el ojo humano).
Figura 1. Esquema de un polarmetro sencillo.
107
Polarimetra Fundamento terico

Muchos de los polarmetros utilizados actualmente se basan en la determinacin manual del ngulo ptico de rotacin y para ello utilizan dos haces luminosos (Figura 2).
Figura 2. Polarmetro digital. En estos instrumentos la radiacin, generada comnmente con una lmpara de sodio, se hace pasar por un filtro o prisma polarizador situado frente a la muestra a un ngulo de 90 con el plano de polarizacin. Este prisma divide el haz en dos rayos separados que forman un ngulo de rotacin de pocos grados, en el sentido de las manecillas del reloj y en sentido inverso respecto a la luz incidente. Los dos rayos se pasan por un tubo de vidrio de longitud conocida que contiene la disolucin del analito. A continuacin, se pasan los dos rayos de luz por un filtro o prisma analizador que se puede girar. A travs del objetivo pueden observarse dos semicrculos que corresponden a cada uno de los dos rayos formados. El prisma analizador se gira hasta que la intensidad de los dos rayos sea igual (slo en una determinada posicin del analizador los dos semicrculos presentan la misma intensidad luminosa). En este punto, los rayos de luz tienen ngulos equidistantes de rotacin, a ambos lados del detector. El punto medio de esos ngulos es el ngulo de rotacin ptica en el que la disolucin de la muestra gir el plano de polarizacin del haz incidente. Puesto que a travs de la medida del ngulo de rotacin ptica se puede hallar la concentracin y pureza de una sustancia, la polarimetra es una tcnica rpida, sencilla y no destructiva muy empleada en control de calidad, control de procesos e investigacin farmacutica, qumica y en la industria alimentaria. Una de sus aplicaciones ms importantes es la determinacin de azcares, para lo cual es necesario que la disolucin a medir est concentrada, que no presente ningn otro azcar adems del que se pretende medir, y que no est turbia ni coloreada. La principal aplicacin de la polarimetra en el anlisis de azcares es la determinacin cuantitativa de sacarosa, de azcar invertido y de glucosa. Antes de realizar la polarimetra debe comprobarse e identificarse que azcar est presente en la muestra. Adems, la polarimetra tiene una gran importancia en la determinacin de almidn.
108
Polarimetra - Determinacin de sacarosa en leche condensada
Prctica 11. DETERMINACIN DE SACAROSA EN LECHE CONDENSADA MEDIANTE POLARIMETRA 11.1. Introduccin
La sacarosa es un disacrido de frmula molecular C12H22O11 constituido por una molcula de D-glucosa y otra de D-fructosa. No contiene ningn tomo de carbono anomrico libre, puesto que los carbonos anomricos de sus dos monosacridos constituyentes se hallan unidos entre s covalentemente mediante un enlace O-glucosdico. Por esta razn, la sacarosa no es un azcar reductor. Este disacrido, ms conocido como azcar de mesa o azcar comn, se obtiene principalmente de la caa de azcar y de la remolacha azucarera. Tambin se encuentra, en menor proporcin, en las frutas y en algunas races como la zanahoria. La sacarosa es un azcar muy utilizado como edulcorante en la elaboracin de diversos alimentos, aunque tambin acta como agente conservante natural cuando se adiciona en concentraciones elevadas. Esto es lo que ocurre, por ejemplo, en la elaboracin de la leche condensada donde la elevada proporcin de sacarosa adicionada (30 al 50 % en peso) impide el desarrollo de los microorganismos, evitando de este modo un proceso de esterilizacin posterior del producto. Una de las aplicaciones ms importantes de la polarimetra es la determinacin cuantitativa de sacarosa en alimentos. Esta determinacin, sin embargo, se ve dificultada por la presencia en la muestra de otros azcares naturales pticamente activos. Por tanto, el mtodo utilizado comnmente para su determinacin se basa en el principio de inversin de Clerget, por el que se deduce el contenido en sacarosa del alimento por el cambio que se produce en el ngulo de rotacin de la disolucin de la muestra cuando se hidroliza la sacarosa en medio cido:
H+ Sacarosa + H2O D-glucosa + D-fructosa
[]D20 = 66,5
[]D20 = 52,7
[]D20 = -92,4
mezcla []D20 = -19,9 El proceso de hidrlisis de la sacarosa se conoce como inversin y la mezcla resultante azcar invertido, ya que en una disolucin que solo contenga sacarosa este proceso se ve acompaado por un cambio en la rotacin especfica de la disolucin resultante que pasa de ser dextrgira a levgira.
En esta prctica se determinar el contenido de sacarosa de una muestra de leche condensada mediante polarimetra. La lectura polarimtrica directa se hace sobre la muestra neutralizada, clarificada y filtrada. La hidrlisis de la sacarosa se realiza mediante un tratamiento cido que no afecta a la lactosa ni a otros azcares presentes en la leche. El cambio observado en el ngulo de rotacin tras el proceso de hidrlisis depender, entonces, de la sacarosa presente en la muestra.
109
11.2. Objetivos
1. Realizar el tratamiento de una muestra real como etapa previa al anlisis. 2. Aprender el manejo de un polarmetro. 3. Determinar el contenido de sacarosa en una muestra de leche condensada.

Embudo de vidrio Matraces aforados de 20, 25 y 100 mL Matraces erlenmeyer de 50 y 100 mL Papel indicador de pH Papel de filtro Pipetas de 5 y 10 mL Pipetas Pasteur con tetina de goma Probeta de 50 mL Varilla de vidrio Vidrio de reloj o pesasustancias Balanza analtica Placa calefactora y agitadora Polarmetro Tubo de observacin de 2 dm
11.4. Reactivos
cido actico cido clorhdrico Amoniaco Cloruro de zinc D-Fructosa D-Glucosa Hexacianoferrato(II) de potasio Sacarosa Agua destilada Muestra de leche condensada

a) Extreme las precauciones en el manejo del tubo de observacin, especialmente en el proceso de llenado del mismo. b) Evite la presencia de burbujas de aire en el interior del tubo de observacin ya que stas interfieren en el haz de luz polarizada y, por tanto, causarn error en la medida. c) Asegrese que antes de introducir el tubo de observacin en el polarmetro se encuentra perfectamente limpio y seco ya que de lo contrario, al tratarse de disoluciones cidas, pudiera daarse el equipo. 110

Disolucin madre de fructosa 5,5510-1 M. Se pesan 10 g de fructosa y se disuelven en unos 80 mL de agua destilada. Posteriormente, se transfiere la disolucin a un matraz aforado de 100 mL y se enrasa con agua destilada. Disolucin madre de glucosa 5,5510-1 M. Se pesan 10 g de glucosa y se disuelven en unos 80 mL de agua destilada. Posteriormente, se transfiere la disolucin a un matraz aforado de 100 mL y se enrasa con agua destilada. Disolucin madre de sacarosa 5,5510-1 M. Se pesan 18,98 g de sacarosa y se disuelven con unos 80 mL de agua destilada. Posteriormente, se transfiere la disolucin a un matraz aforado de 100 mL y se enrasa con agua destilada.
11.5.3. Determinacin de sacarosa:

Se pesan 20 g de leche condensada en un erlenmeyer de 100 mL, se aaden 20 mL de amoniaco comercial y se agita cuidadosamente hasta completa homogenizacin. Una vez homogenizado, se lleva la disolucin a pH neutro aadiendo cido actico glacial comercial con una pipeta Pasteur, midiendo el pH durante la adicin del cido con papel indicador (tenga cuidado al aadir el cido de no quemarse ya que la reaccin de neutralizacin es muy exotrmica). Cuando la disolucin se encuentra a pH neutro se pasa a un matraz aforado de 100 mL, se aade una punta de esptula de cloruro de zinc, otra de hexacianoferrato (II) de potasio y se mezcla suavemente por rotacin del matraz inclinado (evite la agitacin violeta para prevenir la formacin de burbujas). Finalmente, se enrasa el matraz con agua destilada, se tapa y se mezcla bien agitando enrgicamente. Tras dejar reposar durante unos minutos, se filtra la disolucin con un embudo de vidrio cnico y papel de filtro, descartando los primeros 10-15 mL del filtrado De esta forma obtendremos la disolucin problema I. Para llevar a cabo la hidrlisis de la sacarosa, una alcuota de 10 mL de la disolucin problema I se lleva a un matraz aforado de 20 mL y se aaden 6 mL de HCl comercial. Se coloca el matraz en un bao de agua a 40 C durante 1 hora, sumergiendo el matraz hasta donde empieza el cuello. Mezcle por rotacin durante los primeros minutos. Transcurrido el tiempo, se enfra el matraz rpidamente hasta 20 C y se enrasa con agua destilada, obtenindose de esta forma la disolucin problema II.
11.5.3.2. Preparacin de la recta de calibrado

Se prepararan cinco disoluciones de 25 mL que contengan alcuotas de 0, 5, 10, 15 y 20 mL de la disolucin madre de sacarosa de 5,55 10-1 M y se enrasaran con agua destilada. Este mismo procedimiento se sigue con las disoluciones madre de fructosa y glucosa. Se agitarn manualmente los matraces con la finalidad de homogeneizar las disoluciones.
111
Polarimetra - Determinacin de sacarosa en leche condensada 11.5.3.3. Anlisis polarimtrico

En la Figura 11.1 se muestra el polarmetro que se utilizar en la presente prctica.
Figura 11.1. Polarmetro (detalle del depsito de muestras). Para llevar a cabo las medidas en el polarmetro ser necesario, en primer lugar, el ajuste a cero del mismo con agua destilada. Para ello proceder de la siguiente manera: (a) Presionar el interruptor de encendido del instrumento situado en la parte posterior del mismo. Debe esperarse de 5 a 10 minutos desde que se enciende la lmpara antes de empezar a trabajar. (b) Llenar el tubo de observacin (1)(Figura 11.2)con agua destilada. Para ello, desenroscar el anillo de seguridad (4) de uno de los extremos del tubo y quitar el anillo de goma (3) y el disco de vidrio (2). Colocar el tubo de observacin en posicin vertical e introducir la muestra mediante una pipeta Pasteur hasta la boca del mismo. Deslizar el disco de vidrio sobre la boca del tubo, evitando la formacin de burbujas en el interior. A continuacin, colocar el anillo de goma sobre el disco de vidrio y enroscar el anillo de seguridad. Comprobar que si se ha formado alguna burbuja, sta se site en la trampa para las mismas, en caso contrario abrir el tubo y rellenarlo con un poco ms de muestra. (c) Colocar el tubo en el depsito de muestras levantado la tapa de la cmara para las mismas (Figura 11.1).
112
Figura 11.2. (1) Tubo de observacin, (2) disco de vidrio, (3) anillo de goma, (4) anillo de seguridad. (d) En el cuadro de mandos del polarmetro (Figura 11.3), comprobar que el piloto de la tecla de ajuste a cero (1) est encendido. Si se encuentra apagado indica que el analizador est desplazado del cero aproximadamente 3, por lo que deber presionar simultneamente la tecla de rotacin rpida (2) y la de rotacin a la izquierda (3) o a la derecha (4), hasta que se ilumine dicho piloto.
4 5 1 2 3
Figura 11.3. Cuadro de mandos del polarmetro: (1) piloto de ajuste a cero, (2) tecla de rotacin rpida, (3) tecla de rotacin a la izquierda, (4) tecla de rotacin a la derecha, (5) tecla para el ajuste a cero.
(e) Cuando el piloto de ajuste a cero se encuentre iluminado mirar a travs del ocular e igualar el brillo de los campos pticos derecho e izquierdo como se indica en la Figura 11.4. Si, por ejemplo, el lado derecho aparece ms brillante, lo que indica desviacin de la luz hacia la derecha del material de la muestra, se ha de pulsar la tecla de rotacin derecha (4) y el campo visual del lado derecho, que originalmente era el ms brillante, va cambiando poco a poco hasta hacerse ms oscuro. Existe un punto en este proceso en el que el brillo de los campos derecho e izquierdo se iguala, entonces, pulsar la tecla de ajuste a cero (5). Si fuera el lado izquierdo el ms brillante se procedera del mismo modo pero, en este caso, pulsando la tecla de rotacin hacia la izquierda (3).
113
(a)
Medida
(b)
Figura 11.4. Posibles cambios del campo visual: (a) desviacin ptica hacia la derecha, (b) desviacin ptica hacia la izquierda. Una vez realizada la calibracin del polarmetro se realizarn las medidas del ngulo de rotacin de las cinco disoluciones patrn de sacarosa, fructosa, glucosa y de las disoluciones problema I y II (antes y despus del proceso de hidrlisis de la sacarosa). Para ello: (f) Rellenar el tubo de observacin con la disolucin a medir (lavarlo previamente dos veces con la disolucin). (g) Colocar el tubo en el depsito de muestras. (h) Mirando a travs del ocular, igualar el brillo de los campos pticos derecho e izquierdo, tal y como se ha indicado en el apartado (e). Es en el punto de igualdad de brillo en el que debe leerse en la pantalla digital la desviacin ptica de la disolucin que se est midiendo.
11.6. Resultados
1. Con los datos de ngulos de rotacin obtenidos a partir de las disoluciones patrn preparadas de sacarosa, glucosa y fructosa construir las rectas de calibrado. Obtener los valores de la ordenada en origen, pendiente y coeficiente de correlacin de dichas rectas. 2. A partir del cambio en el ngulo de rotacin que se produce tras la inversin de la sacarosa presente en la muestra ([]), obtener el % en peso de sacarosa en la leche condensada (despreciar el contenido de protenas y grasa en la misma) utilizando la siguiente expresin: [] . f = []sacarosa +[]glucosa +[]fructosa siendo f el factor de dilucin en la etapa de hidrlisis (hay que tener en cuenta que el factor de conversin de dos moles de monosacrido en 1 mol de disacrido es 0,95 puesto que se pierde 1 mol de agua). 114

3. Con los datos obtenidos por los distintos grupos de trabajo del laboratorio, realizar un tratamiento estadstico de los resultados (media, desviacin estndar y desviacin con relacin a la media), despus de haber eliminado previamente los datos discordantes. 4. Comentar los resultados obtenidos en cuanto al contenido de sacarosa y compararlos con datos buscados en bibliografa sobre distintos tipos de leche condensada.
11.7. Cuestiones
1. Por qu se aade amoniaco y cido actico a la muestra? 2. Se podra aadir primero el cido actico y despus neutralizar con amoniaco? 3. Para qu se aade cloruro de zinc y hexacianoferrato(II) de potasio?, se podra realizar el ensayo sin aadir dichas sales?
115
Polarimetra - Determinacin almidn en arroz
Prctica 12. DETERMINACIN DE ALMIDN EN ARROZ MEDIANTE POLARIMETRA 12.1. Introduccin

El almidn es un polisacrido de reserva en las plantas que proporciona entre el 70 y 80 % de las caloras consumidas por los humanos de todo el mundo. Tanto el almidn como los productos de la hidrlisis de ste constituyen la mayor parte de los carbohidratos digestibles de la dieta habitual. El almidn est formado por dos componentes: la amilosa y la amilopectina, y se diferencia de los dems carbohidratos en que, en la naturaleza, se presenta como complejas partculas discretas que reciben el nombre de grnulos. Los grnulos de almidn son relativamente densos, insolubles y se hidratan muy mal en agua fra. Una caracterstica importante del almidn es su capacidad para formar con el yodo compuestos de inclusin coloreados, propiedad que permite detectar su presencia en los alimentos. El almidn es el componente principal de muchos alimentos entre los que destacan las patatas, las legumbres y los cereales como, por ejemplo, el arroz. El arroz ha sido durante siglos y sigue siendo en la actualidad el alimento bsico de ms de la mitad de la poblacin mundial, fenmeno que tiene su explicacin en las excelentes propiedades nutritivas de este cereal. Su aporte energtico es de unas 350 kilocaloras por cada 100 gramos, siendo prcticamente la totalidad de esta energa debida al almidn. Adems, el arroz es rico en minerales como fsforo, hierro y potasio, y en vitaminas, adems de disponer de los ocho aminocidos esenciales para el cuerpo humano. La determinacin polisacridos (almidn, celulosa, pectinas, ...) suele hacerse tras someter a los mismos a una hidrlisis cida o enzimtica, mediante la cual los polisacridos se separan en sus componentes que se analizarn, a continuacin, con diversas tcnicas como la espectrofotometra UV-Vis, la cromatografa de lquidos, etc. Sin embargo, gracias a la elevada rotacin especfica que presenta el almidn (en torno a + 190), ste puede determinarse directamente con elevada precisin, an en cantidades relativamente pequeas, mediante polarimetra, despus de disolver el almidn de la muestra en un medio cido. Otra ventaja de esta determinacin es que otros polisacridos, como las hemicelulosas, no interfieren al tener una actividad ptica significativamente menor, por lo que pueden estar presentes en la disolucin junto con el almidn. Debe tenerse en cuenta, sin embargo, que la determinacin polarimtrica de almidn no puede llevarse a cabo en alimentos que contengan almidones modificados, como por ejemplo almidn gelatinizado. En la presente prctica se llevar a cabo la determinacin de almidn en harina de arroz mediante polarimetra. Para ello, se realizar una extraccin previa de los azcares solubles en etanol presentes en la misma y, posteriormente, se determinar el ngulo de rotacin de la disolucin, a partir del cual, se calcular el porcentaje en peso de almidn en la muestra de arroz.
117
12.2. Objetivos
1. Realizar el tratamiento de una muestra real como etapa previa al anlisis. 2. Aprender el manejo de un polarmetro. 3. Determinar del contenido de almidn en una muestra de arroz.

Embudo de vidrio Kitasatos de 250 mL Matraces aforados de 50 y 100 mL Matraz erlenmeyer de 100 mL Pipetas de 2, 5 y 10 mL Pipeta Pasteur con tetina de goma Placa filtrante porosa n 4 Probetas de 50 y 100 mL Vasos de precipitados de 50, 100 y 1000 mL Vidrio de reloj o pesasustancias Goma adaptadora de Kitasato Tapn Suba-seal Trompa de vaco Balanza analtica y granatario Molinillo elctrico Placa calefactora Polarmetro Tubo de observacin de 2 dm
12.4. Reactivos
cido actico glacial cido perclrico Cloruro de zinc Hexacianoferrato(II) de potasio Agua destilada Etanol Muestra de arroz

a) Extreme las precauciones en el manejo del tubo de observacin, especialmente en el proceso de llenado del mismo. b) Evite la presencia de burbujas de aire en el interior del tubo de observacin ya que stas interfieren en el haz de luz polarizada y causarn error en la medida. c) Asegrese que antes de introducir el tubo de observacin en el polarmetro se encuentra perfectamente limpio y seco.
12.5.2. Preparacin de disoluciones

Disolucin de cido perclrico 0,30M. Se toman 1,28 mL de cido perclrico comercial, se transfieren a un matraz aforado de 50 mL y se completan con agua destilada hasta el enrase. Disolucin de cloruro de zinc 1 M en cido actico 2 M. Se pesan 6,95 g de cloruro de zinc en un vaso de precipitados de 50 mL y se disuelven con agua destilada. 118

La disolucin resultante se pasa a un matraz aforado de 50 mL, se aaden 5,80 mL de cido actico glacial comercial y se enrasa con agua destilada. Disolucin de hexacianoferrato(II) de potasio 0,25 M. Se pesan 5,33 g de K4Fe(CN)63H2O en un vaso de precipitados de 50 mL y se disuelven con agua destilada. La disolucin resultante se pasa a un matraz aforado de 50 mL y se enrasa con agua destilada.
12.5.3. Determinacin de almidn:

12.5.3.1. Extraccin del almidn
Moler el arroz con un molinillo elctrico, hasta obtener una harina fina. Pesar 2,5 g de la harina en un vaso de precipitados de 100 mL y aadir 80 mL de etanol. Dejar durante 1 hora a temperatura ambiente, agitando de vez en cuando durante este periodo. Posteriormente, filtrar la muestra con placa filtrante del n 4 y lavar el residuo filtrado con unos 20 mL de etanol. El residuo filtrado se deja secar al aire. Cuando el residuo est bien seco, se pasa a un matraz erlenmeyer de 100 mL, se aaden 50 mL de HClO4 0,30 M y se homogeniza la disolucin. Se tapa el matraz erlenmeyer con un tapn suba-seal y se mete en un bao de agua hirviendo durante 15 min, agitando sobre todo al inicio (tenga cuidado de no quemarse). Transcurrido este tiempo, se aaden 30 mL de agua al matraz erlenmeyer y se enfra rpidamente a temperatura ambiente. Una vez fro se transfiere a un matraz aforado de 100 mL, se aaden 5 mL de la disolucin de cloruro de zinc en cido actico y se agita. A continuacin, se aaden 5 mL de la disolucin de hexacianoferrato(II) de potasio y se agita de nuevo. Finalmente, se enrasa el matraz con agua destilada y se procede al filtrado de la disolucin con un embudo cnico y filtro de pliegues, descartando los primeros 10-15 mL del filtrado.
12.5.3.2. Anlisis polarimtrico

En la Figura 12.1 se muestra el polarmetro que se utilizar en la prctica.
Figura 12.1. Polarmetro (detalle del depsito de muestras).
119

Para llevar a cabo las medidas en el polarmetro ser necesario, en primer lugar, el ajuste a cero del mismo con agua destilada. Para ello proceder de la siguiente manera: (a) Presionar el interruptor de encendido del instrumento situado en la parte posterior del mismo. Debe esperarse de 5 a 10 minutos desde que se enciende la lmpara antes de empezar a trabajar. (b) Llenar el tubo de observacin (1)(Figura 12.2)con agua destilada. Para ello, desenroscar el anillo de seguridad (4) de uno de los extremos del tubo y quitar el anillo de goma (3) y el disco de vidrio (2). Colocar el tubo de observacin en posicin vertical e introducir la muestra mediante una pipeta Pasteur hasta la boca del mismo. Deslizar el disco de vidrio sobre la boca del tubo, evitando la formacin de burbujas en el interior. A continuacin, colocar el anillo de goma sobre el disco de vidrio y enroscar el anillo de seguridad. Comprobar que si se ha formado alguna burbuja, sta se site en la trampa para las mismas, en caso contrario abrir el tubo y rellenarlo con un poco ms de muestra.
Figura 12.2. (1) Tubo de observacin, (2) disco de vidrio, (3) anillo de goma, (4) anillo de seguridad. (c) Colocar el tubo en el depsito de muestras levantado la tapa de la cmara para las mismas (Figura 12.1). (d) En el cuadro de mandos del polarmetro (Figura 12.3), comprobar que el piloto de la tecla de ajuste a cero (1) est encendido. Si se encuentra apagado indica que el analizador est desplazado del cero aproximadamente 3, por lo que deber presionar simultneamente la tecla de rotacin rpida (2) y la de rotacin a la izquierda (3) o a la derecha (4), hasta que se ilumine dicho piloto. 120
4 5 1 2 3
Figura 12.3. Cuadro de mandos del polarmetro: (1) piloto de ajuste a cero, (2) tecla de rotacin rpida, (3) tecla de rotacin a la izquierda, (4) tecla de rotacin a la derecha, (5) tecla para el ajuste a cero. (e) Cuando el piloto de ajuste a cero se encuentre iluminado mirar a travs del ocular e igualar el brillo de los campos pticos derecho e izquierdo como se indica en la Figura 12.4. Si, por ejemplo, el lado derecho aparece ms brillante, lo que indica desviacin de la luz hacia la derecha del material de la muestra, se ha de pulsar la tecla de rotacin derecha (4) y el campo visual del lado derecho, que originalmente era el ms brillante, va cambiando poco a poco hasta hacerse ms oscuro. Existe un punto en este proceso en el que el brillo de los campos derecho e izquierdo se iguala, entonces, pulsar la tecla de ajuste a cero (5). Si fuera el lado izquierdo el ms brillante se procedera del mismo modo pero, en este caso, pulsando la tecla de rotacin hacia la izquierda (3).
(a)
Medida
(b)
Figura 12.4. Posibles cambios del campo visual: (a) desviacin ptica hacia la derecha, (b) desviacin ptica hacia la izquierda. Una vez realizada la calibracin del polarmetro se realizarn las medidas del ngulo de rotacin de la disolucin problema de arroz. Para ello: (f) Rellenar el tubo de observacin con la disolucin a medir (lavarlo previamente dos veces con la disolucin). (g) Colocar el tubo en el depsito de muestras. (h) Mirando a travs del ocular, igualar el brillo de los campos pticos derecho e izquierdo, tal y como se ha indicado en el apartado (e). Es en el punto de igualdad de brillo en el que debe leerse en la pantalla digital la desviacin ptica de la disolucin que se est midiendo.
121
Polarimetra - Determinacin de almidn en arroz
12.6. Resultados
1. Con el dato del ngulo de rotacin obtenido a partir de la disolucin problema de la muestra de arroz, calcular el % en peso de almidn en la misma, teniendo en cuenta que []D20 para el almidn de arroz es igual a 185,9. 2. Con los datos obtenidos por los distintos grupos de trabajo del laboratorio, realizar un tratamiento estadstico de los resultados (media, desviacin estndar y desviacin con relacin a la media), despus de haber eliminado previamente los datos discordantes. 3. Comentar los resultados obtenidos en cuanto al contenido de almidn en el arroz y compararlos con datos buscados en bibliografa.
12.7. Cuestiones
1. Por qu se debe lavar la muestra con etanol antes de proceder a extraer el
almidn de la misma? 2. Por qu se emplea cido perclrico en caliente para extraer el almidn de la muestra?. Se podra extraer simplemente con agua caliente? 3. Para que se aaden las disoluciones de cloruro de zinc en cido actico y de hexacianoferrato(II) de potasio?
122
Polarimetra Estudio de la reaccin de inversin de la sacarosa
Prctica 13. ESTUDIO DE LA REACCIN DE INVERSIN DE LA SACAROSA MEDIANTE MEDIDAS POLARIMTRICAS. 13.1. Introduccin
La sacarosa es un disacrido de frmula molecular C12H22O11 constituido por una molcula de D-glucosa y otra de D-fructosa. El proceso de hidrlisis de la sacarosa, conocido como inversin, se encuentra catalizado por cidos segn la reaccin:
H+ Sacarosa + H2O D-glucosa + D-fructosa
[]D20 = 66,5
[]D20 = 52,7
[]D20 = -92,4
mezcla []D20 = -19,9
En la reaccin de hidrlisis de la sacarosa, se puede definir la velocidad como la disminucin de la concentracin de reactivo con respecto al tiempo. Adems esta velocidad es proporcional a la concentracin de reactivos:
- d[sac] dt = k [sac] [H2O] (1)
As, k es la constante de velocidad y [sac] y [H2O] son las concentraciones de sacarosa y agua, respectivamente. Sin embargo, como el agua es el disolvente y est en exceso con respecto a la concentracin de sacarosa, la concentracin de agua permanece prcticamente constante con respecto al tiempo y, por tanto, puede ser incluida en la constante de velocidad. As la ecuacin 1 quedara como:
- d[sac] dt
k = k [H2O]
(2)
= k [sac]
(3)
La ecuacin de velocidad es consistente con una cintica de primer orden ya que la velocidad slo depende de la concentracin de sacarosa. Aunque en realidad es cintica de pseudo-primer orden, puesto que la constante engloba la concentracin de uno de los reactivos. Si se integra la ecuacin (3) se transforma en:
- d(Co-x) dt = k ( Co-x) - d(Co-x) ( Co-x) = kdt (4)
123

La concentracin inicial de sacarosa se denomina Co, mientras que x es la concentracin de glucosa y fructosa en un instante t. Si integramos la ecuacin (4) entre los valores t = 0 y t = t resulta la siguiente ecuacin:
dx ( Co-x)
= kdt
ln
Co Co-x
1 t
= k
(5)
Las concentraciones Co y x se pueden relacionar con el ngulo de rotacin () mediante la ley de Biot: = []Dt . l . C (6)
donde es el ngulo de rotacin, []Dt es el ngulo de rotacin especfica producido cuando la luz polarizada atraviesa 1 dm de longitud de una disolucin de concentracin 1 g/mL a una temperatura dada (t) y para un tipo de radiacin determinada (lnea D de emisin del sodio), l es el camino ptico (dm) y C es la concentracin (g/mL). Teniendo en cuenta la ecuacin (6) podemos escribir la ecuacin (5) de la siguiente manera:
k = ln o- t- 1 t
8
(7)
Los ngulos de rotacin o, t y son los medidos en el instante inicial (t = 0), a tiempo t y a tiempo t = , respectivamente. Colocando la ecuacin (7):
ln o- t-
8
= kt
(8)
En esta prctica se determinar la constante de velocidad de la reaccin de inversin de la sacarosa utilizando cido clorhdrico y cido tricloroactico, mediante medidas polarimtricas.
13.2. Objetivos
1. Aprender a utilizar un polarmetro. 2. Estudiar la reaccin de inversin de la sacarosa utilizando dos cidos diferentes. 3. Determinar la constante de velocidad de una reaccin. 124

Embudo de vidrio Matraces aforados de 50 y 100 mL Pipeta Pasteur con tetina de goma Pipeta de 10 mL Probeta de 50 mL Varilla de vidrio Vasos de precipitados de 100 y 250 mL Vidrio de reloj o pesasustancias Balanza analtica Cronmetro Placa agitadora Polarmetro Tubo de observacin de 2 dm Granatario
14.4. Reactivos
cido clorhdrico cido tricloroactico Agua destilada Sacarosa

a) Extreme las precauciones en el manejo del tubo de observacin, especialmente en el proceso de llenado del mismo. b) Evite la presencia de burbujas de aire en el interior del tubo de observacin ya que stas interfieren en el haz de luz polarizada y, por tanto, causarn error en la medida. c) Asegrese que antes de introducir el tubo de observacin en el polarmetro se encuentra perfectamente limpio y seco ya que de lo contrario, al tratarse de disoluciones cidas, pudiera daarse el equipo.

Disolucin de sacarosa 20 % (p/v). Se pesa 10 g de sacarosa y se aaden unos 30 mL de agua destilada para disolverla. Una vez disuelta se transfiere a un matraz aforado de 50 mL y se completa con agua destilada hasta el enrase. Disolucin de cido clorhdrico 3 M. Se transfieren 25,53 mL cido clorhdrico comercial a un matraz aforado de 100 mL y se enrasar con agua destilada. Disolucin de cido tricloroactico 3 M. Se disuelven 24,51 g de cido tricloroactico en unos 30 mL de agua destilada. Se transfiere la disolucin a un matraz aforado de 50 mL enrasando con agua destilada.
125
14.5.3. Determinacin de la constante cintica y del orden de la reaccin:

En la Figura 14.1 se muestra el polarmetro que se utilizar en la presente prctica.
Figura 14.1. Polarmetro (detalle del depsito de muestras). Para llevar a cabo las medidas en el polarmetro ser necesario, en primer lugar, el ajuste a cero del mismo con agua destilada. Para ello proceder de la siguiente manera: (a) Presionar el interruptor de encendido del instrumento situado en la parte posterior del mismo. Debe esperarse de 5 a 10 minutos desde que se enciende la lmpara antes de empezar a trabajar. (b) Llenar el tubo de observacin (1)(Figura 14.2)con agua destilada. Para ello, desenroscar el anillo de seguridad (4) de uno de los extremos del tubo y quitar el anillo de goma (3) y el disco de vidrio (2). Colocar el tubo de observacin en posicin vertical e introducir la muestra mediante una pipeta Pasteur hasta la boca del mismo. Deslizar el disco de vidrio sobre la boca del tubo, evitando la formacin de burbujas en el interior. A continuacin, colocar el anillo de goma sobre el disco de vidrio y enroscar el anillo de seguridad. Comprobar que si se ha formado alguna burbuja, sta se site en la trampa para las mismas, en caso contrario abrir el tubo y rellenarlo con un poco ms de muestra. (c) Colocar el tubo en el depsito de muestras levantado la tapa de la cmara para las mismas (Figura 14.1).
126
Figura 14.2. (1) Tubo de observacin, (2) disco de vidrio, (3) anillo de goma, (4) anillo de seguridad. (d) En el cuadro de mandos del polarmetro (Figura 14.3), comprobar que el piloto de la tecla de ajuste a cero (1) est encendido. Si se encuentra apagado indica que el analizador est desplazado del cero aproximadamente 3, por lo que deber presionar simultneamente la tecla de rotacin rpida (2) y la de rotacin a la izquierda (3) o a la derecha (4), hasta que se ilumine dicho piloto.
4 5 1 2 3
Figura 14.3. Cuadro de mandos del polarmetro: (1) piloto de ajuste a cero, (2) tecla de rotacin rpida, (3) tecla de rotacin a la izquierda, (4) tecla de rotacin a la derecha, (5) tecla para el ajuste a cero.
(e) Cuando el piloto de ajuste a cero se encuentre iluminado mirar a travs del ocular e igualar el brillo de los campos pticos derecho e izquierdo como se indica en la Figura 14.4. Si, por ejemplo, el lado derecho aparece ms brillante, lo que indica desviacin de la luz hacia la derecha del material de la muestra, se ha de pulsar la tecla de rotacin derecha (4) y el campo visual del lado derecho, que originalmente era el ms brillante, va cambiando poco a poco hasta hacerse ms oscuro. Existe un punto en este proceso en el que el brillo de los campos derecho e izquierdo se iguala, entonces, pulsar la tecla de ajuste
127
Polarimetra - Estudio de la reaccin de inversin de la sacarosa

a cero (5). Si fuera el lado izquierdo el ms brillante se procedera del mismo modo pero, en este caso, pulsando la tecla de rotacin hacia la izquierda (3).
(a)
Medida
(b)
Figura 14.4. Posibles cambios del campo visual: (a) desviacin ptica hacia la derecha, (b) desviacin ptica hacia la izquierda. Una vez realizada la calibracin del polarmetro se realizarn las medidas del ngulo de rotacin o, t. y : (a) Medida de 0. Tomar 25 mL de la disolucin de sacarosa al 20 % (p/v) y transferirlos a un vaso de precipitados de 100 mL. Aadir 35 mL de agua destilada y homogeneizar la disolucin. Introducir la disolucin en el tubo de observacin y tomar la medida en el polarmetro cuando el brillo de ambos campos sea el mismo. (b) Medida de t. Coger 25 mL de la disolucin de sacarosa al 20 % (p/v) y transferirlos a un vaso de precipitados de 100 mL. Aadir 35 mL de la disolucin de cido tricloroactico 3 M, con agitacin continua y conectar el cronmetro en ese momento. La primera medida de se realizar lo antes posible y a partir de sta se toman medidas cada 3 min hasta el minuto 30 y cada 5 min hasta el minuto 60. (c) Medida de . Para obtener esta medida hay que asegurarse que la reaccin ha terminado, por tanto, la medida se tomar al da siguiente, comprobando con una segunda medida, a las dos horas, que el valor permanece constante. Realizar el mismo procedimiento que el descrito anteriormente utilizando cido clorhdrico para llevar a cabo la hidrlisis de la sacarosa.
13.6. Resultados
1. Construir una tabla con los datos obtenidos a partir de las medidas realizadas que incluya: o, , t, tiempo (segundos), o-, t- y ln (o-/t-) tanto para la reaccin de hidrlisis con cido tricloroactico, como para la reaccin de hidrlisis con cido clorhdrico.
128
Polarimetra - Estudio de la reaccin de inversin de la sacarosa

2. Representar los datos grficamente ln (o-/t-) frente al tiempo. Obtener los valores de la ordenada en origen, pendiente y coeficiente de correlacin de ambas rectas. 3. Obtener los valores de la constante cintica con sus correspondientes unidades, para ambas reacciones de hidrlisis. 4. Comentar los resultados obtenidos con ambos cidos.
13.7. Cuestiones
1. Segn las representaciones grficas, la reaccin de hidrlisis de la sacarosa corresponde con una cintica de pseudo-primer orden?, por qu? 2. Calcular el valor de rotacin especfica de la sacarosa y compararlo con el valor dado en la introduccin de la prctica, coinciden ambos valores?. de qu factores depende dicho valor?
129
Potenciometra Fundamento terico
VI. POTENCIOMETRA Fundamento terico

Las tcnicas potenciomtricas son un grupo de tcnicas electroanalticas basadas en la medida del potencial de una celda electroqumica en ausencia de corrientes apreciables. En una celda para anlisis potenciomtrico tpica vamos a distinguir dos electrodos (electrodo indicador y electrodo de referencia) que se encuentran sumergidos en una disolucin del analito y que estn conectados a un dispositivo para medir el potencial. Un electrodo indicador ideal es aquel que responde rpidamente y de manera reproducible a la actividad del analito en la disolucin problema. Los electrodos indicadores pueden ser metlicos o de membrana. Los primeros generan un potencial elctrico en respuesta a una reaccin redox que tiene lugar en la superficie metlica del electrodo. Sin embargo, algunos de estos electrodos no participan como tal en la reaccin redox, sino que su nica misin es la de transferir electrones. Esto es lo que ocurre con los electrodos que se construyen con metales inertes como el platino, oro y paladio. Por otro lado, los electrodos de membrana o electrodos selectivos de iones (ISE) son diferentes a los electrodos metlicos tanto en su diseo como en su fundamento, ya que la membrana no da ni recibe electrones (es decir, no esta implicada en un proceso redox) sino que es capaz de unirse de manera selectiva al ion que se pretende determinar. Los orgenes de estos electrodos derivan del electrodo de vidrio de pH, cuya robustez, fiabilidad y selectividad hacen que hoy en da sea uno de los ms utilizados dentro de este tipo de electrodos. En la Figura 1 se muestra un electrodo combinado de pH tpico, que incorpora tanto el electrodo indicador de vidrio como el electrodo de referencia.
Figura 1. Electrodo combinado.
de
pH
Las determinaciones potenciomtricas pueden ser de dos tipos: (1) medidas potenciometrcas directas (cuando la actividad del ion que nos interesa se determina realizando una nica medida del potencial de la celda) y (2) valoraciones potenciomtricas
131

(cuando la medida del potencial de la celda se utiliza para detectar el punto final de una valoracin). La determinacin de un ion mediante potenciomtra directa es rpida y simple. Requiere la comparacin del potencial desarrollado por el electrodo indicador en la disolucin problema con el potencial obtenido cuando se sumerge en una o ms disoluciones patrn del analito. Una valoracin potenciomtrica implica la medida del potencial de la celda electroqumica en funcin del volumen de reactivo valorante adicionado. Las valoraciones potenciomtricas proporcionan datos ms fiables que los que se obtienen en valoraciones en las que se utilizan indicadores qumicos, y pueden ser utilizadas en reacciones de neutralizacin, redox, precipitacin y formacin de complejos. Estas valoraciones se pueden automatizar fcilmente. En la Figura 2 se muestra un valorador automtico (autovalorador) para efectuar una valoracin potenciomtrica. Este dispositivo vierte el reactivo valorante desde un depsito (botella de vidrio), situado en la parte posterior, en el vaso que contiene el analito, el cual se agita de manera continua mediante un agitador magntico
Figura 2. Valorador potenciomtrico. La seleccin del electrodo indicador depende de la naturaleza de la valoracin. En valoraciones redox el electrodo debe ser de un metal inerte como Pt o Pd. En valoraciones cidobase el electrodo es normalmente de vidrio. Para complexometras se usan tanto electrodos de membrana como metalicos. En argentometras se usa un electrodo de Ag. 132
Figura 3. combinado.
Electrodo
de
Pt

El proceso de valoracin consiste en la medicin del potencial de la celda (en unidades de milivoltios o pH) despus de cada adicin de reactivo valorante. Al principio se aade el valorante en grandes incrementos de volumen que luego se van haciendo menores a medida que se acerca el punto final. Para detectar el punto final de una valoracin potenciomtrica se pueden utilizar varios mtodos. El ms directo se basa en llevar directamente a una grfica el potencial en funcin del volumen de reactivo adicionado (Figura 4.a), el punto medio en la porcin ascendente de la curva se estima visualmente y se toma como el punto final (punto de inflexin). Otro procedimiento para detectar el punto final es llevar a una grfica el cambio de potencial por unidad de volumen del reactivo valorante (es decir E/V, curva de la primera derivada) en funcin del volumen de reactivo adicionado. Como se muestra en la Figura 4.b se obtiene una curva con un valor mximo que corresponde al punto final. La curva de la segunda derivada (2E/V2) cambia de signo en el punto final (Figura 4.c) y se toma como punto final la interseccin de la misma con el eje de abscisas.
14
10
12 10
(a)
pH/V
8 6 4 2 0
(b)
pH
6 4 2 0
20
40
60
80
100
20
40
60
80
100
Volumen aadido (mL)
Volumen aadido (mL)
30 20 10
pH/V
2
(c)
0 -10 -20 -30
20
40
60
80
100
Volumen aadido (mL)
Figura 4. (a) Curva de valoracin. (b) Curva de la primera derivada. (c) Curva de la segunda derivada.
133
Potenciometra - Determinacin de la acidez en vino
Prctica 14. DETERMINACIN DE LA ACIDEZ EN VINOS MEDIANTE VALORACIN POTENCIOMTRICA 14.1. Introduccin
El vino es una bebida obtenida de la uva mediante fermentacin alcohlica de su zumo o mosto. La fermentacin se realiza por medio de levaduras que transforman los azcares de la uva en alcohol y anhdrido carbnico. Los principales componentes del vino son el agua (85 % a 90 %) y el etanol (9 % a 15 %). La uva es una fruta cida y, como consecuencia, el vino es una bebida cida ya que los cidos de la uva pasan al mismo. Durante el proceso de vinificacin se generan, adems, nuevos cidos. As, se pueden clasificar los cidos del vino en: orgnicos naturales (proceden de la uva, son el cido tartrico, mlico y ctrico), orgnicos derivados (surgidos durante los procesos fermentativos, son el cido lctico, succnico y actico) e inorgnicos (de origen es mineral, destaca el cido sulfrico presente en forma de sulfatos). El proceso de elaboracin del vino influye de manera importante en la acidez del mismo. As, por ejemplo, la presencia del hollejo (piel de la uva) en el proceso de fermentacin reduce la acidez del vino, puesto que sta contiene potasa que difunde al mismo. Segn las prcticas de elaboracin, pueden distinguirse tres tipos principales de vino: el blanco, procedente de mostos de uva blanca o de uva tinta con pulpa no coloreada, habindose evitado en este ltimo caso la difusin al mostos de la materia colorante contenida en el hollejo, el tinto, procedente de mostos obtenidos de uvas tintas con el adecuado proceso de elaboracin para conseguir la difusin al mosto de la materia colorante del hollejo y, el rosado, procedente de uvas tintas, o de mezcla de tintas y blancas, cuyos mostos han fermentado sin los hollejos. La acidez del vino no se expresa como el contenido de cada cido por separado, sino como la suma de todos los cidos, referida al ms abundante que es el tartrico (expresada en gramos de cido tartrico por litro de vino). La acidez total incluye, por tanto, una acidez que se considera negativa en el vino, que es la debida a la presencia de cido actico. sta es la que se conoce como acidez voltil, llamada as porque este cido se evapora espontneamente. Es conveniente, por tanto, que la acidez voltil de un vino sea lo ms baja posible. La acidez voltil se expresa en gramos de cido actico por litro de vino. Si a la acidez total se le resta la acidez voltil, la diferencia se llama acidez fija, expresada en gramos de cido tartrico por litro de vino. En esta prctica se determinar la acidez total, fija y voltil en distintas muestras de vino mediante valoracin cido-base con indicador qumico y mediante valoracin potenciomtrica.
135
14.2. Objetivos
1. 2. 3. 4. Aprender el manejo de un valorador potenciomtrico. Entender el fundamento de las valoraciones potenciomtricas. Determinar la acidez total, voltil y fija de distintos tipos de vinos. Diferenciar entre el uso de un indicador visual y un indicador instrumental para la deteccin del punto final en una valoracin.

Bureta Cristalizador Embudo de vidrio Matraz aforado de 500 mL Matraces erlenmeyer de 250 mL Pipeta Pasteur con tetina de goma Pipeta aforada de 20 mL Probeta de 50 mL Varilla de vidrio Vasos de precipitados de 100 y 250 mL Vidrio de reloj o pesasustancias Granatario Electrodo combinado de pH Pinza de bureta Placa calefactora Soporte Valorador potenciomtrico Bao de ultrasonidos
14.4. Reactivos
Hidrxido de sodio Hidrgenoftalato de potasio Fenolftalena Etanol Agua destilada Muestras de vino

a) Tenga cuidado al pesar (granatario) y manejar el hidrxido sdico puesto que provoca quemaduras graves. b) Asegrese que el electrodo est sumergido en la disolucin antes de comenzar la valoracin. Evitar que el imn toque el electrodo durante la agitacin.

Disolucin de hidrxido de sodio 0,1 M. Se pesa 2 g de hidrxido de sodio y se aaden unos 400 mL de agua destilada para disolverlo. Una vez disuelto se transfiere a un matraz aforado de 500 mL y se completa con agua destilada hasta el enrase. Disolucin de fenolftalena. Se disuelven 0,05 g de fenolftalena en 50 mL de etanol. Posteriormente, agregar 50 mL de agua destilada. 136
14.5.3. Estandarizacin del hidrxido de sodio 0,1 M:

Estandarizar la disolucin de NaOH 0,1 M con hidrogenoftalato de potasio, utilizando fenolftalena como indicador. Para ello, se pesa 1 g de hidrogenoftalato de potasio en un matraz erlenmeyer y se aaden unos 50 mL de agua destilada para disolverlo. Adicionar la disolucin de NaOH desde la bureta hasta que la disolucin tome un color rosa. Repita la valoracin, al menos dos veces, y obtenga la concentracin exacta de la disolucin de NaOH a partir de un valor medio.
14.5.4. Determinacin de la acidez total, voltil y fija:

Poner, aproximadamente, 150 mL de la muestra de vino en un vaso de precipitados de 250 mL. Colocar el vaso en el bao de ultrasonidos, durante unos 15 minutos, para eliminar el dixido de carbono.
14.5.4.1. Valoracin con indicador qumico

Acidez total: Tomar una alcuota de 20 mL del vino desgasificado y colocarla en un erlenmeyer, aadiendo 5 gotas de fenolftalena como indicador. Valorar con la disolucin de NaOH, previamente estandarizada. En el caso de que la muestra sea de vino tinto, valorar hasta que se observe un enturbiamiento y en el caso de que sea de vino blanco, hasta que se detecta el cambio de color persistente. Repita la valoracin, al menos dos veces. Acidez fija: Tomar otra alcuota de 20 mL del vino desgasificado y colocarla en un vaso de precipitados de 100 mL. Evaporar al bao Mara hasta observar una consistencia aceitosa (realizar este proceso en la campana). Aadir 10 mL de agua destilada y llevar de nuevo a sequedad. A continuacin, disolver el residuo en, aproximadamente, 100 mL de agua destilada. Transferir a un matraz erlenmeyer y valorar del mismo modo que en el caso de la acidez total. Repita la valoracin, al menos dos veces.
14.5.4.2. Valoracin potenciomtrica

Acidez total: Tomar otra alcuota de 20 mL del vino desgasificado y colocarla en un vaso de precipitados de 250 mL. Valorar con la disolucin de NaOH, previamente estandarizada, utilizando un valorador potenciomtrico con electrodo combinado de pH (Figura 14.1). Acidez fija: Tomar otra alcuota de 20 mL del vino desgasificado y colocarla en un vaso de precipitados de 100 mL. Evaporar al bao Mara hasta observar una consistencia aceitosa (realizar este proceso en la campana). Aadir 10 mL de agua destilada y llevar de nuevo a sequedad. A continuacin, disolver el residuo en, aproximadamente, 100 mL de agua destilada y transferir a un vaso de precipitados de 250 mL. Valorar con la
137

disolucin de NaOH, previamente estandarizada, utilizando potenciomtrico con electrodo combinado de pH (Figura 14.1). un valorador
Figura 14.1. Valorador potenciomtrico. A continuacin se describe el proceso de valoracin: (a) Rellenar la botella del valorador potenciomtrico con la disolucin de NaOH 0,1 M previamente estandarizada. (b) Encender el equipo y lavar dos o tres veces el pistn. Para ello, apretar alternativamente DOS para vaciar y FILL para rellenar. (c) Seguidamente es necesario cargar el mtodo de valoracin. Pulsar <mode> repetidamente hasta que aparezca DET en la pantalla (Dynamic Equivalence point Titration). Confirmar DET pulsando <enter> y seleccionar la magnitud medida pulsando <select> hasta que aparezca pH en la pantalla. Confirmar pH pulsando <enter>. (d) Colocar el vaso de precipitados con la disolucin del vino en el agitador e introducir la bureta y el electrodo en la disolucin, con cuidado de que el imn no golpee el electrodo durante la agitacin. Al pulsar <start> comenzar la valoracin. Durante la valoracin, la primera lnea de la pantalla muestra el pH actual y el volumen de reactivo valorante dosificado (Figura 14.2). 138
Figura 14.2. Detalle de la pantalla del valorador en el transcurso de la valoracin.

Tan pronto como se haya alcanzado un punto de equivalencia, el valorador lo muestra en la segunda lnea de la pantalla. Dejar que la valoracin contine durante cierto tiempo, hasta aproximadamente pH = 11,50 e interrumpir entonces con <stop>. En la primera lnea de la pantalla aparece ahora Figura 14.3. Detalle de la pantalla del DET pH y en la segunda se valorador al finalizar la valoracin. muestra el punto de equivalencia (Figura 14.3). (e) Para imprimir la curva de valoracin pulsar repetidamente <def> hasta que aparezca en la pantalla >impresin y pulsar <enter> para pasar a la definicin de las impresiones. Elegir con <select> hasta que aparezca >impresin: curva; compl y pulsar <enter> para confirmar. Pulsar <print>, <reports> y <enter> y se imprimir la curva de valoracin.
14.6. Resultados
1. A partir del volumen de NaOH gastado en las distintas valoraciones, calcular acidez total y fija del vino, expresada en gramos de cido tartrico por litro. 2. Con los valores obtenidos de acidez total y fija calcular la acidez voltil, expresada en gramos de cido actico por litro de vino. 3. Con los datos obtenidos por los distintos grupos de trabajo del laboratorio, realizar un tratamiento estadstico de los resultados (media, desviacin estndar y desviacin con relacin a la media), despus de haber eliminado previamente los datos discordantes. 4. Comprueba si los valores obtenidos de acidez total y voltil del vino se encuentran dentro del rango permitido.
14.7. Cuestiones
1. Comparando ambos mtodos de valoracin, cul es ms preciso?, cul es ms rpido? 2. Por qu es necesario calentar las muestras de vino al bao Mara antes de calcular la acidez fija? 3. Encuentras diferencias en la acidez en los distintos vinos?. A qu pueden ser debidas estas diferencias? 4. A la vista de los resultados obtenidos, crees que alguna de las muestras de vino proporcionadas se ha conservado en malas condiciones?, por qu?
139
Potenciometra - Determinacin de cido ascrbico en preparado farmacutico
Prctica 15. DETERMINACIN DE CIDO ASCRBICO EN UN PREPARADO FARMACUTICO MEDIANTE POTENCIOMETRA 15.1. Introduccin
Bajo el trmino vitamina C se engloban dos compuestos con la misma actividad biolgica en el organismo humano, el cido ascrbico y el cido dehidroascrbico. Solo los ismeros L de estos dos cidos tienen accin vitamnica y el cido dehidroascrbico presenta, aproximadamente, un 80 % de la actividad vitamnica del cido ascrbico. El cido ascrbico es una -lactona sintetizada por las plantas por lo que se encuentra, principalmente, en alimentos de origen vegetal. Por esta razn el consumo diario de frutas y verduras frescas aporta la vitamina C requerida diariamente por el organismo humano. La actividad biolgica de la vitamina C en el organismo no est clara. Se sabe, sin embargo, que su deficiencia produce una serie de trastornos que en estado avanzado se conocen como escorbuto (inflamacin articular, hemorragias subcutneas, etc) y vuelve al individuo muy susceptible de contraer infecciones. Es por esta razn, por lo que suele adicionarse en numerosos preparados farmacuticos (contra la gripe y el resfriado) y utilizarse frecuentemente para enriquecer alimentos. El cido ascrbico es un agente reductor que reacciona rpidamente con el in triyoduro (I3) y en su oxidacin cede dos tomos de hidrgeno para transformarse en el cido dehidroascrbico segn la siguiente reaccin:
OH HO O O HO O
+
HO OH
I3-
H2O
O OH OH OH
3 I-
2H+
cido ascrbico
cido dehidroascrbico
Esquema 1. Reaccin de oxidacin del cido ascrbico. Esta reaccin se utilizar en la presente prctica para la cuantificacin del cido ascrbico en un preparado farmacutico mediante una valoracin redox por retroceso, en la que el exceso de I3 adicionado se valorar con una disolucin de tiosulfato. La deteccin del punto final se llevar a cabo con un indicador qumico o mediante valoracin potenciomtrica.
141
15.2. Objetivos
1. 2. 3. 4. Aprender el manejo de un valorador potenciomtrico. Entender el fundamento de las valoraciones potenciomtricas. Determinar el contenido de cido ascrbico en un preparado farmaceutico. Diferenciar entre el uso de un indicador visual y un indicador instrumental para la deteccin del punto final en una valoracin.

Bureta Embudo de vidrio Matraces aforados de 100 y 250 mL Matraces erlenmeyer de 250 mL Pipeta Pasteur con tetina de goma Pipetas de 5, 10 y 25 mL Probeta de 50 mL Varilla de vidrio Vasos de precipitados de 100 y 250 mL Vidrio de reloj o pesasustancias Balanza analtica Electrodo combinado de platino Imn Pinza de bureta Soporte Valorador potenciomtrico
15.4. Reactivos
cido sulfrico Yodato de potasio Yoduro de potasio Tiosulfato de sodio 0,1 M Almidn Agua destilada Timol Preparado farmacutico

a) Asegrese que el electrodo se encuentra sumergido en la disolucin antes de comenzar la valoracin. b) Evitar que el imn toque el electrodo cuando se realiza la valoracin ya que este se podra romper.

Disolucin de cido sulfrico 0,5 M. Se toman 2,77 mL de cido sulfrico comercial, se transfieren a un matraz aforado de 100 mL, al que previamente se ha aadido un poco de agua destilada, y se completa con agua destilada hasta el enrase. 142

Disolucin de yodato de potasio 0,02 M. Se pesan 1,07 g de yodato de potasio y se disuelven completamente con unos 200 mL de agua destilada. La disolucin se transfiere a un matraz aforado de 250 mL y se enrasa con agua destilada. Disolucin de almidn al 10 % (p/v). Aadir 10 g de almidn soluble y 5 mg de timol en 100 mL de agua destilada. Calentar y agitar la mezcla hasta que se produzca la disolucin.
15.5.3. Estandarizacin del tiosulfato de sodio 0,1 M:

Rellenar la bureta con la disolucin de tiosulfato de sodio 0,1 M (Na2S2O3). Tomar 25 mL de la disolucin de KIO3 0,02 M y colocarlos en un erlenmeyer de 250 mL. Aadir 10 mL de la disolucin de H2SO4 0,5 M y 1 g de KI slido. Agitar la mezcla hasta la total disolucin (Esquema 2).
8I+ IO3+ 6H+ 3I3+ 3H2O
Esquema 2. Reaccin redox de formacin del in triyoduro. Adicionar el tiosulfato de sodio desde la bureta hasta que la disolucin tome un color amarillo plido. Seguidamente, aadir al erlenmeyer 2 mL del indicador de almidn hasta observar la disolucin de color azul. A continuacin, seguir adicionando tiosulfato de sodio hasta que desaparezca el color azul (Esquema 3). Repita la valoracin, al menos dos veces, y obtenga la concentracin exacta de la disolucin de Na2S2O3 a partir de un valor medio.
I3 -
2(S2O3)2-
3I-
(S4O6)2-
Esquema 3. Reaccin redox de valoracin del in triyoduro con tiosulfato.
15.5.4. Determinacin de vitamina C:

15.5.4.1. Valoracin con indicador qumico
Pesar, aproximadamente, 1 g de preparado farmacutico (anotar el peso exacto) y disolverlo en un vaso de precipitados con, aproximadamente, 50 mL de agua destilada. En un erlenmeyer de 250 mL pesar 1 g de KI slido, aadir 25 mL de la disolucin de KIO3 0,02 M, 10 mL de la disolucin de H2SO4 0,5 M y la disolucin del comprimido (lavar el vaso que contena la disolucin del comprimido con dos pequeas alcuotas de agua destilada y adicionar los lquidos de lavado al erlenmeyer). Homogeneizar bien la disolucin.
143

Adicionar el tiosulfato de sodio, previamente estandarizado, desde la bureta hasta que la disolucin tome un color amarillo plido. Seguidamente, aadir al erlenmeyer 2 mL del indicador de almidn hasta observar la disolucin de color azul. A continuacin, seguir adicionando tiosulfato de sodio hasta que desaparezca el color azul (Esquema 3). Repita este proceso, al menos dos veces, y obtenga la concentracin de cido ascrbico en la disolucin a partir de un valor medio.
15.5.4.2. Valoracin potenciomtrica

Pesar, aproximadamente, 1 g de preparado farmacutico (anotar el peso exacto) y disolverlo en un vaso de precipitados con, aproximadamente, 50 mL de agua destilada. Pesar 1 g de KI slido en un vaso de precipitados de 250 mL, aadir 25 mL de la disolucin de KIO3 0,02 M, 10 mL de la disolucin de H2SO4 0,5 M y la disolucin del comprimido (lavar el vaso que contena la disolucin del comprimido con dos pequeas alcuotas de agua destilada y adicionar los lquidos de lavado al erlenmeyer). Homogeneizar bien la disolucin. Valorar con la disolucin de Na2S2O3 , previamente estandarizada, utilizando un valorador potenciomtrico con electrodo combinado de Pt (Figura 15.2).
Figura 15.2. Valorador potenciomtrico. A continuacin se describe el proceso de valoracin: (a) Rellenar la botella del valorador potenciomtrico con la disolucin de Na2S2O3 0,1 M, previamente estandarizada. 144

(b) Encender el equipo y lavar dos o tres veces el pistn. Para ello, apretar alternativamente DOS para vaciar y FILL para rellenar. (c) Seguidamente es necesario cargar el mtodo de valoracin. Pulsar <mode> repetidamente hasta que aparezca DET en la pantalla (Dynamic Equivalence point Titration). Confirmar DET pulsando <enter> y seleccionar la magnitud medida pulsando <select> hasta que aparezca U en la pantalla. Confirmar U pulsando <enter>. (d) Colocar el vaso de precipitados con la disolucin en el agitador e introducir la bureta y el electrodo en la disolucin, con cuidado de que el imn no golpee las paredes del electrodo durante la agitacin. Al pulsar <start> comenzar la valoracin. Durante la valoracin la primera lnea de la pantalla muestra el valor de U actual y el volumen de reactivo valorante dosificado (Figura 15.3).
(e) Tan pronto como se haya alcanzado un punto de equivalencia, el valorador lo muestra en la segunda lnea de la pantalla. Dejar que la valoracin contine durante cierto tiempo, hasta aproximadamente U = 150 e interrumpir entonces con <stop>. En la primera lnea de la pantalla aparece ahora DET U y en la segunda lnea se muestra el punto de equivalencia encontrado (Figura 15.4).
Figura 15.4. Detalle de la pantalla del valorador al finalizar la valoracin.
145
Potenciometra - Determinacin de vitamina C en preparado farmaceutico

(f) Para imprimir la curva de valoracin pulsar repetidamente <def> hasta que aparezca en la pantalla >impresin y pulsar <enter> para pasar a la definicin de las impresiones. Elegir con <select> hasta que aparezca >impresin: curva; compl y pulsar <enter> para confirmar. Pulsar <print>, <reports> y <enter> y se imprimir la curva de valoracin.
15.6. Resultados
1. A partir del volumen de disolucin de Na2S2O3 gastado en las valoraciones realizadas, teniendo en cuenta la estequiometra de las reacciones que tienen lugar, calcular la cantidad de cido ascrbico que contiene el preparado farmacutico (expresar los resultados en mg de cido ascrbico por comprimido). 2. Comentar los resultados obtenidos con ambos mtodos: valoracin con indicador y valoracin potenciomtrica. 3. Con los datos obtenidos por los distintos grupos de trabajo del laboratorio, realizar un tratamiento estadstico de los resultados (media, desviacin estndar y desviacin con relacin a la media), despus de haber eliminado previamente los datos discordantes. 4. Comprobar si el valor obtenido de cido ascrbico coincide con el indicado por el laboratorio farmacutico en el envase.
15.7. Cuestiones
1. De los dos mtodos de valoracin utilizados en la prctica cul es ms preciso?, cul es ms rpido? 2. Qu ventajas tienen las valoraciones potenciomtricas frente a las que utilizan indicadores qumicos? 3. Qu error puede cometerse si la disolucin de almidn utilizada como indicador no se hubiera conservado correctamente y estuviera hidrolizada?
146
Potenciometra - Determinacin de estao en hilo de soldar
Prctica 16. DETERMINACIN DE ESTAO EN UNA ALEACIN DE ESTAO Y PLATA MEDIANTE VALORACIN POTENCIOMTRICA 16.1. Introduccin
El estao es un elemento qumico de nmero atmico 50 y smbolo Sn. Ocupa el lugar 49 entre los elementos de la corteza terrestre. Es un metal plateado, maleable, que no se oxida fcilmente con el aire y es resistente a la corrosin. Se obtiene, principalmente, a partir de la casiterita (SnO2), mineral con un contenido de estao entorno al 87 %. Una de las caractersticas ms llamativas del estao es que a temperaturas por debajo de los 13 C se transforma en un polvo amorfo de color grisceo conocido como estao gris. Los objetos de estao que sufren esta descomposicin presentan un aspecto moteado, por lo que a este proceso se le denomina enfermedad o peste del estao. El estao ordinario al partirse produce un sonido caracterstico llamado grito del estao. Las aplicaciones del estao son muy variadas. Se encuentra en muchas aleaciones (bronces, latones) y se usa para recubrir otros metales protegindolos de la corrosin. As, se usa como revestimiento protector del cobre, del hierro y de diversos metales usados en la fabricacin de latas de conserva. Tambin se emplea para disminuir la fragilidad del vidrio, en fungicidas, tintes, dentfricos (SnF2), pigmentos y en materiales de soldadura, por ejemplo, en el hilo de soldar. La composicin de la aleacin metlica empleada en el proceso de soldadura es un elemento de gran importancia. Esta aleacin suele estar compuesta por la unin de estao con plomo, cobre o plata, en distintas proporciones, encontrndose en el mercado en forma de hilo enrollado sobre un carrete, varilla, lingote, etc. Puesto que estas aleaciones funden a una temperatura no muy alta, de entre 180 y 270 C, se utilizan habitualmente para soldar conductores elctricos, principalmente las de estao-plomo, ya que proporcionan soldaduras de gran resistencia y las probabilidades de daos en los circuitos y piezas elctricas son pequeas. Las aleaciones estao-plata y estao-cobre son ms idneas para la unin de tubos de cobre (saneamiento, gas y calefaccin) debido a su gran resistencia a presin y cambios de temperatura. Puesto que las propiedades de las aleaciones de estao pueden variar en funcin del contenido de ste, la determinacin de estao en estas aleaciones adquiere especial inters. As, este metal puede determinarse por mtodos gravimtricos, volumtricos o mediante el empleo de diversas tcnicas instrumentales tales como la espectroscopa de absorcin atmica. En esta prctica se pretende determinar el contenido de estao en un hilo de soldar (aleacin de estao y plata). Para ello, previamente se deber realizar una disolucin cida de la muestra. Posteriormente, el estao se determinar en la disolucin problema obtenida mediante una valoracin potenciomtrica. 147
16.2. Objetivos
1. 2. 3. 4. Realizar el tratamiento de una muestra real como etapa previa al anlisis. Aprender el manejo de un valorador potenciomtrico. Entender el fundamento de las valoraciones potenciomtricas. Determinar el contenido de estao en una aleacin de estao y plata.

Bureta Embudo de vidrio Kitasato de 500 mL Matraces aforados de 250 y 500 mL Matraces erlenmeyer de 100 mL Pipeta Pasteur con tetina de goma Pipeta de 10 mL Placa filtrante de poro n 4 Probeta de 100 mL Varilla de vidrio Vasos de precipitados de 250 y 500 mL Vidrio de reloj o pesasustancias Balanza analtica Electrodo combinado de platino Estufa Goma adaptadora Imn Pinza de bureta Placa calefactora Sistema de succin a vaco Soporte Tijeras Valorador potenciomtrico Granatario
16.4. Reactivos
cido clorhdrico cido sulfrico Dicromato de potasio Sal de Mohr Sulfato ferroso heptahidratado 1, 10-Fenantrolina Acetona Agua destilada Muestra de hilo de soldar

a) La disolucin de la muestra se debe realizar en campana extractora debido a la produccin de vapores altamente txicos. b) Asegrese que el electrodo se encuentra sumergido en la disolucin antes de comenzar la valoracin. c) Evitar que el imn toque el electrodo cuando se realiza la valoracin ya que este se podra romper. 148

Disolucin de dicromato de potasio 0,04 M. Se toman 2,9418 g de K2Cr2O7 y se disuelven completamente en unos 200 mL de agua destilada. La disolucin se transfiere a un matraz aforado de 250 mL y se completa con agua destilada hasta el enrase. Disolucin de sal de Mohr 0,13 M. Se pesan 25,4891 g de (NH4)2Fe(SO4)2 6 H2O y se disuelven completamente con unos 400 mL de agua destilada. La disolucin se transfiere a un matraz aforado de 500 mL, se aaden 10 mL de cido sulfrico comercial y se enrasa con agua destilada. Disolucin de ferrona. Se pesan 1,485 g de 1, 10-fenantrolina y 0,695 g de FeSO47H2O y se disuelven completamente con unos 80 mL de agua destilada. La disolucin se transfiere a un matraz aforado de 100 mL y se enrasa con agua destilada.
16.5.3. Estandarizacin del dicromato de potasio 0,04 M:

Rellenar la bureta con la disolucin de sal de Mohr 0,13 M. Tomar 10 mL de la disolucin de dicromato de potasio 0,04 M y colocarlos en un erlenmeyer de 100 mL. Aadir 2 gotas de ferrona y agitar de forma manual para homogeneizar la disolucin. Valorar con la sal de Mohr hasta que en la disolucin se observe un cambio de color persistente (Esquema 1). Repita la valoracin, al menos dos veces, y obtenga la concentracin de la disolucin de K2Cr2O7 a partir de un valor medio.
Cr2O72- + 14 H+ + 6Fe2+ 2 Cr3+ + 6 Fe3+ + 7 H2O
Esquema 1. Reaccin redox del anin dicromato con la sal de Mohr.
16.5.4. Determinacin de estao:

16.5.4.1. Disolucin de la muestra
Pesar aproximadamente 1 g de hilo de soldar y lavar con acetona los restos de materia orgnica que pueda contener. Posteriormente, se seca en la estufa durante unos instantes para eliminar la acetona. La muestra se corta con unas tijeras en trozos de unos 3 mm de longitud para que la disolucin sea ms rpida. En un vaso de precipitados de 250 mL se lleva a cabo la disolucin de la muestra (Figura 16.1a) adicionando sobre ella 50 mL de cido clorhdrico comercial. Se calienta a 100 C en una placa calefactora hasta completar su disolucin (debe realizarse en campana extractora debido a la produccin de vapores altamente txicos). Tras la disolucin de la muestra se observa la aparicin de un precipitado que ser eliminado por filtracin con placa del n 4 y sistema de
149

succin a vaco (Figura 16.1b). Una vez filtrada la disolucin, la placa se lavar con agua destilada y el filtrado se transfiere a un vaso de precipitados de 500 mL, en el que se han aadido previamente 100 mL de la disolucin de K2Cr2O7 previamente estandarizada. El kitasato se lavar con agua destilada y se transferirn las aguas de lavado al vaso de precipitados, agitando la mezcla hasta su completa homogenizacin.
(a)
(b)
Figura 16.1. (a) Proceso de disolucin y (b) filtracin de la muestra. Por ltimo se valorar la disolucin problema con la disolucin de la sal de Mohr 0,13 M utilizando un valorador potenciomtrico con electrodo combinado de Pt (Figura 16.2).
Figura 16.2. Valorador potenciomtrico. 150

A continuacin se describe el proceso de valoracin: (a) Rellenar la botella del valorador potenciomtrico con la disolucin de la sal de Mohr. (b) Encender el equipo y lavar dos o tres veces el pistn. Para ello, apretar alternativamente DOS para vaciar y FILL para rellenar. (c) Seguidamente es necesario cargar el mtodo de valoracin. Pulsar <mode> repetidamente hasta que aparezca DET en la pantalla (Dynamic Equivalence point Titration). Confirmar DET pulsando <enter> y seleccionar la magnitud medida pulsando <select> hasta que aparezca U en la pantalla. Confirmar U pulsando <enter>. (d) Colocar el vaso de precipitados con la mezcla preparada en el agitador e introducir la bureta y el electrodo en la disolucin, con cuidado de que el imn no golpee las paredes del electrodo durante la agitacin. Al pulsar <start> comenzar la valoracin. Durante la valoracin la primera lnea de la pantalla muestra el valor de U actual y el volumen de reactivo valorante dosificado (Figura 16.3).
(e) Tan pronto como se haya alcanzado un punto de equivalencia, el valorador lo muestra en la segunda lnea de la pantalla. Dejar que la valoracin contine durante cierto tiempo, hasta aproximadamente U = 500 e interrumpir entonces con <stop>. En la primera lnea de la pantalla aparece ahora DET U y en la segunda lnea se muestra el punto de equivalencia encontrado (Figura 16.4).
Figura 16.4. Detalle de la pantalla del valorador al finalizar la valoracin.
151

(f) Para imprimir la curva de valoracin pulsar repetidamente <def> hasta que aparezca en la pantalla >impresin y pulsar <enter> para pasar a la definicin de las impresiones. Elegir con <select> hasta que aparezca >impresin: curva; compl y pulsar <enter> para confirmar. Pulsar <print>, <reports> y <enter> y se imprimir la curva de valoracin.
16.6. Resultados
1. A partir del volumen de disolucin de sal de Mohr gastado en las valoraciones realizadas y teniendo en cuenta la estequiometra de las reacciones que tienen lugar, calcular la cantidad de estao que contiene el hilo de soldar (expresar los resultados en % en peso). 2. Con los datos obtenidos por los distintos grupos de trabajo del laboratorio, realizar un tratamiento estadstico de los resultados (media, desviacin estndar y desviacin con relacin a la media), despus de haber eliminado previamente los datos discordantes. 3. Comprobar si % de estao calculado para la muestra de hilo de soldar coincide con el indicado por el fabricante.
16.7. Cuestiones
1. Se podra determinar con este mtodo el contenido de estao en una aleacin de estao y plomo?, por qu? 2. Se podra utilizar permanganato potsico para producir la oxidacin del estao?
152
Cromatografa en capa fina Fundamento terico
VII. CROMATOGRAFA EN CAPA FINA Fundamento terico

La cromatografa comprende un amplio grupo de tcnicas de separacin con gran importancia ya que permiten separar, identificar y/o cuantificar los componentes de mezclas complejas que por otras tcnicas no podran resolverse. En su sentido ms amplio, la cromatografa est basada en las diferentes velocidades de migracin de los componentes de una mezcla a travs de una fase estacionaria bajo la influencia de una fase mvil. Entre las distintas tcnicas cromatogrficas, la cromatografa en capa fina (TLC, thin-layer chromatography) es una herramienta importante en la industria farmacutica para los controles rutinarios de pureza de los medicamentos. Tambin es habitualmente empleada en la industria alimentaria para el control de aditivos, as como en numerosos estudios bioqumicos y biolgicos. En esta tcnica la separacin se realiza sobre una delgada capa de fase estacionaria inmovilizada en un soporte plano, como una placa de vidrio, aluminio o plstico (Figura 1). La muestra, en cantidades muy pequeas, se coloca en un extremo de la placa a unos 2 cm del borde. La separacin se efecta en un recinto cerrado que contiene fase mvil, la cual asciende por la placa gracias al efecto de capilaridad. Cuando la fase mvil asciende hasta 2-3 cm del borde superior de la placa la separacin se detiene (Figura 2).
Figura 1. Placas de capa fina.
A veces, para obtener una mejor separacin de los componentes se realizan dos desarrollos con fases mviles distintas y en direcciones perpendiculares, esta tcnica se conoce como cromatografa plana bidimensional. El tratamiento de la placa con un reactivo adecuado permite la visualizacin de los componentes separados, en el caso de que stos no sean coloreados. Alternativamente, pueden utilizarse placas que llevan incorporado un material fluorescente, de manera que toda la placa presentar fluorescencia bajo luz UV menos el lugar donde se encuentran los analitos no fluorescentes que aparecer sin fluorescencia.
153
Cromatografa en capa fina Fundamento terico
a)
b)
Figura 2. Desarrollo de la placa mediante cromatografa en capa fina: (a) antes de la separacin (b) despus de la separacin. Para llevar a cabo un anlisis cualitativo, las manchas de la placa de capa fina se caracterizan por la distancia que viajan con respecto a la distancia que recorre la fase mvil. El parmetro que se emplea para caracterizar esta relacin se denomina factor de retraso (Rf ):
Rf =
dr dm
donde dr es la distancia recorrida por el compuesto (centro de la mancha) y dm es la distancia recorrida por el frente de la fase mvil. El Rf obtenido para un analito no proporciona informacin suficiente para poder identificarlo, ya que este valor depende mucho de las condiciones experimentales Debido a esto, el mtodo utilizado para la identificacin tentativa de los componentes de una muestra problema consiste en depositar en la placa, junto a la muestra, disoluciones patrn de especies que se espera encontrar en la misma. La coincidencia de los valores Rf de alguno de los componentes de la muestra con el de alguno de las disoluciones patrn proporciona una gran evidencia para su identificacin. Sin embargo, para tener una mayor certeza en la identificacin es necesario repetir el ensayo utilizado distintas fases mviles y estacionarias, e incluso diferentes mtodos de revelado. En algunas ocasiones, la TLC se utiliza con fines cuantitativos, especialmente cuando no se dispone de otra tcnica que se preste con facilidad a esta determinacin. Este tipo de anlisis implica que debe depositarse en la placa una cantidad conocida de muestra y la precisin en la aplicacin de la misma suele ser la mayor fuente de error en este tipo de anlisis. Para evaluar la cantidad de cada componente en la muestra se puede recurrir a distintos procedimientos como, por ejemplo, al mtodo de elucin que requiere raspar la mancha de la placa y, despus, extraer el analito con algn disolvente apropiado para cuantificarlo mediante otra tcnica adecuada. Otro procedimiento alternativo consiste en utilizar un densitmetro de barrido que puede medir la radiacin emitida por la mancha por fluorescencia o reflexin. 154
Cromatografa en capa fina -Identificacin de aspartamo en bebidas light
Prctica 17. IDENTIFICACIN DE ASPARTAMO Y SUS PRODUCTOS DE HIDRLISIS EN BEBIDAS REFRESCANTES MEDIANTE CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA 17.1. Introduccin
Las bebidas refrescantes denominadas light o dietticas, por su bajo contenido en caloras, deben su sabor dulce al contenido en edulcorantes artificiales que se utilizan como sustitutos del azcar comn (sacarosa), ya que, presentan un alto poder edulcorante con un bajo aporte calrico (0,1 a 3,0 cal/100 mL). El aspartamo es uno de los edulcorantes sintticos bajos en caloras ms utilizado en refrescos y en preparados alimenticios (principalmente postres y dulces). Es un polvo blanco e inodoro, unas 200 veces ms dulce que la sacarosa, tiene buen sabor y no produce caries. Es estable en estado slido, siempre que no se conserve a temperaturas elevadas, mientras que en en medios acuosos presenta una mxima estabilidad a pH 4,2 y una rpida degradacin a pH <2,5 y pH >5,5. La va de degradacin es doble: 1) hidrlisis a cido asprtico y fenilalanina liberando metanol y 2) ciclodeshidratacin a dicetopiperacina seguida de hidrlisis (Figura 17.1). Esta inestabilidad es la responsable de la prdida de parte del poder edulcorante que sufre el aspartamo durante el procesado y almacenamiento de los alimentos. As, se ha comprobado que en bebidas refrescantes almacenadas a 30 C durante 6 semanas la prdida puede llegar a ser del 30 %.
CH3 O NH2 C O C H2 C C O C O NH2 C O C H2 C C O O C OH
HO
+H2O
CH NH H 2C
HO
CH NH
H2 C
ASPARTAMO
+ CH3OH
L-ASPARTIL-L-FENILALANINA
+ CH3OH
+ H2O
O O HO C H2C O C H2 NH2 CH C O OH H2 N CH H2C C OH
HO C O C H2
HN CH C O
C CH NH
DICETOPIPERACINA
CIDO ASPRTICO
FENILALANINA
Figura 17.1. Reaccin de hidrlisis del aspartamo. Los mtodos ms utilizados para el anlisis del aspartamo incluyen la cromatografa de lquidos de alta eficacia (HPLC) y cromatografa en capa fina (TLC). En esta prctica se van a identificar mediante TLC el aspartamo y sus productos de hidrlisis en bebidas refrescantes tipo light.
155
17.2. Objetivos
1. Entender el fundamento de la cromatografa en capa fina. 2. Identificar la presencia de aspartamo, cido asprtico y fenilalanina en bebidas refrescanteslight.

Cmara cromatogrfica Matraces aforados de 50 y 250 mL Pipeta Pasteur Pulverizador Vasos de precipitados de 50 y 250 mL Estufa Lpiz Placa de gel de slice (8 x 12 cm) Probetas de 100 y 250 mL Varilla de vidrio Vidrio de reloj o pesasustancias
17.4. Reactivos
cido actico Aspartamo Ninidrina n-butanol Muestras de bebidas refrescantes ligh cido asprtico Fenilalanina Acetona Agua destilada

a) Es muy importante que se tenga especial cuidado con la placa de gel de slice al manipularla. No se debe tocar la fase estacionaria con los dedos. b) Se debe tener cuidado en preparar la disolucin reveladora con acetona, y al pulverizarla sobre la placa se debe cuidar que sea una pulverizacin uniforme por la misma.

Disolucin n-butanol/cido actico/agua, 6/2/2, v/v/v (fase mvil). Se toman 50 mL de cido actico y 50 mL de agua que se transfieren a un matraz aforado de 250 mL, enrasando con n-butanol. Disolucin de ninidrina al 0.2 %, p/v (disolucin reveladora). Se pesan 0,5 g de ninidrina en un vidrio de reloj y se disuelven en un vaso de precipitados con unos 50 mL de acetona. Transferir a un matraz aforado de 250 mL y enrasar con acetona. 156

Disolucin patrn de cido asprtico de 120 ppm (p/v). Pesar 60 mg de cido asprtico, con la ayuda de un pesasustancias, disolver en un vaso de precipitados de 50 mL con agua destilada y transferirlo a un matraz aforado de 50 mL. Enrasar con agua destilada. Disolucin patrn de cido fenilalanina de 120 ppm (p/v). Pesar 60 mg de fenilalanina, con la ayuda de un pesasustancias, disolver en un vaso de precipitados de 50 mL con agua destilada y transferirlo a un matraz aforado de 50 mL. Enrasar con agua destilada. Disolucin patrn de aspartamo de 120 ppm (p/v). Pesar 60 mg de aspartamo, con la ayuda de un pesasustancias, disolver en un vaso de precipitados de 50 mL con agua destilada y transferirlo a un matraz aforado de 50 mL. Enrasar con agua destilada.
17.5.3. Identificacin de aspartamo y sus productos de hidrlisis:

17.5.3.1. Anlisis cromatogrfico
(a) Activar las placas de gel de slice por calentamiento en la estufa durante 30 minutos a 100 C. Dejar enfriar a temperatura ambiente. (b) Trazar con lpiz una lnea sobre la placa de slice a 2 cm del borde inferior de la misma. (c) Sobre esta lnea depositar las disoluciones patrn (aspartamo, fenilalanina y cido aspartico) y las muestras con una separacin aproximada de 1 cm entre ellas con ayuda de una pipeta Pasteur (Figura 17.2). Hacerlo de forma que las manchas no tengan un dimetro superior a 0,5 cm. Tras depositar cada disolucin bordear suavemente con el lpiz (no Figura 17.2. Aplicacin de las bolgrafo) el permetro de la mancha muestras. observada en la placa. Debajo de cada mancha anotar una letra para identificar posteriormente cada mancha. (d) A continuacin, dejr reposar la placa hasta que las manchas de cada compuesto se hayan secado. (e) Introducir la fase mvil en la cmara cromatogrfica (Figura 17.3), teniendo en cuenta que la altura de la misma no debe ser superior a 1 cm. (f) Introducir la placa en la cmara y cerrarla. Cuando el frente de la fase mvil se encuentre a unos 2-3 cm del borde superior de la placa, esta se saca con cuidado y se traza con un lpiz una lnea para marcar la distancia recorrida por la fase mvil.
157

(g) Dejar reposar la placa en la campana extractora hasta que la fase mvil se haya secado. (h) Una vez seca, y con la ayuda de un pulverizador, se roca la placa con la disolucin reveladora. Dejar reposar la placa en la campana extractora hasta que el exceso de disolucin reveladora se haya evaporado. (i) Finalmente, se introduce la placa en una estufa a 100 C durante 4 min para la visualizacin de las manchas.
Figura 17.3. Detalle de la cubeta cromatogrfica con la placa en su interior.
17.6. Resultados
1. Calcular el valor de Rf para el apartamo, la fenilalanina y el cido asprtico. 2. Identificar la presencia de apartamo, fenilalanina y cido asprtico en las bebidas refrescantes ligt analizadas. 3. A la vista de los resultados, crees que alguna bebida de entre las analizadas ha estado conservada en condiciones inadecuadas?
17.7. Cuestiones
1. El valor del Rf depende de la fase estacionaria empleada? y de la fase mvil? 2. Al cambiar la fase mvil a otra ms polar cmo se ve afectado el valor del Rf de un alcohol? y el de una cetona?
158
Cromatografa en capa fina -Identificacin de cidos orgnicos
Prctica 18. IDENTIFICACIN DE CIDOS ORGNICOS EN ZUMOS Y VINOS MEDIANTE CROMATOGRAFA EN CAPA FINA 18.1. Introduccin
Las frutas, en general, poseen un sabor cido debido a la presencia de una serie de cidos orgnicos naturales que se encuentran entre un 0,5 6 % y que influyen en el sabor y aroma de las mismas. Los cidos orgnicos no son nutrientes esenciales para nuestro organismo, y ninguno de ellos es perjudicial ni daino para el estmago, dado que no alcanzan la acidez del jugo gstrico. Dentro de este grupo de cidos nos encontramos el mlico (manzanas, uvas, cerezas, ciruelas, albaricoques), el cido tartrico (uvas) y el cido ctrico (ctricos, fresas, peras...), entre otros. En los zumos y vinos adems de estos cidos orgnicos naturales, se encuentran otros que aparecen como consecuencia de la fermentacin, denominados cidos orgnicos derivados. Los ms importantes son al cido lctico, en el caso de los zumos, y el lctico y succnico en el caso de los vinos. El anlisis de cido mlico y tartrico en los zumos es importante para realizar un control de identidad y autenticidad de la materia prima, un control de pureza y un control del estado sanitario. El contenido de cido mlico depende de la variedad y madurez de la fruta, vara entre 0,8 y 3,0 g/L para el zumo de naranja y como mnimo 3,0 g/L para el zumo de manzana. Sin embargo, el cido lctico indica fermentacin y su valor lmite se encuentra en 0,5 g/L para zumos de naranja y manzana. En los vinos, el cido tartrico es el ms abundante y tambin el ms estable, pudiendo llegar a suponer ms de dos tercios del total. Su aportacin al vino es la de aadir caractersticas de fruta madura, sabores frescos y agradables. El cido mlico proporciona al vino notas speras poco agradables. Es mejor tolerado en los blancos. Su concentracin depende de la maduracin del fruto (a mayor estado de madurez menor contenido en mlico). La tecnologa de la vinificacin aprovecha un proceso natural como es la llamada fermentacin malolctica para transformar el cido mlico del vino en cido lctico que produce una reduccin de la acidez total del vino y un aumento de su estabilidad biolgica. El cido succnico aporta sensaciones saladas y amargas, muy sutiles, y su presencia es apreciada en los vinos de calidad. Por todo ello, su anlisis en los vinos es de gran utilidad en el control de la fermentacin y la estabilidad de los vinos. Los mtodos ms utilizados para el anlisis de los cidos orgnicos incluyen la cromatografa de lquidos de alta eficacia (HPLC), cromatografa inica y cromatografa en capa fina (TLC). En esta prctica se van a identificar el cido mlico, tartrico, lctico y succnico mediante TLC en diferentes clases de zumos y vinos. 159
18.2. Objetivos
1. Entender el fundamento de la cromatografa en capa fina. 2. Identificar la presencia de diferentes cidos orgnicos (acido lctico, mlico, succnico y tartrico) en zumos y vinos.

Cmara cromatogrfica Matraces aforados de 50 y 250 mL Pipeta Pasteur Probetas de 100 y 250 mL Varilla de vidrio Vidrio de reloj o pesasustancias Cmara de revelado con lmpara de UV Lpiz Placa de gel de slice UV254 (8 x 12 cm) Pipeta aforada de 5 mL Pulverizador Vasos de precipitados de 50 y 250 mL Estufa
18.4. Reactivos
cido actico cido lctico cido succnico Azul de bromofenol Etanol Muestras de vinos cido ctrico cido Mlico Acido tartrico Acetato de n-butilo Agua destilada Muestras de zumos

a) Es muy importante que se tenga especial cuidado con la placa de gel de slice al manipularla. No se debe tocar la fase estacionaria con los dedos. b) Se debe tener cuidado en preparar la disolucin reveladora con acetona, y al pulverizarla sobre la placa se debe cuidar que sea una pulverizacin uniforme por la misma.

Disolucin acetato de n-butilo/cido actico, 2/1, v/v (fase mvil). Con una probeta se toman 80 mL de acetato de n-butilo y 40 mL de cido actico y se mezclan a un vaso de precipitados de 250 mL. 160

Disolucin de azul de bromofenol en etanol (disolucin reveladora). Se pesan 0,1 g de azul de bromofenol en un vidrio de reloj y se disuelven en un vaso de precipitados con unos 50 mL de etanol. La disolucin resultante se transfiere a un matraz aforado de 100 mL y se enrasa con etanol. Disolucin patrn de cido mlico de 6.000 ppm (p/v). Pesar 0,3 g de cido mlico, con la ayuda de un pesasustancias, y disolver en un vaso de precipitados con unos 30 mL de etanol. Transferir a un matraz aforado de 50 mL y enrasar con etanol. Disolucin patrn de cido lctico de 6.000 ppm (p/v). Tomar con ayuda de una pipeta aforada 5 mL de cido lctico. Transferirlos a un matraz aforado de 50 mL y enrasar con etanol. Disolucin patrn de cido succnico de 6.000 ppm (p/v). Pesar 0,3 g de cido succnico, con la ayuda de un pesasustancias, y disolver en un vaso de precipitados con unos 30 mL de etanol. Transferir a un matraz aforado de 50 mL y enrasar con etanol. Disolucin patrn de cido tartrico de 6.000 ppm (p/v). Pesar 0,3 g de cido tartrico, con la ayuda de un pesasustancias, y disolver en un vaso de precipitados con unos 30 mL de etanol. Transferir a un matraz aforado de 50 mL y enrasar con etanol.
18.5.3. Identificacin de cidos orgnicos:

18.5.3.1. Anlisis cromatografco
(a) En primer lugar, se han de activar las placas de gel de slice por calentamiento en la estufa durante 30 minutos a 100 C. Transcurrido el tiempo dejar enfriar a temperatura ambiente. (b) Trazar con lpiz una lnea sobre la placa de slice a 2 cm del borde inferior de la misma. (c) Sobre esta lnea depositar las disoluciones patrn (acido lctico, mlico, succnico y tartrico) y las muestras con una separacin de aproximadamente 1 cm entre ellas, con ayuda de una pipeta Pasteur (Figura 18.1). Hacerlo de forma que las manchas no tengan un dimetro superior a 0,5 cm. Tras depositar cada disolucin bordear con el lpiz (no bolgrafo) suavemente el Figura 18.1. Aplicacin de las permetro de la mancha observada muestras. en la placa. Debajo de cada mancha anotar una letra para identificar posteriormente cada mancha. (d) A continuacin, se deja reposar la placa hasta que las manchas de cada compuesto se hayan secado.
161

(e) Introducir la fase mvil en la cmara cromatogrfica (Figura 18.2), teniendo en cuenta que la altura de la misma no debe ser superior a 1 cm. (f) Introducir la placa en la cmara y cerrarla. Cuando el frente de la fase mvil se encuentre a unos 2-3 cm del borde superior de la placa, esta se saca con cuidado y se traza con un lpiz una lnea para marcar la distancia recorrida por la fase mvil.
Figura 18.2. Detalle de la cubeta cromatogrfica con la placa en su interior. (g) Dejar reposar la placa en la campana extractora hasta que la fase mvil se haya secado. (h) Una vez seca, se pone la placa en la cmara de revelado con lmpara de UV (Figura 18.3) y se identifican los compuestos presentes que aparecern como manchas claras sobre la placa fluorescente. (i) Finalmente, se saca la placa de la cmara y con la ayuda de un pulverizador se roca con la disolucin reveladora. Dejar reposar la placa en la campana extractora hasta que el exceso de disolucin reveladora se haya evaporado. Transcurridos unos minutos, en la placa aparecern manchas de color amarillo frente al resto de la placa que debe aparecer con un color verde.
Figura 18.3. Cmara de revelado provista de lmpara de radiacin UV. 162
18.6. Resultados
1. Calcular el valor de Rf para el acido lctico, mlico, succnico y tartrico. 2. Identificar la presencia de estos cidos en las muestras de zumos y vinos analizadas.
18.7. Cuestiones
1. El valor del Rf depende de la fase estacionaria empleada?, y de la fase mvil? 2. Cmo se podra determinar la calidad de un vino segn un anlisis por cromatografa de capa fina?
163
Cromatografa de lquidos de alta eficacia Fundamento terico
VIII. CROMATOGRAFA DE LIQUIDOS DE ALTA EFICACIA Fundamento terico

La cromatografa lquida de alta eficacia (HPLC, high performance liquid chromatography) es una de las tcnicas cromatogrficas ms utilizadas en la actualidad. Esta tcnica de separacin se basa en la distinta distribucin de los componentes de una muestra entre dos fases: una fase estacionaria, situada en el interior de un tubo estrecho o columna y una fase mvil lquida que se mueve a travs de la primera, arrastrando en su movimiento a la muestra. Dependiendo de la naturaleza de la fase estacionaria se establecern distintos tipos de interaccin entre los componentes de la muestra y la misma, lo que da lugar a los diversos tipos de cromatografa existentes, entre los que destacan: a) la cromatografa slido-lquido o de adsorcin, con fases estacionarias de slice o almina; b) la cromatografa lquido-lquido o de reparto; cuando la fase estacionaria es un lquido soportado sobre un relleno inerte; c) la cromatografa inica, si la fase estacionaria tiene grupos funcionales cargados y d) la cromatografa de exclusin por tamaos, cuando la fase estacionaria son partculas porosas en cuyos poros penetran los analitos en grado inverso a su tamao. En la Figura 1 se muestra el esquema de un HPLC.
Registro cromatograma Muestra bomba
Fase mvil
Columna
Detector
Adquisicin de datos
Desechos
Figura 1. Esquema de un cromatgrafo de lquidos. En un equipo de HPLC la muestra se introduce por medio de una vlvula de inyeccin con ayuda de una microjeringa (Figura 2) y es arrastrada por la fase mvil pasando a alta presin a travs de la columna gracias a una bomba. Es importante que la bomba genere un flujo reproducible y uniforme, libre de pulsaciones. La separacin de los analitos se producir en la columna, en cuyo interior se sita la fase estacionaria (Figura 3).
Figura 2. Vlvula de inyeccin.
165
Figura 3. Columnas tpicas para HPLC. En cromatografa de lquidos es muy importante que la fase mvil no tenga partculas en suspensin, que pueden obturar los tubos conectores, la bomba o la columna, ni gases disueltos. Debido a esto la fase mvil debe ser filtrada a vaco a travs de filtros de membrana adecuados en funcin de la naturaleza de la fase mvil (celulosa, nylon, etc) de tamao de poro muy pequeo (Figura 4.a). Adems, en el interior del recipiente donde se deposita la fase mvil se coloca un filtro de acero inoxidable, que impide que las posibles partculas slidas existentes entren en el sistema cromatogrfico. Este filtro tiene una elevada superficie para evitar que haya una restriccin de flujo desde el reservorio hasta la bomba (Figura 4.b).
Filtro (a) (b) Figura 4. (a) Filtracin a vaco de la fase mvil. (b) Detalle del filtro situado en el interior del reservorio para la fase mvil. 166

Los analitos separados entran al detector, cuya respuesta se visualiza en forma de cromatograma en un registrador o en la pantalla de un ordenador. El detector ms comn en HPLC es el detector de absorbancia UV-Vis por su sensibilidad y amplio intervalo de respuesta lineal. Muchos de estos detectores utilizan una fuente de luz UV-Vis (lmpara de deuterio, xenon o wolframio), un monocromador para elegir la longitud de onda ptima, una celda de flujo en forma de Z (Figura 5) por la que pasa el efluente de la columna y una fila de fotodiodos para registrar el espectro de todos los analitos que pasan por el detector.
eluyente ventanas
Luz UV
detector
desecho
Figura 5. Celda del detector de absorbancia UV-Vis. Por tanto, en funcin de la naturaleza de la muestra se seleccionar una columna adecuada, capaz de separar los componentes de dicha muestra. Despus, se efectuar la eleccin de una fase mvil que produzca una retencin, selectividad y resolucin adecuadas para dichos componentes. A la vista del cromatograma resultante (Figura 6) se podrn variar las condiciones hasta lograr la mejor separacin.
Respuesta del detector
tRB tRA tM
inyeccin tiempo
Figura 6. Separacin de una mezcla de compuestos por HPLC. Entre los parmetros cromatogrficos ms importantes a tener en cuenta cabe destacar los siguientes:
167

Tiempo de retencin (tr): Tiempo que transcurre entre la inyeccin del analito y el momento en que el centro de la banda del compuesto alcanza el detector. Tiempo muerto (tm): Tiempo que tarda la fase mvil en alcanzar el detector. Experimentalmente se calcula como el tiempo necesario para que la mayora de las molculas de un compuesto que no es retenido en la fase estacionaria (M) alcancen el detector. Tiempo de retencin corregido (tr): Es la diferencia entre el tiempo de retencin para un analito y el tiempo muerto. Indica el tiempo que el compuesto est retenido en la fase estacionaria. Factor de retencin (k): Se define como la relacin entre el tiempo que el compuesto pasa en la fase estacionaria y en la fase mvil: k = tr / tm Factor de separacin (): Es el cociente entre el tr de la especie ms retenida (B) y el tr de la especie menos retenida (A): = trB / trA Resolucin (Rs): Es una medida cuantitativa de la capacidad de una columna para separar dos bandas adyacentes. Se calcula como:
Rs = 1,18
trB - trA W 1/2A + W1/2B
siendo W1/2 es el ancho del pico a la mitad de su altura. Nmero de platos tericos (N): Cantidad adimensional que expresa la eficacia de una columna, es decir, su capacidad para dar bandas estrechas. Se puede calcular a partir de un pico cromatogrfico como: N = 5,54 (tr / W1/2)2 Altura de plato terico (HETP): Permite expresar la eficacia de la columna en unidades de longitud. Es la longitud de la columna dividida por el N: HETP = L / N
168
Cromatografa inica
La cromatografa inica es un tipo de cromatografa de lquidos de alta eficacia que se basa en la separacin de analitos inicos mediante el uso de resinas de intercambio inico como fase estacionaria. Las resinas de intercambio inico suelen ser copolmeros del estireno con divinilbenceno. Sobre estas resinas podemos tener grupos funcionales cargados negativamente, resinas de intercambio catinico (que se utilizan para separar especies catinicas) o grupos funcionales cargados positivamente, resinas de intercambio aninico (que se utilizan para separar aniones) (Figura 7). Los puntos activos ms comunes en las resinas de intercambio catinico son los grupos de cido fuerte como cido sulfnico (-SO3-). Los intercambiadores aninicos contienen, principalmente, grupos de base fuerte como amina cuaternaria (-N(CH3)3+).
Intercambio catinico + Intercambio aninico + + +
Figura 7. Representacin esquemtica de las resinas de intercambio inico. En este tipo de cromatografa, la mayor o menor retencin de los analitos depende de la competencia que se establece entre los iones de la fase mvil y los analitos por los puntos activos de la fase estacionaria. La elucin se produce como consecuencia del desplazamiento del analito de la fase estacionaria por parte de los iones presentes en la fase mvil. As, cuando una analito A- entra en una columna rellena con una resina de intercambio aninico se establece el siguiente equilibrio: Resina- N(CH3)3+ E- + A- mvil Resina- N(CH3)3+A- + E- mvil donde E- es el anin que se encuentra en la fase mvil que compite con el analito por los puntos activos de la fase estacionaria. La constante para este equilibrio (Kex) es:
Kex = [A- est ] [E- mvil] / [E- est] [A- mvil]

Kex recibe el nombre de coeficiente de selectividad ya que representa la afinidad de la resina por el ion A- con respecto a otro ion (E-). Cuando Kex es un valor alto, la fase slida tiene una gran tendencia a retener los iones y cuando Kex es pequea sucede lo contrario.
169

A diferencia de otros tipos de cromatografa de lquidos, la cromatografa inica requiere, en algunas ocasiones, el uso de una columna supresora que se coloca inmediatamente despus de la columna analtica. Esta columna est rellena de una segunda resina de intercambio inico que convierte los iones del disolvente en especies moleculares no inicas o poco ionizadas, sin alterar los iones del analito. La utilidad que presentan estas columnas es que permiten aumentar considerablemente la sensibilidad de los detectores de conductividad que se utilizan en cromatografa de intercambio inico ya que, de lo contrario, la elevada conductividad de la fase mvil, en general, tiende a enmascarar la de los analitos. As, cuando se separan aniones, se eligen muchas veces mezclas de carbonato y bicarbonato sdico como eluyente. En este caso la columna supresora contiene una resina de intercambio catinico y el producto de la reaccin en la misma es el cido carbnico muy poco disociado que no contribuye de manera significativa a la conductividad. La reaccin en la columna supresora es entonces: Resina-SO3 - H+ + Na+ (ac) + HCO3- (ac) Resina-SO3 - Na + + H2CO3 (ac) Por otro lado, cuando se separan cationes y se elige HCl como eluyente, la columna supresora ser de intercambio aninico en forma de hidrxido y el producto de la reaccin ser agua: Resina-N(CH3)3+OH- + H+ (ac) + Cl- (ac) Resina-N(CH3)3+Cl- + H2O (ac) Un inconveniente de las columnas supresoras es que conviene regenerarlas peridicamente (de ordinario cada 8 10 h) a fin de convertir sus rellenos otra vez a la forma cida o bsica original. Debido a esto, en algunos cromatgrafos se colocan tres unidades o columnas supresoras idnticas, de manera que mientras una se est utilizando, la segunda est siendo regenerada (mediante el paso de una disolucin de cido o base fuerte) y la tercera est siendo lavada con agua. Una vez que el anlisis ha finalizado, se produce un giro en el rotor y la columna que acaba de ser lavada se utiliza para la supresin. De esta forma se puede trabajar de manera prcticamente continua (Figura 8).
H2SO4 ELUATO H2 0
DESECHO
DETECTOR
DESECHO
Figura 8. Representacin esquemtica de un sistema de tres columnas supresoras. 170
HPLC - Determinacin de paracetamol y cido acetilsaliclico en un frmaco
Prctica 19. DETERMINACIN DE PARACETAMOL Y CIDO ACETIL SALICLICO EN UN PREPARADO FARMACUTICO MEDIANTE HPLC 19.1. Introduccin
La Aspirina es un medicamento de mltiples acciones teraputicas comprobadas como analgsico, antiinflamatorio, antifebril y protector vascular. Fue sintetizada por Felix Hoffmann en 1897 y, actualmente, es uno de los medicamentos ms consumidos en el mundo producindose unas 50.000 toneladas al ao. Su principio activo, el cido acetilsaliclico, se obtiene mediante la esterificacin de cido actico y cido saliclico en forma de cristales de color blanquecino, alargados y de sabor amargo:
O C OH H3C O O C OH O
+
OH
O
H3C O O
+
C CH3
H3C C OH
Acido saliclico
Anhidrido actico
Aspirina O (Acido acetilsaliclico)
El paracetamol es un compuesto que posee unas propiedades analgsicas y antipirticas similares a las del cido acetilsaliclico pero no presenta actividad antiinflamatoria. El paracetamol se utiliza desde finales del siglo XIX en el tratamiento del dolor moderado agudo y crnico. Se obtiene en forma de cristales de color blanco a partir de la reaccin de p-aminofenol y anhdrido actico:
O HO H 3C HO O O
+
NH2 H3C
O
O N H
+
CH3
H3C C OH
p-amonifenol
anhidrido actico
paracetamol (4-acetamidofenol)
Tanto el cido acetilsaliclico como el paracetamol pueden contener impurezas, fundamentalmente debido a una reaccin de sntesis incompleta o a la hidrlisis de parte del producto durante su aislamiento. Por este motivo, es importante controlar su pureza en los preparados farmacuticos. De entre los mtodos existentes para llevar a cabo la determinacin cuantitativa de ambos compuestos, cabe destacar las tcnicas cromatogrficas. Entre stas se encuentran la cromatografa lquida de alta eficacia, la cromatografa de gases y, ms recientemente, la cromatografa de lquidos acoplada a masas. En esta prctica llevar a cabo la determinacin cuantitativa de estos compuestos en un preparado farmacutico mediante HPLC en fase inversa con deteccin ultravioleta a 230 nm.
171
19.2. Objetivos
1. Entender el fundamento de la cromatografa de lquidos. 2. Aprender el manejo de un equipo de HPLC. 3. Determinar el contenido de cido acetilsaliclico y paracetamol en un preparado farmacutico.

Matraces aforados de 10, 50, 100 y 250 mL Pipetas graduadas de 5 y 10 mL Probeta de 100 y 50 mL Vasos de precipitados de 100 mL Vidrio de reloj o pesasustancias Pipetas Pasteur Balanza analtica Bao de ultrasonidos Columna cromatogrfica C18 Microjeringa de 100 L Jeringas de plstico Filtros membrana de nylon Equipo de cromatografa con detector de absorcin UV-Vis
19.4. Reactivos
cido acetilsaliclico cido actico para HPLC Uracilo Paracetamol Acetonitrilo para HPLC Agua Milli-Q Muestra de preparado farmacutico

Disolucin de cido actico al 1 % (v/v). Se transfieren 5 mL del cido actico comercial a un matraz aforado de 500 mL, enrasando con agua Milli-Q. Disolucin de acetonitrilo/cido actico al 1 % (20/80, v/v, fase mvil). Se transfieren 400 mL de la disolucin de cido actico al 1% a un matraz aforado de 500 mL, completando con acetonitrilo hasta el enrase. Disolucin madre de paracetamol 1.000 ppm (p/v). Se disuelven 0,050 g de paracetamol en aproximadamente 25 mL de fase mvil. La disolucin resultante se transfiere a un matraz aforado de 50 mL y se enrasa con fase mvil. 172

Disolucin de cido acetilsaliclico 1.000 ppm (p/v). Se disuelven 0,050 g de cido acetilsaliclico en aproximadamente 25 mL de fase mvil. La disolucin resultante se transfiere a un matraz aforado de 50 mL y se enrasa con fase mvil. Disolucin de uracilo 1.000 ppm (p/v). Se disuelven 0,050 g de uracilo en aproximadamente 25 mL de fase mvil. La disolucin resultante se transfiere a un matraz aforado de 50 mL y se enrasa con fase mvil.
19.5.2. Determinacin de paracetamol y cido acetilsaliclico:

19.5.2.1. Disolucin del preparado farmacutico
Se pesan en una balanza analtica 0,02 g de muestra y se disuelven en, aproximadamente, 50 mL de fase mvil. La disolucin resultante se transfiere a un matraz aforado de 100 mL que se enrasa con la disolucin de la fase mvil. Posteriormente, se toma una alcuota de unos 10 mL y se hace pasar a travs de un filtro de membrana de nylon, con un tamao de poro de 0,45 m, con ayuda de una jeringa de plstico (Figura 19.1).
Figura 19.1. Filtracin disolucin problema.
de
la
19.5.2.2. Preparacin de disoluciones patrn

A partir de las disoluciones madre de cido acetilsaliclico y paracetamol de 1.000 ppm (p/v) se prepararan cinco disoluciones patrn de 10 mL que contengan concentraciones entre 40 y 10 ppm (p/v) de cido acetilsaliclico y entre 20 y 5 ppm (p/v) de paracetamol y se enrasarn con la disolucin de la fase mvil. Se agitarn manualmente los matraces con la finalidad de homogeneizar las disoluciones.

La Figura 19.2 muestra el cromatgrafo de lquidos que se va a utilizar en esta prctica. Para realizar el anlisis, en primer lugar, se debe encender el cromatgrafo y seleccionar el mtodo de trabajo adecuado. A continuacin, se coloca la fase mvil (previamente desgasificada durante unos 10 min en un bao de ultrasonidos) en el recipiente para la misma y se aumenta el flujo, lentamente, hasta alcanzar un valor final de 1,0 mL/min. Por ltimo, se debe acondicionar la columna dejando pasar la fase mvil durante unos 10 min.
173
Figura 19.2. Cromatgrafo de lquidos. Una vez acondicionada la columna, se pueden ir introduciendo en el cromatgrafo las disoluciones preparadas. Para ello, con la vlvula de inyeccin en posicin de carga introducir, en primer lugar, la disolucin de uracilo con ayuda de una microjeringa de 100 L (Figura 19.3a). Seguidamente, girar rpidamente la vlvula a la posicin de inyeccin para su introduccin en la columna (Figura 19.3b).
(a) (b) Figura 19.3. Detalle de la vlvula de inyeccin: (a) posicin carga, (b) posicin inyeccin. Procediendo de la misma manera, introducir en el cromatgrafo las disoluciones madre de 1.000 ppm (p/v) de cido acetilsaliclico y de paracetamol. Finalmente, inyectar las disoluciones patrn preparadas de cido acetilsaliclico y paracetamol para la obtencin de las rectas de calibrado de cada analito y la disolucin problema de la muestra. Imprimir los cromatogramas obtenidos en cada caso y anotar las reas y los tiempos de retencin de los picos correspondientes a los analitos de inters. 174
19.6. Resultados
1. Calcular el tiempo de retencin, tiempo de retencin corregido y el factor de retencin para cada analito. 2. Calcular el factor se separacin y la resolucin entre ambos analitos en las condiciones de trabajo. 3. Construir una recta de calibrado para cada analito con los datos de las reas de los picos obtenidos en los cromatogramas correspondientes a las disoluciones patrn inyectadas. Obtener los valores de la ordenada en el origen, la pendiente y el coeficiente de correlacin de dichas rectas. 4. Obtener la concentracin de cido acetilsaliclico y paracetamol en el preparado farmacutico (expresada en % en peso) a partir de la ecuacin de la recta de calibrado y de la medida de las reas de los picos obtenidos en los cromatogramas correspondientes a la disolucin problema. 5. Con los datos obtenidos por los distintos grupos de trabajo del laboratorio, realizar un tratamiento estadstico de los resultados (media, desviacin estndar y desviacin con relacin a la media), despus de haber eliminado previamente los datos discordantes.
19.7. Cuestiones
1. Cmo se podra determinar la longitud de onda de trabajo ms adecuada para llevar a cabo el anlisis cromatogrfico del paracetamol y cido acetilsaliclico utilizando el detector de absorbancia UV-Vis?
175
HPLC - Determinacin de cafena, aspartamo y cido benzoico en bebidas
Prctica 20. DETERMINACIN DE CAFENA, ASPARTAMO Y CIDO BENZOICO EN BEBIDAS REFRESCANTES MEDIANTE HPLC 20.1. Introduccin
Las bebidas conocidas popularmente como refrescos o bebidas refrescantes son bebidas no alcohlicas preparadas, principalmente, a base de agua potable o mineral. En funcin de su composicin atienden a distintas denominaciones. As, las bebidas de cola se consideran bebidas refrescantes de extractos y son elaboradas con extractos de frutas o de partes de plantas comestibles. En las bebidas refrescantes se permite la adicin de una cantidad variable de azcar, adems de un gran nmero de aditivos. La cafena es un alcaloide del grupo de las xantinas que se adiciona en algunas bebidas refrescantes por su accin estimulante. En los refrescos de cola, este compuesto procede del extracto de nuez de cola, un fruto tropical que la contiene de modo natural. La cafena se encuentra adems en muchos alimentos de uso cotidiano como el caf, el t y el chocolate. El aspartamo (E951) es un edulcorante artificial no calrico descubierto en 1965 y comercializado en los aos ochenta. Es un polvo blanco e inodoro, unas 200 veces ms dulce que la sacarosa que se emplea en numerosos alimentos bajos en caloras o light. Cuando se encuentra seco o congelado es estable pero cuando se conserva en medio lquido a temperaturas superiores a 30 C se descompone y pierde su poder edulcorante. El cido benzoico (E-210) es uno de los conservantes ms utilizados. Es un compuesto que presenta un anillo aromtico y es un slido incoloro poco soluble en agua fra pero bastante soluble en agua caliente o disolventes orgnicos. Es muy til contra mohos, levaduras y bacterias en alimentos de carcter cido, por lo que es muy utilizado como conservante en bebidas refrescantes.
CH3 N N N CH3 O O O O OCH3 O OH
N H3C
cafeina
HOOC
NH2
N H
aspartamo aspartamo benzico Acido benzoico cido
cafena
De entre los distintos mtodos existentes para llevar a cabo la determinacin cuantitativa de aditivos en alimentos, cabe destacar las tcnicas cromatogrficas, como la cromatografa lquida de alta eficacia y la cromatografa de gases, y las tcnicas electroanalticas. En esta prctica se va a llevar a cabo la cuantificacin de cafena, aspartamo y cido benzoico en una bebida de cola light mediante HPLC en fase inversa con deteccin ultravioleta.
177
20.2. Objetivos
1. Entender el fundamento de la cromatografa de lquidos. 2. Aprender el manejo de un equipo de HPLC. 3. Determinar el contenido de cafena, aspartamo y cido benzoico presentes en una bebida de cola light.

Cromatgrafo de lquidos con detector de absorbancia UV-Vis Matraces aforados de 10, 50, 250 y 500 mL Pipetas aforadas de 5 mL Pipetas graduadas de 1 y 2 mL Pipetas Pasteur Probeta de 100 y 50 mL Vasos de precipitados de 100 mL Vidrio de reloj o pesasustancias Bao de ultrasonidos Balanza analtica Microjeringa de 100 L Columna cromatogrfica C18 Filtros de membrana de nylon Jeringa de plstico
20.4. Reactivos
cido benzoico Cafena Metanol para HPLC Muestras de bebidas refrescantes cido fosfrico para HPLC Aspartamo Agua Milli Q

Disolucin de cido fosfrico al 0,5 % (v/v). Se transfieren 2,5 mL de cido fosfrico comercial a un matraz aforado de 500 mL y se enrasa con agua Milli-Q. Disolucin de la fase mvil metanol/cido fosfrico 0,5 % (30/70, v/v). Se transfieren 75 mL de la disolucin de cido fosfrico al 0,5 % a un matraz aforado de 250 mL y se completan con metanol para HPLC hasta el enrase. Disolucin madre de cafena 1.000 ppm (p/v). Se disuelven 0,050 g de cafena en aproximadamente 25 mL de agua Milli Q. La disolucin resultante se transfiere a un matraz aforado de 50 mL y se enrasa con agua Milli Q. Disolucin madre de aspartamo 1.000 ppm. Se disuelven 0,050 g de aspartamo y se en aproximadamente 25 mL de agua Milli Q. La disolucin resultante se transfiere a un matraz aforado de 50 mL y se enrasa con agua Milli Q. 178

Disolucin madre de cido benzoico 1.000 ppm. Se disuelven 0,050 g de cido benzoico en aproximadamente 25 mL de agua Milli Q. La disolucin resultante se transfiere a un matraz aforado de 50 mL y se enrasa con agua Milli Q.
20.5.2. Determinacin de cafena, aspartamo y cido benzoico:

Se toman 5 mL de la muestra con una pipeta aforada, se llevan a un matraz aforado de 10 mL y se enrasa con fase mvil. Posteriormente, se agita el matraz para homogeneizar la disolucin y se pasa a travs de un filtro de nylon con un tamao de poro de 0,45 m (Figura 20.1).
Figura 20.1. Filtracin de la disolucin problema.

A partir de las disoluciones madre de cafena, aspartamo y cido benzoico de 1.000 ppm (p/v) se prepararn cinco disoluciones patrn de 10 mL que contengan concentraciones entre 20 y 60 ppm de cafena, entre 75 y 175 ppm de aspartamo y entre 20 y 60 ppm de cido benzoico y se enrasarn con la disolucin de la fase mvil. Se agitarn manualmente los matraces con la finalidad de homogeneizar las disoluciones.

La Figura 20.2 muestra el cromatgrafo de lquidos que se va a utilizar en esta prctica. Para realizar el anlisis, en primer lugar, se debe encender el cromatgrafo y seleccionar el mtodo de trabajo adecuado. A continuacin, se coloca la fase mvil (previamente desgasificada durante unos 10 min en un bao de ultrasonidos) en el recipiente para la misma y se aumenta el flujo, lentamente, hasta alcanzar un valor final de 1,0 mL/min. Se debe acondicionar la columna dejando pasar la fase mvil durante unos 10 min.
179
Figura 20.2. Cromatgrafo de lquidos. Por ltimo, seleccionar la longitud de onda de trabajo adecuada en el detector a la vista de los espectros de absorcin UV-Vis mostrados en la Figura 20.3 para la cafena, aspartamo y cido benzoico.
2 1,5 Abs 1 0,5 0 190 -0,5 nm
cafena ac.benzoico aspartamo
240
290
340
390
Figura 20.3. Espectros de absorcin UV-Vis para la cafena, aspartamo y cido benzoico. Una vez acondicionada la columna se pueden ir introduciendo en el cromatgrafo las disoluciones preparadas. Para ello, con la vlvula de inyeccin en posicin de carga introducir, en primer lugar, la disolucin de uracilo con ayuda de una microjeringa de 100 L (Figura 20.3a). Seguidamente, girar rpidamente la vlvula a la posicin de inyeccin para su introduccin en la columna (Figura 20.3b). 180
(a)
(b)
Figura 20.3. Detalle de la vlvula de inyeccin: (a) carga (b) inyeccin. Procediendo de la misma manera, introducir en el cromatgrafo las disoluciones de 1.000 ppm de aspartamo y cido benzoico. Finalmente, inyectar las disoluciones patrn preparadas para la obtencin de las rectas de calibrado de cada analito y la disolucin de la muestra problema. Imprimir los cromatogramas obtenidos en cada caso y anotar las reas y los tiempos de retencin de los picos correspondientes a los analitos de inters
20.6. Resultados
1. Calcular el tiempo de retencin, tiempo de retencin corregido y el factor de retencin para cada analito. 2. Calcular el factor se separacin y la resolucin entre ambos analitos en las condiciones de trabajo. 3. Construir una recta de calibrado para cada analito con los datos de las reas de los picos obtenidos en los cromatogramas correspondientes a las disoluciones patrn inyectadas. Obtener los valores de la ordenada en el origen, la pendiente y el coeficiente de correlacin de dichas rectas. 4. Obtener la concentracin de aspartamo, cafena y cido benzoico en las bebidas (expresada en % en peso) a partir de la ecuacin de la recta de calibrado y de la medida de las reas de los picos obtenidos en los cromatogramas correspondientes a la disolucin problema. 5. Con los datos obtenidos por los distintos grupos de trabajo del laboratorio, realizar un tratamiento estadstico de los resultados (media, desviacin estndar y desviacin con relacin a la media), despus de haber eliminado previamente los datos discordantes.
20.7. Cuestiones
1. Se puede ver modificado el espectro de absorcin UV de un compuesto en funcin del pH? 2. Cmo se puede predecir el orden de elucin de los analitos en cromatografa en fase inversa en funcin del pKa de los mismos?
181
HPLC Determinacin de aniones en aguas residuales
Prctica 21. DETERMINACIN DE ANIONES EN AGUAS RESIDUALES MEDIANTE CROMATOGRAFA INICA 21.1. Introduccin
Las aguas residuales se generan como consecuencia de la actividad humana tanto de tipo domstico y urbano como industrial. Aproximadamente el 59 % del agua que se consume en los pases desarrollados se destina al sector industrial, un 30 % a consumo agrcola y el resto a consumo domstico. Este agua contamina nuestros recursos hdricos y nos da idea de la importancia que tiene hoy da el tratamiento de aguas residuales antes de su vertido. Tpicamente, el tratamiento de aguas residuales consiste en una separacin fsica inicial de los slidos de la corriente de agua, seguido de la conversin progresiva de la materia biolgica disuelta en una masa slida mediante el uso de bacterias. Finalmente, una vez que la masa biolgica es separada, el agua tratada puede desinfectarse adicionalmente por procesos fsicos o qumicos. Adems de los parmetros tpicos analizados en las aguas residuales, como DBO y DQO, es importante el anlisis de los aniones presentes. El nitrato es una de las formas de nitrgeno de mayor inters en las aguas residuales. Es un nutriente esencial para muchos auttrofos fotosintticos y una concentracin alta es indicio de una elevada mineralizacin de compuestos nitrogenados. Los fosfatos son un contaminante importante sobre todo en las aguas de cultivo debido al gran uso de fertilizantes y tienen muchos efectos sobre el organismo, por lo que su anlisis tambin es importante. El cloruro es uno de los iones de mayor presencia en todos los tipos de agua y confiere al agua un sabor salado, por lo que en aguas potables su lmite se encuentra en 250 ppm. Los sulfatos suelen aparecer en las aguas residuales en grandes cantidades debido al uso de cido sulfrico .Valores por encima de 250 ppm pueden producir efectos purgantes adems de conferir cierto carcter amargo al agua. El contenido de aniones en las aguas residuales puede verse afectado no slo durante el tratamiento a que es sometido el agua residual sino tambin durante el almacenamiento de la muestra antes de su anlisis. Por este motivo, su anlisis debe realizarse a ser posible inmediatamente despus de la toma de la misma. La actividad microbiolgica puede ser la responsable del cambio producido en el contenido de nitratos, nitritos y amonaco. Adems, los sulfatos pueden ser reducidos a sulfitos y el cloro residual a cloruro, mientras que por oxidacin se pueden ver modificados tambin los fluoruros. En esta prctica se va a determinar el contenido de aniones, nitratos, fosfatos, cloruros y sulfatos, en muestras de agua residual mediante cromatografa inica, utilizando una columna de intercambio aninico con supresin qumica.
183
21.2. Objetivos
1. Entender el fundamento de la cromatografa inica. 2. Aprender el manejo de un cromatgrafo inico. 3. Determinar el contenido de nitratos, fosfatos, cloruros y sulfatos en muestras de agua residual.

Cromatgrafo inico con detector de conductividad Columna cromatogrfica de intercambio aninico (Metrosep A Supp 4) Matraces aforados de 10 y 500 mL Pipetas aforadas de 5 y 10 mL Pipetas graduadas de 1 y 2 mL Pipetas Pasteur Vasos de precipitados de 100 mL Vidrio de reloj o pesasustancias Balanza analtica Precolumna Metrosep A Supp 4/5 Filtros de membrana de nylon Jeringa de plstico
21.4. Reactivos
cido sulfrico Carbonato de sodio anhidro Hidrgeno carbonato de sodio Acetona Agua Milli-Q Patrn comercial de aniones de 10 ppm Muestras de agua residual

Disolucin de NaHCO3 (2,4 mM), Na2CO3 (2,5 mM) / 2 % acetona. Se pesan 132,5 g de carbonato de sodio anhidro, 100,75 g de hidrgeno carbonato de sodio y se disuelven en, aproximadamente, 50 mL de agua Milli-Q. Las disoluciones resultantes se transfieren a un matraz aforado de 500 mL, se aaden 10 mL de acetona y se enrasa con agua-Milli Q. Disolucin de cido sulfrico 50 mM. Se transfieren 1,3 mL de cido sulfrico comercial a un matraz aforado de 500 mL y se enrasa con agua Milli-Q.
184
21.5.2. Determinacin de nitratos, fosfatos, cloruros y sulfatos:

Se toman aproximadamente 5 mL de la muestra de agua residual con una jeringa de plstico y se pasan a travs de un filtro de nylon con un tamao de poro de 0,45 m (Figura 21.1).
Figura 21.1. Filtracin de la muestra.

A partir de la disolucin patrn comercial de nitratos, fosfatos, cloruros y sulfatos de 10 ppm se prepararn tres disoluciones patrn de 10 mL que contengan concentraciones de 1, 3 y 5 ppm de cada in y se enrasarn con agua Milli-Q. Se agitarn manualmente los matraces con la finalidad de homogeneizar las disoluciones.

La Figura 21.2 muestra el cromatgrafo inico que se va ha utilizar en esta prctica.
Figura 21.2. Cromatgrafo inico.
185

Para realizar el anlisis se deben seguir los siguientes pasos: (a) Encender el cromatgrafo y el ordenador. (b) Seleccionar el mtodo de trabajo adecuado. (c) Colocar en los recipientes adecuados el eluyente o fase mvil, el cido sulfrico 50 mM y agua Milli-Q (Figura 21.3).
Figura 21.3. Detalle de los recipientes para la fase mvil, el cido y el agua Milli-Q del cromatgrafo inico. (d) Encender la bomba de pistn, que bombea la fase mvil y la bomba peristltica que bombea tanto el cido sulfrico como el agua Milli-Q (necesarios para realizar la supresin). Poner un flujo de bombeo de 1,0 mL/min (Figura 21.4) y bombear la fase mvil durante diez minutos para acondicionar la columna.
Bomba pistn
Bomba peristltica
Figura 21.4. Detalle de la bomba de pistn y de la bomba peristltica. 186

Introducir en el cromatgrafo las disoluciones patrn de 1, 3, 5 y 10 ppm de nitratos, fosfatos, cloruros y sulfatos para la obtencin de las rectas de calibrado de cada in. Para ello: (a) Hacer click sobre Start (Figura 21.5a). (b) Completar la informacin relativa a las condiciones de inyeccin en la pantalla del ordenador (Figura 21.5b) y presionar Ok..
(a)
(b)
Figura 21.5. Detalle de la pantalla de seleccin de las condiciones de inyeccin. (c) Hacer click sobre Fill (Figura 21.5a) para cargar la muestra en el bucle o loop con ayuda de una jeringa tal y como se muestra en la Figura 21.6, y rpidamente hacer click sobre Inject (Figura 21.5a) para introducir la muestra en la columna.
Figura 21.6. Detalle de la inyeccin.
187

Procediendo de la misma manera, introducir en el cromatgrafo las distintas muestras de agua residual. Imprimir los cromatogramas obtenidos en cada caso y anotar las reas y los tiempos de retencin de los picos correspondientes a todos los iones de inters.
21.6. Resultados
1. Construir una recta de calibrado para cada in con los datos de las reas de los picos obtenidos en los cromatogramas correspondientes a las disoluciones patrn inyectadas. Obtener los valores de la ordenada en el origen, la pendiente y el coeficiente de correlacin de dichas rectas. 2. Obtener la concentracin de nitratos, fosfatos, cloruros y sulfatos en las muestras de agua (expresada en ppm) a partir de la ecuacin de la recta de calibrado y de la medida de las reas de los picos obtenidos en los cromatogramas correspondientes a las mismas. 3. Con los datos obtenidos por los distintos grupos de trabajo del laboratorio, realizar un tratamiento estadstico de los resultados (media, desviacin estndar y desviacin con relacin a la media), despus de haber eliminado previamente los datos discordantes.
21.7. Cuestiones
1. Cmo vara la concentracin de los iones analizados en las diferentes muestras de agua residual proporcionadas?, a qu son debidas estas variaciones? 2. A la vista de los cromatogramas obtenidos, se podra cuantificar algn otro in presente en la muestra utilizando este mismo mtodo de trabajo? 3. Indica qu reaccin tendr lugar durante la regeneracin de la columna supresora con el H2SO4. 4. Calcular el nmero de platos tericos de la columna y la altura de plato a partir del componente ms retenido.
188
HPLC Determinacin de fluoruros en pasta de dientes
Prctica 22. DETERMINACIN DE FLUORUROS EN PASTA DE DIENTES MEDIANTE CROMATOGRAFA INICA 22.1. Introduccin
La pasta de dientes que utilizamos hoy en da contiene aproximadamente unos diez componentes distintos. Algunos de ellos tienen la funcin de limpiar, proteger, dar sabor o consistencia, etc. El componente principal es el carbonato de calcio (yeso) finamente dividido u otro polvo mineral, como el xido de aluminio, que son ligeramente abrasivos y ayudan a eliminar el sarro depositado en los dientes. Generalmente, para dar el color blanco tpico de la pasta se aade xido de titanio. Por el contrario, las pastas de tipo gel transparente deben su poder abrasivo a compuestos de slice, a los que se agregan colorantes. Otros ingredientes son un agente aglutinador y espesante, como puede ser el alginato, un detergente, para limpiar y crear espuma, mentol y un humectante, como la glicerina, para que la pasta no se seque. Por ltimo, dependiendo del tipo de pasta se aaden algunos agentes ms especficos como pueden ser fluoruros, determinados desinfectantes o agentes blanqueantes (bicarbonato de sodio). El fluoruro es la forma inica del fluor, tiene carga negativa y presenta mucha afinidad por los cationes. En el ser humano la mayor parte del fluoruro est presente en los tejidos calcificados, huesos y dientes, debido precisamente a su afinidad por el calcio. Por este motivo los fluoruros presentes en la boca son retenidos en la placa dental a travs del calcio y contribuyen a controlar las lesiones producidas por la caries dental. Esto es as ya que inhiben la desmineralizacin del esmalte sano o estimulan su remineralizacin. Sin embargo, en nios en perodo de formacin bucal su uso excesivo puede ser perjudicial ya que puede producirse fluorosis. La fluorosis dental es un proceso de hipomineralizacin del esmalte dental provocada por un aumento de la porosidad. Como consecuencia de la fluorosis dental severa el esmalte se vuelve quebradizo y aparecen manchas marrones. La concentracin de fluoruros en las pastas dentales suele estar entre 1.000 y 1.100 ppm y las formas ms usuales en que se aade son fluoruro sdico, monofluorofosfato sdico y fluoruros de amonio cuaternario. Entre los mtodos ms utilizados para la su determinacin se encuentran los mtodos potenciomtricos, utilizando un electrodo selectivo de fluoruros, y los mtodos espectrofotomtricos mediante la formacin de un complejo coloreado con alizarina. En esta prctica se va a determinar el contenido de fluoruros en distintas muestras de pastas dentales mediante cromatografa inica, utilizando una columna de intercambio aninico con supresin qumica.
189
22.2. Objetivos
1. Entender el fundamento de la cromatografa inica. 2. Aprender el manejo de un cromatgrafo inico. 3. Determinar el contenido de fluoruros en diferentes muestras de pasta de dientes.

Cromatgrafo inico con detector de conductividad Columna cromatogrfica de intercambio aninico (Metrosep A Supp 4) Matraces aforados de 10, 25 y 500 mL Pipeta aforada de 5 mL Pipetas graduadas de 1, 2 y 5 mL Pipetas Pasteur Vasos de precipitados de 100 mL Vidrio de reloj o pesasustancias Balanza analtica Jeringa de plstico Precolumna Metrosep A Supp 4/5 Filtros de membrana de nylon
22.4. Reactivos
Acido sulfrico Carbonato de sodio anhidro Hidrgeno carbonato de sodio Agua Milli-Q Patrn comercial de fluoruros de 10 ppm Muestras de pasta de dientes

Disolucin de NaHCO3 (1,8 mM) y Na2CO3 (1,7 mM), fase mvil. Se pesan 95,2 g de carbonato de sodio anhidro, 71,5 g de hidrgeno carbonato de sodio y se disuelven en, aproximadamente, 50 mL de agua Milli-Q. Las disoluciones resultantes se transfieren a un matraz aforado de 500 mL y se enrasa con agua-Milli Q. Disolucin de cido sulfrico 38 mM. Se transfiere 1,0 mL de cido sulfrico comercial a un matraz aforado de 500 mL y se enrasa con agua Milli-Q.
190
22.5.2. Determinacin de fluoruros:

Se pesan 1,25 g de cada una de las muestras de pasta de dientes y se disuelven en aproximadamente 10 mL de agua Milli-Q. La disolucin resultante se trasvasa a un matraz aforado de 25 mL y se enrasa con agua Milli-Q. Posteriormente, se toma una alcuota de 10 mL y se pasa a travs de un filtro de nylon con un tamao de poro de 0,45 m con ayuda de una jeringa de plstico (Figura 22.1).
Figura 22.1. muestra.
Filtracin
de
la

A partir de la disolucin patrn comercial de fluoruros de 10 ppm se prepararan tres disoluciones patrn de 10 mL que contengan concentraciones de 1, 3 y 5 ppm de fluoruros y se enrasarn con agua Milli-Q. Se agitarn manualmente los matraces con la finalidad de homogeneizar las disoluciones.

La Figura 22.2 se muestra el cromatgrafo inico que se va ha utilizar en esta prctica.
Figura 22.2. Cromatgrafo inico.
191

Para realizar el anlisis se deben seguir los siguientes pasos: (a) Encender el cromatgrafo y el ordenador. (b) Seleccionar el mtodo de trabajo adecuado. (c) Colocar en los recipientes adecuados el eluyente o fase mvil, el cido sulfrico 38 mM y agua Milli-Q (Figura 22.3).
Figura 22.3. Detalle de los recipientes para la fase mvil, el cido y el agua Milli-Q del cromatgrafo inico. (d) Encender la bomba de pistn, que bombea la fase mvil y la bomba peristltica que bombea tanto el cido sulfrico como el agua Milli-Q (necesarios para realizar la supresin). Poner un flujo de bombeo de 1,0 mL/min (Figura 22.4) y bombear la fase mvil durante diez minutos para acondicionar la columna.
Bomba pistn
Bomba peristltica
Figura 22.4. Detalle de la bomba de pistn y de la bomba peristltica. 192

Introducir en el cromatgrafo las disoluciones patrn de 1, 3, 5 y 10 ppm de fluoruros para la obtencin de la recta de calibrado. Para ello: (a) Hacer click sobre Start (Figura 22.5a). (b) Completar la informacin relativa a las condiciones de inyeccin en la pantalla del ordenador (Figura 22.5b) y presionar Ok.
(a)
(b)
193

Procediendo de la misma manera, introducir en el cromatgrafo las distintas muestras de pasta de dientes. Imprimir los cromatogramas obtenidos en cada caso y anotar las reas y los tiempos de retencin de los picos correspondientes a los fluoruros.
22.6. Resultados
1. Construir una recta de calibrado con los datos de las reas de los picos obtenidos en los cromatogramas correspondientes a las disoluciones patrn inyectadas. Obtener los valores de la ordenada en el origen, la pendiente y el coeficiente de correlacin de dicha recta. 2. Obtener la concentracin de fluoruros en las muestras de pasta de dientes (expresada en ppm) a partir de la ecuacin de la recta de calibrado y de la medida de las reas de los picos obtenidos en los cromatogramas correspondientes a las mismas. 3. Con los datos obtenidos por los distintos grupos de trabajo del laboratorio, realizar un tratamiento estadstico de los resultados (media, desviacin estndar y desviacin con relacin a la media), despus de haber eliminado previamente los datos discordantes.
22.7. Cuestiones
1. A la vista de los cromatogramas obtenidos, se podra cuantificar algn otro in presente en la muestra utilizando este mismo mtodo de trabajo?, cules? 2. Cmo se podra identificar cada uno de los picos presentes en la disolucin patrn comercial? 3. Indica que reaccin tendr lugar durante la regeneracin de la columna supresora con el H2SO4.
194
Cromatografa inica - Determinacin de sodio en slice
Prctica 23. DETERMINACIN DE SODIO EN SLICE MEDIANTE CROMATOGRAFA INICA 23.1. Introduccin
La slice es un slido incoloro, en estado puro. Aparece como componente de muchos materiales naturales (arena, granito, calizas, arcillas, ...). Puede presentarse en forma cristalina (cuarzo) o en forma amorfa en depsitos sedimentarios naturales o como producto de sntesis. La slice cristalina es el dixido de silicio (SiO2) cristalizado y es muy perjudicial para la salud, ya que produce una enfermedad pulmonar conocida como silicosis. Se utiliza mucho en la fabricacin de vidrios, cermicas, cementos, etc. La slice amorfa se sintetiza generalmente por eliminacin de parte del agua de un precipitado gelatinoso de cido silcico, obtenido como resultado de la hidrlisis de silicato de sodio con cido clorhdrico. Su frmula qumica molecular es SiO2 x n H2O. La slice es qumicamente estable, excepto en presencia de cido fluorhdrico y bases fuertes. No se descompone por el calentamiento y es insoluble en agua y en cualquier otro disolvente orgnico. La slice amorfa deshidratada, comercializada bajo el nombre de silicagel , es un compuesto con gran capacidad de absorcin de agua, debido a su elevada porosidad, y por ello se usa habitualmente como agente desecante (Figura 23.1). Segn el mtodo de preparacin, puede presentar estructuras y tamaos de poro diferente, pudiendo algunas llegar a absorber hasta un 40 % de su propio peso en agua.
Figura 23.1. Silicagel .
Otra aplicacin importante de la slice es como fase estacionaria slida para cromatografa y como soporte para fases estacionarias lquidas, utilizadas tanto en cromatografa de gases como en cromatografa de lquidos de alta eficacia. El in sodio es uno de los contaminantes ms importantes que puede contener la slice como consecuencia del proceso de sntesis. Entre las tcnicas mas utilizadas para la determinacin de sodio en este tipo de muestras se encuentran la espectrometra de emisin atmica y la cromatografa inica. En esta prctica se va a determinar el contenido de sodio en diferentes muestras de slice mediante cromatografa inica utilizando una columna de intercambio catinico con deteccin conductimtrica.
195
23.2. Objetivos
1. Aprender el fundamento de la cromatografa inica. 2. Aprender el manejo de un equipo de cromatografa inica. 3. Determinar el contenido de iones sodio en muestras de slice.

Cromatgrafo inico con detector de conductividad Columna cromatogrfica de intercambio catinico Metrosep C2 (4 x 100 mm) Matraces aforados de 10, 50 y 500 mL Pipetas aforadas de 5 mL Pipetas graduadas de 1 y 5 mL Pipetas Pasteur Vasos de precipitados de 100 mL Vidrio de reloj o pesasustancias Balanza analtica Precolumna Metrosep C2 Filtros de membrana de nylon Jeringa de plstico
23.4. Reactivos
cido tartrico cido dipicolnico Agua Milli-Q Disolucin patrn de sodio de 10 ppm Muestras de slice

a) Extreme las precauciones en el manejo de las muestras de slice. Evitar el contacto con piel y ojos. El polvo es irritante para el tracto respiratorio.

Disolucin de cido tartrico 4,0 mM/cido dipicolnico 0,75 mM (fase mvil). Se pesan 0,3 g de cido tartrico y 0,0625 g de cido dipicolnico y se disuelven en aproximadamente 50 mL de agua Milli-Q. Las disoluciones resultantes se transfieren a un matraz aforado de 500 mL, y se enrasa con agua Milli-Q.
196
23.5.3 Determinacin de sodio:

Para la extraccin del sodio se preparar una suspensin de la muestra al 5 % en agua. Para ello, se pesan en una balanza analtica 2,5 g de la muestra de slice, se colocan en una vaso de precipitados y se aaden 50 mL de agua Milli-Q, perfectamente medidos. La suspensin se mantiene con agitacin durante 30 min. Una alcuota de unos 10 mL se pasa travs de un filtro de membrana de nylon con un tamao de poro de 0,45 m con ayuda de una jeringa de plstico (Figura 23.2) para su posterior anlisis en el cromatgrafo.
Figura 23.2. Filtracin de la suspensin de slice.

A partir de la disolucin patrn de sodio de 10 ppm se prepararn tres disoluciones patrn, de 10 mL, que contengan concentraciones de 1, 3 y 5 ppm y se enrasarn con agua Milli-Q. Se agitarn manualmente los matraces con la finalidad de homogeneizar las disoluciones.

La Figura 23.3 se muestra el cromatgrafo inico que se va ha utilizar en esta prctica.
197
Figura 23.3. Cromatgrafo inico. Para realizar el anlisis se deben seguir los siguientes pasos: (a) Encender el cromatgrafo y el ordenador. (b) Seleccionar el mtodo de trabajo adecuado. (c) Colocar el eluyente o fase mvil en el recipiente adecuado. (d) Encender la bomba de pistn, que bombea la fase mvil, y poner un flujo de bombeo de 1,0 mL/min (Figura 23.4). Bombear la fase mvil durante 10 min para acondicionar la columna.
Bomba pistn
Figura 23.4. Detalle de la bomba de pistn. 198

Introducir en el cromatgrafo las disoluciones patrn de 1, 3, 5 y 10 ppm de sodio para la obtencin de la recta de calibrado. Para ello: (a) Hacer click sobre Start (Figura 23.5a). (b) Completar la informacin relativa a las condiciones de inyeccin en la pantalla del ordenador (Figura 23.5b) y presionar Ok.
(a)
(b)
199

Procediendo de la misma manera, introducir en el cromatgrafo las distintas muestras de slice. Imprimir los cromatogramas obtenidos en cada caso y anotar las reas y los tiempos de retencin del pico correspondiente al sodio.
23.6. Resultados
1. Construir una recta de calibrado para el in sodio con los datos de las reas de los picos obtenidos en los cromatogramas correspondientes a las disoluciones patrn inyectadas. Obtener los valores de la ordenada en el origen, la pendiente y el coeficiente de correlacin de dichas rectas. 2. Obtener la concentracin de sodio en las muestras de slice (expresada en ppm) a partir de la ecuacin de la recta de calibrado y de la medida de las reas de los picos obtenidos en los cromatogramas correspondientes a la disolucin problema. 3. Con los datos obtenidos por los distintos grupos de trabajo del laboratorio, realizar un tratamiento estadstico de los resultados (media, desviacin estndar y desviacin con relacin a la media), despus de haber eliminado previamente los datos discordantes.
23.7. Cuestiones
1. A la vista de los cromatogramas obtenidos se podra cuantificar algn otro in presente en la muestra utilizando este mismo mtodo de trabajo? 2. Calcular el nmero de platos tericos de la columna y la altura de plato a partir del componente ms retenido.
200
Cromatografa de gases Fundamento terico
IX. CROMATOGRAFA DE GASES Fundamento terico

La cromatografa de gases (GC, gas chromatography) es una tcnica de separacin que se ha estudiado y utilizado intensamente durante muchos aos para resolver una gran variedad de problemas analticos. Gracias a ello, se han encontrado condiciones vlidas para la separacin de un gran nmero de compuestos por lo que, hoy en da, es la tcnica a elegir para la separacin de compuestos orgnicos e inorgnicos trmicamente estables y voltiles. En cromatografa de gases la separacin de los componentes de la muestra problema se lleva a cabo en base a su distinto reparto entre una fase gaseosa que fluye (fase mvil o gas portador) y una fase estacionaria. En cromatografa gas-lquido, la fase estacionaria es un lquido que recubre la pared interior de una columna o un soporte slido, mientras que la cromatografa gas-slido utiliza un slido adsorbente como fase estacionaria. En la Figura 1 se muestra el esquema de un cromatgrafo de gases.
Figura 1. Esquema de un cromatgrafo de gases. La muestra (generalmente un lquido voltil o un gas) se introduce, normalmente, con la ayuda de una microjeringa a travs de un septo en un inyector caliente donde se vaporiza. Entonces, es arrastrada rpidamente hacia la columna mediante el gas portador (He, N2 o H2). Despus de pasar por la columna que contiene la fase estacionaria, los analitos separados llegan al detector cuya respuesta se visualiza en forma de cromatograma en un registrador o en la pantalla de un ordenador (Figura 2).
10
14
18
min
Figura 2. Separacin de una mezcla de compuestos por GC. 201

En la mayora de las separaciones por GC se utilizan columnas capilares o tubulares abiertas (Figura 3.a), que se caracterizan por una mayor resolucin, rapidez de anlisis y sensibilidad en comparacin con las columnas empacadas. Se fabrican, por lo general, de slice fundida y tienen longitudes entre 15 y 100 m y dimetros internos entre 0,1 y 0,53 mm. Estas columnas se enrollan para permitir su colocacin en el interior de un horno (Figura 3.b) que permite un control preciso de la temperatura de separacin. Sin embargo, no es necesario que la temperatura de la columna sea mayor que el punto de ebullicin de todos los analitos de la muestra, sino lo bastante elevada para que cada analito tenga la suficiente presin de vapor a fin de ser eludo en un tiempo razonable.
(a)
(b)
Figura 3. (a) Columna tubular abierta. (b) Detalle del horno con la columna en su interior. Uno de los detectores ms utilizados en GC para el anlisis de compuestos orgnicos es el detector de ionizacin de llama (FID). Este detector mide la corriente que puede pasar entre un par de electrodos con polarizacin opuesta colocados a ambos lados de una llama formada con una mezcla de hidrgeno y aire, donde se quema el efluente de la columna (Figura 4). La corriente generada y, por lo tanto, la respuesta del detector depende entonces de la cantidad de tomos de carbono ionizables que entran en la llama por unidad de tiempo.
Figura 4. Detector de ionizacin de llama.
La cromatografa de gases, adems de ser una tcnica de separacin importante, permite identificar y cuantificar los componentes de una muestra problema. Cuando se utiliza la cromatografa para anlisis cuantitativo, normalmente se preparan varias 202

disoluciones patrn que contienen concentraciones crecientes y conocidas del analito. El rea (o altura) de cada pico cromatogrfico se representa frente a la concentracin del analito en las disoluciones patrn. La pendiente y la ordenada en el origen de la mejor lnea recta que pase por los puntos puede calcularse estadsticamente mediante anlisis de regresin utilizando el mtodo de los mnimos cuadrados. Se obtiene entonces una recta de calibrado gracias a la cual podr determinarse la concentracin del analito en la muestra problema. Otro mtodo de calibrado muy utilizado en GC es el mtodo del estndar interno. Este mtodo se utiliza en GC cuando la cantidad de muestra a inyectar en el cromatgrafo vara de un anlisis a otro por razones difciles de controlar (como ocurre cuando se utilizan microjeringas para inyectar cantidades muy pequeas de muestra). El mtodo del estndar interno se basa en aadir tanto a las disoluciones patrn como a la disolucin problema de la muestra una cantidad fija de una sustancia pura (estndar interno, SI). Se determinan las reas (o alturas) de los picos cromatogrficos para el analito y para el SI y se calcula el cociente de las reas (o alturas). Entonces, se representan estos cocientes frente a las concentraciones del analito en las disoluciones patrn y se obtiene la recta de calibrado (Figura 5). A partir de la relacin de reas (o alturas) obtenida para los picos del analito y SI en la disolucin problema, podremos conocer su concentracin.
1200 Area SI / Area analito rea analito / rea SI 1000 800 600 400 200 0 0 2 4 C(ppm) (ppm) C 6 8 10
Area SI / Area analito/muestra rea analito muestra rea SI
C analito muestra
Figura 5. Mtodo del estndar interno.
Cuando la respuesta relativa del instrumento al analito y al SI se mantiene constante a lo largo de un determinado intervalo de concentraciones, la cuantificacin puede tambin llevarse a cabo utilizando una nica disolucin patrn (de concentracin conocida y situada dentro del intervalo lineal) a la que se le aade una cantidad conocida del SI. A partir de esta disolucin se calcula el factor de respuesta (F) para el analito con respecto al estndar interno: F = (A/C)a/(A/C)SI donde A es el rea, C es la concentracin, a es el analito y SI es el estndar interno. Entonces, a partir de las reas obtenidas en el cromatograma de la disolucin problema de la muestra y el factor de respuesta calculado para el analito, es posible obtener la concentracin de analito en la disolucin problema mediante la siguiente expresin: Ca = (CSI x Aa) / (F x ASI)
203
GC - Determinacin de impurezas en bebidas alcohlicas
Prctica 24. DETERMINACIN DE IMPUREZAS EN BEBIDAS ALCOHLICAS DESTILADAS MEDIANTE CROMATOGRAFIA DE GASES 24.1. Introduccin
Las bebidas alcohlicas destiladas son aquellas obtenidas directamente de la destilacin de sustancias azucaradas fermentadas. Entre stas cabe destacar el brandy (aguardiente envejecido en vasijas de roble del cual adquiere el bouquet y el color ambarino caracterstico), el whisky (destilado del mosto producido por fermentacin de cereales, como cebada o maz, envejecido en vasijas de madera), la ginebra (se elabora con alcohol rectificado de materias amilceas aromatizado con bayas de enebro) y el ron (se obtiene de la destilacin de melaza, jugo de caa de azcar o miel y que puede ser coloreado con caramelo). Las sustancias que contienen azcares fermentan por la accin de las levaduras, y este proceso transforma los azcares en etanol. Sin embargo, tambin se producen cantidades variables de otros alcoholes como metanol, isopropanol, propanol, butanol y otros compuestos voltiles. El contenido de metanol en el brandy, whisky y ron se encuentra entorno a 1.500 mg/L, 1.000 mg/L y 800 mg/L, respectivamente. Mediante el proceso de destilacin es posible separar, por medio del calor, los distintos componentes del mosto obtenido tras el proceso de fermentacin. En el comienzo y fin del proceso de destilacin se obtienen las llamadas cabezas y colas que contienen la mayor parte de las impurezas, por lo que estas fracciones deben descartarse. En la mitad del proceso sale el alcohol etlico mezclado con agua y el resto de las impurezas. Las bebidas alcohlicas de mayor calidad se elaboran tras un proceso muy riguroso de destilacin, se destilan incluso de tres a cuatro veces, eliminando un elevado porcentaje de esas impurezas. Todas las bebidas alcohlicas destinadas al consumo humano deben cumplir unas condiciones mnimas en cuanto a su graduacin alcohlica, contenido en impurezas totales, contenido en alcohol metlico y contenido en furfural. El metanol es el principal componente del destilado en seco de la madera. Es uno de los disolventes ms universales y encuentra aplicacin tanto en el campo industrial como en diversos productos de uso domstico. El consumo de bebidas adulteradas, principalmente cuando se les adiciona alcohol metlico ocasiona graves daos a la salud de las personas (nauseas, vmitos, clicos, diarrea, dolor de cabeza, trastornos de la visin, trastornos neurolgicos, coma, paro cardiorrespiratorio y muerte). En la presente prctica se determinar el contenido de distintas impurezas presentes en bebidas alcohlicas destiladas mediante cromatografa de gases utilizando un detector de ionizacin de llama.
205
24.2. Objetivos
1. 2. 3. 4. Entender el fundamento de la cromatografa de gases. Aprender el manejo de un cromatgrafo de gases. Identificar las impurezas presentes en diferentes tipos de bebidas alcohlicas. Determinar del contenido de impurezas en diferentas bebidas alcohlicas.

Cromatgrafo de gases con detector de ionizacin de llama (FID) Columna cromatogrfica (MFE-20, polietilenglicol, 25 m x 0,53 mm d.i) Microjeringa de 10 L Micropipeta automtica Medidor de burbuja Matraces aforados de 25 mL Probeta 100 mL
24.4. Reactivos
Nitrgeno (gas portador, flujo: 5 mL/min; gas auxiliar, flujo: 25 mL/min) Aire (flujo: 300 mL/min) Hidrgeno (flujo: 30 mL/min) Etanol, metanol, propanol, butanol, isobutanol, acetaldehdo y acetato de etilo Agua Milli-Q Muestras de bebidas alcohlicas destiladas

24.5.1 Preparacin de disoluciones:
Disolucin acuosa de etanol al 40 % (v/v). A partir del etanol comercial se tomar el volumen correspondiente que se transferir a un matraz aforado de 250 mL y se enrasar con agua Milli-Q. Disolucin patrn de metanol (2.000 ppm, v/v). Con la micropipeta automtica se tomarn 50 L de metanol comercial y se llevarn a un matraz aforado de 25 mL enrasando con la disolucin acuosa de etanol al 40 %. Disolucin patrn de propanol (2.000 ppm, v/v). Con la micropipeta automtica se tomarn 50 L de propanol comercial y se llevarn a un matraz aforado de 25 mL enrasando con la disolucin acuosa de etanol al 40 %. 206

Disolucin patrn de butanol (2.000 ppm, v/v). Con la micropipeta automtica se tomarn 50 L de butanol comercial y se llevarn a un matraz aforado de 25 mL enrasando con la disolucin acuosa de etanol al 40 %. Disolucin patrn isobutanol (2.000 ppm, v/v). Con la micropipeta automtica se tomarn 50 L de isobutanol comercial y se llevarn a un matraz aforado de 25 mL enrasando con la disolucin acuosa de etanol al 40 %. Disolucin patrn acetaldehdo (2.000 ppm, v/v). Con la micropipeta automtica se tomarn 50 L de acetaldehido comercial y se llevarn a un matraz aforado de 25 mL enrasando con la disolucin acuosa de etanol al 40 %. Disolucin patrn acetato de etilo (2.000 ppm, v/v). Con la micropipeta automtica se tomarn 50 L de acetato de etilo comercial y se llevarn a un matraz aforado de 25 mL enrasando con la disolucin acuosa de etanol al 40 %. Disolucin patrn de metanol, propanol, butanol, isobutanol, acetaldehdo y acetato de etilo (1.000 ppm, v/v). Con la micropipeta automtica se tomarn 25 L de cada uno de los patrones comerciales y se llevarn a un matraz aforado de 25 mL enrasando con la disolucin acuosa de etanol al 40 %.
24.5.2 Anlisis cromatogrfico:

La Figura 24.1 muestra el cromatgrafo de gases que se va ha utilizar en esta prctica.
Figura 24.1. Cromatgrafo de gases A continuacin se indican los pasos a seguir para poder llevar a cabo las medidas en el equipo: (a) Abrir los gases: nitrgeno, hidrgeno y aire. (b) Encender el cromatgrafo de gases y el ordenador. (c) Seleccionar el mtodo de trabajo adecuado.
207

(d) Con ayuda de las vlvulas controladoras de flujo, ajustar el flujo del gas portador (nitrgeno) a 5 mL/min, del gas auxiliar (nitrgeno) a 30 mL/min, del aire (300 mL/min) y del hidrgeno (30 mL/min). Para la medida exacta del flujo utilizar un medidor de burbuja (Figura 24.2).
Figura 24.2. Medida del flujo mediante el medidor de burbuja. (e) Ajustar la temperatura de trabajo en el horno de la columna a 50 C. (f) Ajustar la temperatura de trabajo en el inyector y FID a 200 C.
24.5.2.1. Identificacin de impurezas en bebidas alcohlicas

Con ayuda de una microjeringa de 10 L introducir en el cromatgrafo 1 L de la disolucin acuosa de etanol al 40 % (v/v) y anotar el tiempo de retencin para el etanol (Figura 24.3). Posteriormente, inyectar 1 L de las diferentes disoluciones patrn preparadas de metanol, propanol, butanol, isobutanol, acetato de etilo y acetaldehdo de 2.000 ppm (v/v) y anotar los tiempos de retencin para cada una de estas impurezas.
Figura muestra gases. A continuacin inyectar 1 L de cada una proporcionadas por el profesor y anotar los tiempos de que aparecen en los cromatogramas. 208
24.3. Inyeccin de la en el cromatgrafo de de las bebidas alcohlicas retencin de todos los picos
GC - Determinacin de impurezas en bebidas alcohlicas 24.5.2.2. Cuantificacin de impurezas en whisky mediante el factor de respuesta utilizando butanol como estndar interno
Con ayuda de una microjeringa de 10 L, introducir en el cromatgrafo 1 L de la disolucin patrn de metanol, propanol, butanol, isobutanol, acetaldehdo y acetato de etilo de 1.000 ppm (v/v) y obtener el cromatograma correspondiente. Imprimir el cromatograma obtenido y anotar las reas de los picos correspondientes a los analitos de inters y estndar interno, SI, (butanol). Finalmente, en un matraz aforado de 25 mL, aadir la cantidad necesaria de butanol para conseguir una concentracin final de 1.000 ppm (v/v) y enrasar con la muestra de whisky. Introducir en el cromatgrafo 1 L de esta disolucin problema y obtener el cromatograma correspondiente. Imprimir el cromatograma obtenido y anotar las reas de los picos correspondientes a los analitos de inters y SI.
24.6. Resultados
1. Identificar las impurezas presentes en cada una de las bebidas alcohlicas analizadas. 2. Buscar los puntos de ebullicin de cada uno de los componentes analizados y en funcin de estos, proponer el orden de elucin de dichos compuestos. Coincide el orden propuesto con el orden de elucin real? 3. Calcular el factor de respuesta (F) para cada una de las impurezas que se van a analizar en el whisky, utilizando el butanol como estndar interno, mediante la siguiente expresin: F = (A/C)a/(A/C)SI donde A es el rea, C es la concentracin, a es el analito y SI es el estndar interno. 4. Obtener la concentracin de las distintas impurezas presentes en el whisky (expresada en ppm), a partir de las reas obtenidas en el cromatograma de la disolucin problema de whisky y el factor de respuesta calculado para cada impureza, mediante la siguiente expresin: Ca = (CSI x Aa) / (F x ASI)
24.7. Cuestiones
1. Se pueden cuantificar todas las impurezas encontradas en la muestra de whisky utilizando este mtodo cromatogrfico?, por qu?, cmo se podran cuantificar?
209
GC Aplicaciones cualitativas y cuantitativas de la cromatografa de gases
Prctica 25. APLICACIONES CUALITATIVAS Y CUANTITATIVAS DE LA CROMATOGRAFA DE GASES 25.1. Introduccin

Una de las variables ms importantes a controlar en una separacin mediante cromatografa de gases es la temperatura de la columna, razn por la cual sta debe introducirse en un horno termostatizado. La temperatura de la columna es inversamente proporcional al tiempo de retencin de los analitos. Esto es debido a que el aumento de la temperatura provoca un aumento en la presin de vapor de los mismos y, como consecuencia, se produce una disminucin en el coeficiente de distribucin. Sin embargo, hay que tener en cuenta que no todos las analitos se afectan por igual, por lo que el cambio de la temperatura puede mejorar o empeorar la resolucin para una pareja dada de analitos. En la prctica, se utilizan temperaturas ligeramente superiores al punto de ebullicin promedio de los analitos presentes en la muestra. Para muestras que contienen analitos con un amplio intervalo de puntos de ebullicin es mejor emplear un programa de temperatura. Para identificar un pico cromatogrfico en una muestra problema el mtodo ms simple consiste en comparar su tiempo de retencin con el de una disolucin patrn del analito cuya presencia se sospecha. Otra forma ms fiable es mediante cocromatografa, en la que se agrega a la disolucin problema una cantidad de la disolucin patrn del analito cuya presencia se sospecha. Si el tiempo de retencin del analito en la disolucin patrn es idntico al del componente de la disolucin problema, el rea de este pico aumentar con respecto a la de los otros picos del cromatograma. En muestras reales complejas, la cocromatografa es casi concluyente cuando se realiza con dos o ms tipos de columnas. Para el anlisis cuantitativo por GC normalmente se utiliza el mtodo del estndar interno, ya que nos permite corregir las variaciones que se producen de un anlisis a otro en la cantidad de muestra inyectada. Este mtodo se basa en aadir, tanto a las disoluciones patrn como a la disolucin problema, una cantidad fija de un estndar interno (SI). Se representa el cociente de las reas del pico cromatogrfico del analito y del estndar interno frente a la concentracin del analito en cada disolucin patrn y se obtiene la recta de calibrado, a partir de la cual podemos conocer la concentracin de analito en la disolucin problema interpolando en la misma la relacin de reas obtenida para la disolucin problema. En esta prctica se va a estudiar el efecto de la temperatura de columna en el proceso de separacin de una mezcla de tres compuestos orgnicos mediante cromatografa gas-lquido. Adems, se identificaran dichos compuestos en la mezcla problema y se cuantificar uno de ellos utilizando el mtodo del estndar interno.
211
25.2. Objetivos
1. Entender el fundamento de la cromatografa de gases. 2. Aprender el manejo de un cromatgrafo de gases. 3. Estudiar el efecto de la temperatura de columna sobre el proceso de separacin en GC. 4. Realizar un anlisis cualitativo por GC mediante la identificacin de tres compuestos orgnicos en una mezcla problema. 5. Realizar un anlisis cuantitativo por GC utilizando el mtodo del estndar interno.

Cromatgrafo de gases con detector de ionizacin de llama (FID) Columna WCOT 5 % fenil, 95 % dimetilpolisiloxano (25 m x 0,53 mm d.i) Microjeringa de 10 L Matraces aforados de 10, 25 y 250 mL Medidor de burbuja Pesasustancias Pipetas aforadas de 1, 2, 5 y 10 mL Pipetas graduadas de 5 y 10 mL Pipetas Pasteur Vaso de precipitados de 100 mL Viales de vidrio de 2 mL
25.4. Reactivos
Nitrgeno (gas portador, flujo: 5 mL/min; gas auxiliar: 25 mL/min) Aire (flujo: 300 mL/min) Fenol Hidrgeno (flujo: 30 mL/min) Ciclohexano Metanol Tolueno Muestra problema

25.5.1 Preparacin de disoluciones:
Disolucin madre de tolueno 1 % (v/v) en metanol. Se transfieren 2,5 mL de tolueno comercial a un matraz aforado de 250 mL y se enrasa con metanol. 212

Disolucin madre de ciclohexano 1 % (v/v) en metanol. Se transfieren 2,5 mL de ciclohexano comercial a un matraz aforado de 250 mL y se enrasa con metanol. Disolucin madre de fenol (15 g/L) en metanol. Se disuelven 0,15 g de fenol en aproximadamente 25 mL de metanol. La disolucin resultante se transfiere a un matraz aforado de 100 mL y se enrasa con metanol.
25.5.2 Anlisis cromatogrfico:

La Figura 25.1 muestra el cromatgrafo de gases que se va ha utilizar en esta prctica.
Figura 25.1. Cromatgrafo de gases. (a) Abrir los gases: nitrgeno, hidrgeno y aire (b) Encender el cromatgrafo de gases y el ordenador. (c) Seleccionar el mtodo de trabajo adecuado. (d) Con ayuda de las vlvulas controladoras de flujo, ajustar el flujo del gas portador (nitrgeno) a 5 mL/min, del gas auxiliar (nitrgeno) a 30 mL/min, del aire (300 mL/min) y del hidrgeno (30 mL/min). Para la medida exacta del flujo utilizar un medidor de burbuja (Figura 25.2). (e) Ajustar la temperatura de trabajo en el horno de la columna a 50 C. (f) Ajustar la temperatura de trabajo en el inyector y FID a 250 C.
213
Figura 25.2. Medida del flujo mediante el medidor de burbuja.
25.5.2.1. Separacin de los componentes de la mezcla problema: efecto de la temperatura de la columna

(a) Con ayuda de una microjeringa de 10 L (Figura 25.3) introducir en el cromatgrafo 1 L de la mezcla problema y obtener el cromatograma. (b) Cambiar la temperatura de la columna a 60 C. Inyectar de nuevo 1 l de la mezcla problema y obtener el cromatograma. (c) Repetir la inyeccin tras cambiar la temperatura de la columna a 70 C.
Figura 25.3. Inyeccin de la muestra en el cromatgrafo de gases.
24.5.2.2. Identificacin de los componentes de la mezcla problema

Para llevar a cabo la identificacin de los componentes en la mezcla problema se deben preparar los siguientes viales: Vial (1): Metanol puro. Vial (2): 1 mL de metanol y 15 gotas (aadidas con pipeta Pasteur) de la disolucin madre de fenol (15 g/L en metanol) Vial (3): 1 mL de metanol y 1 gota (aadida con pipeta Pasteur) de tolueno. Vial (4): 2 mL de metanol y 1 gota (aadida con pipeta Pasteur) de ciclohexano. Vial (5): 1 gota de muestra problema y 1 gota del vial (3).
214

Una vez seleccionada la temperatura de trabajo adecuada en la columna, inyectar en el cromatgrafo 1 L de los viales (1), (2), (3) y (4) y obtener los cromatogramas correspondientes, anotando los tiempos de retencin para los picos observados en cada caso. Finalmente, para identificar el pico de tolueno mediante cocromatografa, inyectar 1 L del vial (5) y obtener el cromatograma.
24.5.2.3. Cuantificacin de tolueno utilizando ciclohexano como estndar interno

A partir de las disoluciones madre de tolueno y ciclohexano al 1 % (v/v) se prepararn seis disoluciones patrn en matraces aforados de 25 mL que contengan 1, 2, 3, 5, 7 y 10 mL de la disolucin madre de tolueno, respectivamente y 5 mL de la disolucin madre de ciclohexano (estndar interno, SI) en cada uno de ellos. Por ltimo, se enrasarn con metanol y se agitarn manualmente para homogeneizar toda la disolucin. Una vez preparadas todas las disoluciones patrn inyectar en el cromatgrafo 1 L de cada una de ellas, empezando por la de menor concentracin. Imprimir los cromatogramas y anotar los tiempos de retencin y las reas de los picos correspondientes al tolueno y al ciclohexano. Por ltimo, introducir en el cromatgrafo 1 L de la muestra problema y obtener el cromatograma correspondiente. Imprimirlo y anotar las reas de los picos correspondientes al tolueno y al SI.
24.6. Resultados
1. Cmo se ven afectados los tiempos de retencin de los analitos al pasar de 50 a 60 C y de 60 a 70 C?, qu ocurre con el ancho de los picos?, qu ocurre con la resolucin entre los compuestos? 2. Cul de las tres temperaturas consideras que es ms adecuada para realizar la separacin?, por qu? 3. Buscar los puntos de ebullicin de cada unos de los componentes de la muestra problema y del disolvente (metanol). En funcin de los datos obtenidos, proponer el orden de elucin de dichos compuestos. Coincide el orden propuesto con el orden de elucin real? 4. A partir de los tiempos de retencin obtenidos para los picos del metanol, tolueno, fenol y ciclohexano, identificar dichos compuestos en el cromatograma de la muestra problema. 5. Qu ocurre con las reas de los picos cuando se inyecta el vial (5) en comparacin con las reas de los picos de la mezcla problema?, qu indica esto?
215

6. Calcular la relacin de reas para el tolueno y el ciclohexano (rea analito / rea SI) para cada una de las disoluciones patrn de tolueno y para la muestra problema. 7. Representar la relacin de reas frente a la concentracin de tolueno en cada una de las disoluciones patrn, obteniendo la ecuacin de la recta de calibrado por el mtodo de mnimos cuadrados. 8. Calcular la concentracin de tolueno en la muestra problema a partir de la relacin de reas calculada para la misma. Expresar los resultados como % en volumen.
25.7. Cuestiones
1. Cundo es ms adecuado utilizar el mtodo del estndar interno para cuantificar un analito en una muestra? 2. Cmo podemos identificar mediante GC un analito sin comparar con una disolucin patrn?
216
ANEXO
Anexo
Tabla 1. mx de absorcin y mx de compuestos que presentan en su estructura algn grupo funcional caracterstico.
Grupo Funcional mx (nm) mx Tipo de transicin *
Alqueno
177 178 196 225 186 280
Muy Elevada Elevada Elevada Dbil Elevada Dbil
Alquino
* n * n *
Carbonilo
Aldehdo
C H
O
O
180 293
Elevada Dbil
n * n *
Carboxilo
C OH O
204
Dbil
n *
Amida Azo
C NH2
N=N
241 339
Dbil Dbil
n * n * n *
O
Nitro
N+ O
280
Dbil
Nitroso
300 665
Dbil Dbil
n * n *
O
Nitrato
N+ O
270
Dbil
mx > 104 Muy elevada, 103 mx 104 Elevada, mx < 103 Dbil
219
Anexo
Tabla 2. Bandas caractersticas de los grupos funcionales ms importantes Enlace C-H C-H C-H C-H O-H O-H O-H O-H N-H C=C C=C CC C-N CN C-O C=O NO2 Tipo de Compuesto Alcanos Alquenos Alquinos Anillos aromticos Alcoholes, Fenoles Alcoholes con puente de hidrgeno, Fenoles cidos carboxlicos cidos carboxlicos con puente de hidrgeno Aminas, Amidas Alquenos Anillos aromticos Alquinos Aminas, Amidas Nitrilos Alcoholes, teres, cidos carboxlicos, steres Aldehdos, Cetonas, cidos carboxlicos, steres Nitrocompuestos Frecuencias (cm-1) 2.850-2.970 1.340-1.470 3.010-3.095 675-995 3300 3.010-3.100 690-900 3590-3.650 3.200-3.600 3.500-3.650 2.500-2.700 3.300-3.500 1.610-1.680 1.500-1.600 2.100-2.260 1.180-1.360 2.210-2.280 1.050-1.300 1.690-1.760 1.500-1.570 1.300-1.370
220
Anexo
Tabla 3. ndices de refraccin del agua destilada a distintas temperaturas. Temperatura C 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 ndice de refraccin 1,33369 1,33364 1,33358 1,33352 1,33346 1,33339 1,33331 1,33324 1,33316 1,33307 1,33299 1,3329 1,3328 1,33271 1,33261 1,3325 Temperatura C 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 ndice de refraccin 1,3324 1,33229 1,33217 1,33206 1,33194 1,33182 1,3317 1,33157 1,33144 1,33131 1,33117 1,33104 1,3309 1,33075 1,33061
Tabla 4. ndices de refraccin de diferentes aceites vegetales. Tipo de aceite - T de trabajo OLIVA - 20C ORUJO - 20C ALGODN - 20C GIRASOL - 25C CACAHUETE - 25C COLZA - 25C GERMEN DE MAIZ - 25C CARTAMO - 25C PEPITA DE UVA - 25C SOJA - 25C ndice de refraccin 1,4677-1,4705 1,4650-1,4707 1,463-1,472 1,467-1,474 1,467-1,470 1,470-1,474 1,470-1,474 1,472-1,476 1,473-1,475 1,474-1,476
221
Anexo
Tabla 5. Relacin entre el contenido de humedad de una muestra de miel y su ndice de refraccin a 20C. ndice de refraccin (20C) 1.5044 1.5038 1.5033 1.5028 1.5023 1.5018 1.5012 1.5007 1.5002 1.4997 1.4992 1.4987 1.4982 1.4976 1.4971 1.4966 1.4961 1.4956 1.4951 1.4946 1.494 Humedad (%) 13 13.2 13.4 13.6 13.8 14 14.2 14.4 14.6 14.8 15 15.2 15.4 15.6 15.8 16 16.2 16.4 16.6 16.8 17 ndice de refraccin (20C) 1.4935 1.493 1.4925 1.492 1.4915 1.491 1.4905 1.49 1.4895 1.489 1.4885 1.488 1.4875 1.487 1.4865 1.486 1.4855 1.485 1.4845 1.484 1.4835 Humedad (%) 17.2 17.4 17.6 17.8 18 18.2 18.4 18.6 18.8 19 19.2 19.4 19.6 19.8 20 20.2 20.4 20.6 20.8 21 21.2 ndice de refraccin (20C) 1.483 1.4825 1.482 1.4815 1.481 1.4805 1.48 1.4795 1.479 1.4785 1.478 1.4775 1.477 1.4765 1.476 1.4755 1.475 1.4745 1.474 Humedad (%) 21.4 21.6 21.8 22 22.2 22.4 22.6 22.8 23 23.2 23.4 23.6 23.8 24 24.2 24.4 24.6 24.8 25
222
BIBLIOGRAFIA
Bibliografa
BIBLIOGRAFA
Adrian J.; Anlisis Nutricional de los Alimentos. Ed. Acribia (2000). Anderson K. A.; Analytical Techniques for Inorganic Contaminants. Ed. AOAC International (1999). Baudi S.; Qumica de los Alimentos. Ed. Pearson Education (1999) 3 edicin. Burriel F., Lucena F., Arribas S., Hernndez J.; Qumica Analtica Cualitativa. Ed. Paraninfo (1998) 16 edicin. Cavazos N. C., Zrate L., Torres E.; Determinacin de fsforo y cafena en bebidas de cola. Educacin Qumica (2001) 12, 116-120. Cocciardi R. A., Ismail A. A., Wang Y., Sedman J.; Heterospectral two-dimensional correlation spectroscopy of mid-infrared and Fourier self-deconvolved nearinfrared spectra of sugar solutions. J. Agric. Food Chem. (2006) 54, 6475-6481. Conklin A. R.; Analysis of aspartame and its hydrolysis products by thin-layer chromatography. J. Chem. Ed. (1987) 64, 1065-1066. Costa, de S. M., Montenegro M. A., Arregui T.; Characterization of fresh Beta vulgaris from Santiago del Estero (Argentina). Nutrient and caroteniod content of tem and leaves. Cinc. Tecnol. Aliment. (2003) 23, 33-37. Harris D. C.; Anlisis Qumico Cuantitativo. Ed. Revert (2007) 3 edicin. Higson S. P. J.; Qumica Analtica. Ed. McGraw Hill (2007). Isengard H. D., Schulthei D., Radovic B., Anklam E.; Alternatives to official analytical methods used for the water determination in honey. Food Control (2001) 12, 459-466. Isengard H. D., Schulthei D.; Water determination in honey-Karl Fischer tritation, an alternative to refractive index measurements? Food Chemistry (2003) 82, 151-154. Kays S. E., Barton F. E., Windham W. R., Himmelsbach D. S.; Prediction of total dietary fiber by near-infrared reflectance spectroscopy in cereal products containing high sugar and crystalline sugar. J. Agric. Food Chem. (1997) 45, 39443951.
225
Bibliografa
Maeda Y., Yamamoto M., Owada K., Sato S., Masui T.; Simultaneous liquid chromatographic determination of water-soluble vamins, caffeine, and preservative in oral liquid tonics. J. Assoc. Off. Anal. Chem. (1989) 72, 244-247. Matissek, R.; Anlisis de Alimentos: Fundamentos, mtodos y aplicaciones. Ed. Acribia (1999). McDevitt V. L., Rodrguez A., Williams K. R.; Analysis if soft drinks: UV spectrophotometry, liquid chromatography, and capillary electrophoresis. J. Chem. Ed. (1998) 75, 625-629. Olsen E. D.; Mtodos pticos de Anlisis. Ed. Revert (1990). Primo Yufera E.; Qumica de los Alimentos. Ed. Sntesis (1998). Rice G. W.; Determination of impurities in whiskey using internal standard techniques. J. Chem. Ed. (1987) 64, 1055-1056. Rodrguez C. M., Ravelo J. L., Palazn J. M.; Tcnicas de organizacin y seguridad en el laboratorio. Ed. Sntesis (2005). Rubinson K. A., Rubinson J. F.; Qumica Analtica Contempornea. Ed. Prentice Hall (1998) 4 edicin. Rump H. H.; Laboratory Manual for the Examination of Water, Waste Water and Soil. Ed. Wiley-VCH (1999) 3 edicin. Schultz C. P., Eysel H. H., Mantsch H. H., Jackson M.; Carbon dioxide in tissues, cell, and biological fluids detected by FTIR spectroscopy. J. Phys. Chem. (1996) 100, 6845-6848. Sierra I., Morante S., Prez D.; Experimentacin en Qumica Analtica. Ed. Dykinson (2007) 1 edicin. Coleccin Ciencias Experimentales y Tecnologa vol. 20. Skoog D. A., Holler F. J., Nieman T. A.; Anlisis Instrumental. Ed. McGraw-Hill (2001) 5 edicin. Skoog D. A., West D. M., Holler F. J., Crouch S. R.; Fundamentos de Qumica Analtica. Ed. Thomson-Paraninfo (2005) 8 edicin. Universidad Rey Juan Carlos, FREMAP; Seguridad y Salud en Laboratorios: Recomendaciones de Carcter General. Ed. FREMAP.
226

PDF

Hochgeladen von

Dokumentinformationen

Originaltitel

Copyright

Verfügbare Formate

Dieses Dokument teilen

Dokument teilen oder einbetten

Freigabeoptionen

Stufen Sie dieses Dokument als nützlich ein?

Sind diese Inhalte unangemessen?

Copyright:

Verfügbare Formate

PDF

Hochgeladen von

Copyright:

Verfügbare Formate

PRCTICAS DE ANLISIS INSTRUMENTAL

PRCTICAS DE ANLISIS INSTRUMENTAL

ISBN: 978-84-9849-189-0 Depsito Legal:

Preimpresin realizada por los autores

NDICE 9 PRLOGO 13 SEGURIDAD Y NORMAS DE TRABAJO 17 PRCTICAS

II. ESPECTROSCOPA DE ABSORCIN EN EL IR 49

III. ESPECTROSCOPA DE ABSORCIN ATMICA 67

Prcticas de Anlisis Instrumental

VI. POTENCIOMETRA 131

VII. CROMATOGRAFA EN CAPA FINA 153

VIII. CROMATOGRAFA LIQUIDOS DE ALTA EFICACIA 165

IX. CROMATOGRAFA DE GASES 201

ANEXO 219 BIBLIOGRAFA 225

Prcticas de Anlisis Instrumental

Prcticas de Anlisis Instrumental

Isabel Sierra Alonso Profesora Titular de Qumica Analtica de la URJC

Prcticas de Anlisis Instrumental

SEGURIDAD Y NORMAS DE TRABAJO

Seguridad y normas de trabajo

SEGURIDAD Y NORMAS DE TRABAJO

2. Manipulacin de reactivos y material de laboratorio

Prcticas de Anlisis Instrumental

Seguridad y normas de trabajo

2.2. Recomendaciones generales en el manejo de reactivos

Prcticas de Anlisis Instrumental

Seguridad y normas de trabajo

2.3. Recomendaciones generales en el manejo de material de laboratorio

Prcticas de Anlisis Instrumental

Seguridad y normas de trabajo

3. Actuacin en caso de accidente

Prcticas de Anlisis Instrumental

Seguridad y normas de trabajo

3.2. Quemaduras trmicas

3.4 Ingestin e inhalaciones

Prcticas de Anlisis Instrumental

Seguridad y normas de trabajo

3.6 Fuga de gases

Prcticas de Anlisis Instrumental

Espectroscopa de absorcin UV-Vis Fundamento terico

I. ESPECTROSCOPA DE ABSORCIN UV-Vis Fundamento terico

-0.1 200 250 300 350 400 450 500

Figura 2. Espectro de absorcin UV-Vis de la 8-hidroxiquinolena en agua.

Prcticas de Anlisis Instrumental

Espectroscopa de absorcin UV-Vis Fundamento terico

Prcticas de Anlisis Instrumental

Espectroscopa de absorcin UV-Vis Fundamento terico

Figura 4. Disoluciones patrn del analito de concentracin creciente y conocida.

1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0

A disolucin problema C analito en disolucin problema

Figura 5. Ejemplo de una recta de calibrado para espectroscopa de absorcin UV-Vis.

Prcticas de Anlisis Instrumental

Espectroscopia de absorcin UV-Vis - Determinacin de hierro en cemento

Prctica 1. DETERMINACIN DE HIERRO EN CEMENTO MEDIANTE ESPECTROSCOPA UV-Vis 1.1. Introduccin

Prcticas de Anlisis Instrumental

Espectroscopia de absorcin UV-Vis - Determinacin de hierro en cemento

1.3. Aparatos y material

1.5. Procedimiento experimental

Prcticas de Anlisis Instrumental

Espectroscopia de absorcin UV-Vis - Determinacin de hierro en cemento

1.5.2. Preparacin de disoluciones:

1.5.3. Determinacin de hierro:

Prcticas de Anlisis Instrumental

1.5.3.3. Anlisis espectrofotomtrico