TINCIN DE GRAM

La tincin de Gram o coloracin de Gram es un tipo de tincin diferencial empleado en Bacteriologa para la visualizacin de bacterias, sobre todo en muestras clnicas. Debe su nombre al bacterilogo dans Christian Gram, que desarroll la tcnica en 1884. Se utiliza tanto para poder referirse a la morfologa celular bacteriana como para poder realizar una primera aproximacin a la diferenciacin bacteriana, considerndose Bacteria Gram positiva a las bacterias que se visualizan de color morado, y Bacteria Gram negativa a las que se visualizan de color rosa o rojo o grosella.

EXPLICACIN
El cristal violeta (colorante catinico) penetra en todas las clulas bacterianas (tanto Gram positivas como Gram negativas) a travs de la pared bacteriana. El lugol es un compuesto formado por I2 (yodo) en equilibrio con KI (yoduro de potasio) y Sl (Siulterio), los cuales estn presente para solubilizar el yodo, y actan de mordiente, haciendo que el cristal violeta se fije con mayor intensidad a la pared de la clula bacteriana. El I2 entra en las clulas y forma un complejo insoluble en solucin acuosa con el cristal violeta.. La mezcla de alcohol-acetona que se agrega, sirve para realizar la decoloracin, ya que en la misma es soluble el complejo I2/cristal violeta. Los organismos Gram positivos no se decoloran, mientras que los Gram negativos s lo hacen. Para poner de manifiesto las clulas Gram negativas se utiliza una coloracin de contraste. Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina. Despus de la coloracin de contraste las clulas Gram negativas son rojas, mientras que las Gram positivas permanecen violetas. La safranina puede o no utilizarse, no es crucial para la tcnica. Sirve para hacer una tincin de contraste que pone de manifiesto las bacterias Gram negativas. Al trmino del protocolo, las Gram positivas se vern azul-violceas y las Gram negativas, se vern rosas (si no se hizo la tincin de contraste) o rojas (si se us, por ejemplo, safranina). Esta importante coloracin diferencial fue descubierta por Hans Christian Gram en 1884. En este mtodo de tincin, la extensin bacteriana se cubre con solucin de uno de los colorantes de violeta de metilo, que se deja actuar durante un lapso determinado. Se escurre luego el exceso de violeta de metilo y se aade luego una solucin de yodo, que se deja durante el mismo tiempo que la anterior; despus se lava el portaobjetos con alcohol hasta que ste no arrastre ms colorante.

Sigue a tal tratamiento una coloracin de contraste, como safranina, fucsina fenicada diluida, pardo Bismarck, pironin B o hasta inclusive verde de malaquita. Algunos microorganismos retienen el colorante violeta, an despus de tratarlos con un decolorante, y el color no se modifica al aadir ste; otros pierden con facilidad el primer tinte, y toman el segundo. Los que fijan el violeta, se califican de grampositivos, y los que pierden la primera coloracin y retienen la segunda, de gramnegativos. Basndonos pues, en la reaccin Gram, podemos clasificar a los microorganismos en uno de los dos grupos. Los colorantes de p-rosanilina son los que mejores resultados dan en la coloracin Gram. Los representantes ms usados de este grupo son violeta de metilo y violeta cristal o de genciana. En realidad, violeta de metilo es el nombre atribuido al compuesto tetrametil-p-rosanilina. El matiz de color de la p-rosanilina se intensifica al aumentar el nmero de grupos metilo en la molcula; por consiguiente, de los tres grupos, el tono ms oscuro es la hexametil-p-rosanilina (violeta cristal), y el tinte ms ligero, la tetrametil-p-rosanilina (violeta de metilo). Los nombres violeta de metilo 3R, 2R, R, B, 2B, 3B, etc., se refieren al nmero de grupos metilo contenidos. La letra R indica matices rojos, y la letra B, tonos azules. El violeta de cristal contiene seis grupos metilo, y se considera como el mejor colorante primario para teir por el mtodo de Gram. La facultad de las clulas para tomar la coloracin Gram no es propia de toda sustancia viviente, sino que se limita casi en absoluto a hongos y bacterias. As vemos que las clulas de plantas y animales superiores no conservan la primera coloracin; los mohos se tien con cierta irregularidad; los grnulos de micelios propenden retener el colorante. La reaccin de Gram no es infalible ni constante; puede variar con el tiempo del cultivo y el pH del medio, y quiz por otras causas.

TEORAS
Un microorganismo gram positivo debe presentar una pared celular sana. El mismo microorganismo, si sufre dao de la pared por una u otra causa, se vuelve gram negativo. Esto indica la importancia de la pared para la retencin o el escape del colorante. Una posible teora del mecanismo de tincin es la siguiente: El colorante bsico entra al microorganismo, donde forma con el yodo una laca insoluble en agua. El alcohol o la acetona empleados para aclarar, deshidrata las paredes de los microorganismos grampositivos, tratados con mordiente, y forma una barrera que la laca no puede atravesar. En las clulas gramnegativas, los lpidos de la

pared (ms abundantes que en las clulas grampositivas) se disuelven por este tratamiento, lo que permite el escape del complejo de cristal violeta con yodo. Algunos autores objetan esta teora, pero es indudable la importancia general de la pared celular. Varias son las teoras emitidas para explicar el mecanismo de la tincin de Gram. Stearn (1923) bas la suya en una combinacin qumica entre el colorante y las protenas de las bacterias, Las protenas y aminocidos son cuerpos anfteros, esto es, tienen la facultad de reaccionar con cidos y con bases, gracias a sus grupos amino y carboxilo; en soluciones cidas, reaccionan con los cidos, y en soluciones alcalinas lo hacen con las bases. De igual manera, comprobaron que la reaccin de tincin de las bacterias obedece en gran parte a su contenido protenico; estos microorganismos se conducen como cuerpos anfteros, al combinarse con colorantes cidos en soluciones cidas y con los bsicos en medio alcalino. La combinacin con ambos tipos de colorante no se produce en el punto isoelctrico. Como los microorganismos contienen ms de una protena, ese punto no tiene un valor preciso y definido, sino que constituye ms bien una gama o escala que comprende dos o tres unidades de pH. Segn Stern y Stearn, los microorganismos grampositivos tienen una escala isoelctrica de pH inferior a la de los microorganismos gramnegativos; y, a base de sus datos experimentales, deducen las siguientes conclusiones:

Los microorganismos grampositivos pueden hacerse gramnegativos al aumentar la acidez. Los microorganismos gramnegativos pueden hacerse grampositivos al aumentar la alcalinidad. Los microorganismos de reaccin positiva a los colorantes cidos pueden hacerse gramnegativos por aumentar la alcalinidad. Los microorganismos de reaccin positiva a los colorantes bsicos pueden hacerse gramnegativos por aumentar la acidez. En la zona isoelctrica caracterstica de cada especie es muy escasa la tendencia a retener cualquier colorante. Parece estar bien demostrado que las protenas de las bacterias no son simples, sino ms bien una dbil combinacin de sustancias protenicas con otras lipoideas o grasas. La materia grasa extrada de los microorganismos grampositivos difiere de la obtenida de los microorganismos gramnegativos, en que la primera contiene una proporcin mucho mayor de cidos no saturados que muestren gran afinidad por los agentes oxidantes. Todos los mordientes (como el yodo) empleados en la coloracin Gram son oxidantes; su efecto, en general, consiste en dar a la sustancia oxidada un carcter ms cido. Esto aumenta la afinidad de un microorganismo por los colorantes bsicos.

El cambio de respuesta a la coloracin de Gram con el tiempo es propio, sobre todo, de los microorganismos dbilmente grampositivos cultivados en los medios que contengan sustancias capaces de fermentar, y cuya reaccin se vuelve cida en el curso del desarrollo.

Gianni (1952) comprob que los microorganismos grampositivos Bacillus subtilis y B. anthracis tomaban negativamente el Gram cuando los cultivos databan de dos a tres horas. Luego se desarrollaba la sustancia grampositiva debajo de la pared celular, para invertir la reaccin. Otra explicacin de la reaccin de Gram puede ser la posible existencia de una capa exterior alrededor de un ncleo gramnegativo. Libenson y Mcllroy, han comunicado que si la reaccin grampositiva depende de que se forme una combinacin compleja entre los componentes de la coloracin de Gram y las protenas de la pared celular, sera de esperar que las bacterias desintegradas por medios fsicos retuviesen este tinte, ya que ese tratamiento no podra cambiar el carcter qumico de los materiales de dicha pared. Por el contrario, los grmenes grampositivos desintegrados pierden su capacidad de retener el colorante primario y toman negativamente el Gram. La pared celular de los microorganismos grampositivos y gramnegativos es permeable al violeta cristal. Sin embargo, la de los primeros no lo es al complejo de yodo y colorante formado en el interior de la clula. Los resultados experimentales obtenidos con una difusin celular exenta de protenas, y la escasa solubilidad del complejo de yodo y violeta cristal en alcohol y acetona, parecen sustentar la opinin de que la reaccin grampositiva consiste esencialmente en la formacin, dentro de la clula, de una cantidad apreciable de complejo de yodo y colorante difcil de eliminar con el disolvente. La pared celular de los microorganismos grampositivos, a diferencia de la de los gramnegativos, sera prcticamente impermeable al violeta cristal. Los microorganismos aparecern teidos despus de tratarlos con violeta cristal, por ser absorbido el colorante en la superficie externa de la pared celular, y el disolvente eliminar sin dificultad el complejo formado despus del tratamiento con yodo. Ni los grupos sulfhidrilo ni las protenas bsicas han influido especficamente en el mecanismo del colorante de Gram. Libenson y Mcllroy han sostenido que la permeabilidad de la pared celular al violeta cristal, la escasa solubilidad del complejo de yodo y colorante en alcohol y acetona, y el libre acceso del disolvente al complejo constituido, son los principales factores que intervienen en el mecanismo de esa coloracin.

TCNICA DE LA COLORACIN GRAM

Fijar un frotis Con la ayuda de un mechero, flamear un asa bacteriolgica y esperar que enfre un poco. Tomar el asa (previamente flameada) y con sta tomar un poco de muestra. Una vez obtenida una pequea cantidad de la muestra (con el asa), hacer que sta tenga contacto con una lmina portaobjetos, la cual servir para depositar la muestra contenida en el asa. Con el asa (conteniendo la muestra) sobre la lmina portaobjetos, proceder a realizar la extensin de la muestra en el portaobjetos mediante movimientos giratorios (dar vueltas con el asa) sobre la lmina, de tal forma que al terminar la extensin, tengamos como producto una espiral en la parte media de la lmina. Esperar que seque al aire libre o ayudarse con la llama de un mechero para fijar la muestra, teniendo en cuenta que el calor no debe ser directo (slo se pasa por la llama), puesto que el calor excesivo puede cambiar la morfologa celular de las bacterias a observar. El calor deseable es aqul en el que el portaobjetos sea apenas demasiado caliente para ser colocado sobre el dorso de la mano.. Tincin

Con violeta cristal, violeta de genciana, azul de metileno o en todo caso tinta china utilizando una cantidad suficiente de dicho colorante sobre la muestra, como para lograr cubrirla por completo. Se deja actuar al colorante por 1 minuto. Esta tincin de 1 minuto est dada para trabajar a una temperatura ambiente de 25 C. Enjuague Al transcurrir el minuto, se debe enjuagar la lmina conteniendo la muestra con agua corriente. Para realizar el lavado, se debe tener en cuenta que el chorro de agua NO debe caer directamente sobre la muestra, sta debe caer sobre la parte superior de la lmina que no contiene muestra. El chorro debe ser un chorro delgado, aproximadamente de medio a un milmetro de espesor. Tambin el enjuague se debe realizar poniendo la lmina portaobjetos en posicin inclinada hacia abajo... La solucin de cristal violeta, se recomienda sea al 1% . Mordiente Una vez enjuagado el portaobjetos, se aplica como mordiente yodo o lugol durante un minuto ms. El mordiente es cualquier sustancia que forma compuestos insolubles con colorantes y determina su fijacin en las bacterias. Decoloracin (paso critico) Pasado el minuto de haber actuado el mordiente, el frotis se decolora con etanol al 75 %, etanol al 95 %, acetona o alcohol-acetona, hasta que ya no escurra ms lquido azul. Para esto se utiliza el gotero del frasco del decolorante.

Se van aadiendo cantidades suficientes del decolorante, hasta lograr que ste salga totalmente transparente, es decir, hasta que ya no escurra ms lquido azul. Lavado y secado Lavar con agua para quitar los residuos de decolorante y esperar que seque la lmina al aire libre o con la ayuda de la llama de un mechero de la forma anteriormente descrita. Tincin de contraste Una vez que la lmina ya sec, procedemos a teir nuevamente, pero esta vez se va a utilizar un colorante de contraste como por ejemplo la safranina, dejar actuar durante 1 minuto. Nuevo enjuague Pasado el minuto correspondiente, se procede a enjuagar la lmina con agua, se escurre el agua sobrante y se seca en la forma anteriormente descrita. De esta manera, ya tendremos listo el frotis para su respectiva observacin microscpica.

FUNDAMENTOS DE DIFERENCIACIN DE GRAM POSITIVO Y GRAM NEGATIVO

Los fundamentos de la tcnica se basan en las diferencias entre las paredes celulares de las bacterias Gram positivas y Gram negativas La pared celular de las bacterias Gram positivas posee una gruesa capa de peptidoglicano, adems de dos clases de cidos teicoicos: Anclado en la cara interna de la pared celular y unido a la membrana plasmtica, se encuentra el cido lipoteicoico, y ms en la superficie, el cido teicoico que est anclado solamente en el peptidoglicano (tambin conocido como murena) Por el contrario, la capa de peptidoglucano de las Gram negativas es delgada, y se encuentra unida a una segunda membrana plasmtica exterior (de composicin distinta a la interna) por medio de lipoprotenas. Tiene una capa delgada de peptidoglicano unida a una membrana exterior por lipoprotenas. La membrana exterior est hecha de protena, fosfolpido y lipopolisacrido. Por lo tanto, ambos tipos de bacterias se tien diferencialmente debido a estas direrencias constitutivas de su pared. La clave es el peptidoglicano, ya que es el material que confiere su rigidez a la pared celular bacteriana, y las Gram positivas lo poseen en mucha mayor proporcin que las Gram negativas.

La diferencia que se observa en la resistencia a la decoloracin, se debe a que la membrana externa de las Gram negativas es soluble en solventes orgnicos, como por ejemplo la mezcla de alcohol/acetona. La capa de peptidoglucano que posee es demasiado delgada como para poder retener el complejo de cristal violeta/yodo que se form previamente, y por lo tanto este complejo se escapa, perdindose la coloracin azul-violcea. Pero por el contrario, las Gram positivas, al poseer una pared celular ms resistente y con mayor proporcin de peptidoglicanos, no son susceptibles a la accin del solvente orgnico, sino que este acta deshidratando los poros cerrndolos, lo que impide que pueda escaparse el complejo cristal violeta/yodo, y manteniendo la coloracin azul-violcea.

CLASIFICACION DE LOS COLORANTES

SEGN SU ORIGEN:

NATURALES: como la hematoxilina, el carmn y la orcena. SINTETICOS O ARTIFICIALES: como el azul de metileno, la safranina, azul de anilina, el naranja G, etc..

SEGUN SUS PROPIEDADES QUMICAS La mayora de los colorantes empleados en histologa actan como cidos o bases y tienden a formar uniones salinas con radicales ionizables presentes en los tejidos.

colorantes cidos: como por ejemplo la eosina, colorante cargado en forma negativa,

se une a componentes celulares cargados positivamente. Estos componentes cargados positivamente se denominan acidfilos, porque tienen afinidad por los colorantes cidos. Por ejemplo, estos colorantes se unen a grupos aminos de las protenas. Estas protenas pueden pertenecer al citoesqueleto de la clula o hallarse en la matriz extracelular. Debido al elevado contenido de protenas del citoplasma la eosina es un excelente colorante citoplasmtico. La eosina se une tambin a las membranas plasmticas, sin embargo, se desconoce la naturaleza qumica de esta unin. Las clulas que presentan un gran desarrollo de membranas (muchas mitocondrias, mucho retculo endoplasmtico liso, etc.) son sumamente acidfilas, o sea, se tien intensamente con la eosina.

colorantes bsicos: como por ejemplo el azul de metileno, colorante cargado

positivamente, se une a componentes celulares cargados negativamente.

Estos componentes cargados negativamente se denominan basfilos, porque tienen afinidad por los colorantes bsicos. Por ejemplo, estos colorantes se unen al ncleo y ciertas regiones del citoplasma. Como caso particular, la hematoxilina no tiene carga, para teir un tejido se la une a un mordiente que junto a la hematoxilina forman una laca. La laca es bsica y por lo tanto se une a cargas negativas de la clula o matriz extracelular.

colorantes neutros: son colorantes en los que la porcin cida y la bsica colorean.

Tien las partes bsicas de una clula de un color y las partes cidas de otro. Tien el ncleo de un color y el citoplasma de otro. Ej. el eosinato de azul de metileno.

colorantes indiferentes: tien aquellas estructuras o sustancias que los disuelven ms

fcilmente que el lquido en que estn preparados. Un ejemplo es el colorante sudan, un colorante de lpidos.

LA TINCIN NEGATIVA
La tincin negativa es el reverso del procedimiento de tincin usual: las clulas se dejan sin teir, pero se colorea en cambio el medio que las rodea. Lo que se ve, por tanto, es el perfil de las clulas. La sustancia utilizada para la tincin negativa es un material opaco que no tiene afinidad por los constituyentes celulares y que simplemente rodea las clulas, tal como la tinta china (que es una suspensin de partculas de carbono coloidal) o la nigrosina (un colorante negro insoluble en agua). La tincin negativa es un modo satisfactorio de aumentar el contraste de las clulas en la microscopia ptica, pero su mxima utilidad est en revelar la presencia de cpsulas alrededor de las clulas bacterianas. Tincin negativa es una tcnica de microscopa que permite contrastar las muestras mediante una sustancia opaca a los fotones (microscopa ptica) o a los electrones (microscopa electrnica). En el primer caso, se emplea nigrosina o tinta china; para el caso de bacterias que esporulan, esta tcnica permite visualizar las esporas como entes refringentes sobre un campo de fondo oscuro.1 En caso de microscopa electrnica de transmisin, se emplean sustancias de alto nmero atmico que, por tanto, resultan opacas a los electrones transmitidos. Tpicamente, estas sustancias son acetato de uranilo, citrato de plomo o molibdato de amonio. Al electrnico, esta tcnica permite visualizar virus, flagelos, bacterias y otros entes de escaso tamao.

TINCIN DE ZIEHL-NEELSEN
La tincin de Ziehl-Neelsen (BAAR) es una tcnica de tincin diferencial rpida y econmica, usada para la identificacin de microorganismos patgenos, como M. tuberculosis o el gnero Apicomplexa (coccidios intestinales) entre otros. Fue descrita por primera vez por dos mdicos alemanes: Franz Ziehl, un bacterilogo, y Friedrich Neelsen, un patlogo.

Fundamento Las paredes celulares de ciertos parsitos y bacterias contienen cidos grasos (cidos miclicos) de cadena larga (50 a 90 tomos de carbono) que les confieren la propiedad de resistir la decoloracn con alcohol-cido, despus de la tincin con colorantes bsicos. Por esto se denominan cido-alcohol resistentes. Las micobacterias como M. tuberculosis y M. marinum y los parsitos coccdeos como Cryptosporidium se caracterizan por sus propiedades de cido-alcohol resistencia. La coloracin clsica de Ziehl-Neelsen requiere calentamiento para que el colorante atraviese la pared bacteriana que contiene ceras. Al suspender el calentamiento y enfriar con agua, provoca una nueva solidificacin de lo cidos grasos de modo que el colorante ya no puede salir de las bacterias. Por otro lado, el calentamiento aumenta la energa cintica de las molculas del colorante lo cual tambin facilita su entrada a las bacterias. Las bacterias que resisten la decoloracin son de color rojo y la que no se ven de color azul, ya que se utiliza azul de metileno como tincin de contraste Fundamento: los BAAR poseen una pared celular rica en lpidos y cidos carboxlicos (cido miclico) que tienen la propiedad de unirse excepcionalmente fuerte al colorante 1rio (fuscina de Ziehl) cuando se usa el calor como mordiente. Una vez que se forma este complejo colorante-pared, ni siquiera la accin conjunta del cido y del alcohol pueden deshacerlo, ya que las paredes retienen el colorante en forma "resistente". Tcnica: se realiza el frotis. Se aplica el colorante 1rio sobre la muestra y se deja reposar. Luego se emplea la llama de un mechero para calentar la muestra hasta la aparicin de vapores blancos. El calor se emplea como mordiente, gracias al calor los lpidos de la pared dejan pasar el colorante para que se combine con los cidos carboxlicos de la pared, as se forma el complejo colorante-pared. Se deja reposar y se lava con agua. Las bacterias que no han formado el complejo en su pared (no BAAR) no retendrn el colorante, el exceso del mismo ser arrastrado por el agua. Se aplica el colorante 2rio, se deja reposar y se lava con agua. Coloracin en caliente (Tcnica de Ziehl-Neelsen): emplea el calor como mordiente para formar el complejo colorante-pared.

Es la tcnica recin descrita. La principal desventaja consiste en que se puede llevar a cabo una decoloracin en caliente (tiempo prolongado). Esta consiste en aplicar el decolorante cido-alcohol y luego calentar la muestra, la capa lipdica se ablanda y el decolorante puede atravesar la pared celular retirando el decolorante 1rio y revirtiendo el proceso de formacin del complejo colorante-pared. Por esto se dice que la coloracin en caliente no brinda resultados diferenciales. Coloracin en fro (Tcnica de Kinyoun): utiliza un reactivo especial que adems de fuscina agrega una [Fenol]. El fenol disuelve los lpidos de las paredes celulares permitiendo que el colorante 1rio entre el contacto con los cidos carboxlicos y forme el complejo cido-alcohol resistente. Esta tcnica permite obtener resultados diferenciales ya que no es posible la decoloracin en caliente. MOVIMIENTO BROWNIANO El movimiento browniano es el movimiento aleatorio que se observa en algunas partculas microscpicas que se hallan en un medio fluido (por ejemplo, polen en una gota de agua). Recibe su nombre en honor al escocs Robert Brown, bilogo y botnico que descubri este fenmeno en 1827 y observ que pequeas partculas de polen se desplazaban en movimientos aleatorios sin razn aparente. En 1785, el mismo fenmeno haba sido descrito por Jan Ingenhousz sobre partculas de carbn en alcohol. El movimiento estocstico de estas partculas se debe a que su superficie es bombardeada incesantemente por las molculas (tomos) del fluido sometidas a una agitacin trmica. Este bombardeo a escala atmica no es siempre completamente uniforme y sufre variaciones estadsticas importantes. As, la presin ejercida sobre los lados puede variar ligeramente con el tiempo, y as se genera el movimiento observado. Tanto la difusin como la smosis se basan en el movimiento browniano. Se denomina movimiento browniano al movimiento aleatorio que experimentan pequeas partculas visibles que flotan en agua (por ejemplo, los granos de polen). En esta experiencia vamos a intentar observar el movimiento browniano. Una buena forma de observarlo es, en una habitacin oscura, fijndose en un rayo de sol que entra por una rendija. Si no hay corrientes de aire, podremos ver los pequeos granos de polvo iluminados por el rayo de sol movindose aleatoriamente. El problema es que puede confundirse el movimiento browniano con el causado por las pequeas corrientes de conveccin que hay en toda habitacin.

Otra forma de hacerlo es intentando reproducir, en cierta forma, el experimento de Browm. MOTILIDAD Las clulas poseen motilidad.Celulas con movimento vibratil

Para otros usos de este trmino, vase Motilidad (desambiguacin).

La motilidad es un trmino de la biologa para expresar la habilidad de moverse espontnea e independientemente. Est referida tanto a organismos unicelulares como multicelulares. Tambin es un trmino comn para referirse genricamente a la motilidad gastrointestinal. 1) La movilidad se manifiesta por el desplazamiento de los microorganismos a grandes distancias y en una direccin determinada, aunque a veces pueden apreciarse rotaciones o giros. 2) Los desplazamientos cortos y sin sentido se deben al movimiento browniano. 1* Flagelo- proveen motilidad verdadera (desplazamiento mediante estructuras especializadas) que les permite llegar a lugares nuevos para adquirir nuevos recursos (nutrientes). El movimiento del flagelo es aproximadamente 50-60 veces el largo de la bacteria/seg. Este movimiento ocurre por rotacin del flagelo, como si fuera una hlice. 2* Movimiento Browniano que es la constante vibracin de las bacterias en un punto fijo comportamiento que se presenta por estar suspendidas en medio lquido y por su pequeo tamao.