Tecnologas agroecolgicas para la agricultura familiar

PRODUCCION ARTESANAL DE TRICHODERMA

Nancy Sivila y Susana Alvarez Jujuy. 2013

Produccin artesanal de Trichoderma.

Tecnologas agroecolgicas para la agricultura familiar.

Sivila Nancy y Alvarez Susana

Jujuy-Argentina 2013

Alvarez, Susana Edith Produccion artesanal de trichoderma / Susana Edith Alvarez y Nancy Sivila. - 1a ed. - San Salvador de Jujuy: Universidad Nacional de Jujuy. Universitaria de Jujuy. Facultad de Ciencias Agrarias, 2013. E-Book.

ISBN 978-950-721-443-1

1. Agricultura Familiar. I. Sivila, Nancy II. Ttulo CDD 630

1 2

Alumna becaria CIN 2012-2013 Directora de beca CIN

Experiencias realizadas en el marco del proyecto SECTER Cod. 08/A129 y del Proyecto de experimentacin adaptativa para la agricultura familiar. Financiado por el MAGP, Subsecretaria de Agricultura Familiar: Investigacin adaptativa con la cooperativa Prosol de agricultores familiares de la Quebrada de Humahuaca, para la obtencin de sopas de hortalizas y cereales andinos; a partir de tecnologa agroecolgica y agregado de valor en forma semiartesanal.

ndice
Pag Presentacin . SECCION 1: Introduccin... Control Biolgico de Enfermedades. Microorganismos Antagonistas. Caractersticas de Trichoderma. Mecanismos de Accin SECCION 2: Produccin de Trichoderma Etapas en el Proceso de Produccin de Trichoderma Control de Calidad de Trichoderma. Bibliografa.. 25 27 36 45 13 14 17 18 20 10

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resentacin

No hay duda de que la humanidad necesita de un paradigma alternativo de desarrollo agrcola, donde se fomente una agricultura biodiversa, resiliente, sostenible y socialmente justa. La base de estos nuevos sistemas son los distintos estilos agrcolas ecolgicos desarrollados por agricultores familiares de distintas partes del mundo. Sistemas que usualmente son intensivos en conocimientos ancestrales, pero que no siempre resultan eficaces o aplicables. La agroecologa como nuevo paradigma viene a revitalizar stos saberes, a validarlos, adaptarlos y/o incrementarlos cientficamente. Reconociendo que para lograrlo se requiere de un acompaamiento de medidas polticas en donde los agricultores puedan acceder a recursos fundamentales como la tierra, semilla, agua, crdito, y la posibilidad de optimizar el funcionamiento de sus parcelas mediante tecnologas agroecolgicas apropiadas. En ste sentido la presente publicacin propone el desarrollo de una tecnologa que con una capacitacin simple en ciertas destrezas, puede ser autogenerada por el propio agricultor, tecnologa probada cientficamente para el manejo de enfermedades de origen fngico de muchos cultivos, con potencialidades promotoras de crecimiento en las plantas; un preparado artesanal de un agente de control biolgico (Trichoderma spp) como insumo alternativo a los fungicidas qumicos. Sabiendo que su uso o aplicacin no se refiere simplemente a una sustitucin de insumo (sustituir fungicida qumico por fungicida biolgico) sino que implica la promocin en nuestras parcelas de una serie de procesos que de forma integral impactaran en la sanidad, rendimiento, calidad, etc. El documento se divide en dos secciones, la primera que tiene entre sus objetivos exponer de forma simple las bases en las que se sustenta la tecnologa propuesta y una segunda seccin donde se describe la forma de produccin de Trichoderma, basado en experiencias locales compartidas muchas veces con agricultores familiares de la regin.

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Esperando que ste aporte pueda ser til a estudiantes y tcnicos extensionistas, pero por sobre todo a los agricultores con quien compartimos saberes y la ideologa de una agricultura basada en la vida, que sea una granito de arena ms para incrementar la soberana tecnolgica, que junto a la soberana alimentaria y energtica representan los objetivos fundamentales de la agroecologa.

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Seccin I

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ntroduccin

En la agricultura convencional moderna producto de la revolucin verde, los fungicidas son la principal herramienta empleada para el control de hongos fitopatgenos. Dichos pesticidas son sustancias qumicas que producen innumerables efectos indeseados sobre el ecosistema, induciendo a la generacin de microorganismos resistentes o pestes, persistencia ambiental de residuos txicos, contaminacin de suelos y recursos hdricos, lo cual altera el equilibrio ecolgico. Una de las alternativas ms promisorias para disminuir el impacto ambiental causado por el frecuente uso de productos qumicos para el control de plagas y enfermedades de plantas se centra en la utilizacin de agentes de control biolgico. Dentro de estos agentes se destacan los hongos del gnero Trichoderma. Las especies del gnero Trichoderma son los antagonistas ms utilizados a nivel mundial debido a su ubicuidad, a su facilidad para ser aisladas y cultivadas, a su crecimiento rpido en un gran nmero de sustratos y a que no son patgenas de plantas. Trichoderma puede estar en la rizsfera, colonizar y proteger las races de las plantas, o mediante aplicaciones foliares prevenir enfermedades del folaje en un amplio rango de cultivos. La multiplicacin de Trichoderma, se puede realizar en forma artesanal o industrial, implementando distintas tcnicas de fermentacin lquida y/o slida. Entre los sustratos naturales para la produccin de stos hongos antagonistas se encuentran granos de trigo, avena, cebada, centeno, arroz, maz, soya, cabecilla de arroz y salvado de trigo, inclusive desechos de los propios sistemas productivos como paja. Las experiencias de produccin artesanal de Trichoderma en distintos pases, se han basado en el uso del arroz como sustrato; el presente manual tiene como objetivo transmitir las experiencias en la produccin artesanal de trichoderma sobre sustratos alternativos al arroz, tales como el trigo, avena y los pseudocereales quinoa y amaranto. Utilizando como contenedores botellas de vidrios y/o bolsas de polietileno, insumos econmicos y fciles de adquirir.
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ontrol Biolgico de Enfermedades

Baker y Cook (1974) definen el control biolgico como la reduccin de la densidad de inculo o de las actividades productoras de enfermedad de un patgeno o parsito, en su estado activo o durmiente, mediante uno o ms organismos, lograda de manera natural o a travs de la manipulacin del ambiente, del husped o del antagonista, o por la introduccin masiva de uno o ms antagonistas. Por su parte, el agente biocontrolador se define como el microorganismo (hongo o bacteria) con capacidad de limitar o evitar de manera ms o menos selectiva el crecimiento de un hongo patgeno, sin interferir en el crecimiento de la planta. Hongos del genero Trichoderma estn entre los ms promisorios agentes de biocontrol por sus propiedades antagnicas frente a los hongos patognicos de plantas, sobre todo porque ellos pueden estar en la rizsfera y colonizar y proteger las races de las plantas, como tambin colonizar flores, semillas y/o hojas reduciendo daos de enfermedades en un amplio rango de cultivos. Trichoderma puede afectar distintas estructuras de los hongos patgenos: conidios, esclerocios, hifas. Otra de las ventajas es la amplia gama de hongos patognicos que puede controlar, entre los que se encuentran hongos de suelo que causan enfermedades radiculares y/o vasculares, y hongos que producen manchas foliares, mildius o tizones. Se presenta a continuacin un cuadro sinptico con las caractersticas del control biolgico y un cuadro que resume las ventajas y/o inconvenientes a superar en un proceso de transicin, de una agricultura industrial hacia una horticultura agroecolgica.

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Objetivo Principal

Reducir las enfermedades y plagas de las plantas. Reducir el inoculo del patgeno, a travs de medidas que impliquen una supervivencia del mismo ms restringida entre las cosechas, una menor produccin o liberacin de propgalos

Objetivos Particulares

viables y una menor difusin de los mismos. Reducir la infeccin del hospedador por el patgeno. Reducir la severidad del ataque por el patgeno.

Control biolgico

No elimina la enfermedad. Mantiene al patgeno dentro del equilibrio natural. Promoviendo procesos diversos en el agroecosistema. Cada relacin planta-patgeno-antagonista es absolutamente nica. Si se realiza adecuadamente, no tiene efectos Caractersticas colaterales. Los agentes de control biolgico (ACBs) se seleccionan en sistemas autoequilibrados y con alta especificidad respecto al hospedador.

Es econmico e inocuo para la vida en general.

Se ajusta a diferentes tipos de agricultura. Un ACB puede desplegar ms de un mecanismo de control cuya importancia relativa depende de las condiciones ambientales existentes.
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Ventajas del Control Biolgico (CB) El CB es muy barato y puede autoperpetuarse. El CB tiene efectos suaves sobre el equilibrio edfico y no elimina los organismos que ayudan a tener al patgeno controlado. No tiene efectos dainos para el hombre, otros cultivos, rboles, animales, vida silvestre y otros organismos beneficiosos. No se han descripto resistencias a los ACBs. El CB resulta seguro. Los ACBs no se acumulan en la cadena alimentaria El CB es efectivo en ambientes naturales y artificiales.

Inconvenientes a superar El ACB uiversal no existe. No hay una conciencia generalizada del consumo de productos libres de residuos de agroqumicos. Aspecto ste importante en la adopcin de alternativas biolgicas entre otras. Suficiente formacin a tcnicos y/o extensionistas rurales en manejo agroecolgico en general y de CB en particular.

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otros, 2006).

icroorganismos Antagonistas

Entre los microorganismos antagonistas ms estudiados y/o desarrollados comercialmente se encuentran las bacterias de los gneros, Pseudomonas y Bacillus y hongos de los gneros Gliocladium y Trichoderma. El gnero Trichoderma tiene cinco especies consideradas como antagonistas: Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma pseudokoningii y Trichoderma viride (Garca y En general, los antagonistas no tienen un nico modo de accin y la multiplicidad de stos es una caracterstica importante para su seleccin como agentes de control biolgico. Si el antagonista posee varios modos de accin reduce los riesgos de desarrollo de resistencia en el patgeno. Este riesgo de resistencia tambin se reduce mediante el uso de combinaciones de antagonistas con diferente modo de accin.

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aractersticas de

Trichoderma spp.

El gnero Trichoderma fue identificado en 1871 y ha sido ampliamente estudiado, se encuentra de manera natural en un nmero importante de suelos agrcolas. Lo podemos encontrar en diferentes zonas y hbitats, especialmente donde existe materia orgnica o desechos vegetales en descomposicin, as como en residuos de cultivos. Su desarrollo se ve favorecido por la presencia de altas densidades de races, las cuales coloniza rpidamente. Esta capacidad de adaptacin a diversas condiciones ambientales y sustratos confiere a Trichoderma la posibilidad de ser utilizado en diferentes suelos, cultivos, climas y procesos tecnolgicos para su multiplicacin. Trichoderma es un hongo anaerobio facultativo. La mayora de las colonias de Trichoderma en su inicio tienen color blanco, despus se torna a verde oscuro o amarillento, como consecuencia de una densa esporulacin. Trichoderma, produce tres tipos de propgalos: hifas, clamidosporas y esporas conidias. Las esporas son los ms viables de los propgulos empleados en programas de biocontrol. Estos cuerpos especializados se caracterizan por poseer una gruesa pared exterior, constituida por tres capas (endospora, epispora y perispora) que protegen el interior del conidio (protoplasto). Esta gruesa pared se diferencia de la pared celular de las clulas vegetativas del hongo (hifas y clamidosporas), las cuales son mucho ms delgadas y no est formada por capas constitutivas como las esporas. La ventaja del conidio de poseer una pared celular gruesa es la posibilidad de aislarlo de su medio natural y que sobreviva a condiciones adversas, mantenindolo en dormancia hasta que las condiciones sean propicias para la germinacin. En consecuencia, las conidias son verdaderas semillas que utiliza el hongo para colonizar nuevos sustratos y, en el caso de Trichoderma, es la principal producto a obtener en la produccin comercial y/o artesanal.

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Imagen al microscopio ptico de Trichoderma spp.

Las necesidades nutricionales de Trichoderma son bien conocidas, es capaz de degradar sustratos muy complejos como almidn, pectina y celulosa entre otros, y emplearlos para su crecimiento gracias al gran complejo enzimtico que posee (enzimas hidrolticas como amilasas, pectinasas, celulasas y quitinasas entre otras). As mismo, Trichoderma asimila como fuente de nitrgeno compuestos tales como aminocidos, urea, nitritos, amoniaco y sulfato de amonio (Agamez Ramos y otros, 2008). Trichoderma es un hongo con una alta capacidad de tolerar un amplio rango de temperaturas, presentando una amplia distribucin ecolgica. Los valores ptimos para su crecimiento y esporulacin oscilan alrededor de los 25C. Un factor importante a tener en cuenta durante la multiplicacin es la conveniencia de periodos alternados de luz y oscuridad, que favorecen la colonizacin del hongo sobre diferentes sustratos slidos.

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1.

ecanismos de Accin

Trichoderma presenta distintos mecanismos de accin para ejercer su antagonismo, dependiendo de las caractersticas de la cepa de trichoderma, del patgeno y las condiciones ambientales: Micoparasitismo

Este proceso incluira el crecimiento del antagonista hacia el patgeno, desarrollndose alrededor de ste o formando estructuras similares a ganchos o apresorios en la superficie del hospedero, que le permitiran, penetrar al interior (del patgeno) y por accin de enzimas lticas (quitinasa y -1,3 glucanasa) degradar su pared celular.

Algunas cepas de Trichoderma tienen este comportamiento frente a hongos del suelo causantes del damping-off o mal de los almcigos. Localmente se ha comprobado este modo de accin en ensayos realizados con ciertas cepas de Trichoderma frentes a Rizoctonia (Abdo y otros, 2008).

Imgen al microscopio ptico (x40) de hifas de Rhizoctonia solani con enrollamiento a modo de lazo por Trichoderma spp.

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2. Competencia Se puede definir competencia como el desigual comportamiento de dos o ms organismos ante un mismo requerimiento, siempre y cuando la utilizacin del mismo por uno de los organismos reduzca la cantidad disponible para los dems. Un factor esencial para que exista competencia es que haya "escasez" de un elemento, si hay exceso no hay competencia. La competencia ms comn es por nutrientes, oxgeno o espacio.

Materia orgnica en plantas (estircol verde, compost) en suelo regula muchos patgenos como Pythium y Rhizoctonia por medio de saprofitos fuertemente competitivos presentes en los sustratos como Trichoderma spp.

3.

Antibiosis

Se refiere a la produccin por parte de un microorganismo de sustancias txicas para los microorganismos patgenos, las cuales actan en bajas concentraciones (menores a 10 ppm.). Estos metabolitos voltiles y no voltiles, son del tipo antibitico como: viridn, trichodermin, glioviridin, gliotoxin y harzaniolide. De todas estas micotoxinas la ms representativa es Trichodermin que actuara inhibiendo la actividad ribosomal de los patgenos, por lo tanto su reproduccin (Ghisalberti y Sivasithamparam, 1991).

En el CEDAF (Centro de Estudios para el desarrollo de la Agricultura Familiar) se pudo comprobar el efecto de metabolitos txicos voltiles y no voltiles sobre el crecimiento y reproduccin de diversos hongos de suelo, tales como Phytophthora spp, Fusarium, Sclerotium, Sclerotinia, Rhizoctonia a partir de cepas locales de Trichoderma.

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Otros beneficios que cepas de trichoderma puede inducir en las plantas: Conjuntamente a la accin supresora de patgenos, numerosos estudios sealan a Trichoderma, como promotor o estimulador del crecimiento de plantas. Inbar y otros (1994) han documentado que la aplicacin de trichoderma a plantas promueve incremento de tamao, aumento del rea foliar y peso, el efecto positivo sobre la germinacin de las semillas con un pretratamiento con el microorganismo. El grado de potenciacin del crecimiento depende de la especie y cepa de Trichoderma utilizada. La induccin de mecanismos de resistencia se refiere al incremento en la resistencia de una planta hacia los patgenos, despus de que la planta ha estado expuesta o tratada con ciertos microorganismos o qumicos que pueden inducirlo an cuando ste ya no se encuentre presente. En los aos 90, se ha descripto la capacidad de cepas de Trichoderma como agentes responsables de la sntesis de sustancias causantes de induccin de resistencia en plantas. Pudiendo colonizar y penetrar los tejidos de las races de las plantas, e inician una serie de cambios morfolgicos y bioqumicos en las plantas, lo cual conlleva a la resistencia sistmica inducida de la planta (Garca y otros, 2006).

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Ayuda a descomponer materia orgnica, haciendo que los nutrientes se conviertan en formas disponibles para la planta, por lo tanto tiene efecto indirecto en la nutricin del cultivo. Puede ser aplicado en compostaje o materia orgnica en descomposicin para acelerar el proceso de maduracin de stos materiales, los cuales a su vez contendrn altas cantidades de microorganismos benficos, cumpliendo tambin funcin de biofungicida. Trichoderma estimula el crecimiento de los cultivos porque posee metabolitos que promueven los procesos de desarrollo en las plantas. Preservacin del medio ambiente al disminuir el uso de fungicidas qumicos. Favorece la proliferacin de organismos benficos en el suelo, como otros hongos antagnicos.

Ventajas en la aplicacin de Trichoderma para el control de Enfermedades

Se propaga en el suelo, aumentando sus poblaciones y ejerciendo control duradero en el tiempo sobre hongos fitopatgenos. Amplio rango de accin.

Control eficaz de enfermedades de plantas. No necesita periodo de carencia vinculado a la seguridad para la recoleccin de la cosecha. Mejora los costos de produccin del cultivo y genera independencia tecnolgica al poder ser producido por cada agricultor u organizacin de AF.

Regula patgenos de la raz (Phytium, Fusarium, Rhizoctonia, Phytophtora) y del follaje (Botritis y Mildew) antes que puedan generar daos significativos.

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S eccin II

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P
son: 2-Cultivos

roduccin de Trichoderma
partir de procesos de fermentacin artesanal emplea principalmente el arroz lquidos agitados o como: como trigo, sustrato. avena, Otras cebada, experiencias citan a otros cereales centeno, maz o granos de soya, cabecilla de arroz y salvado de trigo. Los formulados pueden realizarse en frascos o en bolsas de polietileno.

Las 4 formas principales de produccin de hongos antagonistas 1-Cultivos bifsicos. fermentaciones lquidas. 3-Cultivos lquidos estticos. 4-Cultivos sobre soporte slido. stos ltimos representan formas de produccin artesanal, que requiere equipamiento simple, de fcil acceso para los agricultores familiares, pero con una mayor demanda de operaciones manuales. La calidad de stos formulados suele ser ptima, obtenindose conidios estructuras y niveles variar infectivas de esta

Cultivos en Botellas Ventajas: Mejor control de la contaminacin y de la calidad del formulado. Durante el proceso de esterilizacin del sustrato, ste se compacta mucho menos que en las bolsas, lo que mejora las condiciones para la multiplicacin de Trichoderma. Desventaja: No siempre se dispone de botellas con un dimetro de abertura que facilite la incorporacin del sustrato y el vaciamiento de los mismos, una ves colonizado.
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con altos porcentajes de viabilidad esporulacin, ltima, que del caracterstica puede

dependiendo

sustrato utilizado. Las hifas son poco resistentes al secado, por lo se busca en la multiplicacin artesanal generar las condiciones necesarias para la produccin de conidios. En Colombia, la produccin de biopreparados de Trichoderma a
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Cultivos en bolsas Ventajas: Ocupa menor espacio en el autoclave u ollas durante la esterilizacin del sustrato, en la estufa y/o estantes durante la incubacin. Mayor volumen de produccin en un solo lote, con el consiguiente ahorro de energa elctrica y humana. Posibilidad de remover el contenido de la bolsa cada cierto tiempo. Envase ms econmico y/o fcil de conseguir. Manipulacin ms sencilla en el momento de utilizar. Mayor riesgo de contaminacin. Manipulacin muy cuidadosa ya que es muy fcil la ruptura de los envases y la prdida del contenido.

Desventaja

Cultivo bolsas.

de

Trichoderma

en

Multiplicacin de Trichoderma en botellas.

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El siguiente diagrama presenta las etapas durante el proceso de produccin artesanal de hongos.
Eleccin del sustrato
Por ejemplo: arroz, trigo, avena, cebada, maz, quinoa, amaranto, etc.

tapas en el proceso de produccin de Trichoderma spp.

Pre-coccin.

Preparacin y acondicionamiento del sustrato

Pesaje del sustrato.

Llenado de botellas o bolsas. Esterilizacin del sustrato.

Inoculacin sobre los sustratos

Incubacin
Listo para su aplicacin a campo.

Temperatura 25-27C Fotoperiodo de doce horas 10 a 15 das

Secado

Paso adicional para evitar la prdida de calidad del formulado, cuando no se usar dentro de los 30 das de producido.

Envasado

Sellado al vaco.

Almacenamiento

En un ambiente oscuro y frenco (temperatura media de 10C.)

El CEDAF dispone de cepas locales de Trichoderma, disponibles en forma gratuita para organizaciones de agricultores familiares.

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Etapas en el proceso de produccin de Trichoderma. Se describen a continuacin las etapas a seguir durante el proceso de produccin artesanal de Trichoderma: Etapa 1 Se debe realizar la eleccin del propios sustrato, agricultores resultando realicen la conveniente en caso de que los produccin, un anlisis de posibles sustratos que no incremente los costos. Experiencias locales han demostrado la excelente calidad de la produccin de Trichoderma utilizando sustratos alternativos al arroz. Cereales como el trigo, la avena y el maz, y pseudocereales como la quinoa y el amaranto, permiten por sus propiedades nutritivas (contenidos de protenas, aminocidos, hidratos de carbono, grasas, minerales etc.) ser utilizados como sustratos. Los agricultores familiares de cada localidad o regin contarn, entonces, con una diversidad de opciones de potenciales sustratos a utilizar para la produccin del hongo antagonista.

Arroz, quinoa, amaranto, avena y trigo

Desechos o descartes de producciones realizados por los propios agricultores pueden probarse como sustratos alternativos para la produccin de Trichoderma.

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Etapa 2 El acondicionamiento del utiliza arroz pelado, quinoa o sustrato, en el caso de emplearse granos, puede variar en relacin al tiempo de pre-coccin o hervor inicial, que estar en funcin de las caractersticas del grano (tamao, grano refinado o pelado, integral, etc.) 1-Colocar sobre fuego una olla con agua. Al alcanzar el punto de ebullicin agregar el sustrato y controlar el tiempo de hervor. Si se amaranto se requiere de solo 5 minutos, mientras que si se trata de trigo o avena integral necesitaremos 40 minutos. 2-Cumplido el tiempo, escurrir el sustrato inmediatamente y colocarlo en bandejas o sobre una superficie plana, dejando que oree, de forma que los granos queden sueltos.

Preparacin del sustrato

El tiempo de pre coccin debe ser suficiente como para ablandar el tegumento de los granos y obtener una ptima hidratacin de los mismos. Se debe tener en cuenta que la fermentacin slida es un proceso que involucra slidos en
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ausencia parcial o total de agua libre; sin embargo, el sustrato debe tener la humedad suficiente para permitir cabo el todos crecimiento sus del microorganismo y que se lleven a procesos metablicos. Una baja humedad puede inhibir el desarrollo del
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microorganismo al no poner la suficiente cantidad de nutrientes en solucin para ser usado por ste, adems de la poca resistencia a la desecacin que tienen los hongos en el periodo activo de crecimiento micelial, as tambin, Etapa 3 Cuando se trabaja en forma artesanal, envases dispone o de no se aconseja el acondicionamiento del sustrato en volmenes un una grandes, no debido a que usualmente no se autoclave, logrndose esterilizacin

un exceso de humedad provoca baja disponibilidad de oxigeno y por ende pobre desarrollo del microorganismo, adems de que el sustrato se compacta impidiendo la colonizacin total del mismo.

jabn o detergente, luego se las sumerge en agua con lavandina y finalmente se enjuagan nuevamente con agua. En botellas de vidrio de estas caractersticas se coloca 100 gramos de sustrato pre cocido y 50 gramos en el caso de utilizarse bolsas pequeas. Cuando se utilizan botellas se cubre la boca de la misma, confeccionando un tapn de algodn y un capuchn de papel de diario el cual queda asegurado a la botella por medio de un pioln. De tratarse de bolsas de polietileno estas son cerradas con una termo selladora o con cinta de pegar. La esterilizacin del material se puede realizar en olla a presin, en una olla a bao o de de Mara (30-40 de minutos) 120C. disponerse

eficiente a bao de Mara. Se debe prestar especial cuidado durante la etapa de esterilizacin, de manera de asegurar que el sustrato que usaremos para la multiplicacin de Trichoderma quede completamente libre de se otro tipo de no microorganismos, de no ser as, la produccin campo. Durante sta etapa, se pueden utilizar botellas de vidrio de 500 mililitros (que tengan una abertura de al menos 3 centmetros de dimetro) o bolsas de polietileno. Las botellas deben lavarse con contaminar resultando apta para su uso a

autoclave, durante 10 minutos a

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Procedimiento de envasado y esterilizacin: en laboratorio y/o casera Pesaje del sustrato Lavado y desinfeccin de botellas o bolsas Llenado de botellas o bolsas Esterilizacin en autoclave Esterilizacin a bao Mara

Etapa 4 Esta etapa no es ms que la siembra del hongo antagonista o sea de Trichoderma, en el sustrato ya esterilizado. Junto a la etapa anterior, representa los momentos del proceso de produccin, en que se debe prestar especial cuidado, a modo de asegurar la calidad del producto final. Para la inoculacin de Trichoderma en los sustratos, se requiere de un cultivo puro del hongo, (Centro Desarrollo insumo de de que la el CEDAF el Estudios para

Agricultura

Familiar) puede facilitar de forma gratuita a organizaciones de AF.

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Cada botella o bolsa con el sustrato esterilizado, se inocula con una seccin de 1cm2 del medio de cultivo colonizado por el hongo, teniendo la precaucin de realizarlo en un lugar donde no haya corriente de aire (para evitar la contaminacin), cerca de un
Cultivo puro de Trichoderma spp.

mechero

sobre

una

mesada con

previamente

desinfectada

alcohol o lavandina. El xito del biocontrol depende en gran parte de la capacidad de los antagonistas de proliferar bajo condiciones del ambiente, por esta razn el uso de cepas nativas con accin fngica en biocontrol puede ser ventajoso comparado con formulados comerciales.

En la provincia de Jujuy el CEDAF selecciona continuamente cepas locales de Trichoderma de diferentes ambientes, con diferentes modos de accin.
Inoculacin o siembra de Trichoderma en bolsas con el sustrato esteril Mesada desinfectada Cultivo puro Mechero

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Etapa 5 Las botellas y bolsas con el sustrato inoculado se colocan en una estufa a 25-27C durante diez das con un fotoperiodo de doce horas, cada dos das se agitan a fin de facilitar la colonizacin homognea del sustrato.

Acondicionamiento de botellas y bolsas en una estufa de cultivo. Sustratos colonizados por Trichoderma en bolsas y botellas, luego del periodo de incubacin.

De no contar con una estufa de cultivo, las botellas o bolsas se pueden acondicionar en estantes o armarios limpios, donde no haya tierra y estn protegidos del sol. Al cabo de dos semanas el sustrato se cubrir totalmente del hongo, con el las que estructuras

prever

su

uso

dentro se

de

las

siguientes heladera o

semanas

puede en un

conservarse en la parte baja de una mantener ambiente fresco. De necesitar conservarlo por ms tiempo, se aconseja realizar los pasos que del la se describen a continuacin, para calidad implican garantizar la que del

tomar distintos tonos de verde o amarillo dependiendo de la especie o cepa de Trichoderma. En ese momento el producto ya est listo para su uso o aplicacin. En caso de

formulado, deshidratacin

sustrato y envasado al vaco.

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Arroz

Quinoa a

Amaranto

Avena

Observacin bajo una lupa de distintos sustratos colonizados por Trichoderma

Etapa 6 Con la superficie del sustrato cubierta por la biomasa conidial de Trichoderma, se pasa al proceso de secado para que los conidios permanezcan viables por mayor tiempo durante el almacenamiento. Se vuelca el contenidos de las botellas y/o bolsas en (sustrato bandejas colonizado) ambiente con un extractor de aire, aire acondicionado, etc., lo que depender de las posibilidades locales. Diariamente se pesa el sustrato colonizado hasta verificar peso secado constante. puede El ser perodo variable de en

funcin del acondicionamiento del ambiente de secado.

acondicionndolas en una cmara o

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Sustrato colocado en bandejas durante el proceso de secado.

Etapa 7

El

sustrato

colonizado

deshidratado se coloca en bolsas de polietileno, sellndose al vaco.

Termo selladora domstica

Etapa 8 El producto final puede ser almacenado por un periodo de hasta 10 meses en oscuridad a temperatura media de 10C, perodo en el que se conserva la calidad del preparado. . Las temperaturas bajas son ms favorables en para condiciones mantener de niveles de viabilidad adecuados almacenamiento.

Producto acondicionado para un almacenamiento prolongado .

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C
biolgico, aseguren

ontrol de Calidad de

Trichoderma spp.
Se trata de pruebas para debe de que el el calidad, control garantizar que formulado microbiolgicas que requieren de instrumental de laboratorio y de un tcnico capacitado, la Facultad de Ciencias brinda Agrarias ste de la UNJu, a servicio

La produccin artesanal de organismos parmetros

mantiene las propiedades biolgicas y as posibilite cumplir con el objetivo pretendido con su aplicacin a campo. El control de calidad del producto final es el punto ms importante que garantiza el funcionamiento de ste y su aceptacin a largo plazo. Si el producto tiene una viabilidad alta al igual que una adecuada Las pruebas recomendadas virulencia, se para maximiza la la que se realizan verificar probabilidad de que son: acte bien calidad del preparado en el campo.

organizaciones de AF sin costo. Se describe a continuacin las pruebas de calidad realizadas rutinariamente en el control de los formulados artesanales: A. B. C. D. Determinacin del

grado de antagonismo. Determinacin de la Determinacin de la Determinacin de produccin de conidios viabilidad de los conidios. contaminantes (Pureza).

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A. Determinacin del grado de antagonismo En general se trata de pruebas de laboratorio que se implican entre 4 a 10 das, que permiten inferir para una especie de hongo patgeno particular, los posibles mecanismos de accin que ejerce Trichoderma en condiciones de laboratorio. Para determinar el grado de antagonismo de las cepas de Trichoderma, frente a un patgeno o grupos de patgenos de plantas, se pueden realizar tres tipos de pruebas: Cultivos duales Permite inferir la capacidad competitiva de Trichoderma frente al hongo patgeno. La competencia ms comn es por espacio y nutrientes. Se requiere un cultivo puro del organismo fitopatgeno y uno del organismo antagonista (Ej.Trichoderma), en ambos casos se extrae una seccin de colonia de aproximadamente 2mm2, los que se colocan en los extremos opuestos de una caja de Petri con medio de cultivo Agar papa glucosado al 2% (APG 2%) separados uno del otro 3 cm. Luego de un periodo de incubacin de 24 a 72 horas a 25C, se evala el efecto antagnico mediante el porcentaje de inhibicin del crecimiento radial del patgeno (%I), aplicando la siguiente ecuacin de Royse and Ries. 1. Cultivos duales, con el que determina la por mtodo para de capacidad espacio placas verificar competitiva 2. El superpuestas, (MV). 3. El Celofn, produccin mtodo para de del papel la verificar

principalmente (CD).

produccin de metabolitos voltiles

metabolitos

difusibles al medio (MDM).

%I=100 x [(r1-r2)/r1] r1= crecimiento radial del patgeno r2= crecimiento radial del patgeno, en orientacin directa al crecimiento del antagonista. (Ver imgenes)
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Trichoderma spp.

Fusarium sp.

Cultivo Dual

Trichoderma spp.

r2 r1

Fusarium sp. Evaluacin del cultivo dual: Izq.: Cultivo visto de arriba, Der.: Envs de la caja de cultivo. Observe caractersticas de medicin de r1 y r2.

Mtodo de placas superpuestas: Su objetivo es verificar la produccin voltiles microorganismos. Se requiere al igual que en la prueba anterior cultivos puros del hongo patgeno y del antagonista o Trichoderma. Se siembra cada hongo tranfiriendo una seccin de 2mm2 en el centro de una caja de petri con medio APG 2%, luego se substituye las respectivas tapas de
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las cajas de Petri por un disco de papel celofn estril, uniendo ambas bases con cinta adhesiva. Paralelamente se siembra en otra caja de Petri con APG 2% el hongo fitopatgeno quien cumplir la funcin de testigo sin antagonista. Las cajas as acondicionadas se colocan en una estufa de cultivo durante 5-7 das, momento en que se mide el crecimiento radial del hongo fitopatgeno enfrentado a Trichoderma y del testigo.
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por para

parte

de otros

Trichoderma de sustancias txicas

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La diferencia de crecimiento de la colonia del patgeno, estar en funcin de la produccin de metabolitos voltiles que difunden desde la colonia de Trichoderma, hacia la colonia del patgeno. Se

aplica la ecuacin de Royse and Ries, donde r1 representa y r2 el el crecimiento radial de la colonia del patgeno testigo crecimiento radial de la colonia del patgeno frente a Trichoderma.

Trichoderma spp.

Fusarium sp.

Placas superpuestas

Mtodo de Placas Superpuestas

Prueba de antagonismo por el mtodo de placas superpuestas: observar el tamao de las colonias de Fusarium spp. Izq.: colonia testigo. Der.: colonia enfrentada al cultivo de Trichoderma.

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Mtodo del Papel Celofn Esta prueba se realiza para determinar si Trichoderma produce sustancias txicas que difunden al medio de cultivo, afectando el crecimiento fitopatgenos. Consiste en colocar un disco de papel celofan estril cubriendo la superficie del medio de cultivo (APG 2%) de la caja de Petri. En el centro de la caja, sobre el papel celofan se transfiere una seccin de 2mm2 de un cultivo de Trichoderma. Este se acondiciona en la estufa de cultivo a 25C durante 48 horas, momento en que se retira el papel celofn con la colonia adherida a l. En ese momento se siembra en el centro de la placa, limpia de estructuras del antagonista, una 2mm2 del hongo a Paralelamente seccin de fitopatgeno. sta ltima de hongos siembra se realiza en otra caja de Petri con APG 2% la siembra del fitopatgeno como testigo. Se acondicionan en una estufa de cultivo a 25C, a los 7 das se mide el crecimiento radial de las colonias y se calcula el porcentaje de inhibicin utilizando la ecuacin de Royse and Ries, donde r1 representa el crecimiento radial de la colonia del patgeno testigo y r2 el crecimiento radial de la colonia del patgeno en la caja donde previamente creci Trichoderma. La diferencia de crecimiento de la colonia del patgeno, estar en funcin de la produccin de metabolitos que difunden desde la colonia de Trichoderma, hacia el medio de cultivo en que luego creci el patgeno. que ser utilizada

Se debe poner especial cuidado en el manipuleo, esterilizacin y colocacin del papel celofan, a fin de asegurar la integridad del mismo. Evitando de esta manera el riesgo de contaminacin del medio de cultivo con estructuras de Trichoderma

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a) Colocacin del papel de celofn sobre el APG 2%. b) Siembra de una seccin de Trichoderma spp. sobre papel celofn. a)

c) y d) Luego de 48 hs de incubacin se retira el papel de celofn con la colonia de Trichoderma spp. y se realiza la siembra de una seccin del hongo fitopatogeno (Fusarium spp) sobre el medio de APG 2%. a) e) Izq.: Colonia de Fusarium spp en presencia de los metabolitos producidos por Trichoderma spp que difundieron al medio. Der.: colonia de Fusarium testigo. e

Mtodo del papel celofn

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B. Determinacin de la produccin de conidios La determinacin de la El nmero de conidios

produccin de conidios es de gran importancia ya que determinar la forma de dosificarlo y/o diluirlo luego a campo. Se determina por conteo directo en cmara de Neubauer. Se realizan suspensiones en tubos de ensayo con 9 ml de agua destilada estril y 1gr del sustrato colonizado, se cuenta el nmero de conidios de los cuatro cuadrados secundarios (CS) esquinados y el central de la cmara (CC), aplicando la siguiente frmula se obtienen los nmeros de conidios por mililitros.
Suma de 5 CS x 50000= conidios/ml.

contados por gramo del producto final se obtiene multiplicando el nmero de conidios presentes en 1 mililitro por el nmero de mililitros en que fue disuelta la muestra y dividiendo este resultado entre los gramos de muestra usados. (CM x B)/ G= GM CM= Conidios por mililitro B= Cantidad de mililitros usados madre. G= Cantidad de gramos usados en la solucin madre. GM= Conidios por gramo de muestra en la solucin

CS

CC

Retculo de la cmara de Neubauer.

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Observacin de conidios en cmara de Neubauer, bajo microscopio ptico.

C. Determinacin de la viabilidad de los conidios Se evala si los conidios estn vivos o no. Se trata de una prueba de germinacin conidial, mediante la realizacin de microcultivos en medios nutritivos agarizados o lquidos o por conteo de viables en placa (ufc/g o ml de producto). Se realizan suspensiones en agua deacuerdo a lo descripto en el punto anterior, posteriormente se realiza la siembra en portaobjetos escavados con APG 2%, colocndose en estufa a 25C. La observacin se realiza dentro de las primeras 24 horas. Observando al microscopio ptico se realiza el conteo de conidios luego germinados, el calculando de porcentaje

germinacin.

Imagen de conidios de Trichoderma spp germinados.

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D. Determinacin de contaminantes (pureza) La prueba de pureza permite verificar antagonista, la proporcin en ste del caso La formulado tcnica consiste en de

preparar suspensiones a partir del obtenido Trichoderma de la forma antes descripta. Realizando una serie de diluciones seriadas, a fin de sembrar en cajas de Petri con APG 2% aquellas ms diluidas. Las que se acondicionan en estufa de cultivo. Dentro de los 4 das se

Trichoderma spp, en relacin con otros microorganismos que se han multiplicado en el formulado, como contaminantes. Se trata de una prueba esencial para mejorar el proceso Todas de las produccin y formulacin. producciones microbianas tienen el riesgo de contaminarse y en las artesanales esto puede ocurrir con ms frecuencia si no se cumplen las buenas prcticas de produccin, debido al gran nmero de operaciones manuales.

evala el desarrollo de colonias que no corresponden a Trichoderma, el resultado se expresa como porcentaje. Se considera 100% de pureza cuando la totalidad de la placa esta colonizada por Trichoderma.

a) Cultivo de dilucin con 100% de Pureza (placa cubierta solo por Trichoderma) b) Cultivo donde se puede observar en el crculo rojo una colonia contaminante junto a la colonia de Trichoderma.

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Bibliografa
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