UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONOMA DE MEXICO

FACULTAD DE QUIMICA

ALUMNA: RODRIGUEZ RTIZ LAURA

TRABAJO: MICROSCOPIA

FECHA: MIERCOLES 3 DE ABRIL DE 2013

1.-MICROSCOPIA La capacidad del ojo humano es limitada a la hora de estudiar lo pequeo. Hay una inmensa cantidad de clulas y microorganismos que influyen significativamente en la vida del hombre y que, por ello, exigen ser estudiadas en favor de un mayor conocimiento y mejora en la calidad de vida. El estudio de estas clulas o microorganismos, por el tamao que poseen, requiere de la microscopa, que es el conjunto de tcnicas y mtodos destinados a hacer visible seres microscpicos. La herramienta principal de la microscopia es el microscopio, que deriva etimolgicamente del griego mikros (pequeo) y skoopo (observar)1. Es decir el microscopio es un instrumento que produce una imagen aumentada de objetos minsculos o detalles muy pequeos de los mismos. Hoy en da existen diferentes tipos de microscopios los cuales son utilizados dependiendo la tcnica y objeto de estudio. 1.1 FUNDAMENTOS Este aparato fue un gran descubrimiento cuando fue utilizado por primera vez por el holands Anton van Leeuwenhoek el ao 1675. Los primeros microscopios denominados simples constaban de una lente, la cual se sostena con la mano y se diriga hacia la fuente de la luz para que sta atravesara la lente y el objeto, sin embargo este microscopio presentaba fallas de difraccin, haba que aplicar tcnicas para corregir las fallas que este produca y por lo tanto no era muy confiable. A principios de siglo XVIII, el microscopio sufre modificaciones no solo en la ptica, sino tambin en la mecnica. Una de las aportaciones ms interesantes fue la de Cuff-Baker que confecciono un aparato de columna con movimiento rpido y movimiento micromtrico y con un espejo fijo para concentrar la luz; sin embargo, este microscopio tambin produca defectos y aberraciones por lo que se retom el estudio del microscopio simple que era ms sencillo y efectivo que este. Esta innovacin seria el antecedente para el actual microscopio compuesto actual. A partir de entonces, la evolucin de microscopio compuesto ha sido progresiva ya que es el ms usado en nuestros das, ya que contiene varias lentes que aumentan la imagen de una muestra bajo estudio. Los microscopios bsicamente se componen de una o varias lentes que permiten obtener una imagen aumentada del objeto y que funciona por refraccin. Por lo tanto, se considera que los microscopios cuentan con dos secciones, una ptica, que sirve para observar, y la otra, que es una parte mecnica, la cual es la que sostiene a la primera. Dos parmetros importantes en la microscopia son la amplificacin y el poder de resolucin.

1.2AMPLIFICACIN La amplificacin o aumento es la relacin de la imagen de un objeto con su tamao real. 1.3PODER DE RESOLUCIN El poder de resolucin es la principal propiedad de cualquier microscopio y es una medida de la definicin de la imagen; es la mnima distancia entre dos puntos de manera que puedan distinguirse como dos objetos separados. 2.- MICROSCOPIO FOTONICO El microscopio fotnico simple o lupa, es un instrumento amplificador de imgenes, compuesta de una lente o sistema de lentes convergentes dispuestas de manera que proporcionan una imagen virtual, derecha y mayor que el objeto, que a su vez est situado entre la lente y el foco. Tambin es conocido como microscopio ptico, microscopio de luz o microscopio de campo claro. El microscopio ptico tradicional es fcil de usar, y la formacin de la imagen no es obstaculizada por la presencia de agua en la muestra. Estos microscopios se pueden utilizar fcilmente para observar objetos vivientes. Adems la capacidad de percibir colores que posee el microscopio ptico constituye una importante ventaja, dado que las variaciones cromticas, ya sean naturales del objeto y sus componentes, pueden suministrar importante informacin. . Existen dos tipos de microscopios fotnicos: el simple y el compuesto. El microscopio fotnico compuesto, se combinan dos lentes o sistemas de lentes convergentes de amplificacin de imagen, colocados en los extremos del tubo: el denominado objetivo, situado ms cerca del objeto a observar; y el ocular, ms cercano al ojo del observador. Como se observa en la figura 1.

Estos microscopios son utilizados en la actualidad y tienen sus antecedentes en los instrumentos desarrollados entre 1590 y 1610.

Se llama compuesto porque la imagen se forma mediante la utilizacin de tres sistemas de lentes, cada uno de ellos constituidos por lentes convergentes y divergentes. Los sistemas de lentes son condensador, objetivos y oculares.

2.1 CAMPO CLARO. Este microscopio se caracteriza porque emplea luz natural o luz artificial como energa luminosa para formar la imagen aumentada del objeto a observar. El campo claro o transparente se debe a que los rayos luminosos directos que provienen del condensador no encuentran a su paso ninguna estructura coloreada y entran como rayos de luz blanca hacia el objetivo. Es por eso que para que el objeto se distinga mejor de sus alrededores y sea ms visible debe ser coloreado o teido con colorantes especficos de acuerdo con lo que se vaya a observar, ya que de estos depende el grado de absorcin y contraste que se transmita hacia el ojo humano o material fotogrfico si se desea, ya que la imagen se transmitir en un color determinado. Si se examinan los objetos sin colorear la imagen ofrecer detalles poco contrastados, casi transparentes. 2.2 CONTRASTE DE FASES Se fundamenta en el hecho de que las distintas partes de la celula tienen regiones con diferentes ndices de refraccin. Haciendo que los rayos luminosos provenientes de distintas regiones sufran efectos de interferencia destructiva, se obtienen contrastes ntidos. La microscopia de contraste de fase es particularmente til para la observacin de clulas vivientes que, de otra manera, son relativamente transparentes y difciles de ver. El microscopio de contraste de fases se utiliza para aquellas preparaciones de densidad homognea y transparente, en las que la baja capacidad de absorcin hace que la imagen obtenida no presente diferencia de luminosidad entre sus elementos, permaneciendo invisibles los detalles. Este microscopio tiene la capacidad ptica de transformar en los objetos transparentes, los pequeos ndices de refraccin que cada uno de sus componentes tiene en diferencia de intensidad luminosa, ofreciendo imgenes donde las estructuras del objeto aparecen diferenciadas de su alrededor en tonos oscuros o brillantes y tonos intermedios. 2.3 CAMPO OSCURO En la microscopa de campo oscuro, el objeto se ilumina solo con rayos oblicuos, y el uso de luz polarizada, que acentua las configuraciones moleculares altamente ordenadas de la clula. En microscopio de campo oscuro la imagen que se forma est constituida por estructuras brillantes en un fondo oscuro. Para que esto ocurra el microscopio utiliza los rayos luminosos oblicuos que no entran a la lente frontal del objetivo, observndose el campo microscopio totalmente oscuro, pero se requiere que la apertura numrica del condensador sea mayor que la apertura numrica del objetivo. Esto impide que los rayos que provienen de la fuente de luz entren en la porcin central de la lente del condensador, y solo influyan los rayos perifricos que al refractarse se hacen oblicuos.

Cuando estos rayos oblicuos encuentran en su recorrido, alguna partcula, son desviados hacia la lente frontal del objetivo y la imagen de la partcula se observa brillante en medio de un fondo oscuro. 2.4 INMUNOFLUORESCENCIA La microscopia de fluorescencia permite observar la localizacin de determinados compuestos que absorben radiacin ultravioleta invisible y emiten porciones de la energa en las longitudes de onda visibles, ms largas, a esto se le conoce como el fenmeno de fluorescencia. La fuente de luz en un microscopio de este tipo produce un rayo de luz ultravioleta que viaja por un filtro, el cual bloquea todas las longitudes de onda excepto la que puede excitar el fluorocromo. El rayo de luz monocromtica se enfoca en la muestra que contiene el fluorocromo, que se excita y emite luz de longitud de onda visible para el observador. Como la fuente de luz produce slo luz ultravioleta (negra), los objetos teidos con un fluorocromo parecen tener un color brillante contra un fondo negro, lo que brinda un gran contraste. Existe la fluorescencia natural o primaria y artificial o secundaria. La primera se produce cuando los objetos o seres microscpicos al ser excitados con radiacin ultravioleta producen su propia fluorescencia y la fluorescencia artificial requiere que los microrganismos u objetos sean coloreados con fluorocromos y sean observados por los microscopios de fluorescencia. Tambin existe la inmunofluorescencia en la que la fijacin del colorante se realza con ayuda de un anticuerpo, estos se pueden hacer intensamente fluorescentes al conjugarse qumicamente con un colorante fluorescente y combinarse con un antgeno especfico, y este tambin puede hacerse fluorescente. Esta tcnica tiene como finalidad detectar reacciones inmunolgicas y es el principal uso de la microscopia de fluorescencia. 2.5CONFOCAL Debido a que la microscopia de fluorescencia,de transmisin presentaban limitaciones e inconvenientes, por ejemplo: que no siempre transmitan una resolucin y nitidez deseada,que los especmenes examinados eran demasiado gruesos, o que el fluorocromo tiende a ser fotooxidado por la energia radiante que lo excita, etc. Debido a estos inconvenientes se logro disear el microscopio confocal que permite que el observador visualice el objeto o ser microscpico fluorescente en un solo plano del foco, creando una imagen transversal del corte mucho mas ntida. En cualquier momento de la formacin de la imagen confocal, solo una parte pequea de l muestra es iluminada por a luz de excitacin focalizada de un haz lser, que se desplaza con rapidez a diferentes puntos del plano focal de la muestra. Las imgenes desde estos puntos se registran con una cmara de video y se almacenan en una computadora, y esta se muestra en una pantalla de computacin. 2.6PRINCIPALES CARACTERISTICAS Y USOS DEL MICROSCOPIO FOTONICO. Caractersticas: Permite aumentos desde 25 a 1500veces El poder de resolucin es de 0,2 m

La muestra es atravesada por la luz Las lentes son de vidrio Los cortes son muy finos y se obtienen con un microtomo USOS

Un microscopio fotnico emplea la luz o fotones como fuente de energa para formar imgenes aumentadas y detalladas que a simple vista el ojo humano no podra visualizar. 3.- MICROSCOPIO ELECTRONICO Todos los microscopios electrnicos, son complicados, requieren una preparacin, de la muestra mucho ms elaborada y normalmente solo se pueden examinar ejemplares deshidratados, colocados en cmara de vaco. Esta ltima restriccin surge del hecho de que los haces de electrones son dispersados por el aire o el agua, si bien los microscopios electrnicos de megavolts pueden penetrar delgadas capas de agua, permitiendo as la observacin de clulas vivientes. Los microscopios electrnicos con pocas excepciones,slo pueden visualizar clulas que estn muertas, fijaas y teidas. En los microscopios electrnicos tpicos, los electrones presentan las propiedades de una onda, con una longitud de onda de 0.005nm. Cabe recordar que la distancia mnima a la cual dos objetos se pueden distinguir es proporcional a la longitud de onda de la luz que ilumina los objetos. As, en teora, el lmite de resolucin para el microscopio electrnico es de 0,005nm. Tiene la ventaja de alcanzar una extraordinaria amplificacin. Puede dar un poder de resolucin hasta mil veces mayor que el ptico, debido a que emplea un haz de electrones en lugar de un haz de fotones. 3.1 ESTRUCTURA Y TECNICAS TECNICAS La cantidad de informacin que se obtiene de una observacin microscpica depende, en buena medida, como se ha preparado el ejemplar. En microscopa electrnica hay muchas tcnicas diferentes para preparacin de la muestra, cada una con sus propias ventajas. Las cinco tcnicas ms comunes son: de cortes finos, de tincin (teidura) negativa, de sombreado metlico, de congelacin- fractura o crofactura y de montaje de estructuras intactas. A continuacin una breve descripcin de ellas. a) tcnica de cortes finos: recurre al uso del ultramicrtomo para cortar laminas que tienen unos pocos cientos de angstroms de espesor. Para soportar el paso de la navaja de vidrio o diamantes sin romperse, el espcimen se incluye previamente en plasticoas duros, los cuales penetran la pieza antes de polimerizarse. Al pasar la pieza por la navaja se desprenden los cortes que quedan flotando en una superficie de agua de donde son recojidos en una malla de cobre, cubierta con una fina membrana plstica o de carbn como sporte. Al cortar la muestra en laminas muy finas, se eliminan las estructuras que estn por arriba o por debajo del plano que se observa y que confundiran la imagen. Para mejorar el contraste es necesario incorporar colorantes al tejido, dado que las estructuras que han quedado en estos cortes finos no dispersan los electrones suficientemente como para ser vistas

b) Tcnica de tincin negativa: difiere de la tincion positiva en que el espcimen mismo no es teido. En cambio se lo incluye en una sustancia densa, generalmente cido fosfotngstico, el cual se elige por su densidad electrnica extraordinariamente alta, y en consecuencia, por su capacidad para dispersar el haz de electrones. Las partes del espcimen que no incluyen el cido fosfotngstico transmiten los electrones con facilidad y se puede ver su imagen. Dado que el colorante penetra en las hendiduras y aberturas diversas, se puede visualizar parcialmente la estructura fina. Esta tcnica se utiliza principalmente con virus y otros materiales particulados. c) Tcnica de montaje de estructuras intactas: se utiliza con frecuencia para observar cromosomas y otras estructuras gruesas que pueden aislarse libres de impurezas. Como se indica en el nombre del procedimiento, el objeto no se secciona ni se tie. Las reas ms gruesas dispersan los electrones ms que las reas finas, originando el contraste suficiente como para producir una imagen. Dado que la dispersin del haz es directamente proporcional a la densidad electrnica del objeto, y, en consecuencia, a su masa, este mtodo, mediante una calibracin apropiada, nos permite estimar la masa del espcimen examinado. Con el fin de preservar la forma de los especmenes a observar con el microscopio electrnico de barrido, estos se preparan fijndolos qumicamente o por congelacin y deshidratacin, sombrendolos posteriormente con una capa de metal pesado. Este ultimo paso provee una superficie conductora, la cual permite la eliminacin de los electrones capturados que, al desviar el haz incidente, causara distrociones. 3.2 TRANSMISION DE ELECTRONES El microscopio electrnico de transmisin es decididamente monocromtico. Suando se deben examinar detalles de la estructura celular de tamaos inferiores al micrn, solo se puede utilizar el microscopio electrnico de transmisin. El microscopio electrnico de transmisin (TEM) dirige un haz de electrones a travs de la muestra. Los electrones son emitidos por un ctodo de tungsteno calentado por un medio elctrico. El potencial elctrico del catodo se mantiene a 50.000-100.000 volt, y el del anodo, cerca del extremo del tubo, es cero. Esta cada de volaje produce la aceleracin de los electrones a medida que se desplazan hacia el anodo. Una lente condensador enfoca el haz de electrones sobre la muestra; las lentes objetivas y proyector enfocan los electrones que atraviesan la muestra y los proyectan sobre una pantalla de observacin o una pelcula fotogrfica. 3.3 SOMBREADO METALICO se utiliza para dotar de relieve al objeto en estudio. Si el deposito metalico se realiza slo en una direccin, un lado del objeto ser recubierto, en tanto que el otro no. Los electrones pasan con facilidad a travs del rea de menor contenido metalico, menos fcilmente a travs del plano de la estructura, y se dispersan con mayor intensidad del lado de la estructura donde se ha acumulado el metal. Como resultado la muestra se observa como si estuviera iluminada lateralmente por una fuerte luz. Es una tcnica que permite visualizar detalles de superficie en partculas muy pequeas mediante microscopio electrnico. Se dispersa la muestra sobre la superficie de mic y luego se seca en un vapor al vacio. Se calienta mediante electricidad un filamenton de metal pesado, como platino u oro, por lo que el metal se evapora y parte del cae sobre la grilla con la muestra,como una pelcula muy delgada. Para estabilizar la replica se recubre entonces la muestra con una pelcula de de carbono evaporado de un electrodo superior. Entonces se

disuelve el material biolgico con cido, por lo que el observador solo visualiza la rplica metlica de la muestra. Por lo general en las micrografas electrnicas de estas preparaciones, la imagen aparece revertida: las zonas recubiertas por carbono se ven claras y las zonas sombreadas por platino se ven oscuras. En esta tcnica se coloca una delgada capa de metal evaporada, por ejemplo platino, sobre un angulo de una muestra biolgica. Un bao de cido disuelve el material biolgico y deja la replica metalica sobre la superficie, que luego se puede estudiar mediante microscopio electrnico de transmisin. Dado que algunos electrones incidentes se dispersan en distintas direcciones, en lugar de atravesar el preparado, las variaciones en el angulo y el espesor del metal depositado permiten la informacin de una imagen. Si el metal se deposita, sobre todo,a un lado de la muestra, la imagen parece tener sombras donde el metal aparece oscuro, y las sombras claras. 3.4 CRIOFACTURA Tambien llamada tcnica de congelacin-fractura: se lleva a cabo congelando rpidamente la muestras y cortndola en el vaco a una temperatura de -100C. En estas condiciones, la navaja no hace un corte limpio, sino que tiende a fracturar el espcimen a lo largo de lneas naturales de debilidad, por ejemplo, por el medio de una membrana que corra paralela al corte. Despus de cortada,la muestra se puede dejar al vaco el tiempo suficiente como para permitir que cierta cantidad de agua se evapore de los tejidos ms blandos, con lo cual estos se contraen. A este proceso se le llama grabado. La cara expuesta se sombrea con metal para dar suficiente contraste; posteriormente, todo el material organico se elimina mediante acidos, dejando una rplica metlica para ser observada con el microscopio electrnico. La replica conserva as la mayor parte de los detalles de la muestra, por lo cual ofrece la mejor imagen de algunas de las estructuras del interior de la celula, y constituyen la nica manera de observar la superficie y las caractersticas internas de una membrana. 3.5 BARRIDO La capacidad del microscopio electrnico de barrido para utilizar distintos tipod de radiacin proporciona algunas de las ventajas del color, pero resulta una deficiente sustitucin de los incontables matices a los cuales es sensible el ojo humano. Adems, da imgenes superficiales, dado que los electrones no atraviesan el ejemplar. Otra ventaja del microscopio electrnico de barrido es la facilidad con que se puede cambiar de aumento sin reenfocarlo.Es til cuando se deben estudiar pequeos detalles de diferente profundidad. El microscopio electrnico de barrido hace que un delgado haz de electrones recorra el preparado en una y otra direccin, en forma similar a la de un haz de electrones que recorre la pantalla del tubo de de un televisor. De hecho, la imagen del microscopio se exhibe en una pantalla de televisin cuyo haz se desplaza sincrnicamente con el que barre el ejemplar. A medida medida que los electrones golpean contra el ejemplar, se dispersan o desprendenelectrones secundarios de la muestra;en cualquiera de los dos casos, los electrones que provienen de la muestra son recogidos por un tubo fotomultiplicador. Los eectrones dispersados varian en cuanto a su abundancia y a la facilidad de ser detectados, de acuerdo con su origen. Las hendiduras producirn menos electrones detectables, en tanto que las proyecciones sern destacadas. Esta variacin se utiliza para modular el haz que pasa por el tubo de televisin y asi se produce una imagen.

La resolucin del microscopio electrnico de barrido es mucho mejor que la de los instrumentos pticos, pero menor, en general, que la del microscopio electrnico de transmisin. 3.6 PRINCIPALES ELECTRONICO. Caractersticas: Permite aumentos superiores a 10.000, 200.000 y excepcionalmente 500.00 El poder de resolucin es de unos 3 a 10 La muestra es atravesada por un haz de electrones emitidos por un filamento de tungsteno Las lentes son campos magnticos Los cortes son ultra finos y se obtienen con un ultramicrotomo La imagen se genera sobre una pantalla fluorescente USOS permite estudiar la ultraestructura o morfologa submicroscpica de la clula. Adems permite obtener imgenes ampliadas de a muestra, las que se proyectan sobre una pantalla como la ddel televisor. 4.-ANALISIS DE FRACCIONES CELULARES El fraccionamiento celular es usado para investigar la bioqumica y fisiologa de organelos fuera del ambiente complejo de la clula de la celula intacta. El objetivo principal de este experimento es aislar los cloroplastos, nucleo y mitocondria del tejido de plantas por el mtodo de fraccionamiento celular. Los otros objetivos son examinar esas fracciones microscpicas y estimar el coeficiente de sedimentacin de los cloroplastos. CENTRIFUGACION (DIFERENCIAL Y EN GRADIENTE DE DENSIDAD Centrifugacin: cada componente celular esta sujeto a una fuerza centrifuga debido a las diferencias de tamao y densidad. La fuerza centrifuga relativa (RCF) en unidades de g, es la expresin generada por la centrifuga. La RFC es u7na funcion de velocidad de centrifugacin en revoluciones por minuto y la distancia por partculas desde el eje de rotacin. Centrifugacion diferencial. La mayora de los procedimientos de fraccionamiento comienzan con una centrifugacin diferencial a velocidades crecientes, denominada centrifugacin a CARACTERISTICAS Y APLICACIONES DEL MICROSCOPIO

velocidad diferencial. Las distintas velocidades de sedimentacin de los diversos componenes celulares permiten su separacin parcial mediante la centrifugacin. Despus de la centrifugacin con cada velocidad durante un periodo adecuado se vuelca el sobrenadante y se centifuga a una velocidad mayor. Cada fraccin de sedimento se resuspende y luego se separa por centrifugacin por gradiente de densidad en equilibrio. Con la centrifugacin diferencial no se obtienen fracciones de organelos totalmente puras. Un mtodo para purificar aun mas las fracciones es la centrifugacin por gradiente de densidad en equilibrio, que separa los componentes celulares de acuerdo con su densidad. La fraccin impura de organelas se coloca en una capa sobre una solucin que contiene un gradiente de una sustancia no ionica densa, como glucosa o glicerol. Se centrifuga el tubo a alta velocidad durante varias horas, lo que permite que cada partcula migre hasta una posicin de equilibrio en la que la densidad del lquido circundante sea igual a la densidad de la partcula. 5.-CITOMETRIA DE FLUJO Mediante el citometro de flujo es posible separar diferentes clulas, de acuerdo con la luz que dispersan o la fluorescencia que emiten a medida que fluyen a travs de un haz de rayos laser; en consecuencia, es posible separar clulas de un tipo particular dentro de una mezcl. De hecho, el clasificador de clulas activado por fluorescencia , intrumento basado en la citometriade flujo, puede seleccionar una celula entre miles de clulas distintas. La citometra de flujo es un mtodo analtico en el que se mide la emisin de multiples fluorescencias y la dispersin de la luz de clulas o partculas microscpicas, alineadas secuencialmente mediante una corriente lquida laminar, cuando son presentadas de una en una y a gran velocidad frente a una luz lser de longitud de onda adecuada. Con ella podemos analizar estructuras a nivel molecular, nivel subcelular, nivel celular y supracelular por ejemplo: secuencias de ADN o ARN libres, liposomas o cromosomas aislados,bacterias u hongos unicelulares, esferoides etc., entre otros.

Referencias. PRINCIPIOS DE BIOLOGIA CELULAR. ROBERT D. DYSON. FONDO EDUCATIVO INTERAMERICANO,S.A. 1970 PAG.44-56

http://colegiocristorey.com/nenuca/uca/biologia/biologia_2_bcc/biologia_2_bcc_apuntes_micr oscopio.pdf