ESTUDIO DE DIHBRIDOS (wdp x fb) EN Drosophila melanogaster CON LIGACION CROMOSOMICA AL SEXO (w-f) Y ENTRECRUZAMIENTO DE ALELOS (b-dp)

C. S !d" # R A!d"$ # R. %$!!&f$".

Laboratorio de Gentica, Universidad del Tolima, Barrio Santa Helena, Ibagu- Colombia.

R$'()$! Se realiz un e!"erimento con l#neas de mutantes de Drosophila melanogaster "ara com"robar los "atrones $ereditarios en un cruce black forked (bf) % con &hite dumpy '&d"( ), observando la e!"resi n de caracteres dominantes, recesivos, ligados al se!o * los "osibles entrecruzamientos. Se obtuvo de sucesivamente la +ilial , * -. /enoti"os silvestres en $embras * +or0ed en mac$os se observaron "ara la "rimera generaci n * ,- mutaciones di/erentes "ara la segunda. Los resultados se analizaron mediante el uso de la "rueba de C$i- cuadrado con el /in de veri/icar la asertividad en e!"erimento. +inalmente se conclu*e 1ue $a* asociaci n entre las variables estudiadas 'ligamiento al se!o * "robabilidad de recombinaci n( "ero sin embargo, los datos "resentan un margen de error 1ue se debe al azar, a "roblemas en el conteo realizado o con la identi/icaci n de las mutaciones. * + b" ' ,+ -$. Drosophila melanogaster, mutaciones, di$#brido, ligado al se!o, entrecruzamiento, C$icuadrado. INTRODUCCION Uno de los organismos m2s utilizados en e!"erimentos de gentica, es la Drosophila melanogaster, o mosca de la /ruta, 1ue se caracteriza "or ser de "e1ue3o 'de - a 4 mm(, "or tener un ciclo vital corto ',5 6 ,, d#as a -78C( * "or tener un elevado n9mero de descendientes "or "are:a a"ro!imadamente "oner 755 $uevos. Drosophila es ideal como modelo biol gico e!"erimental "or1ue es /2cil de re"roducir * mane:ar la cual se "uede mantener en viales de vidrio aliment2ndola con una "a"illa com"uesta "or /ruta 'banano(, levadura, az9car *;o melaza, mezclada con agar-agar. Drosophila melanogaster tiene < "are:as de cromosomas= Los cromosomas se!uales > * ? 'I( * 4 "are:as de autosomas 'II, III, I@(. Los cromosomas ? * I@ son "e1ue3os * telocntricos * la ma*or#a de los genes se localizan en los cromosomas >, II * III 1ue son metacntricos * grandes. Al cromosoma ? es $eterogametico * contiene algunos genes relacionados con la es"ermatognesis. La determinaci n del se!o de"ende de la relaci n entre el n9mero de cromosomas > 'n>( * el de com"lementos autosomicos 1ue lleve el individuo 'nB(. si 'n> ; nB( C , el individuo ser2 $embra * si 'n> ; nB( C 5,7 el individuo ser2 mac$o. Al /enoti"o normal de la Drosophila melanogaster corres"onde a cuer"o de color marr n claro, o:os grandes * ro:os, * alas 1ue sobre"asan la longitud del abdomen * son trans"arentes * ligeramente "untiagudas. Las nerviaciones de las alas est2n com"uestas "or 7 venas longitudinales * dos transversales. An los mac$os, la "arte distal dorsal del abdomen es oscura * en la "arte ventral se encuentra el "ene rodeado "or las "lacas genitales '1ue le sirven "ara su:etarse a la $embra(, son m2s "e1ue3os 1ue las $embras * en el tarso del "rimer "ar de "atas, "oseen una estructura com"uesta de unos "elos gruesos * cortos, llamada D"eine se!ualE 1ue "ermite distinguir se!os

incluso en las "u"as maduras, antes de 1ue emer:a el adulto. Las $embras tiene un abdomen m2s grande, de coloraci n clara * terminaci n "untiaguda. en la "arte ventral el 9ltimo segmento lleva la "laca vaginal, de coloraci n blan1uecina. An Drosophila es "osible encontrar diversas mutaciones como Black 'b(, White (w), Dumpy (dp), Forked (f), Yellow (y), Ebony (e) etc!

median el ancla:e de los m9sculos de la cut#cula. Asto e!"licar#a su utilidad como variaci n mor/ol gica de los te:idos a travs de su regulaci n de las "ro"iedades mec2nicas 1ue "odr#a "oseer la mosca, como des"lazamiento * dominio del vuelo. Black (b) corres"onde a un mutante autos mico recesivo situado en la "osici n <H.7 ubicado en el cromosoma dos. Se e!"resa con un color de cuer"o negro mate.

Los "atrones Fig"! Drosophila

+enoti"o silvestre. Imagen tomada de Brc$ivo Fig. !. Mutacin blac" (b). Tomado de http://cienciasbiologicas.uniandes.edu.co/genetica/no do.php?id=5

Al e!"erimento llevado a cabo con Drosophila se /undamentaba en el estudio de las siguientes mutaciones= Dumpy (dp) es un mutante autos mico recesivo situado en la "osici n ,4 del cromosoma dos. Fosee alas truncadas * reducidas a -;4 de su longitud.

Aste /enoti"o se observa en e!"resi n de los "igmentos 1ue dan la coloraci n del cuer"o. Al gen "roduce la beta-alanina, debido a la descarbo!ilaci n del as"artato origina entonces la melaninizaci n, la mutaci n ocurre "or errores de marco de lectura, lo 1ue genera el corrimiento de todos los codones, * cambia la secuencia de amino2cidos 1ue codi/ica una "rote#na /uncional. Astudios realizados revelan 1ue $a* cierto ti"o de/ectos visuales en estos mutantes. Al gen tambin se asocia a de/ectos en el "roceso cuticular * no cuticular , el mutante negro en Drosophila res"onde anormalmente a est#mulos visuales como el adecuado reconocimiento del ob:etivo * direcci n, lo cual sugiere un "roblema con las /unciones de orden su"erior visual. White (w).

Fig. 2. Mutacin dumpy (dp). Tomado de http://cienciasbiologicas.uniandes.edu.co/genetica/no do.php?id=5

Aste gen corres"onde a un /enoti"o mutante 1ue a/ecta el tama3o * la /orma de las e!tremidades, la cut#cula tor2cica, la tr21uea * "iezas bucales. Ge acuerdo con sus /enoti"os de cut#cula, Dumpy se e!"resa en varios sitios de ad$esi n celular cut#culae"idrmica, inclu*endo la tr21uea * las clulas del tend n del m9sculo, 1ue

+ig. <. Iutaci n &$ite '&(. Tomado de arc$ivo

White Se conoce como la "rimera mutaci n encontrada en Drosophila melanogaster! As una mutaci n recesiva ligada al se!o en la "osici n ,,7 del cromosoma >. Gescubierta en ,J,5 "or T$omas Hunt Iorgan, 1uien en cierta ocasi n recogi un solo mac$o mutante de o:os blancos de una "oblaci n de moscas 1ue suelen tener los o:os ro:os brillantes en estado silvestre. Iorgan realizo cruces e!"erimentales con dic$a mutaci n, los cuales, lo llevaron a la conclusi n de 1ue esta mutaci n estaba de alguna manera conectada /#sicamente al gen 1ue determina el gnero en Drosophila! La "rote#na "roducida "or la mutaci n del gen de ti"o white sirve como un ancla:e de uni n de trans"orte de BTF, 1ue lleva los "recursores de los "igmentos del o:o color ro:o * marr n, es decir guanina * tri"t /ano, a los o:os durante el desarrollo de "u"aci n. Forked (f) 1ue es un mutante recesivo ligado al se!o situado en la "osici n 7K.L ubicado en el cromosoma >. Los individuos 1ue la "resentan "oseen cerdas acortadas, retorcidas * dobladas con los e!tremos bi/urcados o totalmente doblados.

+inalmente, como resultado del e!"erimento es "osible encontrar dimutantes como White# dumpy, mutante de o:os * ocelos color blanco * alas truncadas. White Black, $ue es un mutante de o:os * ocelos color blanco * cuer"o de color negro mate, Black forked mutante de cuer"o negro * setas retorcidas, dumpy forked con alas truncadas * setas retorcidas * trimutantes, como white#dumpy# forked (wdpf), con o:os color blanco, setas retorcidas, alas truncadas * reducidas. Todas las anteriores mutaciones * "osibles variaciones de las mismas son "osibles en la cruza de individuos "ara Drosophila melanogaster! An general, en Drosophila melanogaster e!isten in/inidad de mutaciones 1ue son 9tiles en el e:ercicio de cruces di$ibridos o cual1uier otra /orma de cruza, lo anterior "ermite reiterar las le*es mendelianas 1ue son im"rescindibles en lo 1ue el estudio de un gen se re/iera. Iutaciones con di/erentes "atrones de $erencia como White, black, forked * dumpy "ueden estar ligadas al se!o, $acer recombinaci n en la meiosis, o segregarse inde"endientemente una de otra "or lo las "ro"orciones /enot#"icas * genot#"icas son variables * de"enden de muc$os /actores.

+ig. 7. Iutaci n /or0ed '/(. Cromosoma , * - en Drosophila! +enoti"os traba:ados. Tomado de arc$ivo.

Los "atrones $ereditarios /ueron descubiertos * "lanteados "or Gregor* Iendel, 1uien realiz cruzamientos entre variedades o l#neas "uras 1ue di/er#an en tres caracteres 'BBBBCC ! aabbcc(. B estos organismos se les conoce como "oli$#bridos. Un "oli$#brido 'BBC( es un individuo $eterocigoto "ara ! loci, es decir, un individuo cu*o genoti"o contiene dos alelos distintos en cada locus. Si los loci en estudio son biallicos '"or e:em"lo= B,a . B, b . ... M,n( el genoti"o "oli$#brido es BaBb...Mn. Los "oli$#bridos "roducen tantos ti"os de gametos distintos como combinaciones di/erentes de n alelos $a*an, es decir, se "ueden /ormar /!. Como los alelos se re"arten al azar entre los gametos 'le* de la segregaci n inde"endiente( "ara cada locus >,! la mitad de los gametos ser2n de Nti"o >N * la otra mitad de Nti"o !N. For otra "arte, como los alelos se combinan inde"endientemente, los alelos B * a se combinan con los alelos B * b con la misma "robabilidad, * as# lo $ar2n al combinarse los alelos C * c. As decir, los -n ti"os de alelos se /ormar2n con la misma /recuencia ',;-n(. Las "ro"orciones /enot#"icas se ven a/ectadas "or el entrecruzamiento cromos mico 'crossing over( donde dos cromosomas se a"arean e intercambian secciones de su BGM. Al resultado de este "roceso es un intercambio de genes, llamado recombinaci n gentica.

"e1ue3o, es"uma, cartulina "lasti/icada, un /rasco eterizador, ta"a eterizadora, gotero(. +ue necesario adem2s el uso de cloro/ormo "ara adormecer las moscas, medios de cultivo "ara alimentar ce"as de Drosophila $ue en este caso se utilizo medio con banano, * "or 9ltimo el material biol gico. ce"as Black forked (bf) % * White dumpy '&d"( ) Se realizo una se"araci n de $embras v#rgenes corres"ondientes a Black forked (bf)% mediante la revisi n cada seis $oras de los organismos, con el 0it se adormecen todas las moscas * a travs de una buena ins"ecci n se seleccionan las $embras v#rgenes, los adultos mac$os se descartan en la morgue '/rasco con alco$ol(. Las $embras /ueron de"ositadas en un medio de cultivo "ara su mantenimiento. Se realizo el mismo "rocedimiento con la ce"a white dumpy (bdp), "ero seleccionando solo los mac$os * descartando las $embras. Los organismos (bf) % * '&d"( ) se de"ositaron en "ro"orciones adecuadas ',7 $embras * ,7 mac$os, ".e( en un /rasco estril con medio de cultivo, controlando los /actores ambientales tem"eratura, $umedad, iluminaci n como tambin las condiciones del medio "ara 1ue se re"roduzcan. Fasados K d#as /ue "osible observar una serie de larvas vermi/ormes blancas comiendo vorazmente del medio, las cuales em"iezan a ascender "or las "aredes del /rasco $asta em"u"ar. An ese momento se sacaron los "arentales 'F,( * se llevaron a la morgue. Luego de obtener un n9mero adecuado de individuos en la +, era necesario establecer el cruce te rico con el /in de de/inir las "ro"orciones /enot#"icas es"eradas as# "oder cruzar individuos de +, 1ue ser2n a$ora los "arentales de la segunda generaci n cruz2ndolos de la manera anteriormente descrita. +inalmente des"us de obtenida la +se se"araron mac$os * $embras de

MATERIALES Y METODOS Fara el traba:o de adormecimiento, se!ado * clasi/icaci n de las moscas /ue necesario adecuar un 0it de laboratorio '"incel 5.5, embudo

cada una las mutaciones "osibles en un n9mero m#nimo de 755 individuos, teniendo una ma*or "recauci n con el aislamiento de dimutantes * trimutantes *a 1ue se entregan vivas al ce"ario del laboratorio de gentica de la Universidad del Tolima. TABLA 0. CRONOGRAMA ACTI1IDADES.
A,2&-&d d E!2"$6 d$ )$d&5' d$ Drosophila STOC7 S&$)b" d$ 4$)b" ' -8"6$!$' 9 ) ,45' (*0) E)$"6$ 30 S&$)b" 30x30 3$,4 --;54;-5,,

dum"* * blac0 no se e!"resan "ero genot#"icamente son $eterocigotos "ara los alelos del mac$o. An la +, se obtiene un numero total de ,JH individuos, de los cuales, /ueron utilizados 47 mac$os ')( * <5 $embras '%( como "arentales "ara la +-. GRA3ICO 0. NUMERO DE INDI1IDUOS UTILIZADOS COMO *ARENTALES DE LA 3/.

DE

C5)$!2 "&5' (bf) % * /ueron necesarios seis d#as "ara un correcto aislamiento. M9mero total de $embras ,7. Iac$os= ,7. Se siembra una r"lica con ,5 individuos de cada se!o Seg9n las "ro"orciones TABLA /. NUMERO DE INDI1IDUOS observadas se OBTENIDOS EN LA sembr +,!+, M9mero total DESCENDENCIA de 3/. $embras ,7. Iac$os= ,7. MUTACION/SEX Se siembran dos = O re"licas cada una f 42 con ,5 mac$os * ,5 $embras.

,;5<;-5,,

H;5<;-5,, ,7;5<;-5,,

>

E)$"6$ ,5!2$5

3/

-4;5<;-5,, -K;57;-5,, +- arro:o un n9mero individuos

3&! +&: ,&;! ,5!2$5 3/

RESULTADOS Y DISCUSI<N An la /ilial , se obtiene /enoti"o silvestre "ara $embras '%( las cuales genot#"icamente son $eterocigotos "ara cada car2cter estudiado 'color de o:os, cuer"o, /orma de las alas * cetas(. Los mac$os ')( son genot#"icamente $emicigotos "ara los alelos de las mutaciones white forked '$erencia ligada al se!o( e!"res2ndose solo el car2cter /or0ed * siendo silvestre dominante sobre el color de o:os O$ite. Los caracteres

b w Dp gran de S Wf Dpf Wdp Wb bf Wdpf Wfb TOTAL TOTAL

37 69 18 115 15 6 10 5 14 1 7 339

116 43 0 40 267 0 17 0 0 21 0 0 504 843

GRA3ICO /. NUMERO DE INDI1IDUOS OBTENIDOS EN LA DESCENDENCIA 3/.

A!iste segregaci n inde"endiente "ara los alelos wf ligados al se!o * bdp "ara el cruce di$#brido en Drosophila melanogaster! Hi" tesis alternativa= H,= >- Q5 A!iste de"endencia en de los alelos ligados entrecruzamiento "ara en el cruce di$#brido melanogaster. Fara +- se obtiene entonces en ma*or "ro"orcion al /enoti"o silvestre '-KL%, ,,7)C4H-(, seguido de la mutaci n forked ',,K%, <-)C,7H(,black '<4%, 4L)CH5(, dumpy'<5%,,H)C7H(,black forked'-,%, ,<)C47(. Blgunas mutaciones se e!"resaron solo "ara el genero masculino como= white 'KJ)(, white forked ',7)(, white dumpy ',5)(, white black '7)(, white dumpy forked ',)( white forked black 'L)(! As "osible entonces com"robar la e!istencia de alelos dominantes * recesivos, los cuales "ueden segregarse seg9n la ubicaci n en el cromosoma durante la meiosis "ara un numero P ma!imo de 5,45 /enoti"os es"erados en un cruce di$ibridido. Sin embargo, los datos obtenidos no son com"letamente iguales a los es"erados "or lo cual es necesario $acer un a:uste con la "rueba conocida como C$i cuadrado X/ "ara e!aminar la "robabilidad de 1ue estas desigualdades ocuran "or azar. Al a:uste se calcula as#= X/? @(N5. Ob'$"- d5- N5. E'p$" d5)/ N5. E'p$" d5 Fara el an2lisis de los datos /ue necesario "lantear una "rueba de $i" tesis gentica de la siguiente manera= Hi" tesis nula= Ho= >-= 5 la segregaci n al se!o wf * los alelos bdp de Groso"$ila

>-cC %C -K4.7K4 >-cC )C -44.<5H %

P= 5.57 P= 5.5,

11.07

15.09

>-c=-K4.7K4

Grados de libertad= K-,= A

)

P= 5.57
19.68

P= 5.5,
24.7 >-c=-44.<5H

Grados de libertad= ,--,= 00 Como el valor calculado "ara >-c es ma*or 1ue el valor tabulado, se dice, 1ue $a* entrecruzamiento o recombinaci n de los alelos bdp * ligamiento de los alelos wf "ara el se!o en Drosophila melanogaster! Fuesto 1ue los resultados son mu* signi/icativos al nivel del ,R $a* evidencia su/iciente "ara rec$azar la $i" tesis nula * ace"tar la $i" tesis alternativa. Los valores es"erados se obtienen seg9n las /recuencias /enot#"icas del cruce te rico 'vase ane!os(. mediante la multi"licaci n del n9mero de la muestra "or la /recuencia "ara cada /enoti"o.

TABLA B. *RO*ORCIONES MACHOS ES*ERADOS OBSER1ADOS EN LA 3/.

DE Y

"roblemas de /enoco"ia, contaminaci n u omisiones en el "rocedimiento. CONCLUSIONES

FENOTIPO = S F Dp B W Bf Wb Wdp Wfdp fdp wfb wfdp TOTAL

OBS 115 42 18 37 69 14 5 10 15 6 7 1 339

ESP 42.03 42.03 21.01 21.01 42.03 21.01 21.01 21.01 42.03 21.01 21.01 21.01 33! "
DE Y

Drosophila melanogaster es una e!celente modelo "ara el traba:o de ce"as en cruces de gentica. Las di/erentes clases de mutaciones "ermiten corroborar "atrones $ereditarios * com"robarlos e!"erimentalmente mediante la e:ecuci n de cruces te ricos * la com"robaci n de datos obtenidos mediante la "rueba 'C$i- cuadrado(. Los /enoti"os de la +, "ermiten evidenciar las le*es mendeliadas en /unci n de la dominancia * recesividad de genes ubicados en los cromosomas autosomicos. La cruza alelos &-/ ligados al se!o * involucran el "atr n de $erencia cruzada, caracter#stica "ara estos genes, "or lo tanto la $embra de setas '+or0ed( cuando se cruza con mac$os silvestre "ara este car2cter, toda la descendencia masculina en +, ser2 igual a su "rogenitora. An el caso de 1ue la mutaci n ligada al se!o '&( a"arece en el mac$o "rogenitor, da como resultado la desa"arici n del rasgo '&( en la +, "ero re a"arece solo en los mac$os de la +-, com"rob2ndose as# el "atr n de $erencia 1ue salta una generaci n "ara los genes ligados al se!o. Los alelos de genes recesivos ligados al se!o '/-&( se encuentran m2s /recuentemente en los mac$os 1ue en las $embras, "uesto 1ue los mac$os de la es"ecie de Drosophila melanogaster son $emicigotos "ara los caracteres ligados al se!o. estos caracteres no a"arecen en las $embras a menos de 1ue el "rogenitor "aterno tenga la mutaci n.

TABLA C. *RO*ORCIONES HEMBRAS OBSER1ADAS ES*ERADAS EN LA 3/.

FENOTIPO > s f dp b fdp bf TOTAL

OBS 267 116 40 43 17 21 504

ESP 124.99 124.99 62.49 21.01 62.49 73.33 4!9 3

Al a:uste de datos no es bueno, las mutaciones es"eradas en el cruce te rico son e/ectivamente obtenidas, sin embargo las "ro"orciones /enot#"icas observadas no son mu* "recisas * se conclu*e 1ue el modelo no es 9til "ara "rocesos /uturos. Astos resultados se le "ueden atribuir a errores en el conteo *;o se!ado,

An las caracter#sticas ligadas al se!o, los gametos "arentales * recombinantes /ormados "or la $embra "ueden observarse en los mac$os de la +- sin im"ortar el genoti"o de los mismos. Los alelos "ara las mutaciones b-d" 1ue se encuentran en el mismo cromosoma est2n ligadas, sin embargo en el "roceso de recombinaci n las cromatidas no $ermanas de cromosomas $om logos intercambian genes, "roceso donde se "roducen gametos recombinantes, b2sico "ara la variabilidad gentica de una es"ecie, en Drosophila &elanogaster esto ocurre "ara $embras * no "ara mac$os. Las desviaciones mencionadas entre los valores observados * es"erados del cruce en el modelo e!"erimental di$ibrido sugieren 1ue deben ser consideradas como evidencia de ligamiento.

mostro "reocu"aci n "or el estado del "resente traba:o. BIBLIOGRA3IA Cruzamiento Foli $#brido. Gu#a de traba:o online. Universidad Com"lutense de Iadrid. Ancontrado en= $tt"=;;&&&.ucm.es;in/o;genetica;gru"o d;inde!.$tm Fracticas de Bn2lisis mendeliano. Gu#a de traba:o online. Universidad Com"lutense de Iadrid. Iutantes en Drosophila! Universidad del los Bndes. Gentica de "oblaciones. Ancontrado en $tt"=;;cienciasbiologicas.uniandes.edu. co;genetica;nodo."$"SidC7L. OILLIBM G STBM+IALG, Gentica, tercera edici n, Aditorial Ic Gra& 6 Hill, I!ico ,JJ-. OILTIM. IB, STUF+UVG B., Groso"$ila dum"* is a gigantic e!tracellular "rotein re1uired to maintain tension at e"idermal-cuticle attac$ment sites. Universit* o/ Ianc$ester, Sc$ool o/ Biological Sciences, Ianc$ester, I,4 JFT, UT FHILLIFS BI, SIBVT V, STVBUSS V, BVAIBS B, TALL? LA. T$e Groso"$ila blac0 enigma= t$e molecular and be$avioural c$aracterization o/ t$e blac0 mutant allele. Ge"artment o/ Genetics, Universit* o/ Ielbourne, Far0ville, @ictoria, Bustralia.

AGRADECIMIENTOS Se agradece a los asistentes del laboratorio de gentica de la Universidad del Tolima, los cuales mostraron inters "or el estado del e!"erimento * a*udaron en un me:or entendimiento del cruce te rico. Bgradecimiento al docente Ble:andro Bastidas "or su a*uda en c2lculos estad#sticos * "or su"uesto a la docente Iar#a Alo#sa Bldana, 1uien