Replikacija DNK

Replikacija DNK je proces kojim se obezbeuje da se genetiki materijal, dupliran u S fazi interfaze, prenosi sa roditeljske na novosintetisane elije (sa generacije na generaciju) nepromenjen, ime se obezbeuje opstanak vrste. Kod prokariota replikacija se deava u roku od 20-30 min, a kod eukariota u proseku traje oko 8h. Duina trajanja replikacije kod eukariota zavisi od veliine molekula DNK.

Dva lanca DNK su: komplementarna i antiparalelna 5 GGA TAT G 3 3 CCT ATA C 5

SEMIKONZERVATIVNA REPLIKACIJA
Watson KrickKrick-ov model

SEPARACIJA DVA DNK LANCA

A C A G T C T G T C A G A C A G T C T G T C A G A C A G T C T G T A C A T G T C A G

SVAKI DNK MOLEKUL SADRI JEDAN STARI I JEDAN NOVI LANAC

A C A G T C T G T C A G A C A G T C T G T C A G

RODITELJSKI MOLEKULI DNK

SVI STARI LANCI SLUE KAO TEMPLET KOJI DETERMINIE REDOSLED NUKLEOTIDA U NOVOM KOMPLEMENTARNOM LANCU

Dokaz semikonzervativne replikacije DNK - Matthew Meselson i Franklin Stahl ,1957.god

Pretpostavlli su da e, prema gustini DNK lanaca bakterija (u koje su ugraeni laki i teki izotopi azota), moi da utvrde da li su stari roditeljski lanci bili matrica za sintezu novih lanaca, i na koji nain se ovi lanci razdvajaju u procesu deobe . Centrifugiranje DNK u gradijentu gustine cezijum hlorida: Makromolekuli (I organele) sa razliitim gustinama mogu se medjusobno razdvojiti centrifugiranjem u rastvoru koji sadri gradijent gustine koji je rastui od vrha ka dnu epruvete. U odgovor na centrifugalnu silu, makromolekuli e migrirati du epruvete dok ne pronadju gustinu rastvora koja odgovara njegovoj. Tu e se zadrati i formirati traku koja se moe izdvojiti i koristiti za dalje analize. Za DNK analize najee se koristi CsCl, so tekih metala koja formira rastvor veoma velike gustine. DNK se jednostavno izmea sa ovim rastvorom i sve se centrifugira na velikim brzinama dui vremenski period . Gradijent CsCl e se formirati dejstvom centrifugalne sile, a DNK e zauzeti poziciju unutar gradijenta koji je jednak njenom.

Heavy DNA

Light DNA

Replikacija DNK vrlo je sloen proces Replikacija DNK obuhvata:

razmotavanje dvolanane zavojnice roditeljske DNK I razdvajanje lanaca potpuno i tano kopiranje svakog roditeljskog lanca DNK pribavljanje potrebnih koliina sva etiri dezoksiribonukleotida za sintezu novih lanaca DNK pribavljanje potrebnih koliina histona za organizaciju nove DNK u nukleozome i pakovanje u hromozome

HEMIZAM REPLIKACIJE DNK

Formiranje fosfodiesterske veze izmedju novog dezoksiribonukleotida I 3OH kraja rastueg lanca DNK,reakcija katalizovana DNK polimerazom SINTEZA NOVOG LANCA
ZAPOINJE NASPRAM 3KRAJA STAROG LANCA

DNK se sintetie u 5'-3' smeru -3'OH grupa prajmera napada fosfornu grupu na nadolazeem nukleozid trifosfatu Odlazea grupa je pirofosfat Osloboena energija iz hidrolize pirofosfata omoguuje da se reakcija polimerizacije odigra DNK sinteza je ireverzibilna

DNK polimeraza

Opti pregled replikacije DNK

DNK virusa SV40 sadri 5.1kb (1kb=1000 nukleotida); duina 1,7m DNK E.coli sadri 4000 kb,1360m Humani haploidni genom sadri oko 3 milijarde bp, 1m DNK-linearan ili cirkularan (zatvoren) DNK je superspiralizovana-lokalno se razdvajaju lanci-samo u mestima gde se trenutno vri sinteza novog lanca Replikacija kod cirkularne DNK: -zapoinje u replikativnom poetku (origin of replication) gde se vezuju proteini inicijatori replikacije - odvija se simultano u oba pravcabidirekciono - mesto replikacije(aktivne DNK sinteze) se oznaava kao replikativna viljuka (uvek ih ima dve) -zavrava u terminacionom regionu
(teta)

Replikacija DNK E.coli (1963)-(A) autoradiografija bakterija raslih u medijumu sa obeleenim timidinom nakon dve generacije B) ematizovan prikaz dve replikacione viljuke uoene na slici A

Replikacija bakterijskeDNK

Enzime koji katalizuju sintezu novog lanca DNK tokom replikacije nazivamo DNK-polimerazama

DNA-polimeraze uvijek sintetiu novi lanac u smeru 5-3 DNK-polimeraze ne mogu zapoeti (inicirati) sintezu novog lanca DNK zapoinje je primaza (RNK polimeraza) DNK-polimeraze kopiraju DNK sa vrlo visokom tanou

Replikativna viljuka
Replikativna viljuka je asimetrina, jer iako se oba lanca istovremeno sintetiu u 5-3 smeru, jedan lanac se sintetie kontinuirano pratei rasplitanje replikativne viljuke (vodei lanac) dok drugi zapoinje u dnu replikativne viljuke i formira se u suprotnom pravcu od pravca replikativne viljuke, da bi se odrao smer sinteze DNK 5-3, tj.diskontinuirano, u vidu Okazaki fragmenata koji se kasnije povezuju (lanac koji zaostaje). Replikacija je semidiskontinuiran proces

DNK polimeraze kod bakterija

REPLIZOM-kompleks razliitih proteina ukljuenih u replikaciju DNK Artur Kornberg (1956) izolovao iz E.coli DNK polimerazu I (jedan polipeptidni lanac, Mr 103kD) -ne moe da zapone sintezu polinukleotidnog lanca de novo -zahteva prisustvo prajmera (kratkih lanaca RNK ije nastajanje katalizuje enzim primaza) -aktivna samo u prisustvu matrice -polimerazna (katalizuje stvaranje novih fosfodiesterskih veza i popunjava praznine nakon uklanjanja prajmera) i egzonukleazna (uklanja prajmere) aktivnost u oba smera 5-3 i 3- 5

-(ugradjuje oko 20 nukleotida/sec) - DNA polimeraza I katalizuje tri reakcije: polimerizaciju nukleotida u smjeru 5.3 sinteza novog lanca DNK hidrolizu polinukleotida u smjeru 3.5 korektivna aktivnost hidrolizu polinukleotida u smjeru 5.3 zamjenjuje RNK poetnicu s DNK9. DNK polimeraza II katalizuje sintezu DNK u 5-3 smeru samo u prisustvu prajmera i matrice, egzonukleazna aktivnost samo u 3- 5 smeru DNK polimeraza III (DNK replikaza)-katalizuje sintezu DNK u 5-3 smeru samo u prisustvu prajmera i matrice; egzonukleazna aktivnost samo u 3- 5 smeru; obavlja sintezu najveeg dela DNK E.coli (ugradjuje 1000 nukleotida/sec)

 DNK poli III je osnovni enzim polimerizacije prokariota ija je glavna uloga da sintetie vodei lanac i vei deo zaostajueg lanca, poto ima veliku brzinu ugraivanja nukleotida (1000nukleotida/s). Pored polimerazne, ona ima i korektivnu-ispravljaku (egzonukleaznu) ulogu u 3-5 pravcu. Ovaj enzim ugrauje odgovarajue nukleotide u pravcu 5-3, a ako grekom ugradi neodgovarajui nukleotid, iseca ga, vraajui se u nazad i istovremeno ga zamenjujui odgovarajuim nukleotidom, nastavljajui dalje replikaciju u 5-3 pravcu DNK pol I je mnogo sporija, ugrauje samo 20 nukleotida/s, pa vri polimerizaciju samo kraih delova DNK lanaca. Glavna uloga pol I je korektivna, ima sposobnost da ispravlja greke u DNK, isecajui nukleotide u oba pravca i u 3-5 i u 5-3 slui za uklanjanje prajmera iz Okazakijevih fragmenata u zaostajuem lancu i njegovu istovremenu zamenu dezoksiribonukleotidima

Struktura bakterijske DNK polimeraze III

Enzim je deo multimernog kompleksa sa oko 10 vrsta subjedinica. Jezgro enzima ine 3 subjedinice:-polimerazna aktivnost, -egzonukleazna aktivnost i (teta) Jezgro se udruuje sa subjedinicom , dimer prstenastog oblika sa pozitivno naelektrisanom upljinom kojom obuhvata DNK du koje slobodno klizi.

DNK pol podsea na poluzatvorenu aku. Ima tri domena koja su oznaena kao palac, prsti i dlan. Novosintetisana DNK je povezana sa dlanom, dok je aktivno mesto polimerizacije smeteno na dlanu i to u pukotini izmeu palca i prstiju delimino zatvorene ake.

 Dlan je odgovoran za katalitiku ulogu i prepoznavanje ispravnog baznog para Prsti su odgovorni za katalitiku ulogu polimeraze, omoguuju zatvaranje ispravnog baznog para Palac odrava poloaj prajmera u odnosu na katalitiki centar i vezu izmeu enzima i supstrata

Ispravno sparivanje nukleotida -polimeraza iz otvorene, katalitiki neaktivne konformacije prelazi u zatvorenu, aktivnu, obuhvata svaki nukleotidni par i stvara se fosfodiesterska veza Neispravno spareni nukleotidi -polimeraza ne trpi konformacionu promenu, nukleotid disosuje i izostaje formiranje fosfodiesterske veze

Ispravljaka aktivnost DNK polimeraze: pogreno ugraen nukleotid usmerava DNK ka centru za ispravljaku ulogu DNK polimeraze film

RNK prajmeri i primaze

Uee RNK u inicijaciji rerplikacije bazirana na otkriima: Okazaki fragmenti esto imaju kratke nizove RNK (3-10 n) na svojim 5 krajevima DNK Pol katalizuju dodavanje nukleotida na 3 kraj lanca RNK kao i na DNK elije sadre enzim PRIMAZU koji sintetie RNK fragmente duine oko 10 baza koristei DNK kao matricu Nasuprot DNK Pol koja dodaje nukleotide na kraj postojeeg lanca, primaza inicira sintezu RNK iz sredine povezujui dva nukleotida

DNK SINTEZA INICIRANA FORMIRANJEM KRATKIH RNK PRAJMERA

RNK polimeraze-primaze
PRIMAZA je vrsta RNK polimeraza koja je ukljuena jedino u proces DNK replikacije. Za svoju aktivnost ne zahtevaju prjamere kao DNK Pol. U E.coli primaze su neaktivne dok se ne udrue sa 6 drugih proteina formirajui kompleks PRIMOZOM . Uloge ovih proteina su u odmotavanju roditeljske DNK i prepoznavanju ciljne DNK sekvence od koje zapoinje replikacija. Kod eukariota termin primozom se ne koristi jer njihove primaze nisu asocirane sa odmotavajuim proteinima ve su vezane za DNK Pol , kljunu u inicijaciji replikacije. Primaza je enzim koji ne poseduje ispravljaku aktivnost moe da formira relativno veliki broj greaka tako da bi to moglo da povea nivo mutacije nastale tokom replikacije, da se ne iseca i ne zamenjuje sa dezoksiribonukleotidima..

Primaza

DNK polimeraza III

Matrini lanac DNK

Inicijacija sinteze RNK

Sinteza RNK prajmera

Sinteza Okazaki fragmenta

Replikacija vodeeg lanca se odvija uvek u pravcu 55-3, to znai da se vodei lanac sintetie naspram lanca 33-5 matrice. Nakon otvaranja DNK (pod delovanjem helikaza), prvi enzim koji prilazi replikativnoj viljuci je RNK polimeraza, koja koja otpoinje otpoinje sintezu vodeeg lanca. Kada RNK polimeraza naputa replikatitivnu viljuku, i na njeno mesto dolazi DNK polimeraza III, koja poinje da ugrauje dezoksiribonukleotide, kopirajui lanac matricu

Sinteza lanca koji zaostaje

Istovremeno poinje replikacija i drugog antiparalelnog lanca DNK, ali ona poinje u dnu replikativne viljuke. Kako se replikativna viljuka otvara, RNK poetnica zapoinje novi lanac DNK. Kada ugradi desetak ribonukleotida, naputa lanac, i umesto nje se vezuje DNK pol III, koja poinje da ugrauje odgovarajue dezoksiribonukleotide

LIGAZE
Ligaze su enzimi koje lepe dva susedna DNK fragmenta formirajui fosfodiestarsku vezu izmeu njih Tokom replikacije povezuju 3OH grupu jednog Okazaki fragmenta i 5'-fosfatnu grupu susednog fragmenta

Razdvajanje lanaca DNK i formiranje replikativne viljuke

DNK helikaze (maine na ATP pogon;proteini koji hodaju po DNK) -Omoguavaju raskidanje H-veza i otvaranje dvolanane
zavojnice koristei energiju hidrolize ATP-a za promenu svog oblika i translokaciju du DNK u 5-3 smeru

 Helikaze su heksamerni enzimi prstenastog oblika koji imaju nezamenljivu ulogu u svim procesima razdvajanja lanaca DNK, bilo da se radi o procesu replikacije, transkripcije ili ispravljanja oteenja DNK i razmene genetikog materijala. Da bi se ostvarilo raskidanje vodoninih veza izmeu lanaca DNK potrebna je energija koja se dobija iz hidrolize ATPa, pri emu deo te energije helikaze koriste da klize po molekulu DNK, u smeru 5-3 raskidajui vodonine veze. Ovi proteini se zato nazivaju maina na ATP pogon.

Da bi se spreilo ponovno uspostavljanje vodoninih veza, iza helikaze se postavljaju SSB proteini koji omoguavaju da se dva DNK lanca odre otvorena

SSB proteini DNK

HELIKAZE

SSB proteini (single-stranded DNA binding)-proteini koji destabilizuju dvolananu zavojnicu; Vezivanje je nezavisno od sekvence DNK, elektrostatikim interakcijama sa fosfatnim vezama kooperativno vezuju jednolananu DNK- vezivanje jednog SSB olakava vezivanje ostalih SSB za odreenu DNK isteu okosnicu, olakavaju sparivanje sa novim nukleotidima i odravaju replikativnu viljuku otvorenu

DNK TOPOIZOMERAZE Osnovna funkcija smanjenje tenzije uvrtanja u dvolananom delu DNK usled otvaranja replikativne viljuke DNK topoizomeraza tipa I- endonukleaza prisutna i kod prokariota i kod eukariota; see samo jedan lanac DNK, vee se za njegov kraj kovalentnom vezom bogatom energijom, i provlai segment drugog lanca ime uklanja jedan supernavoj

 DNK topoizomeraza tipa II kod bakterija (DNK iraza)

je enzim koji slobodnu energiju hidrolize ATP-a prevodi u energiju uvrtanja molekula DNK zbog ega se u hromozom bakterija dodaju negativni supernavoji: oko enzima se namotava DNK, vezivanjem ATP-a raskidaju se oba lanca DNK, ali im 5' krajevi ostaju vezani za jednu od subjedinica enzima. Kroz fiksirane krajeve enzim provlai segment DNK u pravcu stvaranja novog negativnog supernavoja

Mehanizam replikacije DNK kod prokariota-E.coli

Inicijacija zapoinje na mestima poetka -OriC Elongacija- sinteza prajmera,dalje rasplitanje DNK, Vezivanje DNK POl III i sinteza lanaca Terminacija-replikativni terminus-350 bp Interakcije Tus-Ter i helikaze spreavaju dalje razdvajanje lanaca; DNK topoizomeraza II odvaja dva novonastala kruna molekula

Inicijacija i terminacija replikacije kod prokariota

Regulacija replikacije kod prokariota

Replikacija DNK mora da se dogodi samo jednom u toku elijskog ciklusa Regulacija iskljuivo u fazi inicijacije Odgovorni: A) uestalost replikacije u korelaciji sa koncentracijom proteina DnaA i Ici A koji vezuje nizove od 13bp inhibirajui replikaciju B) stepen metilacije nizova GATC u okviru ponovaka od 13bp-mehanizam regulacije nedovoljno poznat

Tanost replikacije DNK

Koliko su este pogreke u replikaciji DNA? Tokom replikacije ugradjuje se svega jedna pogrena baza na svakih milijardu nukleotida DNK pol imaju vei afinitet prema komplementarnom nukleotidu (princip otvorene/zatvorene konformacije )

Najei razlog nastajanja greaka tokom replikacije su tautomerni prelazi azotnih baza (prelaz H atoma sa jedne na drugu poziciju unutar molekula baze)

Ispravku vri:
DNK polimeraza III svojom 3-5 egzonukleaznom aktivnou

IMINO FORMA ADENINA SPARUJE SE SA CITOZINOM UMESTO SA TIMINOM. IMINO FORMA CITOZINA SPARUJE SE SA ADENINOM UMESTO SA GUANINOM ENOLNA FORMA GUANINA SPARUJE SE SA TIMINOM UMESTO SA CITOZINOM ENOLNA FORMA TIMINA SPARUJE SE SA GUANINOM UMESTO SA ADENINOM

UKLANJANJE POGRENO SPARENIH BAZA MISMATCH REPAIR

Deluje odmah nakon replikacije Obeleavanje roditeljskog lanca (E.coli-Dam metilaza katalizuje metilaciju adeninskih ostataka u okviru nizova 5 GATC 3 nekoliko sekundi po replikaciji

1000 bp

Egzonukleaza I

II

Replikacija DNK kod eukariota

Replikacija eukariota je semikonzervativan, semidiskontinuiran, i bidirekcioni proces Odigrava se jednom u toku elijskog ciklusa Odvija se 10-20 puta sporije nego kod prokariota REPLIKATOR set cis-aktivnih sekvenci neophodnih za inicijaciju replikacije, u okviru koga je i mesto poetka replikacije (origin of replication) duina > 1000 bp INICIJATOR protein koji se vezuje za replikator specifino prepoznajui odreene nukleotidne sekvence Zapoinje na mnogo mesta istovremeno REPLIKON-segment DNK koji se replikuje poev od jednog mesta poetka replikacije- jedna replikativna jedinica

Replikacioni poeci kod eukariota

Replikacija genoma E. Coli 20 minuta Replikacija sisarskih genoma trebalo bi oko 3 nedelje a vri se za nekoliko sati? Razlog-postojanje vie replikacionih poetaka (humani genom ih ima 30000, medjusobno rastojanje50300kb, kvasac ima 400, medjusobno rastojanje 40kb. Kod kvasca su oznaeni kao ARSautonomously replicating sequence100bp od kojih 11 ini jezgro, jer se za njih vezuje set proteina-tzv, origin replication complex (ORC). ORC angauje druge proteine, ukljuujui i helikazu za otpoinjanje replikacije

DNK polimeraze kod eukariota

DNK polimeraze , , , , replikacija mitohondrijske DNK i reparacija oteenja DNK i replikacija hromozomske DNK
DNK polimeraza -vie subjedinica-jedna ima primaznu a najvea polimeraznu aktivnost u 5-3 smeru poev od prajmera, ugradjuje malo (100-200) nukleotida zbog ega zapoinje sintezu Okazakijevih fragmenata, sintetiui prvo prajmere pa kratkih DNK lance koje nastavlja pol , nema egzonukleaznu aktivnost DNK polimeraza 2 subjedinice, polimerazna i egzonukleazna aktivnost ( 35 smeru), ugradjuje neogranien broj nukleotida, aktivnost joj zavisi od interakcija sa PCNA (proliferating cell nuclear antigen), ovaj kompleks ini replikazu vodeeg lanca Replikacioni faktori RFA (analog SSB) i RFC (u formiranju aktivnih replikativnih kompleksa)

DNK POLIMERAZE U SISARSKIM ELIJAMA

DNK POLIMERAZE

Lokalizacija u

+ + +

nucleusu mitohondrijama
5 - 3 polimerazna aktivnost 3 - 5 egzonukleazna aktivnost Veza sa primazom

+ +

+ +

5 - 3 egzonukleazna aktivnost

DNK polimeraze eukariota DNK polimeraze bakterije E. Coli

Zapoinjanje replikacije (vezuje primazu)

Pol DNK reper Replikacija Replikacija; Replikacija;
DNK reper DNK reper

Pol

Pol I Uklanjanje zaetnika, DNK reper Pol II DNK reper Pol III Replikacija

Pol mitDNK Pol DNK reper Pol DNK reper

Pol Pol Pol Pol Pol Pol Pol Rev1

3 5
VODEI LANAC

helikaza

DNK pol III

(PROKARIOTI)
3

DNK
primaza (P) DNK pol. (E)

DNK pol (EUKARIOTI)

3 5

helikaza

RNK prajmer

DNK

primaza (P) DNK pol. (E)

3 5

helikaze

RNK prajmer

DNK
DNK pol. III (P) DNK pol. (E) 3 5

Telomere i telomeraze: replikacija linearnih krajeva hromozoma

Telomere (linearni krajevi hromozoma) sainjeni su od naizmenino zastupljenih kratkih repetativnih nekodirajuih sekvenci (humane telomere ine 100-1500 kopija TTAGGG sekvence tandemski ponovljene) koje onemoguavaju gubljenje vanih genetikih informacija tokom skraivanja DNK molekula u replikaciji

Telomere se repliciraju telomerazama, reverznom transkriptazom koja sintetie DNK od RNK, a koja nosi sopstveni RNK molekul komplementaran telomernoj DNK. Telomere tite gene na hromozomima na dva naina,
predstavljaju rezervoar nekodirajuih DNK i vezuju proteine koji spreavaju degradaciju krajeva hromozoma.

Konvencionalna DNK pol ne moe da replicira telomerni region jer prostorno nema gde da vee RNK prajmer
Repeat unit

Telomere se sintetiu de novo katalitikom aktivnou TELOMERAZE Greider i Blackburn iz protozoe Tetrahymene prvi izoluju telomerazu

Po svom sastavu telomeraza je ribonukleoproteinski kompleks koji u sebi nosi RNK molekul (kod Tetrahymene dug 159
nukleotida i sadri sekvencu od 9 nukleotidaAACCCCAAC, koja odgovara 1,5 TELOMERNOM PONOVKU-TTGGGG

Koliko vremena je potrebno za kompletno replikovanje virusa SV40 koji se sastoji iz 5,1kB (1kb-1000 nukleotida) a koliko za E. Coli iji je genom 4000 kb , ako i u jednom i u drugom sluaju replikaciju vri polimeraza III ija je brzina ugraivanja nukleotida u novo sintetisani lanac 1ooo nukl/sec. 1. 1min 2. 60min 3. 66min 5,1x1000=5100 nukleotida 1000.1s 5100..x x=5,1s je potrebna za replikaciju SV40 4000x1000=4000000nukleotida u E Coli 1000nuk.1s 4000000.x x=4000sec 4000:60=66min je potrebno za replikaciju E Coli,ako se replikacija odvija sa samo jednog replikativnog poetka