BASES TCNICAS DEL FISH

Francesc Sol
Servei de Patologia Laboratori de Citogentica i Biologia Molecular Hospital del Mar. Barcelona

Qu es la FISH?

La tcnica de FISH permite la deteccin y localizacin de secuencias especficas de ADN sobre cromosomas, clulas o tejidos

MARCAJE Y DETECCIN
DNA muestra DNA sonda
AMCA

Deteccin por fluorescencia

Biotina Anti Bio Anti anti Bio-FITC Biotina Anti Bio Anti anti Bio-FAAFA Digoxigenina

FISH
Anti Dig Anti anti Dig- TRITC

DNA muestra

Deteccin enzimtica
Digoxigenina Anti Dig Anti anti Dig-PAP

DNA sonda

CISH

TCNICAS DE DIAGNSTICO GENTICO DE LOS LINFOMAS

Citogentica convencional (cariotipo) Hibridacin in situ (FISH o CISH) Biologa molecular: Southern blot y PCR

TCNICAS: CG, SB, PCR vs FISH

SB todos mucho baja No No PCR todos poco alta S S FISH todos poco alta No No

PARMETROS CG fresco mucho baja No S

Tejido Cantidad Sensibilidad Falsos + Falsos -

CITOGENTICA CONVENCIONAL vs FISH

CITOGENTICA
Requiere clulas en divisin Requiere tejido fresco

FISH
No requiere clulas en divisin Permite estudiar material parafinado o congelado Solo aporta informacin de la sonda que se utiliza Moderado coste econmico

Permite detectar alteraciones de todo el genoma Bajo coste econmico

COMPARATIVA: FISH vs PCR

FISH
Mayor especificidad: menos falsos negativos y menos falsos positivos Requiere un nmero mnimo de clulas Requiere un microscopio de fluorescencia

PCR
Elevada incidencia de falsos negativos: puntos de rotura variables Elevada sensibilidad: falsos positivos

CASO PRCTICO
Muestra referida para estudio de FISH Orientacin diagnstica: LLC-B Peticin FISH: ATM, CEN12, RB, P53
FISH CITOGENTICA

+12

47, XY, del(7)(q32), +12, add(12)(p11) t(14;19)(q32;q13)

LLC-B

LZME

CISH o FISH?
CISH FISH

COMPARATIVA: CISH vs FISH

CISH
No requiere microscopio de fluorescencia Mayor estabilidad de la sonda El patlogo est ms habituado Mayor tiempo de procesado Visualiza 1-2 colores

FISH
Requiere microscopio de fluorescencia Hasta el momento, poca experiencia del patlogo Permite trabajar con 2-4 sondas de distinto color Menor tiempo de procesado Mayor sensibilidad

CUANDO APLICAR LA FISH?

Ausencia de tejido fresco Si se ha aplicado citogentica: Cariotipos normales (linfocito T) Metafases con cromosomas de mala calidad Cariotipos muy complejos difciles de definir

FISH

o CITOGENTICA MOLECULAR

TCNICAS COMPLEMENTARIAS

SONDAS DISPONIBLES (COMERCIALES)

BCR/ABL AML/ETO PML/RARA CBFB/MYH11 MLL TEL/AML1 C-MYC 5q/7q/Cen IgH/BCL1 IgH/BCL2 BCL6 MYC/IgH ALK IgH/MLT API2/MLT Rb (13q14) IgK UROVYSION IgL HER2 BCL3 HER2/topo BCL10 HER1 IgH/PAX5 P53 CEN N-MYC c-MYC Ciclina D1 BACs

PUESTA A PUNTO DE LA FISH

Microscopio de fluorescencia con filtros apropiados Protocolo tcnico: paso crtico, digestin del tejido parafinado Experiencia en valoracin e interpretacin Controles para establecer niveles de corte Sentido comn para la eleccin de la sonda a utilizar y para la interpretacin de los resultados

CRITERIOS DE VALORACIN
Valorar la FISH en la zona tumoral Analizar 500 ncleos para sondas centromricas y 200 ncleos para sondas especficas de locus Nunca valorar clulas solapadas Establecer en una primera etapa los niveles de corte de cada sonda a partir de muestras control (utilizar el mismo tejido que el tumoral)

NIVELES DE CORTE (CUT-OFF)

10 muestras control con el mismo tejido que el tumoral Hibridar con la sonda y contar 500 ncleos:
ncleos con 1,2,3 seales de hibridacin ncleos con o sin reordenamiento

Frmula matemtica: media 3 x DS

translocaciones (fusin): 5% reordenamientos (split): 2% deleciones/monosomias: 10% trisomias/ganancias: 5% amplificacin: locus/cen>2

TIPOS DE FISH
METAFSICA:
requiere metafases y la experiencia de un citogenetista

INTERFSICA:
requiere ncleos, y no es imprescindible la experiencia del citogenetista, aunque si es importante un mnimo de conocimientos de gentica para su interpretacin

t(14;19)

#8

der(12)

#8 #14q32

#14q32

FISH METAFSICA

FISH METAFSICA (SONDA MLL, 11q23)

SKY o M-FISH (cariotipo espectral o multicolor FISH)

TIL PARA DETECTAR TRANSLOCACIONES

CROSS SPECIES COLOR BANDING: RxFISH

TIL PARA DETECTAR INVERSIONES Y TRANSLOCACIONES ENTRE CROMOSOMAS HOMLOGOS

MULTICOLOR BANDING FISH

TIL PARA DETECTAR DELECIONES Y PRECISAR PUNTOS DE ROTURA

FISH INTERFSICA
Para detectar o descartar alteraciones concretas sin la necesidad de tener un tejido con capacidad de entrar en divisin (tejido parafinado)

SONDAS DE UTILIDAD DIAGNSTICA (PATLOGOS)

Sondas centromricas:
para la deteccin de alteraciones numricas se usan como control de referncia de la hibridacin de sondas de locus especfico

Sondas especficas de locus: para la deteccin de translocaciones, deleciones o amplificaciones

sondas de fusin sondas split

TEJIDO A UTILIZAR
Muestras de citogentica: ncleos desnudos Improntas:
impacto de clulas normales (ausencia de clulas tumorales)

Tejido parafinado:
siempre se dispone de tejido parafinado localizacin del rea tumoral tcnica y valoracin ms compleja

Tejido fresco:
se puede realizar la citogentica convencional clula tumoral muy diluida tcnica y valoracin ms sencilla

SONDAS CENTROMRICAS

1 TRISOMA 1 MONOSOMA 13

13

TRIPLOIDA O TRISOMA DE LOS 2 CROMOSOMAS

TRISOMA vs TRIPLOIDA
SONDA CENTROMRICA

SONDA CENTROMRICA CON OTRO CROMOSOMA

TRISOMA

TRIPLOIDA

SONDA CENTROMRICA TIL PARA DETECTAR ALTERACIONES NUMRICAS

Ncleos desnudos: tratamiento de citogentic

ALTERACIONES NUMRICAS: DETECCIN DE TRISOMA 12

CEP 12

CISH

FISH

TEJIDO PARAFINADO: SONDA DE LOCUS ESPECFICO

TIL PARA DETECTAR ALTERACIONES ESTRUCTURALES: translocaciones, deleciones, amplificaciones,... BCL2 IgH

TEJIDO PARAFINADO

SONDAS DE LOCUS ESPECFICO SONDAS DE FUSIN

SONDAS SPLIT o BREAK APART

NORMAL

TRANSLOCADO

COMPARATIVA SONDAS DE FUSIN VS SPLIT

FUSIN: Ms compleja de valorar Baja incidencia de falsos positivos con sondas duales Filtros ms apropiados SPLIT: Fcil de valorar Baja incidencia de falsos positivos Filtros poco apropiados

EJEMPLOS DE VALORACIN (FUSIN)

TRISOMA

TRIPLOIDA

TRANSLOCADO

NORMAL

FUSIN

DETECCIN DE ALTERACIONES NUMRICAS CON SONDAS DE LOCUS ESPECFICO (FUSIN)

DELECIN

AMPLIFICACIN

PERMITEN DETECTAR ALTERACIONES NUMRICAS Y ESTRUCTURALES

TRIPLODA

TRISOMA

DETECCIN DE TRANSLOCACIONES (SONDA DE FUSIN)

SONDA DE LOCUS ESPECFICO: POR EJ. POSIBLES INTERPRETACIONES: -TRISOMA DE IgH - TRANSLOCACIN DE IgH

IgH/BCL1

SONDA IgH/BCL2

REORDENAMIENTO IgH/BCL2

TRISOMA DE IgH O CROMOSOMA 14

EJEMPLOS DE VALORACIN (SPLIT)

TRISOMA

TRIPLOIDA

TRANSLOCADO

NORMAL

REORDENADO

EDICIN DE INFORMES
ISCN (1995/2006): International System for Human Cytogenetic Nomenclature: formulacin compleja Indicar la sonda utilizada Resultado de la fusin: por ejemplo, 2R 2V (normal), 1R 1V 2A (translocado) Informe con conclusin final: normal o translocado o delecionado. Recomendacin: nomenclatura + conclusin final

PROTOCOLO A SEGUIR EN LOS LINFOMAS DIAGNSTICO

Con el resultado citogentico el clnico est en una posicin ms favorable para establcer el diagnstico, aplicar la terapia ms efectiva y programar el seguimiento del paciente Si citogentica normal o no informativa: FISH o PCR segn diagnstico Mayor especificidad de la FISH que la PCR Si citogentica alterada: si cariotipo complejo: M-FISH, SKY o RxFISH si cariotipo no informativo: FISH segn diagnstico ESTUDIO DE CLONALIDAD EN CASOS DUDOSOS

ESTRATEGIA PARA EL DIAGNSTICO DE LOS LINFOMAS (DIAGNSTICO INTEGRADO)

- Citologa/histologa - Citometra de flujo/inmunohistoqumica - Citogentica - FISH: segn orientacin diagnstica y resultado citogentico - Biologa molecular: clonalidad (10-20% de los casos) y estudio de reordenamiento molecular para seguimiento de la EMR - Banco de Tumores ES FUNDAMENTAL UNA BUENA COMUNICACIN ENTRE EL PATLOGO Y EL GENETISTA

AGRADECIMIENTOS
SERVEI DE PATOLOGIA
Sergi Serrano Citogentica i Bio. Molec. Blanca Espinet Marta Salido Beatriz Bellosillo Gemma Navarro

Francesc Alameda Lourdes Florensa Teresa Bar Encarna Prez Carlos Barranco Anna Ferrer Josep M Corominas Josep Lloreta Mar Iglesias Lluisa Marioso Assumpta Munn Lara Pijoan

Tcnicos: RM. Vila, R. Navarro, M. Bragulat, C. Melero, M.C. Vela, R. Longaron, M. Musset , E. Torres, E. Moragn Becarios: O. Villa, L. Astier, E. Puigdecanet, C. Bar, R. Salgado, A. Carracedo Secretarias: A. Balaguer, J. Cruz