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BIOCHEMIE METABOLISMUS

HS 2011

Biologie 3:

INHALT: 1. Proteine 2. Dreidimensionale Struktur von Proteinen 3. Enzyme 4. Grundlagen der Bioenergetik 5. Glykolyse 6. Tricarbonsurezyklus 7. Lipide 8. Biologische Membranen 9. Membrangekoppelte ATP-Synthese 10. Photosynthese 11. Gluconeogenese 12. Signalbertragung

Ziel der Vorlesung Die Vorlesung soll die Grundlagen der enzymatischen Katalyse vermitteln
und die wichtigsten metabolischen Mechanismen und Reaktionswege des Energiestoffwechsels und einiger Synthesen erarbeiten. Das vorliegende Skript umfasst den Stoff, der in der Vorlesung behandelt wird, und soll Ihnen das Mitschreiben whrend der Vorlesung weitgehend ersparen. Es ist aber nicht eine 1:1Wiedergabe der Vorlesung und soll auch nicht ein Lehrbuch ersetzen. Wir empfehlen z.B. Biochemie von L. Stryer oder Lehninger's Principles of Biochemistry als Ergnzung und Vertiefung.

Prfung Fr Studierende der Biologie ist die Vorlesung Biochemie/Metabolismus Teil des Moduls
Biologie 3 zusammen mit den Vorlesungen Makromolekle/Grundlagen der Genetik und Entwicklungsbiologie. Die Prfung zu diesem Modul (schriftlich, 3 x 45 min, d.h. 45 min fr die Biochemie) findet im Januar statt (20.1.2012). Man beachte fachspezifische Vorschriften. Die Prfung besteht aus kurzen Essayfragen und Fragen, die mit einem Wort, einem Satz oder mit Richtig/Falsch beantwortbar sind. Eine gute Art, sich den Stoff anzueignen, ist es, selbst Prfungsfragen zu erfinden. Solche Fragen werden gern entgegen genommen und als bungsaufgaben verbreitet.

Webseite Das Skript als pdf-Dokument ist erhltlich von EVA. Eine Webseite mit alten
Prfungen und verschiedenen Links wird im Laufe des Semesters zugnglich werden.

Prof. Martin Spiess, Biozentrum, 577A, Tel 061-267 2164, Martin.Spiess@unibas.ch

PROTEINE

Es ist das Ziel der Biochemie, biologische Prozesse zurckzufhren auf die physikalischen und chemischen Eigenschaften der beteiligten Molekle: Proteine, Kohlenhydrate, Nukleinsuren (DNA, RNA) und Lipide. Chemische Bausteine Prinzipien der zellulren Organisation Stoffwechselwege Mechanismus von Replikation, Transkription und Translation Genetischer Code Archeae sind universell, im Wesentlichen identisch fr Prokaryonten, Archae und Eukaryonten: ! Allgemeingltigkeit biochemischer Prinzipien. Einfachheit der Bausteine: 20 Aminosuren, 5 Nukleotide, wenige Zucker, Polyole und Fettsuren Molekulare Komponenten der E. coli-Zelle (% des Gesamtgewichts): H2O (70%) Proteine (15%) DNA (1%) RNAs (6%) Kohlenhydrate (3%) Lipide (2%) Intermediate des Stoffwechsels (2%) anorganische Ionen (1%). ! Wasser als Hauptbestandteil: Lsungsmittel, und Reaktand. Die anomalen physikochemischen Eigenschaften des Wassers sind fr das Leben auf der Erde von besonderer Bedeutung und beruhen auf dem hohen Dipolmoment von H2O und partiellem Ionencharakter: ! H-Bindungen ! Hohe Dielektrizittskonstante: Lsungsvermgen fr Ionen, polare Verbindungen; polar-apolare Phasentrennung ! Anomale Protonenleitfhigkeit

1. Proteine 2

1.1 Struktur von Proteinen

1. 2. 3. 4. 5.

Primrstruktur: Aminosure-Sequenz Sekundrstruktur: Kettenkonformation Tertirstruktur: 3D Faltung Quartrstruktur: Assoziation mehrerer Ketten Suprastrukturen (Mutliproteinkomplexe, Protein-RNA und Protein-DNA Komplexe)

1.2 Aminosuren
20 Aminosuren (direkt in Genen codiert):

Mittleres Molekulargewicht: ~110 kD

1. Proteine 3

(nicht aromatisch)

Achtung: Ladungszustand hngt vom pH ab: pH7: Seitenketten von Glu und Asp sind negativ, von Lys, Arg und (in geringem Mass) His sind positiv geladen. pH11: Seitenketten von Glu, Asp, Cys und Tyr sind negativ, von Arg positiv geladen. pH 2: Keine Seitenketten sind negativ, jene von Lys, Arg und His sind positiv geladen. (siehe Tabelle der pKa-Werte weiter unten)

1. Proteine 4 Weitere Aminosuren: Selenocystein (21. Aminosure, UGA [normalerweise Stopcodon] plus mRNA-Struktur) Post-translationell modifizierte Aminosuren (Phosphotyrosin, Phosphoserin, Phosphothreonin, Hydroxyprolin, Hydroxylysin, u.a.) Seltene Aminosuren in kurzen, nicht-ribosomal hergestellten Peptiden (z.B. Ornithin, "-Alanin). Eigenschaften von Aminosuren (siehe organische Chemie): - Polaritt, Ladung, Aromatizitt - Konfiguration: tetraedrisch bzgl. C#, asymmetrisches C# (ausser Gly) ! optisch aktiv (Spiegelbildisomerie: D-, L-Konfiguration) - In Proteinen nur #-L-Aminosuren; in bakteriellen Peptiden oft L- und D-Konfiguration. - 2 zustzliche asymmetrische C in Thr und Ile

Lsungseigenschaften: 1. Ampholyt-Charakter (Zwitterionen), pKa-Werte von #-COOH, #-NH2 und R. 2. Hydrophobizitt (hydrophobe WW) je nach R. Analytische Verwendung der Lsungseigenschaften: 1. Elektrophorese (elektrisches Feld) 2. Ionenaustauscher-Chromatographie (Ladung) 3. Trger-Chromatographie (Papier u. dgl.) 4. Acidimetrische Titration (Sure-Base-Titration) + pH < IP H3N-CHHR-COOH z>0 + pH = IP H3N-CHR-COOz=0 IP: Isoelektrischer Punkt pH > IP H2N-CHR-COO z<0 pH = pKa + log #/(1-#) # = [A]/([A]+[HA]) := Dissoziationsgrad

! bei pH = pKa : # = 0.5 (bei diesem pH sind 50% (de)protoniert)

1. Proteine 5 Sure-Base Eigenschaften:


Gruppe Sure ! Base "COOH ! COO + H+ #COOH ! COO + H+ OH ! O + H+ SH ! S + H+ $-Aminogruppe NH3+ ! NH2 + H+

(je kleiner, desto strker die Sure)


pKa 4.4 4.4 10.0 8.5 10.0 12.0 6 NH3+ ! NH2 + H+ COOH ! COO + H+

(pKs)

Asparaginsure (Seitenkette) Glutaminsure (Seitenkette) Tyrosin (Seitenkette) Cystein (Seitenkette) Lysin (Seitenkette) Arginin (Seitenkette) Histidin (Seitenkette)

%-Aminogruppe (Peptidkette) %-Carboxylgruppe (Peptidkette)

8.0 3.1

Der pKa-Wert von Histidin liegt im neutralen pH-Bereich und kann darum als physiologischer pHSensor dienen. pKa-Werte knnen jedoch durch die Mikro-Umgebung in einem Protein um mehrere Einheiten verschoben werden. Spektroskopische Eigenschaften: Die aromatischen Aminosuren (Trp, Tyr, Phe) absorbieren im nahen UV. Deswegen weisen reine Proteine ein Absorptionsmaximum bei 280 nm auf. Die Basen der DNA absorbieren dagegen maximal bei 260 nm. Nur Tryptophan hat eine signifikante Fluoreszenzemission.

1. Proteine 6

1.3 Die Primrstruktur von Proteinen


Die Peptid-Bindung

Wasserabspaltung (d.h. Kondensation) zwischen der #-Carboxylgruppe einer Aminosure mit der #-Aminogruppe einer anderen Aminosure fhrt zur Peptidbindung (= Sureamidbindung).

Die Peptidbindung ist planar wegen des partiellen Doppelbindungscharakters (Resonanzstabilisierung). Dadurch ist die freie Beweglichkeit einer Polypeptidkette erheblich eingeschrnkt, denn nur die beiden Einfach-Bindungen zum #-Kohlenstoffatom (NHC ; C CO) sind frei drehbar.
# #

Fr eine planare Peptidbindung betrgt der C -C Abstand 3.8. Sterisch stark bevorzugt ist das trans-Isomere. Eine Ausnahme ist Prolin: 838% cis (abhngig von der vorangehenden Aminosure):
# #

Die Peptidbindung ist nicht ionisiert, besitzt aber eine Polaritt. Dadurch erhlt die gesamte Polypeptidkette eine Polaritt (N- ! C-Terminus). Die in vivo Synthese am Ribosom verluft ebenfalls von N ! C.

1. Proteine 7 Wichtig fr die Struktur von Proteinen sind zudem die H-Bindungsdonor und -akzeptoreigenschaften der Peptidbindung (siehe Sekundrstruktur). Die N- und C-terminalen Aminosuren der Kette besitzen noch eine freie Amino- bzw. Carboxylgruppe. Kombinatorik: Ein Peptid aus n Aminosuren hat bei Verwendung aller 20 natrlichen Aminosuren 20n verschiedene mgliche Sequenzen. Oxidation von 2 Cys-SH Seitenketten fhrt zu Cystin (Cys-SS-Cys), d.h. zur Quervernetzung der Kette.

Nomenklatur n < 20 Di-, Tri-, Tetra-, Penta-, ... = Oligopeptide n > ~20 Polypeptide; n > ~50 Proteine Nicht ribosomal synthetisierte Peptide: Glutathion = $-Glu-Cys-Gly (Redox-System im Cytosol) Gramicidin: L- und D-Aminosuren u. seltene Aminosuren

1.4 Charakterisierung der Primrstruktur


1.4.1 Quervernetzung durch SS-Brcken beseitigen Hufig wird die schrittweise Reduktion und Blockierung verwendet: Reduktion der SS-Brcke mit einem Mercaptan (R-SH, z.B.Mercaptoethanol: R = HOCH2-CH2-)

Blockieren heisst, die freien SH-Gruppen mit einer chemisch inerten Schutzgruppe versehen. Jodessigsure reagiert mit freien SH-Gruppen zu einem Thioether. Alle CysteinSeitenketten sind praktisch irreversibel nun zu Carboxymethyl-Cystein verndert und die Zahl der Carboxymethylgruppen kann durch Analyse des Molekulargewichts bestimmt werden.

1. Proteine 8 1.4.2 Mit welcher Aminosure beginnt die Sequenz? Proteine haben nur zwei verschiedene Klassen von primren Aminogruppen: Eine einzige #-Aminogruppe am Amino-Terminus (pKa ! 8) und je eine %-Aminogruppe pro Lysinrest (pKa ! 10). Diese Gruppen lsst man mit chromogenen Reagenzien, wie z.B. das Edman-Reagens Phenyulisothiocyanat, reagieren. Anschliessend werden alle Peptidbindungen Peptidbindungen hydrolysiert (6 N HCl fr 24 h bei 110C im Druckrohr). Durch Chromatographie wird die modifizierte, farbige Aminosure identifiziert..

Welches Problem ergibt sich bei Lysin? 1.4.3 Bestimmung der Aminosure-Zusammensetzung Hydrolyse wie oben. Dabei werden Trp sowie Gln (! Glu + NH4Cl) und Asn (!Asp + NH4Cl) irreversibel zerstrt; Trennung der einzelnen Aminosuren durch Chromatographie. Die Aminosuren werden unmittelbar anschliessend durch Reaktion mit Phenylisothiocyanat spektroskopisch detektierbar und quantifizierbar gemacht.

Wie knnte man den Gehalt an Tryptophan (mol/mol Protein) bestimmen?

1. Proteine 9

Die aus der Fragmentierung entstehenden Peptide werden durch Chromatographie getrennt.

1.4.4 Bestimmung der N-terminalen Aminosuresequenz: Edman-Abbau Die #-Aminogruppe der N-terminalen Aminosure wird mit Phenylisothiocyanat markiert. Mit wasserfreier Sure findet in einem zweiten Schritt eine Zyklisierung statt, bei der die benachbarte Peptidbindung gespalten wird. Dabei wird die nchste Aminosure N-terminal und die Reaktion kann wiederholt werden. Die bei jedem Zyklus als Phenylthiohydantoin (PTH) abgespaltene Aminosure wird durch Chromatographie identifiziert, u.s.w., bis ca. 40 Zyklen.

NB: Die chemische Sequenzierung wird zunehmend durch massenspektroskopische ersetzt (Bestimmung der Masse von Peptiden und ihrer Kollisionsfragmente)

1. Proteine 10 1.4.5 Fragmentierung von Proteinen Weil die Sequenzierung auf relative kurze Peptide beschrnkt ist, mssen Proteine zur vollstndigen Sequenzanalyse fragmentiert werden. Dazu gibt es chemische und enzymatische Methoden. CNBr reagiert ausschliesslich mit der Seitenkette von Methionin und fhrt zu einer Zyklisierung, die die nachfolgende Peptidbindung spaltet.

Spezifische Proteasen katalysieren die sequenzabhngige Hydrolyse von Peptidbindungen, z.B. das Enzym Trypsin spaltet nur die Peptidbindungen nach Lys oder Arg.

1.4.6 berlappende Teilsequenzen ergeben die Gesamtsequenz


berlappungsanalyse: Spaltung mit verschiedenen Reagenzien/Enzymen und Vergleich der Fragmente:

Insulin

Reagiert Insulin mit Jodessigsure? Wie kann man zeigen, dass Insulin aus zwei Oligopeptiden besteht? Wie trennt man die beiden Oligopeptide? Fluoresziert Insulin? Absorbiert Insulin bei 280 nm? Was ist die Nettoladung von Insulin bei pH 7 (ohne Faltungseffekte)? Wo spaltet Trypsin?

DIE DREIDIMENSIONALE STRUKTUR VON PROTEINEN

Trotz der Einschrnkungen der Drehbarkeit um die Peptidbindung ist die Anzahl verschiedener rumlicher Anordnungen einer Polypeptidkette enorm gross. An Oligopeptiden wurden energetisch gnstige Bindungslngen und -winkel berechnet (Ramachandran). Modellbau machte die wasserstoffverbrckten Sekundrstrukturen !-Helix und "-Faltblatt plausibel (Pauling). Die Prognosen wurden durrch Kristall- und NMR-Strukturen besttigt. Contour Energiediagramm (Ramachandran Plots) fr # und $ Winkelpaare:

-Gly

L-Ala

Exp (Creatinaminohydrolase)

Zustzlich wird die dreidimensionale Struktur von Proteinen durch verschiedene kovalente (CysCys Brcken) und nichtkovalente intramolekulare Wechselwirkungen zwischen den Seitenketten sowie zwischen dem Rckgrat und den Seitenketten bestimmt und stabilisiert.

2.1 Molekulare Wechselwirkungen


Reichweite () 1-2 2.8-3.0 3-5 2-4 Wechselwirkung kovalente WW H-Brcken (~Dipol-Dipol) van der Waals Coulomb ( w (r ) = Energie (kJ/mol) 100-800 5-20 1-3

Q1 ! Q2 ) 4"" 0 r

10-40

2. Die dreidimensionale Struktur von Proteinen

Wasserstoffbrcken:

Van der Waals-Wechselwirkung

2.2 Sekundrstruktur
Die rechtsgngige !-Helix: Die Polypeptidkette bildet eine rechtsdrehende Helix, wobei intramolekulare H-Brcken (>C=O...H-N<) zwischen (CO)i und (NH)i+4 gebildet werden. Die Seitenketten ragen nach aussen (minimale sterische Hinderung) und stabilisieren die Helix oft durch intrahelikale Wechselwirkungen (z.B. Salzbrcken). Abstand zwischen 2 Aminosuren entlang der Helixachse: 1.5 Aminosuren pro Helixwindung: 3.6 Progression entlang der Helix pro Windung: 3.6 x 1.5 = 5.4

Prolinhaltige Peptide knnen wegen der zyklischen Seitenkette die Geometrie der !-Helix nicht einnehmen. Prolin fhrt zu Krmmung/Knickung der Helix.

2. Die dreidimensionale Struktur von Proteinen

Die "-Faltblattstruktur ("-pleated sheet): Ausbildung von H-Brcken zwischen verschiedenen Kettenstrngen des Proteins, die parallel oder antiparallel zueinander laufen knnen. Die Strnge mssen gestreckt und im gleichen Raster gefaltet sein, damit die Seitenketten (Restgruppen = R groups) senkrecht zum Faltblatt ausgerichtet sind (minimale sterische Hinderung). Wie bei !-Helices werden Faltbltter oft durch Seitenkettenwechselwirkungen stabilisiert (oft van-der-Waals Wechselwirkungen grosser hydrophober Aminosuren).

Abstand zwischen 2 Aminosuren: 3.5 (maximal gestreckte Kette wre 3.8/Aminosure) Antiparalleles Faltblatt:

Paralleles Faltblatt:

2. Die dreidimensionale Struktur von Proteinen

" Hairpins (""-Haarnadeln"):

verbinden zwei in der Proteinsequenz benachbarte, antiparallele "-Elemente (Haarnadelstruktur).

Typ I

Typ II

"-Hairpins

enthalten oft Glycin (klein und flexibel) oder Prolin (erzwingt Richtungsnderung wegen zyklischer Struktur) sowie hydrophile Aminosuren (Ser, Asn). Loop Strukturen Die Verbindungsschlaufen zwischen !-Helices und "-Strngen (oder !-Helix und !-Helix) haben eine durchschnittliche Lnge von 6-10 Aminosuren. Weil die Tertirstruktur im Allgemeinen durch Bndelung von !-Helices und "-Strngen erfolgt, liegen die meisten Verbindungsschlaufen notwendigerweise an der Oberflche des Proteins.

2.3 Tertirstruktur
Tertirstruktur bezeichnet man die rumliche Anordnung smtlicher Atome der Polypeptidkette. Aus der Analyse von hochaufgelsten Proteinstrukturen (<2) knnen verschiedene strukturelle Prinzipien fr die Ausbildung einer rumlich definierten 3-D Struktur zusammengefasst werden:
Als

1. Peptidbindungen sind planar und meistens, aber nicht immer, trans. Cis-Bindungen sind besonders hufig bei Prolin. 2. Drehbarkeit um die #- und $-Winkel ist eingeschrnkt. Ausnahme: hohe Flexibilitt um Glycin 3. Stabilisierung des Peptidgersts durch maximale Zahl H-Brcken, die oft auch nicht-linear sind 4. Reste R normal zur Faltblattebene in "-Struktur bzw. zur Tangente der !-Helix 5. Faltblattebenen sind oft verbogen (twisted), Helices leicht geknickt 6. Helix-brechende Aminosuren (Pro, Gly) beenden meist Helices, kommen aber gelegentlich auch im Helixinnern vor 7. Unpolare Aminosuren innen und polare aussen fhren zu minimaler Energie 8. Dichte Packung; innerer hydrophober Kern nicht hydratisiert, flssig-kristallin, FestkrperEigenschaften; %&1.3 g/cm3. Selten findet man Lcher mit H2O oder Ionen im Moleklinneren.

2. Die dreidimensionale Struktur von Proteinen

Beispiel: Myoglobin ist ein kleines Protein (153 AS), welches nur !-helikale Sekundrstrukturen und Verbindungsschlaufen enthlt. Die Tertirstruktur lsst sich formal als eine Zusammenlagerung von Sekundrstrukturelementen (bei Myoglobin !-Helices) auffassen, die durch Peptidschlaufen (loops) an der Oberflche des Proteins miteinander verbunden sind. Deshalb kommen in der Tertirstruktur auch Seitenketten miteinander in Berhrung, die in der Primrstruktur weit auseinander liegen (Fernordnung). Amphipathische !-Helices: Die Zylinderflche jeder !-Helix des Myoglobins ist zur Hlfte an der Oberflche (polare Seitenketten). Die andere Hlfte des Zylinders ist vom Lsungsmittel abgeschirmt, weil sie nach innen ausgerichtet ist (apolare Seitenketten).

Es gibt viele Strukturtypen (Faltungstypen, engl. folds) , die nur !-Helices oder "Faltbltter + Verbindungsschlaufen enthalten. 0% Faltblatt: z.B. Myoglobin, Myohemerythtrin, Tropomyosin, Rhodopsin, Cytochrom b562 (Membranproteine)

0% Helix: z.B. Immunoglobulindomnen, Superoxid-Dismutase

2. Die dreidimensionale Struktur von Proteinen

Am hufigsten ist jedoch die Kombination aller Strukturelemente, z.B. Triosephosphatisomerase (TIM, links) oder die Coenzym-Bindungsdomnen vieler Dehydrogenasen (rechts). Mehrdomnenproteine Ab ca. 100-150 Aminosuren bilden Proteine oft mehrere Domnen, d.h. unabhngig faltende Abschnitte der Polypeptidkette, z.B. Pyruvatkinase: A (~120 AS)

B (~230 AS)

C (~140 AS) Domne A liegt in einem Loop der Domne B. Bei der Biosynthese falten sich Domnen zunchst unabhngig voneinander und assoziieren schliesslich zur Tertirstruktur. Proteine mit mehreren Domnen sind wahrscheinlich durch zufllige Fusion der entsprechenden Gene und Selektion entstanden. Entspricht die Kristallstruktur der Struktur in Lsung (in vivo)? Proteinkristalle sind solvatisiert und enthalten ca. 50% Mutterlauge (Kristallwasser). Hydratation in Lsung (&0.4 g H2O/g Protein) liegt in der gleichen Grssenordnung wie der Wassergehalt im Kristall. ' geringe Unterschiede der Protein-Lsungsmittel Wechselwirkungen; keine signifikanten nderungen der Gleichgewichts-Eigenschaften (mittlere Abstnde von Resten, Ligandenbindung).

2. Die dreidimensionale Struktur von Proteinen

Proteine sind oft auch im Kristall enzymatisch aktiv. Unterschiede im dynamischen Verhalten, Enzymkinetik wegen der Fixierung von flexiblen Moleklteilen. Die Aufklrung von Proteinstrukturen in Lsung mittels NMR hat zudem gezeigt, dass diese mit Rntgenstrukturen weitgehend identisch sind. Unterschiede finden sich meist nur in den Loopbereichen, die in Rntgenstrukturen besser definiert sind als in Lsung (Kristallkontakte).

2.4 Quartrstruktur
bergang von der Ebene des (chemischen) Molekls zur Makrostruktur aufgrund von Wechselwirkungen nicht-kovalent miteinander verknpfter Polypeptidketten (Untereinheiten); Bildung stchiometrisch und geometrisch definierter Asssoziatstrukturen, meist verbunden mit Ausbildung biologischer Funktion. Die Krfte, die Quartrstrukturen stabilisieren, sind identisch mit den schwachen intermolekularen Wechselwirkungen, die fr die Ausbildung der Sekundr- und Tertirstruktur verantwortlich sind: H-Bindungen, hydrophobe WW, Ionenpaare. Beispiele: Dimer Trimer Tetramer homogene Quartrstrukturen Myosin Kollagen heterogene Quartrstrukturen Tubulin (!") Trimere G-Proteine (!"() Haemoglobin (! "2); Proteinkinase A (R2C2)
2

Kollagen-Triplehelix: besteht aus repetitiven Tripeptiden (Gly-Pro-Pro- oder Gly-Pro-Hypro)n und bildet lange Filamente (wie Seile). An der Kontaktoberflche sind keine Seitenketten

Hydroxyprolin entsteht als posttranslationelle Modifikation von Prolin:

(erst nachdem das Protein synthetisiert wurde)

Coiled-coils: sind hufig vorkommende Oligomerisierungsdomnen. Di-, tri-, tetra- und pentamere Coiled-coils sind bekannt. Homo- und Hetero-oligomere, meist parallel, selten antiparallel. Die Polypeptidketten bilden !-Helices, wobei in jeder Heptade a-b-c-d-e-f die AS a und d hydrophobe Seitenketten besitzen. Dadurch entsteht auf der Helixoberflche ein "hydrophober Streifen" der sich langsam um die !-Helix windet. Zwei oder mehr solcher Helices knnen sich mit ihren hydrophoben Oberflchen aneinanderlagern, sodass sie sich umeinanderwinden (eben "coiled coils").

2. Die dreidimensionale Struktur von Proteinen

Vorteile von Oligomeren Proteinen: Kooperativitt ' Regulation der Aktivitt Geringere osmotische Aktivitt. Der Dissoziations-Assoziations-Zustand (GluDH, Hb, etc) wird durch Gleichgewichtskonstante/n Kd definiert. Hufig korreliert der Assoziationszustand mit der nderung oder dem Verlust der Aktivitt: Assoziation ermglicht Kommunikation (Kooperation) von Untereinheiten durch Konformationsnderungen: positive oder negative Effektoren verschieben Konformations- oder Assoziations-Gleichgewichte und bewirken Affinittserhhung oder -erniedrigung. Allosterie am Beispiel der O2-Bindung an Hmoglobin Myoglobin (Mb) und Hmoglobin (Hb) haben fast identische 3-D Strukturen, aber Myoglobin ist monomer whrend Hmoglobin tetramer (!2"2) ist.

Die Sauerstoffbindung erfolgt ber die prosthetische Gruppe Hm, die nicht-kovalent an das Protein gebunden ist. Auf Grund starker Absorptionsbanden um 550 nm der Hm haben beide Proteine eine rote Farbe. Die Apo-Proteine sind dagegen farblos.

2. Die dreidimensionale Struktur von Proteinen

Die Quartrstruktur von Hmoglobin ermglicht allosterische Wechselwirkungen zwischen den Untereinheiten. Sauerstoffbindung an einer Untereinheit beeinflusst die Bindung an den anderen: Die Bindungstellen verhalten sich kooperativ. Die Bindung des ersten O2 hat geringe Affinitt (geringe Zunahme der Bindung bei steigender O2-Konzentration). Die Bindung des zweiten, dritten und schliesslich vierten O2 wird immer leichter, wodurch die Bindungskurve steiler wird, bevor sie sich dann asymptotisch dem Maximum annhert. Es ergibt sich eine sigmoidale Sauerstoffbindungskurve fr Hmoglobin. Dies ermglicht eine effizientere Sauerstofffreisetzung im Muskel und die bertragung des Sauerstoffs auf Myoglobin.

Fr allosterische Wechselwirkungen, wie sie in Hmoglobin vorkommen, wurden verschiedene Modelle vorgeschlagen. Die wichtigsten sind das sequentielle Modell und das konzertierte oder Alles-oder-Nichts Modell:

Die Sauerstoffbindung an Hb kann mit konzertiertem Modell gut beschrieben werden. Der tatschliche Mechanismus liegt zwischen den beiden Modellen. Die O2 Bindung an Hm wird durch verschiedene Parameter reguliert. Dabei sind der pH-Wert und das in Erythrozyten in hohen Konzentrationen vorkommende 2,3-Bisphosphoglycerat (BPG) am wichtigsten: Der pH-Wert in der Nhe von Gewebe mit aktivem Metabolismus (z.B. Muskeln) ist niedriger als in der Lunge. Dies erhht die Effizienz der Saurestoffabgabe von Hmoglobin and Myoglobin. BPG bindet spezifisch an einen Bereich mit positiv geladenen Aminosuren. Dadurch verringert sich die Sauerstoffaffinitt (Stabilisierung der niedrigaffinen T-Form, s.u.).

2. Die dreidimensionale Struktur von Proteinen

10

Durch den Effekt von BPG wird die Sauerstoffaufnahme und -abgabe bei physiologisch relevantem p(O2) mglich. Foetales Hmoglobin besteht aus !2(2. Die (-Untereinheiten reduzieren BPGBindung, was zu erhhter Affinitt fr O2 fhrt, d.h. zu effizienterer bertragung vom mtterlichen zum foetalen Blut.

2.5 Superstrukturen (Makrostruktur)


Funktionelle Einheiten werden zu mikroskopischen bzw. makroskopischen Assoziaten zusammengefgt: Haut, Haare, Horn Bnder Knochen, Sehnen, Bindegewebe, Haut Muskel Flagellen Cytoskelett, Spindelapparat Virenpartikel Struktur-Funktionsbeziehung makroskopisch Mechanismus). Keratin Elastin Kollagen Actin, Myosin, Tropomyosin Flagellin Actin, Tubulin virale Hllproteine erkennbar: Muskelkontraktion (sliding filament-

Assoziation ist hufig Entropie-getrieben, obgleich Ordnung entsteht: Freisetzung von Wassermoleklen!

2. Die dreidimensionale Struktur von Proteinen

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2.6 Faltung der 1D Sequenz zur 3D Struktur


Nur die wenigsten Zufallssequenzen knnen sich zu einer definierten Tertirstruktur falten. Die Evolution hat einige Milliarden Jahre Zeit gehabt, faltbare Sequenzen zu entdecken. Dennoch sind native Proteine unter physiologischen Bedingungen (T = 25 10C, pH = 7.0 0.5, Ionenstrke = 0.2 0.15 M) nur marginal stabil. In den 60er Jahren wurde von Anfinsen gezeigt, dass alleine die Primrstruktur die 3D Struktur determiniert. Es gelang ihm, reduzierte, entfaltete RNase A durch nderung der Lsungsmittelbedingungen ohne zustzliche zellulre Komponenten rckzufalten (analog zum Entkochen eines Eies).

Nach der thermodynamischen Hypothese stellt die 3D Struktur den Zustand minimaler potentieller Energie dar. Die kinetische Hypothese dagegen nimmt an, dass die 3D Struktur das kinetisch zugngliche Minimum der potentiellen Energie ist, also nicht unbedingt das globale Minimum. Theoretische Strukturberechnungen sowie experimentelle Daten zur Rckfaltung ausgehend von den verschiedensten Entfaltungsbedingungen sprechen fr die thermodynamische Hypthese. In manchen Proteinen scheint es jedoch alternative Zustnde (lokale Energieminima) zu geben, die durch nderungen der (Lsungsmittel-)Bedingungen zum globalen Minimum werden (vgl. Faltungskrankheiten: Alzheimer, BSE, ). Das Gleichgewicht der Proteinfaltung Der ungefaltete Zustand (U) eines Proteins besteht aus einem Ensemble von sehr vielen (n >> 1030) statistischen Konformationen (random coil) und steht in einem dynamischen Gleichgewicht mit dem nativen Zustand (N):

kf ku

[3-1]

Im Gleichgewicht sind die Vorwrts- und Rckwrtsreaktion gleich schnell, also

k f ! [U ]eq = ku ! [N ]eq
und es wird eine Gleichgewichtskonstante (Keq) definiert als:

[3-2]

2. Die dreidimensionale Struktur von Proteinen

12

Keq0 : =

[ N ]eq [U]eq

kf ku

[3-3]

Die freie Enthalpie (!G) fr die Bildung von N ergibt sich aus (siehe allg. Chemie):
"G 0 = #RT ln K eq

[3-4]

Sie liegt fr Proteine typischerweise im Bereich von 10 bis 40 kJ/mol, was einer Keq von 50 bis 107 entspricht. Dieser Wert entspricht beispielsweise der Stabilisierungsenergie von nur wenigen HBrcken oder Salzbrcken und zeigt, dass im Gleichgewicht ein signifikanter Teil der Molekle im ungefalteten Zustand vorliegt. Die Labilitt der Proteine ist offenbar der Preis fr die Ausbung einer bestimmten Funktion. Spezifische Bindung eines Hormons ("Erkennung"), Katalyse einer Stoffwechselreaktion, oder Signaltransduktion erfordern allgemein eine diskrete Konformationsumwandlung des Proteins (siehe Kapitel 3: Enzyme). Stabile, d.h. starre Strukturen sind fr diese Aufgabe ungeeignet. Zudem ist die Regulation der Proteinmengen in der Zelle mit zu stabilen Strukturen schwierig (N meist resistent gegen Abbau durch Proteasen). Proteindenaturierung Wenn die usseren Bedingungen zu stark von den physiologischen Werten abweichen, verlieren Proteine ihre definierte native Struktur (N): Zugabe von HCl (pH<2) oder KOH (pH>12) denaturiert viele Proteine auf Grund der Abstossung gleicher Ladungen. Erwrmen fhrt zur reversiblen Entfaltung von Proteinen. Beim Abkhlen wird die native Struktur jedoch wieder erreicht. Beispiel: Ribonuklease A Hohe Konzentrationen chaotroper Substanzen wie Harnstoff (NH2-CO-NH2) oder Guanidinium Chlorid (GdmCl; [NH2-CNH-NH2]+Cl-) binden an die Polypeptidekette. Dadurch wird der entfaltete Zustand relativ zum nativen Protein stabilisiert.

2. Die dreidimensionale Struktur von Proteinen

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Welche Krfte stabilisieren den nativen Zustand? Der geringe Wert von !G (~ (10-40) kJ/mol, siehe oben) zwischen N und U ist die kleine Differenz zwischen grossen Summen von destabilisierenden und stabilisierenden EnergieBeitrgen:

"G 0 = #RT ln K eq = "H 0 # T"S 0

[3-5]

Da der Faltungsprozess in wssriger Lsung abluft, mssen nderungen in )H0 und )S0 im Protein und im Lsungsmittel bercksichtigt werden: Destabilisierung durch die enorm hohe Anzahl (n >> 1030) rumlicher Konformationen des denaturierten Zustands (Kettenentropie): ' T!S0Kette < 0. Stabilisierung durch den hydrophoben Effekt. Im denaturierten Zustand bilden sich geordnete Wasserstrukturen um jede hydrophobe Seitenkette. Diese Ordnung wird bei der Faltung zur nativen Struktur aufgehoben (Wasserentropie): ' T!S0Wasser> 0. Stabilisierung durch die Ausbildung eines hydrophoben Inneren (van-der-Waals Wechselwirkungen hydrophober Seitenketten), sowie von H-Brcken und Salzbrcken: ' )H0Kette < 0. Destabilisierung durch den Verlust von Wechselwirkungen mit dem Lsungsmittel (z.B. HBrcken) und im Lsungsmittel (Klathratstrukturen von Wasser um hydrophobe Seitenketten): 0 )H Kette/LM > 0.

Der Verlust von H-Brcken mit dem Lsungsmittel kann nur kompensiert werden, wenn die >N-H und >C=O Gruppen aller internen Peptidbindungen im nativen Zustand auch Wasserstoffbrcken bilden. Dieser Zwang erklrt die Ausbildung von !-Helices und "-Faltblttern im Innern nativer Proteine. Disulfidbrcken zwischen Cystein-Seitenketten stabilisieren Proteine zustzlich, weil der Konformationsraum des ungefalteten Proteins eingeschrnkt ist (entropische Destabilisierung von U), und weil in der Umgebung der Disulfidbrcken die Wechselwirkungen im nativen Protein strker sind (enthalpische Stabilisierung von N). Schlussfolgerungen: Die Struktur eines nativen Proteins wird ausschliesslich durch dessen Aminosuresequenz bestimmt. Oft reicht eine Punktmutation aus, um ein Protein aus energetischen Grnden unfaltbar zu machen; z.B. durch Austausch eines Leucins im Innern des Proteins durch ein Arginin. Vererbbare Krankheiten (inaktive Enzyme) knnen auf solchen Mutationen beruhen.

2. Die dreidimensionale Struktur von Proteinen

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Wie faltet sich ein Protein bei der Biosynthese? Versuche zur Rckfaltung von knstlich denaturierten Proteinen beweisen, dass sich kleine Proteine innerhalb von Millisekunden bis Sekunden zurckfalten knnen. Dabei wird oft ein kompakter Zwischenzustand (I, molten globule) durchlaufen.
U
kUI kIU

kIN kNI

[3-6]

In I ist ein Teil der Sekundrstruktur bereits ausgebildet, aber die exakten Seitenkettenwechselwirkungen sind noch nicht vorhanden. Das Protein im U- und im I-Zustand hat die starke Tendenz, in unproduktiven Nebenreaktionen unlsliche Aggregate zu bilden, da die hydrophoben Seitenketten noch nicht im Innern des Proteins vor unspezifischen intermolekularen Wechselwirkungen geschtzt sind.
U
kUI kIU
kagg Aggr.

kIN kNI
k'agg

[3-7]

Aggr.

Im Cytoplasma (d.h. in der Umgebung der Ribosomen) befindet sich eine Klasse von Proteinen, die bei der richtigen Faltung grsserer Proteine sowie beim Transport von Proteinen in und durch Membranen helfen. Sie binden an lsungsmittelzugngliche hydrophobe Bereiche der frisch synthetisierten Proteine (in U oder I), wodurch die Aggregation verhindert und somit die korrekte Faltung zu N begnstigt wird. Weil sie die Faltung kanalisieren, werden sie molekulare "Chaperones" (Anstandsdamen) genannt (z.B. Hsp70, GroE). Andere zellulre Proteine greifen direkt in den Faltungsprozess ein, indem sie langsame Schritte der Proteinfaltung wie Isomerisierungsreaktionen um Xaa-Pro Peptidbindungen (Prolylisomerasen) oder die Bildung der korrekten Disulfidbrcken (Protein-Disulfid-Isomerasen) katalysieren oder Aggregation verhindern (Chaperones, Heat-shock-proteins).

ENZYME

3.1 Enzyme: Katalysatoren elementarer Stoffwechselreaktionen


Fr den koordinierten Ablauf des Stoffwechsels sind katalytisch wirksame Proteine Enzyme verantwortlich. Enzyme sind echte Katalysatoren: chemische Reaktionen werden durch ihr Einwirken sowohl vorwrts als auch rckwrts beschleunigt. D.h., das thermodynamische Gleichgewicht wird nicht verndert, aber die Energiebarriere fr den Uebergang zwischen Substrat und Produkt wird herabgesetzt. Enzyme greifen direkt in die Reaktion ein, gehen aber dennoch unverndert aus ihr hervor. Das Enzym bindet das Substrat am aktiven Zentrum. Im gebundenen Zustand ist die Energiebarriere geringer, um das Substrat in den Uebergangszustand zu berfhren. Auch das Produkt wird gebunden, denn das Enzym katalysiert ja auch die Rckreaktion. Weil Enzyme einen neuen Reaktionsweg anbieten, eben in der Umgebung des aktiven Zentrums, kann die katalysierte Reaktion rascher ablaufen als die unkatalysierte.

3.2 Struktur/Funktionsbeziehung in Proteinen


Besondere Eigenschaften Enzyme knnen extrem effizient sein: bis zu 109-fache Beschleunigung. Enzyme sind meist sehr spezifisch: pro Stoffwechselreaktion ein Enzym ("ein Enzym, ein Substrat, ein Produkt"). Die Funktion eines Enzyms kann reguliert werden. Enzyme an strategisch wichtigen Knotenpunkten des Netzwerks von Stoffwechselreaktionen knnen durch chemische Signalsubstanzen (sog. Effektoren) an- oder abgeschaltet werden (Regulation der Aktivitt bei gleichbleibender Enzymkonzentration).

3. Enzyme

Beispiel: Biosynthese von Phenylalanin, Tyrosin und Tryptophan Bei gengender Konzentration des Endprodukts einer komplizierten Biosynthese-Route (z.B. Tryptophan) wird ein Enzym gehemmt, das am Eingang zu dieser Einbahnstrasse steht, (z.B. DHAP-Synthasen sowie eine der drei Anthranilatsynthasen; negative Rckkopplung). Synthese und Abbau von Enzymen knnen ebenfalls reguliert werden (Regulation der Enzymmenge bei gleichbleibender Aktivitt).

Das aktive Zentrum

Die Bildung eines EnzymSubstratkomplexes ist der erste Schritt jeder enzymkatalysierten
Reaktion. Das Substrat bindet an das aktive Zentrum, meist eine Vertiefung an der Oberflche des Enzyms (z.B. durch ionische Wechselwirkung, H-Brcken, etc.). Bindung bedeutet, dass Krfte zwischen dem Protein und dem Substrat wirken. Proteinen und Substrat sind nicht absolut starr. Deshalb sind Substrat und aktives Zentrum nicht exakt komplementre Abbilder voneinander (Lock-and-key), sondern es ergibt sich eine Anpassung zwischen Substrat und dem aktiven Zentrum: eine induzierte Konformationsnderung (Inducedfit).

Lock-and-key-Modell

Induced-fit-Modell

Induced-Fit bei der Substratbindung an Hexokinase. Glukose induziert jene Konformation, welche berhaupt erst in der Lage ist, das 2. Substrat (ATP) zwischen der dunklen und hellen Domne zu binden. Im geschlossenen Zustand ist Wasser vom Zugang zum aktiven Zentrum ausgeschlossen.

3. Enzyme

Aminosuren mit potentiell reaktiven Seitenketten knnen direkt an der Katalyse beteiligt sein: Lys, His, Ser, Tyr, Cys, Glu und Asp. Alle Aminosuren knnen zur Bindung des Substrats und zu den Eigenschaften der Umgebung beitragen (Salzbrcken, H-Brcken, van der Waals-Wechselwirkung, etc.). Koenzyme und Kofaktoren Die chemische Reaktionsfhigkeit der elf polaren Aminosure-Seitenketten ist ungengend fr die Katalyse einiger Stoffwechselreaktionen, vor allem Redoxreaktionen. Kleine organische Molekle oder anorganische Kationen erweitern das katalytische Repertoir.
Metallionen als Kofaktoren.

Metallion Na+, K+ Mg++ Cu++ Zn++ Mn++ Ni++ Fe++/Fe+++

Enzym ATPase, Pyruvatkinase Phosphohydrolasen, Phosphotransferasen, Malatsynthase Tyrosinase, Cytochromoxidase ADH, Carboanhydrase, Carboxypeptidase Pyruvatcarboxylase Urease Cytochrome, Ferrodoxin, Peroxidase, Katalase Enzym/Funtion Transaminase, Decarboxylase Decarboxylase, Acyl-Transfer Acyl-Transfer Carboxylase C1-Transfer Oxidoreduktase Oxidoreduktase Oxidoreduktase Vitamin Pyridoxin Thiamin Pantothensure Liponsure Biotin Folsure Niacin Riboflavin Riboflavin

Koenzyme und dazugehrige Vitamine (behandlt in spteren Kapiteln).

Koenzym PLP = Pyridoxalphosphat TPP = Thiaminpyrophosphat CoA = Coenzym A Lipoamid Biotin FH4 = Tetrahydrofolat NAD+ = Nicotin-adenin-dinukleotid FAD = Flavin-adenin-dinukleotid FMN = Flavin-monomukleotid

Beispiel: Carboxypeptidase A ist ein Metallo-Enzym: Das Zn2+ polarisiert die C=O Gruppe des Substrats und erleichtert somit die Addition eines H2O.

3. Enzyme

3.3 Katalysemechanismus von Proteasen

Spezifitt am Beispiel von Serin-Proteasen Proteasen hydrolysieren die Peptidbindungen von denaturierten Proteinen. In nativen Proteinen sind die meisten Peptidbindungen durch die kompakte Faltung vor Proteasen geschtzt.

Trypsin hydrolysiert die Peptidbindung auf der Carbonyl-Seite von (dh "nach") positiv geladenen Aminosuren: Lys und Arg. Chymotrypsin hydrolysiert nach grossen, hydrophoben Seitenketten: hauptschlich Trp, Phe, Tyr. Elastase hydrolysiert nach kleinen, ungeladenen Seitenketten. Die Spezifitt beruht auf der unterschiedlichen Ausstattung einer Vertiefung (specificity pocket), in

3. Enzyme

die die kritische Aminosure Seitenkette des Protein-Substrats hineinpassen muss:

Katalysemechanismus von Chymotrypsin

Das aktive Zentrum: Die OH-Gruppe von Ser195 wird durch ein H-Brcken-System mit His57
und Asp102 aktiviert (Verringerung des pKa-Wertes, Erhhung der Nukleophilie). Die katalytische Triade Asp --- His ---Ser*.

Spezifische Bindung, so dass die Peptidbindung optimal zu Ser195 positioniert wird ist nur bei
Trp, Phe, oder Tyr mglich.

Kovalente Katalyse: His57 (untersttzt von Asp102) deprotoniert partiell Ser195, das die
Carbonylgruppe nucleophil angreift; das N-terminale Polypeptid ist vorbergehend ans Enzym verestert, whrend das C-terminale Polypeptid dissoziiert. Hydrolyse: Wasser erhlt Zugang zum Ester, wird durch His65 aktiviert und greift den Ester an. Das N-terminale Peptid dissoziiert als zweites Produkt und hinterlsst unverndertes Enzym.

3. Enzyme

3.4 Enzymkinetik
Einfache Stoffwechselreaktionen Die Chorismatmutase katalysiert die praktisch irreversible Umwandlung von Chorismat in Prephenat. Ein Substrat ! ein Produkt.

Geschwindigkeitsgesetz der spontanen (unkatalysierten), irreversiblen Reaktion

[4-1]

Umsatzkurve: Die Konzentration von A (Anfangskonzentration [A0]) fllt nach einem


exponentiellen Zeitgesetz gegen Null ab.
[At] (M) [Ao]

1/ k

t (min)

Verlauf einer sponatenen, irreversiblen Reaktion erster Ordnung.

Die Geschwindigkeit (v) der Reaktion ist gegeben durch:

v=!

d[ A ] = k[ A] dt

mit k [ s!1 ]

[4-2]

Integration von Gleichung 4-2 ergibt:

[ A] = [A]0 e ! k"t
Aus Gl. 4-3 wird der exponentielle Abfall der Konzentration von A ersichtlich.

[4-3]

Aus Gl. 4-2 folgt, dass die Anfangsgeschwindigkeit (v0) proportional zur bekannten Anfangskonzentration ([A]0) ist:

v0 = !

" d[A ]$ = k[ A]0 # dt % t =0

[4-4]

3. Enzyme

Abhngigkeit der Geschwindigkeit einer unkatalysierten Reaktion 1. Ordnung von der Substratkonzentration ([S]0)

Geschwindigkeitsgesetz der enzymkatalysierten Reaktion (Michaelis-Menten Gleichung) In einer enzymkatalysierten Reaktion bindet das Enzym (E) sein Substrat (S) und es kommt zur Bildung eines Enzym-Substrat-Komplexes (ES). Nach Umwandlung vom Enzym-SubstratKomplex zum Enzym-Produkt-Komplex EA ! EP dissoziiert EP sofort zu E+P, sodass sich EP nicht anhuft: [4-5] Sttigungskurve: Der charakteristische Unterschied zwischen der enzymkatalysierten und der spontanen Reaktionen besteht in der Form der Substratabhngigkeit der Anfangsgeschwindigkeit, v0. Trotz hnlichkeit mit der Umsatzkurve der spontanen Reaktion handelt es sich nicht um eine Exponentialkurve. Bei der spontanen Reaktion ist v0 proportional zur Anfangskonzentration. Bei der enzymkatalysierten Reaktion weicht die Substratabhngigkeit rasch von der Geraden ab und nhert sich einer horizontalen Asymptote (Vm, die maximale Geschwindigkeit). Die Kurve ist Teil einer Hyperbel (hyperbolische Sttigungskurve):

v 0 = k23 " [ ES ] =

[ S ]0 " [ E ]0 " k 23 K M + [ S ]0

[4-6]

Abhngigkeit der Geschwindigkeit einer katalysierten Reaktion von der Substratkonzentration ([S]0)

Das Sttigungsverhalten ist typisch fr katalysierte Reaktionen, bei denen der Katalysator in geringer, aber konstanter Konzentration ([E0]) vorliegt.

3. Enzyme

Kurvendiskussion:

Bei [S]0 >> KM nhert sich v0 asymptotisch der maximalen Geschwindigkeit vmax: Die
Geschwindigkeit der katalysierten Reaktion ist direkt von der Enzymkonzentration abhngig. [E]0 ist die totale Konzentration der aktiven Zentren. Bei oligomeren Enzymen muss also die Zahl der identischen Untereinheiten bercksichtigt werden.

(v 0 )[ S ] >> K
0

= v max = k 23 " [ E ]0

[4-7]

Unter diesen Bedingungen ist das Enzym mit Substrat gesttigt. Das gesamte Enzym liegt als Enzym-Substrat-Komplex vor: [ES] ! [E]0. Die Geschwindigkeitskonstante k23 ist die katalytische Konstante oder Wechselzahl und hat die Dimension einer Frequenz (s-1). Sie bedeutet die ! durchschnittliche Anzahl von katalytischen Zyklen, die ein einzelnes aktives Zentrum pro Sekunde maximal durchfhren kann.

Bei [S]0 = KM erreicht v0 die halbmaximale Geschwindikgeit (v0 = 1/2vmax; siehe Gl. [4-6]). Zu
Ehren von Michaelis wird die Konstante KM Michaelis-Konstante genannt.

Bei [S]0 << KM liegt nur ein geringer Teil der Enzym-Molekle als ES-Komplex vor. Es gilt:

( v0 )[ S]

0 <<K M

k23 [ E ]0 "[ S ] 0 KM

[4-8]

k23/KM hat die Dimension einer Geschwindigkeitskonstante 2. Ordnung (M-1s-1). Sie dient als
quantitative Kennziffer sowohl fr die relative Spezifitt als auch fr die relative Effizienz eines Enzyms. Sie ist ein wichtiges Kriterium zum Vergleich von mutierten Enzymen mit dem WildTyp.

3.5 Wie kann die Enzymaktivitt reguliert werden?


Kompetitive Hemmung Die effiziente Umwandlung von Substrat in Produkt im aktiven Zentrum eines Enzyms erfordert eine genaue und komplementre Wechselwirkung zwischen funktionellen Gruppen des Substrats (-OH, -NH3+, -OPO3 Gruppen, etc.) und den Aminosureseitenketten des Enzyms. Weil die Strukturen von Produkt und Substrat oft sehr hnlich sind, fhrt die Anwesenheit von Produkt bei der Substrat ! Produkt Reaktion hufig zu einer Hemmung der Enzymreaktion. Beispiel: Phosphoglucoisomerase

3. Enzyme

Wenn sich das Produkt anhuft, bindet es an einen Teil der vorhandenen Enzymmolekle und blockiert damit die Bindung von Substratmoleklen. Produkthemmung ist kompetitiv: Konkurrenz um denselben Bindungsort, nmlich das aktive Zentrum. Kompetitive Hemmstoffe: Chemische Substanzen, die dem Substrat oder Produkt strukturell hnlich sind (Substratanaloga), aber selbst keine enzymkatalysierte Reaktion durchlaufen. Zugang durch chemische Synthese. Viele Medikamente (z.B. Sulfonamid, ein Antibiotikum, oder Azidothymidin, ein Chemotherapeutikum gegen HIV-Virus) sind kompetitive Hemmstoffe fr essentielle Enzyme des pathogenen Organismus. Nicht-kompetitive Wechselwirkungen Ein wichtiger Mechanismus zur Weiterleitung von Information ist die Konformationsumwandlung von Proteinen (z.B. Enzymen, Rezeptoren) durch kleine Molekle (chemische Signale oder Effektoren). Auf diese Weise verndert die Bindung eines regulatorischen Metaboliten oder Hormons an eine regulatorische Bindungsstelle auch die Struktur des aktiven Zentrums und umgekehrt (indirekte Wechselwirkung). Die Kommunikation zwischen den beiden nichtberlappenden Bindungsstellen ist nicht-kompetitiv: Beide knnen gleichzeitig besetzt sein. Daraus folgt, dass diese Form von Signalbertragung nicht wie im Fall kompetitiver Hemmung notwendigerweise zu einer Hemmung fhren muss. Im Gegenteil: Nicht-kompetitive Wechselwirkung kann auch zur Aktivierung eines Enzyms fhren.

Allosterische Regulation Bei oligomeren Enzymen kann die vom Substrat oder Effektor in einer Untereinheit induzierte Konformationsumwandlung an die anderen, noch unbesetzten aktiven Zentren der brigen Untereinheiten weitergeleitet werden. Wie bei der Sauerstoffbindung ans tetramere Hmoglobin (siehe oben) ergibt sich eine sigmoide Aktivittskurve. Am Beispiel des allosterischen Enzyms Aspartat Carbamoyl-Transferase ACT (Pyrimidinsynthese) ist die sigmoide Sttigungskurve bezglich des Substrats (Aspartat) durch den allosterischen Aktivator ATP zu niedriger und durch den allosterischen Inhibitor CTP zu hherer Substratkonzentration verschoben. Bei derselben Aspartatkonzentration ist der Umsatz in Gegenwart von ATP grsser (Aktivierung), in Gegenwart von CTP jedoch niedriger (Hemmung).

3. Enzyme

10

Experimentell kann die Reaktionskinetik besonders einfach verfolgt werden, wenn einer der Reaktionspartner eine nderung der Absorptionseigenschaften erfhrt. Dies is zB bei Reaktionen der Fall, bei denen NAD+/NADH oder NADP+/NADPH beteiligt sind. NAD+ und NADP+ nehmen ausschliesslich Elektronenpaare auf. Die zwei Elektronen werden gleichzeitig aufgenommen (vergleiche mit FAD und FMN weiter unten). In den meisten Fllen sind auch zwei Protonen beteiligt, wobei eines zusammen mit den Elektronen auf NAD(P)+ bertragen und das andere in die Lsung abgegeben wird. Man kann + formell schreiben: NAD+ + H + H + NADH + H oder
NAD + 2 H + 2 e
+ + !

NADH + H

Die Enzyme sind generell Oxidoreductasen, werden ! oft Dehydrogenasen genannt. Im Gegensatz zu NAD+ absorbiert NADH bei 340 nm (Ultraviolett). So kann man zB die Lactatdehydrogenase einfach und sensitiv verfolgen:

GRUNDLAGEN DER BIOENERGETIK

4.1 Der Energiefluss in der Biosphre


Von etwa 21021 kJ Lichtenergie, die pro Jahr von der Sonne auf die Erde gelangen, werden etwa 0.1% durch photosynthetische Organismen eingefangen und als chemische Energie in Form von organischen Verbindungen in Pflanzen gespeichert. Diese chemische Energie ist die Grundlage fast aller Lebensprozesse unserer Biosphre. Beim Abbau und der Oxidation zu CO2 wird die Energie wieder (letztlich als Wrme) freigesetzt.

In allen Organismen finden sich einige wenige fundamentale Prozesse, um chemische Energie zu nutzen und zu speichern.

4.2 Energiereiche Verbindungen


"Kurzfristige" Energie Der unmittelbare Energiespender fr viele biologische Reaktionen ist Adenosintriphosphat (ATP). ATP besteht aus Adenin, einer organischen Base Ribose, einem C5-Zucker Triphosphat, eine Kette von drei Phosphoprylgruppen Verbindungen wie ATP werden als energiereiche Verbindungen bezeichnet. Dies bedeutet nicht, dass das Molekl an sich einen hohen Energiegehalt hat, sondern dass es eine stark exergone (= energieliefernde) Reaktion mit Wasser oder mit einem anderen Phosphorylakzeptor eingehen kann.

4. Bioenergetik

Die C-Atome am Adeninring werden mit normalen Ziffern, die am Ribosering mit apostrophierten Ziffern, und die Phosphorylreste mit griechischen Buchstaben bezeichnet.

In der Zelle ist die gesamthaft in ATP gespeicherte Energie sehr klein; ATP muss deshalb schnell erneuert werden, wobei diese energiebedrftige Synthese auf Kosten langfristiger Energiereserven erfolgt. Ein Mensch synthetisiert tglich das Aequivalent von ~100 kg ATP aus ADP und Pi! ATPasen, knnen Phosphorylgruppen von ATP auf Wasser bertragen, was auch als Hydrolyse, d.h. als Spaltung von ATP durch Wasser betrachtet werden kann. Die meisten ATPasen knnen einen Teil der dabei frei werdenden chemischen Energie in andere Energieformen umwandeln, z.B. die Kontraktion einer Muskelfaser, Transport von Moleklen durch eine Membran und die Lichtproduktion eines Glhwrmchens. Die spontane Hydrolyse von ATPgeschieht vernachlssigbar langsam. Kinasen sind Enzyme, die die Phosphorylgruppe des ATP nicht auf Wasser, sondern auf andere organische Akzeptoren (z.B. Zucker oder Proteine) bertragen "Mittelfristige" Energie Einige energiereiche, phosphorylierte Verbindungen knnen energiebedrftige Reaktionen in Zellen nicht direkt treiben, knnen aber ihre Phosphorylgruppe schnell (gewhnlich in einem einzigen enzymatisch katalysierten Reaktionsschritt) auf ADP bertragen und ATP produzieren. Z.B.:

O O P O
O O P N H O NH2+ N H O O

O H2C O
Phosphoenolpyruvat (PEP)

O O P O O

H3 C

Phosphocreatin = Creatinphosphat

Acetylphosphat

"Langfristige" Energie Die wichtigsten Energiereserven lebender Zellen sind Fette und Kohlehydrate (Glycogen, Strke). Auch Proteine knnen als Energiereserven fungieren, werden jedoch seltener verwendet, da dies einer "Verbrennung des Mobiliars" gleichkommt. Diese organischen Verbindungen knnen energiebedrftige Prozesse in lebenden Zellen nicht direkt antreiben; sie werden durch komplexe exergone Reaktionsfolgen zu kleineren Bruchstcken abgebaut. Bei diesem Abbau wird entweder direkt ATP aus ADP und Pi gebildet, oder die entstandenen Bruchstcke werden oxidiert und die bei dieser Verbrennung freiwerdende Energie wird zur Synthese von ATP verwendet. Die wichtigsten dieser Reaktionsfolgen sind Glykolyse, Fettsureabbau (!-Elimination) und oxidative Phosphorylierung.

4. Bioenergetik

4.3 Biochemische Gleichgewichte


Der Standardzustand von ! G Die freie Enthalpie G (Gibbs-Energie, engl. free energy) eines Systems setzt sich aus einer Enthalpie- (H) und einer Entrropie-Komponente (S) zusammen (T = absolute Temperatur):

G = H " TS
Die nderung der freien Enthalpie, z.B fr eine chemische Reaktion, bei konstatem Druck und Volumen ist ! "G = "H # T"S
!G

bestimmt die Gleichgewichtslage der Reaktion: !G = 0 Gleichgewicht ! !G < 0 spontane Reaktion !G > 0 nicht spontan

Um unterschiedliche Reaktionen einfach vergleichen zu knnen, betrachtet man jeweils den Standardwert !G0, der dem !G einer Reaktion entspricht, wenn alle Reaktanden (Edukte und Produkte) mit der chemischen Aktivitt a = 1 M in Wasser bei 298.15 K (25C) und 1 atm vorliegen. Die Aktivitt entspricht der "effektiven Konzentration" und ist bei idealem Verhalten identisch mit der Konzentration. Bei von 1 M abweichenden Konzentrationen gilt fr eine Reaktion mit Reaktionspartnern i und stchiometrischen Koeffizienten !i

!G = !G 0 +

RT "

$ i #i ln

ai 1M

Die !i der Ausgangsstoffe sind negativ und die der Produkte positiv. Fr biochemische Reaktionen die H+ oder OH involvieren, wrden !G0-Werte allerdings fr unsinnig tiefen bzw. hohen pH gelten. Deshalb wurden biochemische Standardbedingungen definiert fr pH 7, d.h. H+ und OH Konzentrationen von 107 M: !G0'. Wenn wir ideales Verhalten annehmen, kann a durch die Konzentration ersetzt werden: "G = "G 0 ' + RT #

% $ ln
i i

[i]

[i] bedeutet hier die tatschliche Konzentration dividiert durch die Standardkonzentration (1 M bzw. 107 M). ! Also z.B. fr die Reaktion

2A + B
gilt

3C + 2H+

"G = "G 0 ' + RT ( 3ln[C ] + 2ln[ H + ] # 2ln[ A] # ln[ B])

4. Bioenergetik

oder umgeformt "G = "G 0 ' + RT ln [C ] 3 [ H + ] 2 [ A]2 [ B]

Hier die !G0'-Werte einiger Reaktionen, bei denen Phosphat durch Hydrolyse abgespalten wird: !

Alle Werte sind negativ, d.h. die Hydrolysen sind exergon und laufen spontan ab (unter Standardbedingungen). Beachte: Die Hydrolyse von ATP zu ADP und Pi hat nicht das negativste !G0', sondern ein mittleres.

Standardwerte und Gleichgewichtskonstante Bei !G = 0 liegt Gleichgewicht vor, also [C ]3 [ H + ]2 0 = "G ' + RT ln [ A ] 2 [ B]
0

Fr die Gleichgewichtskonstante K gilt also !

K=

[C ]3 " [ H + ]2 [ A]2 " [ B]

=e

$G 0 RT

4. Bioenergetik

ATP und bioenergetische Kopplung Viele Reaktionen sind unter Standardbedingungen und bei den im Organismus herrschenden Konzentrationen endergonisch (!G > 0), laufen daher nicht spontan ab. Ein Beispiel ist die Phosphorylierung von Glucose (der erste Schritt der Glykolyse): Glucose + Pi - ! Glucose-6-phosphat Dagegen: ATP ! ADP + Pi
! G0 ' !G
0

= +13.4 kJ/mol

' = 30.5 kJ/mol

Bei Kopplung der beiden Reaktionen: Glucose + ATP ! Glucose-6-phosphat + ADP


! G = 17.1 kJ/mol
0"

Dabei spielt es fr die Energetik auch keine Rolle, dass im Verlauf der enzymatischen Reaktion gar kein freies Phosphat entsteht. Es ist in diesem Beispiel nicht H2O, was das "-Phosphat angreift, sondern die 6-Hydroxylgruppe der Glucose. Die Edukte und Produkte der summierten Hydrolysereaktionen und der tatschlichen Reaktion sind aber die gleichen und damit ist die Berechnung des !G0' durch Summation der formalen Teilreaktionen mglich. Auch bei anderen Reaktionen wird die Phosphatgruppe eingefhrt und von diesem "energiereichen" Phosphat (Zwischenprodukt) luft die Reaktion weiter Beispiel 2: Die Reaktion Glucose + Fructose ! Saccharose (=Rohrzucker) + H2O Hat ein !G0 = !G0' = 23 kJ/mol. Mit Hilfe der Energiebertragung von ATP: 1) ATP + Glucose ! ADP + Glucose-1-phosphat (Zwischenprodukt) 2) Glucose-1-phosphat + Fructose ! Saccharose + Pi somit ergibt sich die "gekrzte" Gesamtreaktion: ATP + Glucose + Fructose ! ADP + Saccharose + Pi mit !G0'= 23 -30.5 = 7.5 kJ/mol. Beispiel 3: Unter ATP-Verbrauch wird Glutaminsure mit Ammoniak in Glutamin umgewandelt:

4. Bioenergetik

Diesmal ist es die "-Carboxylat-Gruppe von Glutaminsure, die das "-Phosphat von ATP angreift und in einem ersten Schritt ADP produziert. Phosphoglutamat entspricht einem"aktivierten Glutamat" dessen Ammonolyse zu Glutamin ebenfalls exergon ist. ATP eignet sich sehr gut als kurzfristiger Energietrger, weil sein !G0' in der Mitte zwischen denen der "Hochenergie-" und "Niederenergie-" Phosphate steht (siehe Tabelle auf p. 4): Es kann viele Phosphorylierungsreaktionen ausfhren, viele andere Reaktionen antreiben, aber danach als ADP auch schnell von den mittelfristigen Energielieferanten, den "Hochenergie-Phosphaten" wieder zu ATP regeneriert werden. Wird mehr Energie fr eine Reaktion bentigt, kann ATP auch zwischen der #- und $Phosphatgruppe gespalten werden, wobei Pyrophosphat (PPi) und AMP entsteht:
NH2 ! O O HO HO OH OH " O O # O O P O O N N O N N

O P O P

Das Pyrophosphat wird in der Zelle durch das Enzym Pyrophosphatase sehr rasch weiter hydrolysiert in einer Reaktion, die auch wieder sehr exergon ist:
ATP + H2 O ! AMP + PPi + H PPi + H2 O ! 2 Pi + H
+ + +

!G' = -30.6 kJ/mol !G' = -33.5 kJ/mol !G' = -64.1 kJ/mol

Summe:

ATP + 2 H2O ! AMP + 2 Pi + 2 H

Das !G' der Gesamtreaktion ist entsprechend stark negativ. Die Hydrolyse von Pyrophosphat muss bei Reaktionen, die ATP zu AMP hydrolysieren, energetisch immer miteinbezogen werden. Die reine Hydrolyse von ATP ist physiologisch selten sinnvoll, weil dabei nur Wrme produziert wird. Normalerweise ist ATP-Hydrolyse in der Zelle an eine Konformationsnderung des Proteins gekoppelt (z.B. bei der Muskelkontraktion) oder an andere Reaktionen, die so "angetreiben" werden.

Wegen ATP4- + H2O ! ADP3- + H+ + Pi ist der !G-Wert der ATP-Hydrolyse pH-abhngig!

4. Bioenergetik

Grenzen der Thermodynamik Alle Aussagen der Thermodynamik gelten fr reversiblen Verlauf der Prozesse. Praktisch wird dies nicht erreicht und ein Teil der Energie wird fr irreversible Prozesse verbraucht. So liefert im Organismus die totale Oxidation von 1 Mol Glucose 32 Mol ATP C6H12O6 + 32 H+ + 32 ADP3-+ 32 Pi + 6 O2 Der Wirkungsgrad (W) ist

32 ATP4-+ 6 CO2+ 38 H2O

W =

in ATP gespeichert 32 # 30.5 kJ/mol "G 0 = = 34% 0 aus Zuckerverbrennung total "G 2879kJ/mol

Der theoretische Wirkungsgrad bei reversibler Prozessfhrung wre 100%, entspricht also mehr als der doppelten ATP-Menge. Die richtige Verbrennung von Glucose ohne angekoppelte oxidative ! Phosphorylierung wrde natrlich kein ATP liefern (W = 0). Die Thermodynamik liefert daher Aussagen ber Maximalwerte bei 100% Wirkungsgrad. Und natrlich macht die Thermodynamik keine Aussagen ber die Kinetik einer Reaktion und spontane Reaktionen brauchen daher aus kinetischen Grnden nicht abzulaufen. Nicht anwendbar ist die klassische Thermodynamik auf offene Systeme mit Stoffaustausch.

4.4 Redox-Potentiale
Redox-Reaktionen sind Elektronentransfer-Reaktionen: Reduktion = Aufnahme von Elektronen Oxidation = Abgabe von Elektronen

Elektronentransfer als freie Elektronen, z.B. V 2 + " V 3 + + e# . ! ! zusammen mit Wasserstoffatomen (formal als Hydridanionen: H + e " H ), z.B.

Hydrochinon

Benzochinon

Transfer von Protonen (H+) ist keine Redoxreaktion!

4. Bioenergetik

Reduzierende und oxidierende Substanzen Eine reduzierende Substanz hat die Tendenz, Elektronen an einen Elektronenakzeptor abzugeben. Dabei wird die reduzierende Substanz (der Elektronendonor) oxidiert und der Akzeptor reduziert. V2+ ist z.B. eine "reduzierende Substanz". Eine oxidierende Substanz hat die Tendenz, Elektronen von einem Elektronendonor aufzunehmen. 1,4-Benzochinon ist z.B. eine "oxidierende Substanz". Offensichtlich sind die Begriffe "reduzierende Substanz" und "oxidierende Substanz" nicht absolut, sondern relativ. Jeder Redoxpartner kann entweder als reduzierende oder als oxidierende Substanz dienen abhngig vom Partner in der Redoxreaktion. Zusammen mit einem extrem starken Oxidationsmittel wie K2Cr2O7 wird auch Benzochinon als reduzierende Substanz reagieren und oxidiert werden. Es ist deshalb essentiell, das Oxidations- bzw. Reduktionspotential einer Substanz zu quantifizieren. Das Redozpotential (%) wird in einer Halbzelle unter Standardbedingungen (je 1 M oxidierte und reduzierte Form der Substanz, 25C, pH 7) gemessen gegenber einer Standard-Halbzelle

H2 ! 2 H + + 2e "
(1 N HCl gesttigt mit H2-Gas), deren Potential %0' = 0 definiert ist. Das Redoxpaar V++/V+++ besitzt gegenber der Standardelektrode ein Standard-Redox-Potential von 0.255 V (d.h. es gibt Elektronen an die Standard-Halbzelle ab). Umgekehrt betrgt das StandardRedox-Potential von Benzochinon/ Hydrochinon +0.699 V (d.h. es nimmt Elektronen von der Standard-Halbzelle auf). Je "reduzierender" eine Substanz, desto niedriger ihr Standard-Redox-Potential. Je "oxidierender" eine Substanz, desto hher ihr Standard-Redox-Potential. Das Redoxpaar V++/V+++ besitzt gegenber dem Redoxpaar Benzochinon/ Hydrochinon ein RedoxPotential von 0.954 V (d.h. es wirkt reduzierend und wird oxidiert). Konzentrationsabhngigkeit des Redoxpotentials Gemss Massenwirkungsgesetz hngt das Redox-Potential einer Redoxpaars von den Konzentrationen der beiden Formen ab. Gemss der Nernst-Gleichung gilt:
' !h = !0 +

RT zF

ln

[ oxidiert ] [ reduziert ]

R T z F

= Gaskostante = 8.31 J/degmol = absolute Temperatur = Anzahl Elektronen transferiert = Faraday-Konstante (die Ladung eines Mols Elektronen) = 96'406 J/Vmol [= C/mol]

4. Bioenergetik

Fr einen Zwei-Elektronen-Transfer bei Raumtemperatur erhlt man somit:


' !h = !0 + 0.013ln

[ oxidiert ] [ reduziert ]

Wenn beide Formen in gleicher Konzentration vorliegen gilt:


' !h = !0

Anwendung auf die Atmungskette Die folgende Tabelle zeigt die Redoxpaare, die an der Atmungskette beteiligt sind, und ihre Standard-Redox-Potentiale: Redox-Paare NADH/NAD+ FMNH2/FMN (an die NADH-Dehydrogenase gebunden) QH2/Q Cytochrom c++/Cytochrom c+++ Cytochrom aa3++/Cytochrom aa3+++ O--/O %0 0.32 V 0.21 V +0.11 V +0.26 V +0.29 V +0.82 V

Wenn eine FMNH2/FMN Halbzelle (%0 = 0.21 V) elektrisch verbunden wird mit einer Ubichinol/Ubichinon (QH2/Q) Halbzelle (%0 = +0.11 V), werden die Elektronen von der ersten zur zweiten fliessen. Prinzipiell das selbe geschieht, wenn die Redox-Paare in engem Kontakt in der mitochondriellen Membran sitzen. (Man beachte, dass sich das Redoxpotential von FMN gebunden an die NADH-Dehydrogenase erheblich von jenem von freiem FMN unterscheidet). Die Redoxkomponenten der mitochondriellen Atmungskette sind in der Tabelle nach ihren Standard-Redoxpotentialen angeordnet. Das ist die gleiche Reihenfolge, in der die Elektronen in den Mitochondrien weitergegeben werden. Die Redoxkomponenten bilden eine eigentliche Elektronen-Transfer-Kette: Die Elektronen treten am "negativen Ende" ein und "fliessen hinunter" zum "positiven Ende", bis sie sich mit Sauerstoff vereinigen. Sauerstoff wird formal von O zu O-reduziert, das mit 2 H+ Wasser bildet, die bei der Oxidation der Substrate freigesetzt worden sind.

4. Bioenergetik

10

nderung der freien Energie in Redox-Reaktionen Wenn ein Mol NADH oxidiert wird durch ein Mol Coenzym Q unter Standardbedingungen, werden "zwei Mol" Elektronen (= 261023 Elektronen) eine Potentialdifferenz von 0.42 V (+0.1 (-0.32) = +0.42) durchlaufen. Diese Ladungsbewegung entspricht einer freiwerdenden Energie, die dem Produkt der Menge der elektrischen Ladung (nF) und der beschleunigenden Spannung (!%0) entspricht. Also:

!G ' = " zF !# o ' = "2 $ 96406 Cmol "1 $ 0.42V = "81 kJ / mol
Da die Synthese von ATP aus ADP und Pi unter Standardbedingungen nur 30.6 kJ/mol bentigt, sollte diese Redoxreaktion ausreichen ATP-Synthese zu ermglichen. Und sie tut es auch.

5. GLYKOLYSE
Zucker = Kohlehydrate: Summenformel (CH2O)n Aldosen = Aldehydzucker:

Ketosen = Ketonzucker:

Hier sind wichtig: Glucose, Ribose, Glycerinaldehyd und ihre isomeren Ketosen, nmlich

5. Glykolyse Glykolyse ist wohl der lteste und einfachste Reaktionsweg fr die Produktion von ATP in lebenden Zellen. Zucker werden ohne Sauerstoff zu kleineren Moleklen abgebaut. Die Energiedifferenz wird zum Teil fr die Synthese von ATP aus ADP und Pi verwendet. Die Energieausbeute ist relativ gering, da die Endprodukte der Glykolyse (z.B. Aethylalkohol oder Milchsure) noch mehr als 90% der potentiellen chemischen Energie des Startmaterials (z.B. Glucose) enthalten.

1. Hexokinase Bei dieser exergonen Reaktion wird das Glucosemolekl durch Phosphorylierung aktiviert. Kinasen = Enzyme, die eine Phosphorylgruppe von ATP auf einen Akzeptor bertragen.

2. Phosphoglucoisomerase (Aldose-P ! KetoseP)

3. Phosphofructokinase Der Zucker wird durch diese zweite Phosphorylierung noch weiter aktiviert.

4. Aldolase (1 Hexose-bisP ! 2 Triose-P)

5. Triosephosphatisomerase Durch diese Isomerisierung knnen beide Bruckstcke von Fructose-1,6-bisP in den nach-folgenden Reaktionen umgesetzt werden.

5. Glykolyse

Aldolase katalysiert eine Aldolkondensation/-spaltung. Die Ketose wird vorbergehend als Schiff'sche Base kovalent an die Seitenkette eines Lysins gebunden.

6. Glycerinaldehyd-3-P-dehydrogenase (Triose-P-dehydrogenase)

Die SH-Gruppe eines Cysteins des Enzyms greift den Aldehyd an. Durch Oxidation entsteht ein Thioester, der nicht durch Wasser (Hydrolyse) sondern durch Phosphat (Phosphorolyse) gespalten wird. Die Elektronen werden vom Coenzym NAD+ bernommen.

5. Glykolyse

7. Phosphoglyceratkinase Das "energiereiche" Phosphat wird auf bertragen: Das erste ATP (x2) ist gewonnen!

ADP

8. Phosphoglyceratmutase

9. Enolase Die reversible Entfernung von H2O ndert die freie Energie des Molekls nur geringfgig, sie wird aber gewissermassen anders verteilt, sodass das !G' der Phosphatbertragung viel strker negativ wird.

10. Pyruvatkinase Phosphoenolpyruvat ist eine besonders "energiereiche" Verbindung, da die instabile Enolform sich nach Abspaltung der Phosphorylgruppe exergon zur stabilen Ketoform (Pyruvat) isomerisieren kann. In dieser Reaktion wird ein zweites ATP (x2) gewonnen.

5. Glykolyse Unter anaeroben Bedingungen wird NADH durch folgende Reaktionen regeneriert (d.h. zu NAD+ zurck oxidiert): In Sugetierzellen durch die Lactatdehydrogenase. In Hefe wird in 2 Schritten Aethylalkohol und Kohlendioxid gebildet:

Lactat wird ber das Blut in die Leber transportiert, wo es wieder zu Glucose umgewandelt werden kann.

In der Glykolyse von Glucose bis Pyruvat wrde man nach den !G'-Werten 4 praktisch irreversible Reaktionen erwarten (deutlich negatives !G') und eine Reaktion, die kaum ablaufen sollte (stark positiv).

Unter tatschlichen Bedingungen (inkl. zellulre Konzentrationen der beteiligten Molekle; !G) erweisen sich nur noch 3 Reaktionen als stark exergon: Diese mssen bei der Gluconeogenese durch andere Reaktionen "umgangen" werden. Alle anderen Reaktionen (auch die Aldolase-Reaktion) fhren zu sehr geringen Energienderungen und sind deshalb reversibel. Die Reaktion Glucose ! 2 Lactat ist unter Standardbedingungen von einem Abfall der freien Energie !G' von 197 kJ/mol begleitet. Da gleichzeitig 2 ATP aus ADP und Pi gebildet werden (!G' = +30.6 kJ/mol pro ATP), wre die Effizienz der Glykolyse unter Standardbedingungen nur 31% (2 x 30.6/197 = 0.31). Unter

5. Glykolyse physiologischen Bedingungen drfte das fr die Synthese von ATP notwendige ! G' fast doppelt so hoch wie !G' sein. Entsprechend ist die Effizienz der Glykolyse mit ~60% recht beachtlich. Dennoch ist der Ertrag der Glykolyse relativ gering, weil die Produkte noch viel chemische Energie enthalten. Beim vollstndigen Abbau von Glucose zu CO2 und H2O wird fast 20 mal so viel Energie (!G'= 2840 kJ/mol) frei (siehe Tricarbonsurezyklus und Atmungskette).
O

ATP O

Aufwand
P

Ertrag Glucose " G-6-P " F-6-P " FDP " 2x GAP " 2x 1,3-PGA " 2x 3-PGA " 2x 2-PGA " 2x PEP " 2x Pyruvat " 2x Lactat

1 ATP

ATP

1 ATP

P O

P O P NADH P O P ATP HO O P HO O P (2) (2)

2 NADH 2 ATP

P O

2 ATP

2 NADH

Total:
HO O P ATP HO (2) NADH HO O O (2)

2 ATP

Glykolyse erfolgt in praktisch allen Zellen im lslichen Zytosol. Lediglich einige eukaryontische Parasiten (z.B. Trypanosomen, Erreger der Schlafkrankheit) haben einige Glykolyseenzyme in spezialisierten Organellen (Glycosomen; Abarten von Peroxisomen) kompartimentiert.

5. Glykolyse Regulation der Glykolyse Die Glykolyse wird am ersten spezifischen exergonen Schritt reguliert: Phosphofructokinase (PFK). ATP und Citrat (aus dem Tricarbonsurezyklus) sind allosterische Hemmstoffe dieses tetrameren Enzyms, ADP oder AMP sind allosterische Stimulatoren. Da Phosphofructokinase das geschwindigkeitsbestimmende Enzyme ist, wird die Glykolyse bei aerobem Stoffwechsel (! hoher ATP-Spiegel) gehemmt ("PasteurEffekt"). Zustzlich wird Phosphofructokinase durch #-D-Fructose-2,6-bisphosphat stimuliert, das als second messenger (siehe Kapitel Signalbertragung) wirkt. Dieser Metabolit erhht die Affinitt des Enzyms fr Fructose-6-phosphat und verringert die allosterische Hemmung des Enzyms durch ATP. Fructose-2,6bisphosphat wird durch Phosphofructokinase 2 (PFK2) durch Phosphorylierung von Fructose-6-phosphat gebildet. PFK2 ist gleichzeitig eine Phosphatase, welche den 2-Phosphorylrest wieder abspalten kann. Welche der beiden gegenstzlichen Reaktionen in diesem "Tandem-Enzym" berwiegt, wird durch die Konzentration von Fructose-6-phosphat sowie durch Phosphorylierung von PFK2 an einem Serinrest bestimmt. Fructose-2,6-bisphosphat reguliert in umgekehrter Weise die Fructose-1,6-bisphosphatase in der Gluconeogenese (siehe spter).

Sauerstoffmangel hat also zwei verschiedene Effekte: (1) Weil die oxidative Phosphorylierung blockiert ist, sinkt der intrazellulre ATP-Spiegel, PFK wird stimuliert und der Glucoseverbrauch steigt. Das ist der Pasteur-Effekt. (2) Weil das in der Glykolyse gebildete NADH nicht mehr durch die Atmung verbraucht wird, kann es nur mit Pyruvat (Hefe: Acetaldehyd) als Elektronenakzeptor zu NAD+ zurckoxidiert werden. Die Endprodukte ndern sich: statt CO2 und Wasser wird anaerob Lactat (Hefe: Aethanol und CO2) produziert.

6. TRICARBONSURE-ZYKLUS

1. Der Tricarbonsurezyklus koppelt die Glykolyse an die Atmungskette Die Glykolyse Glucose ! 2 Lactat !G' = 197 kJ/mol

liefert nur 2 ATP pro Mol Glucose, d.h. nur 4-5% des Abfalls an freier Energie, der die vollstndige Verbrennung von Glucose zu CO2 und H2O begleitet: Glucose + 6 O2 ! 6 CO2 + 6 H2O !G' = -2'871 kJ/mol

Die Endprodukte der Glykolyse werden durch bertragung von Elektronen auf NAD+ und FAD oxidiert. Dies geschieht durch eine zyklische Reaktionsfolge, in der Tricarbonsuren als Zwischenprodukte vorkommen, den Tricarbonsurezyklus (engl. Tricarbonic acid [TCA] cycle), Citronensurezyklus oder (zu Ehren des Entdeckers Hans A. Krebs) Krebs-Zyklus.

6. Tricarbonsure-Zyklus Der Zyklus zerlegt die Endprodukte der Glykolyse und des Fettsureabbaus in zwei Komponenten: in reduzierende Elektronen, die auf NAD+ und FAD bertragen werden, und Kohlenstoff in oxidierter Form als CO2. In Prokaryonten ist der Tricarbonsure-Zyklus im Cytoplasma, in Eukaryonten in der Mitochondrien-Matrix lokalisiert. Ein Enzym, die Succinatdehydrogenase, ist fest in die innere Mitochondrienmembran bzw. die bakterielle Plasmamembran integriert und wurde ursprnglich als Komplex II der Atmungskette beschrieben.

Ausser NAD+/NADH dient im Tricarbonsure-Zyklus das Flavin-Adenin-Dinukleotid (FAD/FADH2) als Elektronenbertrger, wobei das Flavin-Ringsystem hintereinander zwei Elektronen einzeln aufnehmen kann (Semichinon-Radikal als Zwischenstufe):
O H3 C H3 C O O P O OH N N N NH O e + H+ H3 C H3 C H N+ N R N O NH O e + H+ H3 C H3 C H N N R N H O NH O

OH OH NH2 N N N N O

O P O O

OH OH FAD Flavin-Adenin-Dinukleotid

Zucker werden meistens "aktiviert" durch Phosphorylierung (z.B. Glucose-6-phosphat). Acetat (= Essigsure), Fettsuren und Succinat werden aktiviert mit dem Cofaktor Coenzym A via "energiereiche" Thioesterbindung:
NH2 !-Mercaptothylamin O HS N H N H Pantothenat O O O P OH O O O P O O N N O N N

Coenzym A

O OH O P O O

6. Tricarbonsure-Zyklus 2. Umwandlung von Pyruvat zu Acetyl-CoA und CO2: Pyruvatdehydrogenase-Komplex Das unmittelbare Edukt des Tricarbonsure-Zyklus ist Acetyl-CoA. Pyruvat aus der Glykolyse wird in die Mitochondrein transportiert und dort durch die Pyruvatdehydrogenase in Acetyl-CoA umgewandelt. Die Reaktion ist stark exergon (!G' = - 33.5 kJ/mol). Die Hydrolyse des Thioesters CH3CO~SCoA + H2O ! CH3COOH + HSCoA besitzt ein !G' = -31.4 kJ/mol. Der Pyruvatdehydrogenase-Komplex besteht aus 3 verschiedenen Enzymen (jedes in mehreren Kopien) und 5 verschiedenen Coenzymen (total ca. 7106 D). Die eigentliche PyruvatdehydrogenaseUntereinheit katalysiert die Decarboxylierung von Pyruvat. An dieser Reaktion ist Vitamin B1 = Thiamin in der Form von Thiaminpyrophosphat (TPP) beteiligt. TPP besitzt ein besonders reaktionsfhiges C-Atom, das Pyruvat angreifen kann. Das Additionsprodukt wird dann zum Hydroxythyl-Derivat decarboxyliert. Hydroxythyl-TPP wird auch als "aktivierter Acetaldehyd" bezeichnet. (Eine hnliche Reaktion ist die einfache Decarboxylierung von Pyruvat zu Acetaldehyd in der alkoholischen Grung.) Dihydrolipoyltransacetylase: Dieses Enzym enthlt als Cofaktor Liponsure, die als Amid kovalent an einen Lysinrest des Enzyms gebunden ist. Das Enzym katalysiert zwei aufeinanderfolgende Reaktionen: Die Bildung eines Acetyl-thioesters und die bertragung der Acetylgruppe auf Coenzym A. Dabei wird die Disulfidbindung reduziert.
H N O S S

O Pyruvat CoA-SH + NAD+ Pyruvatdehydrogenase NADH + H+ +CO2

C O CH3

S-CoA Acetyl-CoA C O CH3

H2 N O O
.

N N

C C

O N S
+

C H3

O H
+

O O O

O P O P O

H2 N O C O N+ HO C CH3 S

N N

O O

O O O

O P O P

O H N O S SH C C H3 HSCoA

Durch die Dihydrolipoyldehydrogenase wird die oxidierte (SS) Form der Liponsure regeneriert und ein Elektronenpaar auf FAD bertragen. Danach werden durch das gleiche Enzym die beiden Elektronen von FADH2 auf NAD+ bertragen. In Sugerzellen konkurriert der Pyruvatdehydrogenase-Komplex mit Lactatdehydrogenase. In Hefezellen konkurriert er mit Pyruvatdecarboxylase.

C H N O SH SH CH 3

SCoA

FAD

H N O

S S

FADH2

NAD+

FAD

NADH + H+

6. Tricarbonsure-Zyklus 3. Die einzelnen Schritte des Tricarbonsurezyklus


S-CoA Acetyl-CoA C O CH 3 NADH

Eine C4-Dicarbonsure und Acetyl-CoA werden zu einer C6-Tricarbonsure kondensiert. 4 Elektronenpaare werden auf 3 NAD+ und 1 FAD bertragen und 2 Kohlenstoffe als CO2 freigesetzt. Die ursprngliche C4-Dicarbonsure wird dabei regeneriert.

C4 C4

C6 C6

TricarbonsureZyklus C4 C4
FADH 2 GTP

C5 C4
CO2 NADH

CO2 NADH

C OO Oxaloacetat C O CH2 COO Citratsynthase CoA

Citratsynthase ("condensing enzyme")

S-CoA C O

C H3 Acetyl-CoA COO C C OO C H2 COO CH2

Citrat HO

Aconitase H2 O COO -

Aconitase (Isomerisierung via Aconitat)

cis-Aconitat

CH2 C C OO CH COO H2 O

Aconitase COO Isocitrat HC COO H O CH COO NAD + Isocitratdehydrogenase C OO C H2 !-Ketoglutarat CH 2 C O C OO CO2 + NADH + H+ CH2

Isocitratdehydrogenase Ein erstes Elektronenpaar wird auf NAD+ bertragen. Das erste CO2 wird freigesetzt.

6. Tricarbonsure-Zyklus

!-Ketoglutaratdehydrogenase-Komplex Ein zweites Elektronenpaar wird auf NAD+ bertragen. Das zweite CO2 wird freigesetzt.
Ein Teil der Energie wird als Thioester mit CoA aufgefangen. Dieser Enzymkomplex ist dem Pyruvatdehydrogenase-Komplex sehr hnlich. Succinyl-CoA-Synthetase Eine Substratphosphorylierung! Pi wird ber ein energiereiches Histidinphosphat am Enzym mit GDP kondensiert. GTP kann in einer Gleichgewichtsreaktion durch Nucleosidphosphokinase in ATP "umgewechselt" werden: GDP + ATP GTP + ADP Succinatdehydrogenase Succinatdehydrogenase ist fest an die Innenseite der inneren Mitochondrienmembran (in Bakterien: der Plasmamembran) gebunden und bertrgt ein drittes Elektronenpaar via ein nichtkovalent gebundenes FAD und Eisen-Schwefel-Zentren auf Ubichinon. Es kann deshalb auch als Enzym der Atmungskette betrachtet werden (Komplex II). Fumarase Wasseranlagerung an die Doppelbindung. Malatdehydrogenase Ein viertes Elektronenpaar wird auf NAD+ bertragen. Dabei wird Oxaloacetat regeneriert fr einen neuen Zyklus.

COO CH2 !-Ketoglutarat CH2 C O COO !-Ketoglutaratdehydrogenase COO CH2 Succinyl-CoA CH2 C O S-CoA Succinyl-CoA-Synthetase COO Succinat CH2 CH2 COO Succinatdehydrogenase COO Fumarat CH HC COO Fumarase COO HO CH Malat CH2 COO Malatdehydrogenase COO Oxaloacetat C O CH2 COO NADH + H+ NAD+ H2O FADH2 FAD GDP + Pi GTP + CoA-SH NAD+ + CoA-SH CO2 + NADH + H+

6. Tricarbonsure-Zyklus 4. ATP-Ausbeute der Oxidation von Glucose zu CO2 und H2O Die Elektronen, die von den Zwischenprodukten auf NAD+ und FADH2 bertragen wurden, werden von diesen auf die Atmungskette und somit letztlich auf Sauerstoff bertragen. Die frei werdende Energie wird zur Synthese von ATP genutzt. Ein Elektronenpaar von NADH liefert dabei 1.5 oder 2.5 ATP, von FADH2 1.5 ATP (siehe Kapitel 9)

Pro 1/2 Glucose: 1 ATP aus der Glykolyse ! 1 cytosolisches NADH aus der Glykolyse ! 1 NADH aus der Pyruvatdehydrogenase ! 3 NADH aus dem Tricarbonsurezyklus ! 1 FADH2 aus dem Tricarbonsurezyklus ! 1 GTP !

ATP 1 1.5 2.5 7.5 1.5 1 15 ATP 2 x l5 = ~30 ATP

Total: Jedes Glucosemolekl ergibt also

Die Energieausbeute unter Standardbedingungen ist 30 x 30.55 x 100 / 2'871 = ~33% unter den tatschlichen Bedingungen sogar noch wesentlich hher.

5. Regulation des Tricarbonsurezyklus Pyruvatdehydrogenase und TCA-Zyklus werden streng reguliert in allen exergonen Reaktionsschritten: Pyruvatdehydrogenase, Citratsynthase, Isocitratdehydrogenase und !-Ketoglutaratdehydrogenase. Aktivierung durch "Low energy"-Indikatoren (ADP, AMP). Inhibition durch "Hgh energy"-Indikatoren (ATP, NADH, Succinyl-CoA). Pyruvat-DH zustzlich durch die Verfgbarkeit von Acetyl-CoA (aus Fettsureabbau). Hormonelle Ragulation beeinflusst die Aktivitt von Pyruvat-DH und "-Ketoglutarat-DH via Phosphorylierung des Enzyms (siehe Kapitel Signalbertragung).

7. LIPIDE

1. Fette und Fettsuren Lipide sind eine heterogene Klasse von Biomoleklen, die unlslich sind in Wasser, aber gut lslich sind in organischen Lsungsmitteln, z.B. MethanolChloroform.

Fette sind Ester des Glycerins mit drei meist verschiedenen langkettigen Fettsuren
O O H2C HC O H2C O O

Triacylglycerin
O

Fette werden als wasserfreie Trpfchen (lipid droplets) im Cytoplasma gespeichert, besonders in Adipocyten (Fettgewebe) und Hepatocyten (Leberzellen). Sie dienen hauptschlich als Energievorrat, aber auch als Wrmeisolations- und Sttzmaterial.

Fettsuren sind langkettige, unverzweigte Carbonsuren mit einer geraden Anzahl C-Atomen. Dies ist auf ihre Biosynthese aus Essigsure-Einheiten zurckzufhren. Es gibt gesttigte Fettsuren (d.h. ohne Doppelbindungen) und ungesttigte (d.h. mit einer oder mehreren C=C Doppelbindungen): Einige natrlich vorkommende tierische Fettsuren
Anzahl Anzahl Trivialname C 12 14 16 18 20 16 18 18 18 20 C=C 0 0 0 0 0 1 1 2 3 4 Laurinsure Myristinsure Palmitinsure Stearinsure Arachidinsure Palmitoleinsure Oleinsure Linolsure Linolensure Arachidonsure n-Dodecansure n-Tetradecansure n-Hexadecansure n-Octadecansure n-Eicosansure cis-!9-Hexadecansure cis-!9-Octadecansure cis,cis-!9,!12Octadecadiensure all cis-!9,!12,!15Octadecatriensure all cis-!5,!8,!11,!14Eicosatetraensure CH3(CH2)4(CH=CHCH2)4(CH2)2COOH CH3CH2(CH=CHCH2)3(CH2)6COOH CH3(CH2)10COOH CH3(CH2)12COOH CH3(CH2)14COOH CH3(CH2)16COOH CH3(CH2)18COOH CH3(CH2)5CH=CH(CH2)7COOH CH3(CH2)7CH=CH(CH2)7COOH CH3(CH2)4(CH=CHCH2)2(CH2)6COOH Systematischer Name Formel

7. Lipide Palmitinsure Oleinsure

Durch die cis-Konfiguration von Doppelbindungen entsteht ein "Knick", der die Packung von Fettsureketten in Phospholipiden in Membranen strt und deren Fluiditt erhht. Seifen und Detergentien Lipide und Fettsuren sind amphipathisch = amphiphil, d.h. sie enthalten sowohl hydrophile als auch hydrophobe Oberflchen. Fettsuren besitzen hydrophobe uind hydrophile Anteile in einer solchen Anordnung, dass sie als Detergentien wirken, d.h. zwischen hydrophoben und hydrophilen Phasen vermitteln und so Fette in Lsung bringen knnen. Wegen ihres hydrophoben Teils sind amphipathische Molekle nur in geringer Konzentration als Einzelmolekle in Wasser lslich. Steigt die Konzentration ber einen Grenzwert, die sog. kritische Mizellarkonzentration (cmc = critical micellar concentration), so formen die Molekle reversibel lockere Aggregate, sog. Mizellen, in denen die apolaren Teile nach innen gerichtet sind und die polaren Teile nach aussen ragen. Die cmc ist fr jedes amphiphile Molekl eine charakteristische Konstante, die allerdings von der Temperatur, Ionenstrke etc. abhngt.

unter der cmc

ber der cmc

Die klassischen Detergentien, die Seifen, werden aus Lipiden gewonnen: Durch alkalische Hydrolyse (Verseifung) von Fett entstehen Natriumsalze von Fettsuren. Wegen ihrer Detergenseigenschaften sind freie Fettsuren (z.B. Laurinsure) toxisch und kommen in vivo nur in sehr geringen Konzentrationen vor.

Natriumlaurylsulfat = Natriumdodecylsulfat = SDS ist ein experimentell viel verwendetes Detergens, das im Gegensatz zu "milden" Detergentien wie Triton oder Octylglucosid, Proteine (lsliche oder membranverankerte) denaturiert (siehe SDS-Gelelektrophorese, weiter unten).

Laurinsure

Dodecylsulfat = Laurylsulfat (SDS = sodium dodecylsulfate)

O O Na +
.

S O

Br

Cetyltrimethylbromid

+ N

Triton-X

HO

HO OO

Octylglucosid
HO

OH OH

Cholsure und verwandte Molekle (z.B. Deoxycholsure) sind physiologische Detergentien, die von der Galle produziert und zur Emulgierung der Nahrungsfette in den Darm ausgeschttet werden.

COO HO

Deoxycholat
HO

7. Lipide

Das "starke" Detergens SDS denaturiert Proteine (besonders in Kombination mit Hitze). Es entstehen dabei Komplexe der entfalteten Polypeptidketten mit den negativ geladenen SDS-Moleklen. Die Ladung pro Masse des Proteins ist dabei recht einheitlich. Die Komplexe sind aber umso sperriger, je lnger die Polypeptidkette ist. Das ermglicht die elektrophoretische Auftrennung von SDSdenaturierten Proteinen nach der Grsse in Polyacrylamidgelen, die wie ein Filter die grsseren Komplexe mehr zurckhalten als die kleinen (SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese).

2. Phospholipide und Shingolipide Phospholipide bezeichnet man auch als Phosphoglyceride oder Glycerolipide, weil sie wie die Fette (= Triglyceride) aus einem zentralen Glycerin bestehen, das mit Fettsuren (allerdings nur 2) verestert ist. Die dritte Hydroxylgruppe des Glycerins ist ber eine Phosphodiestergruppe mit einem polaren Alkohol verestert:
+ N O O P O O CH2 HC O H2 C O O O P O O CH2 HC O H2 C O + NH 3 O O O O P O O CH2 HC O H2 C O OH HO O O P O O CH2 HC O H2 C O OH OH OH H O OH O O P O O CH2 HC O H2 C O O O O O O O O O O O

Phosphatidyl-cholin = Lecithin
+ H3N

Phosphatidyl-thanolamin

Phosphatidyl-serin

Phosphatidyl-glycerin

Phosphatidyl-inositol

Zwischenstufen der Synthese oder des Abbaus sind (u.a.):


O HO P O O CH2 HC O H2 C O O O

Phosphatidsure

O HO P O O CH2 HC O H O H2 C O

Lysophosphatidsure

7. Lipide Die Zusammensetzung der Fettsuren ist komplex, sodass die Gesamtzahl verschiedener Phospholipide sehr gross ist (>100). E. coli enthlt hauptschlich 3 Typen von Phospholipiden: Phosphatidylthanolamin (~80%) Phosphatidylglycerin (~15%) Cardiolipin (~5%).

Sphingolipide haben Sphingosin (statt Glycerin und einer Fettsure) als "Rckgrat".

Die Membranen von Nervenzellen sind besonders reich an Glycolipiden.

3. Hydrolyse von Fetten Triacylglyceride werden zunchst schrittweise durch Lipasen zu Glycerin und freien Fettsuren hydrolysiert. hnlich werden Phospholipide zu 3-P-Glycerin und freien Fettsuren hydrolysiert. Glycerin wird zu 3-P-Glycerin phosphoryliert, welches nach Dehydrierung mit NAD+ in die Glykolyse eingeschleust werden kann.

In der entgegengesetzten Richtung kann 3-P-Glycerin fr die Biosynthese von Fetten und Phosphoglyceriden aus Glucose bereitgestellt werden (s.u.).

4. Oxidation von Fettsuren Abbau (Katabolismus) und Biosynthese (Anabolismus) von Fettsuren sind ein gutes Beispiel fr die Regulation von zwei gegenlufigen Stoffwechselwegen. Ein gleichzeitiges Wirken von Ana- und Katabolismus wrde nur zur Hydrolyse von ATP (Wrme) fhren: Kurzschluss. Es gibt RegulationsStrategien, die je nach physiologischem Bedarf entweder nur anabolische oder nur katabolische Prozesse zulassen. Dies geschieht durch subtile Regulation einzelner chemischer Prozesse, sowie durch Kompartimentierung.

7. Lipide Freie Fettsuren sind toxisch und werden rasch mit Coenzym A verestert (Thioester):
NH2 !-Mercaptothylamin O HS N H N H Pantothenat O O O P OH O O O P O O N N O N N

Coenzym A

O OH O P O O

Dies geschieht unter Aufwendung von chemischer Energie (ATP) in zwei Schritten:
A TP

Zuerst entsteht ein Fettsure-Adenylat, das als gemischtes Anhydrid sehr reaktiv ist, analog zu den Aminosure-Adenylaten bei der Biosynthese von Proteinen.
HS

N H2 PP i O O O P O O N N O N N

CoA
AMP O S

OH OH

Das Fettsure-Adenylat wird dann in einen Thioester der Fettsure bergefhrt. Die Thioester von Fettsuren sind an der !-CH2-Gruppe relativ reaktiv.

CoA

Die "-Oxidations-Spirale

H H " FAD Acyl-CoA-Dehydr ogenase FADH 2 H !

O S

CoA

Acyl-CoA

H H

O S H

CoA

Trans- !2-Enoyl-CoA

H 2O Enoyl-CoA -Hydratase H OH O S H H NAD + 3-Hydroxyacyl-CoA-Dehydr ogenase NADH + H+ O O S H H HS "-Ketoacyl-CoA -Thiolase O S O

CoA

3-Hydroxyacyl-CoA

CoA

"-Ketoacyl-CoA

CoA

CoA +

CoA

#cyl-CoA + Acetyl-CoA

7. Lipide Im ersten Oxidationsschritt dient FAD als Elektronenakzeptor, im zweiten NAD+. FADH2 und NADH werden ber die Atmungskette fr die Synthese von ATP verwendet. Nur die thiolytische Spaltung der -CO-CH2-Bindung durch die SH-Gruppe eines Coenzym A ist stark exergon (irreversibel). Acetyl-CoA wird ber den Tricarbonsurezyklus zu CO2 und weiterem FADH2 und NADH fertig oxidiert.

Energiebilanz Die Oxidation von Fettsuren erzeugt sehr viel chemisch verwertbare Energie (ATP). Diese hohe ATPAusbeute sowie die Mglichkeit, Triacylglyceride intrazellulr als Fett-Trpfchen zu speichern erklrt, warum Neutralfette fr Zellen die wirksamsten Energiespeicher sind. Reaktion Aktivierung von Palmitat zu Palmitoyl-CoA Oxidation von 8 Acetyl-CoA im Tricarbonsure-Zyklus Oxidation von 7 FADH2 in der Atmungskette Oxidation von 7 NADH in der Atmungskette Total ATP-Produktion 2 8x10 = 80 7x1.5 = 10.5 7x2.5 = 17.5 106

5. Biosynthese von Fettsuren

7. Lipide Die 3 Reaktionen zwischen -CH2-CH2- und -CO-CH2- sind chemisch identisch. Der kritische Unterschied besteht in der Bildung bzw. Spaltung der CO-CH2 Bindung:
O O OH HN O NH O S N H ATP O O N NH O S O S N H

ADP + Pi

Acetyl-CoA wird zunchst mit CO2 zu Malonyl-CoA carboxyliert. Hierbei bertrgt das Coenzym Biotin die (durch Hydrolyse von ATP aktivierte) Kohlensure (HCO3 = in Wasser gelstes CO2).

CoA
O S

O O O HN

CoA

NH O S N H

Weitere Unterschiede, die das kontrollierte Nebeneinander der zwei Reaktionswege ermglichen: 1. Die zellulre Lokalisation: Mitochondrien vs. Zytoplasma. (Auch die Enzyme der chemisch identischen Reaktionen sind nicht identisch, weil die Lokalisation in ihrer Sequenz festgelegt ist. Es handelt sich um Isoenzyme, die von separaten Genen codiert werden.) 2. Der Acyl-Carrier: CoA vs. ACP. 3. Elektronen-Akzeptor/Donor: FAD und NAD+ vs. NADP+. 4. Stereochemie der Hydrations-/Dehydrationsreaktion: 3-L- vs. 3-D-Hydroxyacyl-Carrier. Im Gegensatz zur "-Oxidation sind die Substrate der Synthesespirale nicht Coenzym A NH2 Thioester des CoA, sondern Thioester eines !-Mercaptothylamin Pantothenat N kleinen Proteins: Acyl Carrier Protein (ACP) N Die kritische SH-Gruppe des ACP ist O O O O N N identisch mit Phosphopantothein, welches von HS O P O P O N N O H H CoA auf eine SerinSeitenkette des ACP O O OH bertragen worden ist. Der Acetyl-Rest wird O OH von Acetyl-CoA auf ACP bertragen. In O P O Form des AcetylACP ist die aktivierte O Essigsure eindeutig fr die Synthese von !-Mercaptothylamin Pantothenat langen Fettsuren bestimmt und dem Tricarbonsurezyklus entzogen. Diese O O O HS O P O CH Ser ACP Unterscheidung ist in Bakterien wie 2 N N H H O Escherichia coli wichtig, weil der OH Zitronensurezyklus, sowie die "-Oxidation Acyl-Carrier-Protein und Biosynthese der Fettsuren im gleichen Kompartiment, nmlich im Cytoplasma, ablaufen. Nachdem der Malonyl-Rest ebenfalls von Malonyl-CoA auf ein ACP bertragen worden ist, kondensiert Acyl-ACP mit Malonyl-ACP zu "-Ketoacyl-ACP. Die Reaktion wird durch die stark exergone Abspaltung von CO2 praktisch irreversibel. CO2 spielt also bei der Biosynthese der Fettsuren eine katalytische Rolle.

7. Lipide

6. Biosynthese von Lipiden Phosphatidsure und Fett


Dihydroxyaceton-P CH 2OH C O
NADH

Glycerin-3-P wird aus Dihydroxy-Aceton-Phosphat durch Hydrierung mit NADH erhalten. In zwei weiteren Schritten werden die beiden freien OHGruppen durch AcylCoA mit Fettsuren verestert.

CH2O PO 2 3

NAD+

O CH 2O HO C H
2

O R1 R2
Acyl-CoA CoA

C H 2OH HO C H
2

O C O

CH 2O C H

C
2

R1

C H2 OPO3 Glycerin-3-P

CH2O PO 3
Acyl-CoA CoA

CH2O PO 3 Phosphatidsure
H2O

Lysophosphatidsure

Pi

Fette (Triglyceride = Triacylglycerine) entstehen aus Phosphatidsure durch Ersatz des Phosphats durch eine dritte Fettsure: Eine Phosphatase und eine Transacylase katalysieren den Austausch.

O O R2 C O CH 2 O C H CH2 OH Diacylglycerin
Acyl-CoA

R1

CoA

O O R2 C O CH 2 O C H CH2 O Triacylglycerin C O C R1 R3

Phospholipide Um die Phosphatgruppe der Phosphatidsure mit einem polaren Alkohol verestern zu knnen, muss sie erst durch Bildung einer Pyrophosphorsure-Anhydrid-Bindung aktiviert werden:
O O R2 C O CH 2 O C H
CTP PPi

O R1 R2 O C O CH 2 O C CH2 H O C O P O O R1 O P O O O O N

NH2

2 CH2 OPO3

Phosphatidsure

CDP-Diacylglycerin OH OH

7. Lipide Dies geschieht im Fall der Phospholipid-Biosynthese durch Reaktion mit CTP. Anschliessend wird die aktivierte Phosphatidsure (CDP-Diacylglycerin) entweder auf L-Serin oder auf ein weiteres Molekl Glycerin-3-P bertragen, wobei CMP freigesetzt wird. Phosphatidylserin wird zu Phosphatidylthanolamin (PE) decarboxyliertund durch Einfhrung von drei Methylgruppen in Phosphatidylcholin (PC, Lecithin) berfhrt. Phosphatidylglycerin entsteht aus Phosphatidylglycerinphosphat durch die Wirkung einer Phosphatase. Cardiolipin (= Diphosphatidylglycerin), entsteht in einer Umesterungs-Reaktion aus 2 Moleklen Phosphatidylglycerin, wobei Glycerin freigesetzt wird.
CDP-Diacylglycerin
Serin

CDP-Diacylglycerin
Glycerinphosphat

CMP

CMP

Phosphatidylserin

Phosphatidylglycerinphosphat

CO2

Pi

Phosphatidylthanolamin 3x Methylierung

Phosphatidylglycerin
Phosphatidylglycerin

Glycerin

Phosphatidylcholin

Cardiolipin
O C C O O CH2 OC H O O CH2 O P O CH2 HC O O C C O CH2O P O OC H O CH2 O CH2 OH

8. BIOLOGISCHE MEMBRANEN
1. Allgemeines Membranen sind ein essentieller Bestandteil aller Zellen. Bei Prokaryoten ist das Cytoplasma von mindestens einer Zellmembran umgeben; bei Eukaryoten ist zustzlich das Cytoplasma durch Membranen in Kompartimente (Organellen) unterteilt. Biologische Membranen sind a. Trennflchen, die die Zellen von der Umwelt abtrennen oder in Kompartimente unterteilen b. biochemische Maschinen, die Energietransformationen und Transportprozesse katalysieren c. biochemische "Antennen", die chemische oder physikalische Signale von aussen (Hormone, Licht etc.) empfangen, verstrken und weiterleiten. Biologische Membranen sind zweidimensionale asymmetrische Lsungen von amphiphilen Proteinen in einer Lipiddoppelschicht aus Phospholipiden, Cholesterin und Sphingolipiden. Fast alle biologischen Funktionen werden von den Membranproteinen katalysiert. Membranen knnen bis zu 75% aus Protein bestehen, wie z.B. die innere Mitochondrienmembran, oder nur zu 25%, z.B. die den Sehpurpur (Opsin) tragende Membran der Sehstbchen.

2. Phospholipid-Bilayer Phospholipide sind weder in Wasser noch in vllig apolaren Lsungsmitteln gut lslich. Gute Lsungsmittel sind 90% Aceton oder Chloroform/Methanol-Mischungen. Wegen ihrer Geometrie bilden Phospholipide in wssriger Lsung allerdings meist nicht Micellen (oben) wie die blichen Detergentien, sondern flchige Strukturen. An der wssrigen Oberflche bilden die Phospholipidmolekle dabei einen Monolayer, bei dem die polaren Kopfgruppen der Lipide in das Wasser eintauchen und die apolaren Fettsurereste in die Luft stehen. Im Wasser bilden sich flchige Doppelschichten = Bilayer aus (mitte). Knstlich hergestellte Membranen bilden meist kugelfrmige Doppelschichten (in sich geschlossene Flche), sog. Liposomen (unten).

Mizellen und Doppelschichten werden vorwiegend durch den Entropie-Effekt zusammengehalten: Die Wassermolekle, die relativ fest ber H-Brcken verbunden sind, schliessen die hydrophoben Acylreste aus. Bei beiden dieser Anordnungen wird vermieden, dass hydrophobe Regionen direkt mit Wasser in Kontakt sind. Aus diesem Grund sind planare Bilayer mit "offenen" Rndern nicht stabil. Alle biologischen Membranen sind in sich geschlossen und trennen Rume voneinander ab. Da die Acylreste z.T. ungesttigt und daher sperrig sind, ist eine Doppelschicht umso "flssiger", je hher der Anteil an ungesttigten Fettsuren und je hher die Temperatur ist. hnlich normalen Flssigkeiten "schmelzen" und "gefrieren" Membranen: bei niedrigen Temperaturen existierende Lebewesen (Kaltwasserfische) enthalten deshalb besonders stark ungesttigte Phospholipide.

8. Biologische Membranen

Jede Phospholipid-Doppelschicht hat also einen hydrophoben Kern, der als elektrischer Isolator wirkt und etwa die Viskositt von Olivenl hat. In proteinfreien Phospholipid-Doppelschichten knnen die einzelnen Phospholipid-Molekle um die eigene Achse rotieren und in der Membranebene diffundieren, nicht jedoch von einer Seite auf die andere Seite berwechseln: ein flip-flop ist in proteinfreien Phospholipid-Doppelschichten energetisch "verboten", da geladene Kopfgruppen durch den hydrophoben Membrankern wandern mssten. In vielen biologischen Membranen scheinen spezifische Membranproteine (Flippasen) den Flip-flop von Phospholipiden zu katalysieren. Phospholipide knnen also schnell in der Membranebene diffundieren und um ihre Lngsachse rotieren, aber nur bedingt von einer Seite der Membran auf die andere wechseln.

In den meisten biologischen Membranen haben die beiden Monolayer des Phospholipid-Bilayers eine quantitativ verschiedene Phospholipidzusammensetzung: Der Bilayer ist partiell asymmetrisch, durch die Aktivitt energiegetriebener Flippasen.

3. Cholesterin Ein wichtiger Bestandteil von tierischen Membranen ist Cholesterin, das insbesondere in der Plasmamembran bis zu einem Drittel der Lipide ausmachen kann. Pflanzen, Protozoen und Pilze enthalten geringere Mengen von verwandten Sterinen. Den Bakterien fehlt diese Stoffklasse.

HO

8. Biologische Membranen Die Fluiditt von Membranen wird durch die Sterine (engl. sterols) wegen ihrer steifen Struktur verringert. Die Hydroxylgruppe von Cholesterin wirkt als relativ polare Kopfgruppe. Cholesterin wird aus C5-Isopreneinheiten aufgebaut, die wiederum aus Acetyleinheiten gebildet werden. Die Cholesterin-Biosynthese gliedert sich in 3 Hauptabschnitte: 1. Synthese von Mevalonsure aus Acetyl-CoA. 2. Umwandlung von Mevalonsure in aktivierte Isopreneinheiten. 3. Kondensation von 6 Isopreneinheiten zu Squalen. 4. Ringbildung zu einem 4-Ring-Steroidgerst.

2x

O S

1. Synthese von Mevalonsure aus Acetyl-CoA Zwei Acetyl-CoA-Molekle werden durch eine Thiolase zu Acetoacetyl-CoA kondensiert.

CoA CoA

Acetyl-CoA

HS O O S

Acetoacetyl-CoA

CoA
O S HS

s HMG-CoA-Synthase kondensiert ein drittes Acetyl-CoA dazu, sodass !-Hydroxy-!-methyl-glutaryl-CoA entsteht. Diese beiden ersten Reaktionen sind reversibel.

CoA CoA CoA -glutaryl-CoA


(HMG-CoA) Hydroxy-methyl

CH 3 OOC CH 2 C OH CH 2

O C S

2 NADPH

Die Reduktion zu Mevalonsure dagegen ist der erste irreversible Schritt. Die HMG-CoA-Reductase ist deshalb das Schlsselenzym fr die Regulation der Cholesterinsynthese!

HMG-CoAreductase
CH 3 OOC CH 2 C OH CH 2

2 NADP+ + HS-CoA

CH 2 3 ATP

OH

Mevalonat

2. Umwandlung Isopreneinheiten

von

Mevalonsure

zu

aktivierten
CH 3 OOC CH 2 C O O P O O CH 2

3 ADP O CH 2 O P O O O P O O

Mevalonsure wird unter Aufwendung von 3 ATP durch dreifache Phosphorylierung aktiviert. Die Phosphatgruppe an der !-Hydroxylgruppe erleichtert die Decarboxylierung und gleichzeitige Dephosphorylierung, wobei eine Doppelbindung entsteht.

3-Phospho5-pyrophosphomevalonat

CO2 + Pi O O P O O P O O O P O O O

Es ergeben sich zwei isomere und durch Pyrophosphat aktivierte Isoprene.

O O O P O

Aktivierte Isoprene

8. Biologische Membranen 3. Kondensation von 6 Isopreneinheiten zu Squalen


P P

Prenyltransferase
PPi

P P

Durch zwei Kopf-zu-Schwanz-Kondensationen von 3 aktivierten Isoprenpyrophosphaten entsteht Geranylpyrophosphat und dann Farnesylpyrophosphat.
Prenyltransferase
PPi

P P

Geranyl-PP

P P

Farnesyl-PP
P P

Zwei Farnesylpyrophosphate werden schliesslich Kopfzu-Kopf und unter Reduktion mit NADPH zu Squalen vereinigt.

P P

+ NADPH

Squalensynthase

2 PPi + NADP+

4. Ringbildung zu einem 4-Ring-Steroid-gerst Die Squalenstruktur lsst sich leicht so darstellen, dass die mgliche Bildung von drei 6-Ringen und einem 5Ring sichtbar wird. Zuerst wird durch die SqualenMonooxygenase ein Sauerstoff als Epoxid eingefhrt.
Squalenmonooxygenase

Squalen

Squalen

NADPH + O2

NADP+ + H2O

Die Epoxidgruppe ist reaktiv und die Doppelbindungen sind so positioniert, dass in einer konzertierten Reaktion die zyklische Struktur von Lanosterol entstehen kann.
O

Squalen

2,3-epoxid

Cyclase

Durch etwa 20 weitere Reaktionen, die insbesondere verschiedene Methylgruppen verschieben oder entfernen, entsteht schliesslich Cholesterin, das wiederum das Ausgangsprodukt fr die Synthese von Steriodhormonen und Gallensuren ist.

Lanosterol
HO

Cholesterin
HO

8. Biologische Membranen 4. Membranproteine Nicht nur die Llipide, sondern auch die Proteine einer Membran sind amphiphil: sie enthalten sowohl hydrophile als auch hydrophobe Oberflchen. Letztere sind in die Lipiddoppelschicht eingebettet.

Im einfachsten Fall ist der hydrophobe Teil eine ununterbrochene Sequenz von apolaren Aminosuren, die als "-Helix in die Membran eingelagert sind. Da bei dieser Anordnung jede Aminosure die Lnge der Helix um 1.5 verlngert und der apolare Kern einer Membran etwa 30 dick ist, bentigt ein Protein dafr etwa 20 Aminosuren. Diese apolaren Abschnitte lassen sich meist in einem Hydrophobizitts-Plot darstellen: Jeder Aminosure wird ein Wert fr die Hydrophopbizitt ihrer Seitenkette zugeordnet. Fr jede Position in der Polypeptidkette wird dann die durchschnittliche Hydrophobizitt der 715 benachbarten Aminosuren aufgetragen (um die Kurve zu gltten).
(Die Hydrophobizittsskala nach Goldman, Engelman und Steitz.)

In den obigen Hydrophobizitts-Plots erkennt man in allen drei Fllen einen ersten hydrophoben Abschnitt ganz am N-Terminus (schwarz), der der Signalsequenz entspricht. Diese Sequenz "dirigiert" das Protein zum ER (Eukaryoten) bzw. zur Plasmamembran (Prokaryoten), wird dann abgespalten (Pfeil) und ist im fertigen Protein nicht mehr vorhanden. Im brigen sieht man klar, dass Glycophorin die Membran ein einziges Mal durchspannt. Bacteriorhodopsin besitzt sieben Transmembranhelices, die z.T. nicht sehr deutlich von einander separiert sind. Das Porin OmpF ist mit dieser Methode nicht als Membranprotein erkennbar.

8. Biologische Membranen Mehrfach die Membran durchspannende Proteine (multi-spanning oder polytopic membrane proteins) sind fast immer Bndel von Transmembranhelices. Eine Ausnahme bildet eine Gruppe von Porenproteinen in der usseren Membran von Bakterien, Mitochondrien und Chloroplasten. Dabei bildet die Polypeptidkette ein !-Faltblatt in Form eines Zylinders. Um ausgestreckt die hydrophobe Phase der Membran zu durchspannen, braucht es nur 79 Aminosuren. Jede zweite Seitenkette im Faltblatt ist nach aussen gerichtet und apolar. Es braucht deshalb eine aufwendigere Sequenzanalyse um !-Barrel-Proteine zu erkennen. Ausser den typischen integralen Membranproteinen sind auch sog. periphere Proteine mit Membranen assoziiert. Sie sind nicht-kovalent an integrale Proteine, gelegentlich auch direkt an die PhospholipidKopfgruppen, gebunden. Sie lassen sich meist mit hoher Salzkonzentration oder chaotropen Substanzen wie Harnstoff ablsen. Proteine knnen sich in der Membran hnlich wie Phospholipide bewegen. Rotation und Diffusion in der Membranebene sind jedoch langsamer. Proteine knnen nicht durch die Membran rotieren (flip-flop). Sie sitzen asymmetrisch in der Membran. Membranproteine knnen aus der Lipidmembran weder durch hohe Salzkonzentrationen noch durch denaturierende Stoffe wie Harnstoff, sondern nur durch Detergentien herausgelst werden. Diese bilden mit den Phospholipiden gemischte Mizellen und decken die apolaren Domnen der Membranproteine ab.

Beim Entfernen des Detergens bilden die Lipide spontan wieder Doppelschichten in Form von Liposomen, in denen die Proteine oft wieder korrekt eingebettet sind. Das erlaubt funktionelle Studien mit gereinigten Membranproteinen (z.T. Messung von Ionentransport ins Innere der Liposomen).

8. Biologische Membranen 5. Transport durch biologische Membranen Eine Phospholipid-Bilayer ist fr elektrisch geladene oder polare Molekle weitgehend undurchlssig. Nur kleine, polare, ungeladene Molekle sind von dieser Regel ausgenommen.

Bei ungeladenen Substanzen steigt die Permeationsfhigkeit mit der Lslichkeit in apolaren Lsungsmitteln.

Der Transport von geladenen oder polaren Moleklen durch biologische Membranen kann im Prinzip durch zwei grundstzlich verschiedene Mechanismen erfolgen: durch Carrier / Transporter oder durch Kanle (channels). Ein Carrier hnelt einer Schleuse: die zu transportierende Substanz wird auf einer Seite der Membran an das Carrier-Protein gebunden, worauf der Carrier seine Konformation so ndert, dass die zu transportierende Substanz auf der anderen Seite der Membran freigesetzt werden kann. Wenn fr diesen Vorgang Energie aufgewendet wird (was es dann auch erlaubt, Substanzen gegen ihren Konzentrationsgradienten zu transportieren), spricht man von einer Pumpe. Ein Kanal ist dagegen eine mit Wasser gefllte Pore, die fr bestimmte Substanzen durchlssig ist.

8. Biologische Membranen

ATP-getriebene Pumpe

Ionenkanal

Transporter / Carrier

Ein Beispiel fr einen Carrier ist der Glucose-Transporter in der Plasmamembran u.a. von Erythrozyten: Glucose kann, dem Konzentrationsgeflle folgend, vom Blut durch den Transporter in die Zellen "diffundieren". Diese erleichterte Diffusion (facilitated diffusion) unterscheidet sich von einer einfachen Diffusion dadurch, dass sie der Michaelis-MentenKinetik gehorcht.

Detaillierteres Modell eines "facilitated diffusion"-Transporters:

Um Substanzen gegen das Konzentrationsgeflle durch Membranen zu pumpen (z.B. Aufnahme von Nhrstoffen aus der Umgebung durch freilebende Bakterien), muss Energie aufgewendet werden: man spricht von aktivem Transport. Oft kann das Transportsystem selbst ATP spalten und die dabei freiwerdende Energie fr den aktiven Transport einer Substanz verwenden (ATP-getriebene Pumpe). Manchmal kann ein Transportsystem auch indirekt durch ATP angetrieben werden: ein durch eine ATP-getriebene Ionenpumpe erstellter Ionengradient kann in einer Symport- (oder Antiport-)Reaktion die konzentrative Aufnahme einer anderen Substanz ber einen Transporter treiben, der die Energie des Ionengradienten als Energiequelle bentzt.

Uniporter

Symporter

Antiporter

8. Biologische Membranen Ein Beispiel ist die aktive Aufnahme von Glucose im Darm. Durch eine ATP-getriebene Pumpe wird ein Na+-Gradient aufgebaut, der dann den Symport mit Glucose auch gegen einen Glucosegradienten antreibt.

Ionophoren sind toxische Molekle, die Ionen durch biologische Membranen transportiert knnen. Ein typischer Ionophor ist das zyklische Oligopeptid Valinomycin, das spezifisch mit K+-Ionen einen lipophilen Komplex bildet, und deshalb K+ (aber nicht Na+ oder H+) durch Membranen transportiert. Das mit K+ beladene oder leere Valinomycin diffundiert hin und her wie eine Fhre. Solche Ionophoren sind natrlich toxisch.

8. Biologische Membranen 10 Reprsentieren biologische Membranen genetische Information? Die Bausteine biologischer Membranen werden, ebenso wie die anderen Bausteine einer Zelle, durch die in DNA gespeicherte Information determiniert: Proteine direkt, Lipide und Zucker indirekt (ber die sie synthetisierenden Enzymproteine). Zustzlich zu der Information, die durch ihre Bausteinen reprsentiert wird, enthalten biologische Membranen aber noch Information, welche durch die rumliche Anordnung dieser Bausteine gegeben ist. Ein Beispiel: selbst wenn wir alle Informationen zur Synthese der einzelnen Bestandteile der Plasmamembran von Menschenzellen verfgbar htten, wssten wir a priori nicht, wie ein bestimmtes Protein der Plasmamembran in diese eingebettet ist. Man nimmt deshalb heute an, dass biologische Membranen als Matrize (template) fr ihre eigene Synthese fungieren. Ohne bereits vorhandene Plasmamembran kann also keine Plasmamembran gebildet werden. Mit anderen Worten: biologische Membranen vermehren sich durch Wachstum der bereits bestehenden gleichartigen Membranen. Dieses Vermehrungsprinzip entspricht im Wesentlichem dem von DNA. Wenn also durch Eingriff von aussen ein Membrantyp in einer Zelle verloren geht, kann sich diese Membran nicht mehr regenerieren, selbst wenn in der Zelle alle dafr notwendigen Bausteine vorhanden sind. Die in unserer DNA schlummernde genetische Information reprsentiert also nur einen Teil unseres Erbguts. Ein anderer, ebenso wichtiger Teil ist in unseren verschiedenen Membransystemen niedergelegt. Beide Arten von Information werden bei Zellteilung an die Tochterzellen weitervererbt. Ein weitere, nicht direkt genetische Information ist das Kulturgut, das Menschen ihren Kindern durch Beispiel, durch akustische Vermittlung (Sprache, Musik), und durch Schrift und Bild weitergeben. All diesen Informationen ist gemeinsam, dass sie fr unsere Identitt notwendig sind und bei Deletion irreversibel verloren gehen.

9. MEMBRANGEKOPPELTE ATP-SYNTHESE
1. Substratphosphorylierung Photophosphorylierung Oxidative Phosphorylierung ATP-Synthese in der Glykolyse erfolgt durch chemische Reaktionen mit Substratmoleklen an lslichen Enzymen (Substratphosphorylierung). Diese ATP Synthese ist nicht sehr effizient und die Anhufung von Glykolyseendprodukten (Aethanol, Milchsure) wirkt zudem hemmend oder gar toxisch. Effizientere ATP-Synthesewege haben sich entwickelt, die an Membranen ablaufen: A. Lichtgetriebene ATP-Synthese (= Photophosphorylierung) in Halobakterien mit Bacteriorhodopsin. B. Oxidations-getriebene ATP-Synthese (oxidative Phosphorylierung) in Pro- und Eukaryoten C. Photophosphorylierung in Pflanzen und gewissen Bakterien Die fr die endergone Reaktion ADP + Pi > ATP + H2O notwendige Energie wird also

entweder durch Sonnenlicht (a, b) oder durch exergone Redoxreaktionen (c) gewonnen.

Ein membranumhlltes Kompartiment enthlt in der Membran zwei Enzymsysteme: 1. Eine H+-Pumpe, die unter von einer Energieverbrauch H+ Seite der Membran auf die andere pumpt und dabei einen H+Gradienten und gleichzeitig ein elektrisches Membranpotential aufbaut. 2. Eine H+-getriebene ATP-Synthase, welche den exergonen Rckfluss von H+ durch die Membran an die Synthese von ATP koppelt.

H+ H+ H+ H+ H+ H+ H+

H+

H+ H+ H+ H+ H+ H+

H+ H+

H+

H+ H+

H+ H+

H+

H+ H+ H+

H+ H+

H+-Pumpe

H+ H+ H+ H+ H+ H+

H+ H+

H+ H+

Energie
H+ H+ H+ H+

H+ H+ H+

H+

H+ H+ H+ H+ H+ H+ H+ H+ H+ H+ H+ H+ H+

H+

H+

ADP + Pi
H+ H+ H+ H+

ATP-Synthase
H+ H+ H+ H+ H+ H+ H+

H+ H+

ATP
H+ H+ H+ H+ H+ H+ H+

H+ H+

H+

H+ H+

H+ H+

H+

Trennung und Rckfluss von H+ finden in folgenden Membranen statt: a. Prokaryoten: in der Zellmembran (Gramnegative Bakterien: in der inneren Zellmembran) b. Eukaryoten: in der innere Mitochondrienmembran (oxidative Phosphorylierung) und in der Thylakoidmembran (Photophosphorylierung).

9. Membrangekoppelte ATP-Synthese 2. Die H+-getriebene ATP-Synthase Die verschiedenen membrangekoppelten ATP-Syntheseprozesse unterschieden sich hauptschlich in der H+-Pumpe. Die ATP-Synthase ist in allen Systemen sehr hnlich. Alle bekannten Zellen enthalten mindestens eine H+-getriebene ATP-Synthase, die im Verlauf der Evolution sehr konserviert geblieben ist. Sie besteht aus mehr als 20 Polypeptiden mit einem Gesamtgewicht von etwa 500 kD. Der Komplex besteht aus einem membranintegrierten Teil Fo und einem globulren Teil F1, der in die Matrix ragt. F1 besteht aus fnf verschiedenen Polypeptiden mit der Stchiometrie !3"3#$%. Je 3 ! und " Untereinheiten abwechselnd im Kreis bilden die Hauptmasse des F1-Komplexes. Die " Untereinheiten enthalten je eine katalytische Stelle fr ATP-Synthese bzw. -Hydrolyse. Zuoberst sitzt eine $-Untereinheit. Die #-Untereinheit ragt ins Zentrum des !3"3-Komplexes und ist noch mit % verbunden. (In der Abbildung wurden die vorderen !und "-Ketten durchsichtig gezeichnet.)

"

F1

! # b a

" $

Fo

cn

Der F1-Komplex lsst sich von der Membran ablsen und besitzt in dieser Form ATPaseAktivitt (Hydrolyse von ATP zu ADP). Nebenstehend ist die Kristallstruktur des !3"3#-Komplexes.

Der membranintegrierte Fo-Komplex besteht hauptschlich aus den 3 Proteinen a, b und c mit der Stchiometrie a b2 c10-14. Protein c besteht aus zwei haarnadelfrmig die Membran durchspannenden Helices. In E.coli bilden 12, in Hefemitochondrien 10 und in Chloroplasten 14 c-Proteine einen kreisfrmigen Komplex. Die Protonen passieren den Fo-Komplex zwischen den c-Proteinen und dem Protein a. Dabei werden Konformationsnderungen induziert, die zu einem Drehen des c-Komplexes gegenber a fhrt (wie das Schaufelrad in einer Turbine). Die Drehung wird ber #% ins Innere von F1 bertragen. Die !- und "Ketten drehen sich nicht mit, sondern werden ber die b-Proteine und $ gegenber a stationr gehalten. (#% und cn bilden den Rotor, a b2 !3"3$ bilden den Stator der Turbine.)

9. Membrangekoppelte ATP-Synthese

Die Drehung der #-Untereinheit zwingt den "-Untereinheiten verschiedene Konformationen auf: L = loose: ADP und Phosphat knnen binden.

T = tight: Die Bindungsstelle schliesst sich; die hydrophobe Umgebung frdert die Kondensation von ADP+Pi zu ATP.

O = open: ATP kann dissoziieren.

Wieviele Protonen mssen durch Fo fliessen, um ein ATP zu synthetisieren? Jedes c-Protein transportiert ein Proton pro Drehung. Bei 10 c-Proteinen in Mitochondrien wre also von 10 Protonen pro Drehung auszugehen. Pro Drehung werden 3 ATP synthetisiert. Das entspricht 31/3 H+/ATP. Weil die ATP-Synthase von E.coli 12 und von Chloroplasten 14 c-Proteine besitzt, ist anzunehmen, dass dort pro ATP 4 oder mehr H+ bentigt werden. Wenn kein ADP vorhanden ist, lsst sich die Kurbel nicht mehr weiter drehen sinnvollerweise. Die ATPSynthase kommt zum Stillstand, ebenso der Protonenfluss. Das ist ein wichtiger Aspekt der Atmungskontrolle (siehe weiter unten). Umgekehrt wird die ATP-Synthese durch Stoffe gehemmt, die den Fo-Kanal fr H+ blockieren: In Mitochondrien das Antibiotikum Oligomycin. In allen Systemen (Bakterien, Chloroplasten, Mitochondrien): Dicyclohexyl-carbodiimid (DCCD). DCCD bindet sich kovalent an einen Glutamatrest der hydrophoben c-Untereinheiten von Fo.

N=C=N
Stoffe, welche die Membran gegenber Protonen durchlssig machen, zerstren den H+-Gradienten und verhindern ebenfalls die ATP-Synthese. Solche Stoffe nennt man Entkoppler, weil sie die Protonenpumpe von der ATP-Synthase enkoppeln. . Es sind meist schwache, lipophile Suren, NO 2 NO 2 H+ die durch Membranen diffundieren knnen. O2N O O2N OH Sie wirken als H+-Trger (Protonophoren) ber die Kopplungsmembran. Das bekannteste Beispiel ist 2,4-Dinitrophenol.
NO 2 NO 2

Detergentien entkoppeln auch (warum?).

O2N

O H+

O2N

OH

Entkoppler setzen die Energie, die in den H+-Gradienten gespeichert wurde, als Wrme frei. Im braunen Fett von neugeborenen Sugern und von Tieren, die einen Winterschlaf machen, wird dieser Mechanismus zur Wrmeproduktion genutzt. Das braune Fett sind spezialisierte Adipozyten (Fettzellen), die das Protein Thermogenin, auch Entkoppler-Protein genannt, enthalten, das ein kontrolliertes Protonenleck bildet.

9. Membrangekoppelte ATP-Synthese + 3. H -Pumpen A. Bacteriorhodopsin In stark salzhaltigen Lsungen (Rnder des Toten Meeres) leben halophile (salzliebende) Archaebakterien. Halobacterium halobium trgt in seiner Plasmamembran ein aus 248 Aminosuren bestehendes purpurfarbenes Protein, das die Membran 7 mal durchspannt. Die Farbe wird durch die prosthetische Gruppe all-trans-Retinal erzeugt. Dieser Aldehyd ist als Schiff'sche Base an eine %-Aminogruppe eines Lysinrests gebunden. Da dieses Chromoprotein dem Sehpurpur (Rhodopsin) unserer Sehstbchen sehr hnlich ist, wird es Bacteriorhodopsin genannt. Mehrere Aminosureseitenketten, darunter besonders 2 Aspartate, bilden eine Anordnung von negativen Teilladungen, die eine Kette von H+ binden. Eines davon ist auch mit der Schiff'schen Base assoziiert. Bei Absorption eines Photons wird eine trans-C=C-Bindung zur cis-Konformation isomerisiert. Dabei wird das assoziierte Proton verschoben, in den Einflussbereich eines anderen Aspartats gebracht und sein pKa erniedrigt. Die ganze Kette von Protonen wird dadurch verschoben, mit dem Resultat, dass netto ein Proton vom Zellinneren (in der Abbildung oben) verschwindet und eines auf der Membranaussenseite (unten) erscheint. Es werden also Protonen nach aussen gepumpt.
H+ Asp-COOH+ N

Lys

Asp-COO - + H

h!

Asp-COOH Lys N Asp-COO H H +

(N.B.: Das Rhodopsin unserer Sehzellen im Auge ist ebenfalls ein 7-Transmembranprotein mit einem kovalent gebundenen Retinal, allerdings mit einem 11-cis-Retinal. Licht bewirkt die Isomerisierung zu alltrans-Retinal. Dies bewirkt keinen Protonentransport, sondern eine Konformationsnderung im Protein, die ber eine Signalkaskade einen Nervenimpuls auslst.)

Dass in Mitochondrien ein Protonengradient die ATP-Synthase antreibt, wurde 1961 von Peter Mitchell als die Chemiosmotische Hypothese postuliert. Das klassische Experiment, das dies praktisch bewies, kombinierte die Rekonstitution von gereinigtem Bakteriorhodopsin und isolierter mitochondrieller F1Fo-ATP-Synthase in einer Membran. Die gereinigten Proteine wurden in Detergens miteinander und mit Lipiden gemischt. Das Detergens wurde durch Dialyse entfernt, wobei sich Liposomen mit eingebautem Protein (= Proteoliposomen) bildeten. Bei Belichtung wurde ATP synthetisiert (zumindest in den Liposomen die Bakteriorhodopsin in der richtigen Orientierung eingebaut hatten).

9. Membrangekoppelte ATP-Synthese B. Oxidative Phosphorylierung Die allermeisten Organismen verwenden eine Elektronen-Transfer-Kette, um Protonen zu pumpen. Dabei werden Elektronen von Moleklen mit negativerem Standardredoxpotential in mehreren Stufen auf Molekle mit positiverem Standardredoxpotential bertragen. Diese Prozesse sind an den Transport von H+ durch die Membran gekoppelt. Insgesamt reduzieren Elektronendonatoren (D) aus der Nahrung einen in gengender Menge vorkommenden Elektronenakzeptor (A) nach der allgemeinen Reaktion: DH2 + A > D + AH2 + Protonengradient D3+ + A2+ + Protonengradient (bertragung von 2 e- zusammen mit 2 H+) (bertragung einzelner e-)

oder z.B.: D2+ + A3+ >

Als Donatoren knnen z.B. H2, H2S oder organische Verbindungen dienen. Akzeptoren knnen NO3(Nitrat), S (elementarer Schwefel) oder O2 (molekularer Sauerstoff) sein. Viele Bakterien und die Mitochondrien bentzen als Elektronendonatoren organische Verbindungen und als Elektronenakzeptor Luftsauerstoff. Der vielstufige Redoxprozess entspricht also einer kontrollierten Verbrennung. Elektronen werden aus organischen Verbindungen z.B. durch Glykolyse, "-Elimination und aus dem Tricarbonsurezyklus gewonnen und auf NAD+ und FAD bertragen. Von NADH und FADH2 werden sie dann ber eine Elektronentransportkette in der bakteriellen Plasmamembran und in der inneren Mitochondrienmembran auf Sauerstoff bertragen. Diesen Prozess nennt man deshalb Atmung und die Redoxkette Atmungskette. Die Atmungskette von tierischen Mitochondrien besteht aus drei grossen Proteinkomplexen, die fest in die innere Mitochondrienmembran eingebettet sind: NADH-Ubichinon-Reductase Cytochromreductase Cytochromoxidase (= Komplex I = NADH-Dehydrogenase ) (= Komplex III = Cytochrom bc1-Komplex) (= Komplex IV = Cytochrom aa3-Komplex)

Diese Komplexe werden miteinander durch zwei mobile, kleine Redoxkomponenten verbunden: Ubichinon Cytochrom c (engl. Ubiquinone = Coenzym Q) gelst und frei beweglich in der Membran

lsliches Protein im mitochondriellen Intermembranraum

Ubichinon besteht aus einem aromatischen Ring und einer hydrophoben Kette von 10 Isopreneinheiten:

Ubichinon kann schrittweise 2 Elektronen (je zusammen mit einem Proton) aufnehmen und wieder abgeben. (Vergleiche mit NAD+ und FAD!)

9. Membrangekoppelte ATP-Synthese
O O O O R Q = Ubichinon

+ 1 H+ + 1 e HO

O O O R Semichinon

+ 1 H+ + 1 e HO

O O OH R QH2 = Ubichinol

Cytochrome sind Proteine mit einem eisenhaltigen Hm. Hm-Molekle sind Porphyrine (vier ber Methengruppen ringfrmig verknpfte, N-haltige Fnfringe) mit verschiedenen Modifikationen. Die Stickstoffe koordinieren zu einem zentralen Eisenion, das als Fe2+ und Fe3+ vorliegen und deshalb als Redoxpartner ein e- abgeben oder aufnehmen kann. Die konjugierten Doppelbindungen ergeben charakteristische Absorptionsspektren, die auch den Redoxzustand des Eisenions anzeigen. In a- und b-Cytochromen ist das Hm fest aber nicht kovalent gebunden. (Zur Gruppe des Protoporphyrin IX gehrt auch das Hm in Hmoglobin und Myoglobin.) In cCytochromen ist das Hm kovalent ber CysteinSeitenketten gebunden. Das Redoxpotential hngt von der Proteinumgebung ab.

Cytochrom c Ausser dem beweglichen Cytochrom c gehren auch Untereinheiten der Cytochromreductase und der Cytochromoxidase zu den Cytochromen, weshalb sie auch Cytochrom bc1-Komplex bzw. Cytochrom aa3Komplex genannt werden. Die drei Protonenpumpen der Atmungskette bestehen alle aus mehreren Untereinheiten und bilden Teilketten mit mehreren Redoxkomponenten, die rumlich relativ fix gegeneinander positioniert sind. Ausser den schon erwhnten Klassen von Redoxkomponenten enthalten diese Pumpen auch noch EisenSchwefel- und Kupfer-Zentren.

Einfaches Fe-S-Zentrum

[2Fe-2S]-Zentrum

[4Fe-4S]-Zentrum

9. Membrangekoppelte ATP-Synthese [2Fe-2S]- und [4Fe-4S]-Zentren enthalten ausser 4 Cystein-Schwefelatomen noch 2 bzw. 4 elementare Schwefelatome (So). Eisen-Schwefel-Zentren knnen einzelne Elektronen aufnehmen und abgeben (Fe2+/Fe3+). Kupferionenkomplexe bestehen aus einem oder zwei Cu+-Ionen und knnen einzelne Elektronen abgeben (zu Cu2+) und wieder aufnehmen.

Die 2 Elektronen aus NADH in der mitochondriellen Matrix werden in der NADH-Q-Reductase auf ein fest gebundenes FMN und dann ber 3 [4Fe-4S]-Zentren, ein fest gebundenes Ubichinon (Q) und ein [2Fe-2S]Zentrum schliesslich auf ein mobiles Q bertragen. Gekoppelt an diese Redox-Reaktionen werden 4 H+ aus der Matrix in den Intermembranraum transportiert. Die Cytochromreductase bertrgt die 2 Elektronen von Q auf 2 Cytochrom c. Der bergang von einem 2Elektronen-Transporter auf einen 1-Elektron-Transporter wird fr den Protonentransport durch die Membran genutzt. Die 2 H+, die von der NADH-Q-Dehydrogenase zusammen mit 2 e- auf Q bertragen wurden, stammten aus der Matrix. Bei der bertagung auf die Cytochromreductase werden sie auf der Intermembranraumseite wieder freigesetzt. Nur eines der beiden e- wird (via ein Fe-S-Zentrum und Cytochrom c1) direkt auf ein erstes Cytochrom c bertragen. Das andere e- wandert ber zwei bCytochrome auf ein Q, das als Semichinon (Q-) gebunden bleibt. Von einem zweiten Ubichinol (QH2) werden wieder die beiden H+ hinaustransportiert und ein e- auf ein Cytochrom c gebracht. Das zweite ereduziert das gebundene Q- gnzlich zu QH2, wobei wieder 2 H+ aus der Matrix verwendet werden. Das ergibt netto QH2 + 2 H+ > 2 e- (auf Cyt c) + Q + 4 H+ wobei die 4 H+ aus der Matrix stammen und im Intermembranraum freigesetzt werden. Cytochromoxidase ist das Sauerstoff-reduzierende Enzym der Atmungskette. Es "sammelt" 4 e- von Cytochrom c, indem es sie ber zwei Kupfer-Zentren, ein a-Hm und ein a-Hm/Cu-Zentrum auf O2 bertrgt und H2O produziert. Dabei werden wieder 4 H+ gepumpt, pro Elektronenpaar aus NADH also 2 H+.

9. Membrangekoppelte ATP-Synthese
NADH -400
.

NAD +

-200

NADH-QReductase

4 H+
Intermembranraum

100

(mV)

Redoxptential

CytochromeReductase

4 H+
Cyt c

400
Matrix CytochromeOxidase

40 2 H+ 20

600

800 2 H+ + 1/2 O2 H2O

Die Effizienz der Energiebertragung bei der Reduktion von Sauerstoff zu Wasser mit Elektronen aus NADH in einen H+-Gradienten ist mit gegen 90% enorm hoch. Die Effizienz ist etwas geringer fr Elektronen aus FADH2, weil diese erst auf der Stufe von Ubichinon in die Atmungskette eintreten: Succinat-Dehydrogenase (= Komplex II), das einzige membrangebundene Enzym des Tricarbonsurezyklus, bertrgt das Elektronenpaar aus der Oxidation von Succinat zu Fumarat zunchst auf ein nicht-kovalent gebundenes FAD und dann auf Ubichinon (ohne Protonenpumpen). Acyl-CoA-Dehydrogenase, das erste Enzym der "-Oxidation von Fettsuren, reduziert FAD zu FADH2. Die Elektronen werden dann durch zwei weitere FAD-haltige Enzyme, nmlich ETF (Electron transfering flavoenzyme) und ETF-Q-Reductase, auf Ubichinon bertragen (ohne Protonenpumpen).

Freie

Energie

200

60

(kJ/mol)

80

9. Membrangekoppelte ATP-Synthese Glycerin-3-Phosphat-Shuttle: Die Glycerin-3-Phosphat-Dehydrogenase produziert FADH2 im

NAD + NADH Cytosolische Glycerin-3-P-DH

Intermembranraum aus der Oxidation von Glycerin-3-P zu DihyCytosol Glycerin-3-P Dihydroxyaceton-P droxyaceton-P und bertrgt die Elektronen auf Ubichinon. Im ussere Membran mit Poren Skelettmuskel und im Hirn werden Intermembranraum mit diesem Enzym die Elektronen Mitochondrielle Glycerin-3-P-DH FAD aus NADH im Cytosol (aus der FADH 2 Q Innere Membran Glykolyse) in die Atmungskette QH2 gefhrt. NADH aus der Glykolyse Matrix sind also nicht gleich viel wert wie NADH aus dem Fettabbau und dem Tricarbonsurezyklus. In anderen Geweben wie Leber, Niere und Herz werden die Reduktionsquivalente von cytosolischem NADH via den Malat-Aspartat-Shuttle auf mitochondrielles NAD+ bertragen (ausfhrlicher beschrieben im Zusammenhang mit der Gluconeogenese). Im Cytosol wird Oxaloacetat mit NADH zu Malat reduziert, das durch die innere Mitochondrienmembran transportiert wird. In der Matrix wird NADH durch Oxidation von Malat zurck zu Oxaloacetat wieder gebildet.

Der P/O-Quotient Wieviel ATP wird pro Elektronenpaar produziert, das von NADH auf Luftsauerstoff bertragen wird (oder: fr jedes Sauerstoffatom, das dabei reduziert wird)? = Was ist der P/O-Quotient? Es werden 10 H+ aus den Mitochondrien transportiert. Fr die Synthese von 3 ATP braucht es den Rckfluss von 10 H+. => ? Aber: Weil ein grosser Teil des ATP im Cytosol verbraucht wird, muss ATP aus den Mitochondrien hinausund ADP und Phosphat hineintransportiert werden. Ein ADP-ATP-Carrier transportiert ADP im Austausch gegen ATP. Weil ATP negativer geladen ist als ADP, wird der Export von ATP durch das Membranpotential begnstigt. Fr Phosphat ist das Gegenteil der Fall: Phosphataufnahme in die negative Matrix muss angetrieben werden. Dies geschieht durch 1:1-Kopplung an den Rckfluss eines H+ durch einen Symporter fr Phosphat und H+. => Fr die Synthese von 3 ATP und den Transport von Phosphat, ADP und ATP braucht es den Rckfluss von ~13 H+. Pro Elektronenpaar aus NADH werden 10 H+ hinausgepumpt. => Der P/O-Quotient ist ~2.5. Der P/O-Quotient fr Elektronenpaare aus FADH2 oder cytosolischem NADH via Glycerin-3-PhosphatShuttle betrgt dagegen nur ~1.5.

Atmungskontrolle Wenn Zellen wenig Energie brauchen und das meiste ADP zu ATP phosphoryliert worden ist, staut sich der Protonengradient an; die drei Protonen-Pumpstationen mssen Protonen gegen einen immer hheren Gegendruck pumpen und stehen schliesslich still. Da das Pumpen von Protonen strikt an den Elektronentransfer gekoppelt ist, kommt auch dieser zum Stillstand: Es tritt Atmungskontrolle ein, was die unntze Verbrennung von Nahrungsstoffen vermeidet.

9. Membrangekoppelte ATP-Synthese

10

Atmungshemmer Zahlreiche Stoffe blockieren den Elektronenfluss in der mitochondrialen Atmungskette an ganz bestimmten Stellen. Diese Stoffe sind fast stets starke Gifte, da sie die wichtigste Energieproduktion aerober Zellen hemmen und deshalb sehr schnell zum Zelltod fhren. Diese Hemmstoffe haben aber auch wesentlich zur Aufklrung des Elektronenflusses in der Atmungskette beigetragen. Die wichtigsten dieser Gifte sind: Gift Barbiturate (Amytal) Rotenon (ein pflanzliches Gift) Antimycin A (ein von Pilzen produziertes Antibiotikum) Cyanid, Azid, CO Angriffspunkt NADH-Q-Reductase NADH-Q-Reductase Cytochromreductase Cytochromoxidase

10. PHOTOSYNTHESE
1. Lichtabsorption durch Pigmente Statt wie in der oxidativen Phosphorylierung chemische Energie fr die Elektronentransportkette aufzuwenden, wird in verschiedenen Organismen Lichtenergie dazu eingesetzt, Elektronen auf ein hohes Energieniveau zu bringen. Pigmente = lichtabsorbierende Molekle. Chlorophylle bestehen aus einem planaren Ringsystem hnlich dem Hm, aber mit einem zentralen Mg2+-Ion und mit einer langen Phytolseitenkette (aus Isopreneinheiten). Chlorophyll a und b von Pflanzen und Bacteriochlorophyll aus Bakterien unterscheiden sich in einigen Substituenten und haben deshalb unterschiedliche Absorptionsspektren. Zustzliche Pigmente sind in Cyanobakterien Phycoerythrobilin und das hnliche Phycocyanobilin; in Pflanzen !Carotine und Lutein (= Xanthophyll).

10. Photosynthese Zum effizienteren Lichteinfang sind die Reaktionszentren, wo die Redoxkette in Gang gesetzt wird, von vielen Lichtsammlerproteinen umgeben, die Photonen einfangen und die Anregung praktisch verlustlos durch Excitontransfer an das Reaktionszentrum weitergeben.

In Cyanobacterien bilden die Lichtsammler grosse Komplexe ausserhalb der Membran, sog. Phycobilisomen.

Bei Pflanzen sind die Lichtsammlerproteine Membranproteine wie die Reaktionszentren selbst.

2. Zyklische Photophosphorylierung in Prokaryoten Am besten verstanden ist das Reaktionszentrum von Rhodopseudomonas viridis, einem Purpurbakterium. Es besteht aus: 3 Membranproteinen mit total 4 Bakteriochlorophyll-Moleklen 2 Bakteriophophytin-Moleklen (= Bakteriochlorophyll ohne Magnesium) 1 Menachinone (QA), fest an das Reaktionszentrum gebunden 1 Eisenatom 1 Ubichinon (QB), das nur lose an das Reaktionszentrum gebunden ist. 1 c-Typ Cytochrom mit 4 Hmgruppen auf der periplasmatischen Seite der Membran.

Das bakterielle Ubichinon ist krzer (6 statt 10 Isopreneinheiten) als das eukaryotische. Menachinon ist ein zustzliches Chinon von Bakterien, Plastochinon eines von Pflanzen

10. Photosynthese Der Reaktionsablauf im Reaktionszentrum: (1) Licht schlgt ein Elektron aus zwei Bakteriochlorophyllmoleklen (dem sog. special pair) heraus; zurck bleibt eine zwischen diesen beiden Moleklen delokalisierte positive Ladung (ein Elektronenloch). Das Elektron wird ber das dritte Bakteriochlorophyllmolekl auf ein Bakteriophophytin bertragen und dann (2) zum Menachinon QA. (3) Das Elektron wandert zuerst zum Eisenion und von dort zum Ubichinon QB. (4) Das Elektronenloch in den beiden Bakteriochlorophyllmoleklen wird in der Zwischenzeit durch ein Elektron aus einer Kette von 4 Hmgruppen wieder gefllt. (5) Schritte 14 wiederholen sich, sodass schliesslich zwei Elektronen auf Ubichinon ankommen. (7) Das reduzierte Ubichinol dissoziiert vom Reaktionszentrum ab und bertrgt das Elektronenpaar auf den Cytochrom bc1-

Komplex, der der Cytochromreductase der oxidativen Phosphorylierung in Mitochondrien entspricht, Protonen pumpt und die Elektronen schliesslich auf ein mobiles Cytochrom c bertrgt, das sie zum Reaktionszentrum zurck fhrt. Der Protonengradient wird durch eine ATP-Synthase zur Produktion von ATP verwendet. Bei dieser zyklischen Photophosphorylierung wird also nur Licht, ADP und Pi verbraucht und ATP gebildet.

(Nur die Pigmente und Elektronenbertrger sind hier dargestellt. Sie sind recht starr in den Proteinen in optimaler Position zueinander fixiert. Die bertragungszeiten zwischen den Pigmenten sind spektroskopisch gemessen worden.)

10. Photosynthese 3. Nichtzyklische Photophosphorylierung in Prokaryoten In anderen Prokaryonten werden die Elektronen, die die Redoxkette durchlaufen, nicht immer recycliert. Bei grnen Schwefelbakterien, laufen sie entweder ber Ubichinon, Cytochrom bc1-Komplex und ein Cytochrom c zurck und liefern die Energie fr einen Protonengradienten, der ATP produziert. Alternativ werden sie via das Eisen-Schwefel-Protein Ferredoxin (Fd) auf eine Ferredoxin-NAD+-Reductase bertragen, die NADH (Reduktionsquivalente) produziert. Die Elektronen werden dann ersetzt durch die Oxidation von H2S zu elementarem Schwefel (S0) oder SO42-.
E-

1000

Fd
Fd-NAD REDUCTASE

NAD +

REDOXPOTENTIAL (MV)

500

Q h!
CYT C553 CYTBC1KOMPLEX
X

NADH

H+

0 H 2S

P840
S, SO42

500

4. Photophosphorylierung in Pflanzen

Photosynthese in Pflanzen findet in Chloroplasten statt. Wie die Mitochondrien besitzen Chloroplasten eine ussere, dank Poren fr kleine Molekle durchlssige Membran, und eine innere Membran. Das Stroma (entspricht der Matrix von Mitochondrien) enthlt aber weitere durch Membranen abgetrennte Strukturen, die Thylakoiden, die stellenweise dicht aufeinander geschichtet sind zu sog. Grana. Diese Thylakoidenmembranen enthalten zwei Reaktionssysteme, die evolutionr mit den beiden oben beschriebenen verwandt sind und koordiniert miteinander arbeiten. Die Energie von zwei absorbierten Photonen wird eingesetzt um ein Elektron auf NADP+ zu bertragen und unterwegs noch eine Protonenpumpe fr ATP-Synthese anzutreiben. Die Elektronen stammen aus H2O, wodurch O2 produziert wird. Die Protonen werden ins innere der Thylakoiden gepumpt und treiben die ATP-Synthasen an, die ins Stroma ragen.

10. Photosynthese

e1000

ePh

Fd
NADP +
Fd-NADP+ Reductase

500
Redoxpotential (mV)

PQA PQB
Cyt b6fKomplex

NADPH

h!
x H+ Pc

P700
500 H 2O

h! P680
O2

1000

Photosystem II

Photosystem I

10. Photosynthese Im Reaktionszentrum des Photosystems II (mit einer maximalen Absorption bei 680 nm) wird durch ein Photon ein Elektron zu einem sehr negativen Redoxpotential angeregt, so dass damit ein gebundenes Phophytin (= Chlorophyll ohne Magnesium) reduziert werden kann, dann ein fest gebundenes Plastochinon (PQA) und schliesslich ein vorbergehend gebundenes Plastochinon (PQB). Die Elektronenlcke im Reaktionszentrum wird durch ein e- aus H2O aufgefllt, das durch das sog. wasserspaltende Enzym (mit essentiellen Mn-Ionen) geliefert wird. Dabei entsteht O2. Wenn auf diese Weise zwei Elektronen auf PQB angekommen sind, wird dieses freigesetzt. Sein Elektronenpaar wird vom Cytochrom b6f-Komplex bernommen, der hnlich funktioniert wie der Cytochrom bc1-Komplex (= Cytochromreductase) in Mitochondrien und Protonen aus dem Stroma in die Thylakoiden pumpt. ber einen zweiten mobilen Elektronentransporter, Plastocyanin, ein lsliches Cu+/2+-Protein werden Elektronen einzeln zum Photosystem I gebracht, um dort die Elektronenlcke zu fllen. Diese entsteht, wenn Photonen ein Elektron im Reaktionszentrum (maximale Absorption bei 700 nm) zu einem sehr negativen Redoxpotential angeregt haben, dass es ber ein Chlorophyll, ein fest gebundenes Chinon, und 3 Fe-S-Zentren auf das mobile Elektronentransportprotein Ferredoxin (ein 2Fe2S-Protein) wandert. Letzte Station ist schliesslich der Ferredoxin-NADP+-Reductase-Komplex, der 2 Elektronen sammelt und NADPH produziert. Dank einer zyklischen Variation ist das Verhltnis von ATP-Produktion (d.h. von gepumpten H+) zu Reduktionsquivalenten in NADPH fast beliebig variabel und allen Bedrfnissen anpassbar: Ferredoxin kann sein Elektron auch an ein Chinon und somit zurck an den Cytochrom b6f-Komplex, die H+-Pumpe, liefern.

10. Photosynthese 5. CO2-Assimilation: Der Calvin-Zyklus Die meisten heterotrophen Organismen oxidieren organische Stoffe zur Energiegewinnung und mssen die Reduktionsquivalente, die dabei anfallen, mglichst gewinnbringend verwerten. Phototrophe Organismen wie die Pflanzen knnen mit Licht und Wasser ATP und Reduktionsquivalente gewinnen. Das ermglicht es ihnen CO2 zu organischen Moleklen zu reduzieren. Die Assimilation von CO2 geschieht in einer zyklischen Reaktionsfolge, dem Calvin-Zyklus, der aus drei Abschnitten besteht: 1. Fixation von CO2 an Ribulose-1,5-bisphosphat (ein C5-Molekl), wobei zwei 3-Phosphoglycerate entstehen (2 x C3). 2. Reduktion von 3-Phosphoglycerat zu Glyceraldehyd-3-Phosphat, das in die Glykolyse, die Gluconeogenese, etc. eingehen kann. 3. Regeneration von Ribulose-1,5-bisphosphat.

10. Photosynthese

CH2 OPO3 O C HC OH HC OH CH2O PO3 Ribulosebis-phosphat

1. Ribulose-1,5-bisphosphat-Carboxylase, Rubisco, ist wohl das hufigste Enzym der Biosphre, kommt es doch im Stroma von Chloroplasten in einer Konzentration von ~250 mg/ml vor. CO2-Einbau fhrt zur Spaltung des intermediren C6-Molekls zu zwei C3-Moleklen 3-Phosphoglycerat.

COO
2 CH2 OPO3

C C OH HC OH
2 CH2O PO3

2 CH2 OPO3

2 CH2 OPO3

HC OH CH2O PO3
2

COO

H2O

HO HO

COO

C O HC OH
2 CH2O PO3

C O HC OH
2 CH2O PO3

+
COO HC OH CH2O PO3
2

3-Phosphoglycerat
2. 3-Phosphoglycerat wird durch Phosphorylierung aktiviert (3-Phosphoglycerat-Kinase) und mit NADPH reduziert (Glyceraldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase) in einer Reaktionsfolge, die der Umkehrung der entsprechenden Schritte in der Glykolyse entspricht.

COO HC OH
2 CH2O PO3

ATP

ADP

COO PO3 HC OH

NADP+ NADPH + Pi

HC HC

O OH
2

2 CH2O PO3

CH2 OPO 3

3-Phosphoglycerat

1,3-Bisphosphoglycerat

Glyceraldehyd-3-P
C3

C3

3. Mittels Transaldolasen und Transketolasen werden aus Glyceraldehyd-3Phosphaten (C3) wieder Ribulose-1,5-bisphosphate (C5) regeneriert. Transaldolasen (TA) kondensieren eine Aldose mit einer Ketose (siehe die Aldolase in der Glykolyse). Transketolasen (TK) haben Thiaminpyrophosphat als Cofaktor und bertragen die C-1 und C-2 einer Ketose auf eine AkzeptorAldose und produziert eine verkrzte Aldose und eine verlngerte Ketose. Nebenstehendes Schema zeigt wie 5 C3-Zucker in 3 C5-Zucker umgewandelt werden. Zustzlich braucht es noch 2 Phosphatasen (um Bisphosphate zu Phosphaten zu hydrolysieren), eine Epimerase (um Xylulose-5-Phosphat zu Ribulose-5-Phosphat zu epimerisieren) und eine Ribulose-5-Phosphat-Kinase (um Ribulose-5-Phosphat zu aktivieren).

TA C6

+ C3
TK

C3

+ C4 + C5
TA

C3

+ C7
TK

C5

+ C5

10. Photosynthese EVOLUTION DES ENERGIESTOFFWECHSELS Die molekulare Information ber zellulre Energietransformationen erlaubt fundierte Vermutungen darber, wie diese Prozesse im Verlauf der Entwicklung des Lebens auf unserer Erde entstanden sind. Unser Planet ist etwa 4.5 Milliarden Jahre, die ltesten Fossilien etwa 3.8 Milliarden Jahre alt. Vor 3.8 Milliarden Jahren enthielt die Erdatmosphre wahrscheinlich fast kein Sauerstoffgas, sondern bestand vorwiegend aus inerten Gasen wie Stickstoff, Methan, Ammoniak, Kohlenmonoxid etc. Diese inerte Umgebung erlaubte die langsame Akkumulation von einfachen organischen Stoffen in den Weltmeeren. Folgende Entwicklungsstadien sind plausibel: (1) Einfache Zellen entwickeln Glykolyse-hnliche Prozesse, in denen die in der Umgebung akkumulierten organischen Stoffe abgebaut werden, wobei Energie frei wird. (2) Bei diesen Prozessen werden Protonen frei, die aus den Zellen entfernt werden mssen. Zellen entwickeln in ihrer Zellmembran Pumpen, die Protonen aus der Zelle hinauspumpen. Diese Pumpen werden durch ATP-Hydrolyse angetrieben. (3) Organische Stoffe werden knapp. Zellen lernen, Sonnenlicht einzufangen und damit einen Protonengradienten ber ihre Zellmembran aufzubauen. Dieser kann zur Synthese von ATP verwendet werden, indem die bereits in der Zellmembran vorhandene Protonenpumpe in umgekehrter Richtung (d. h. als Protonen-getriebene ATP Synthase) eingesetzt wird. Damit ist die Energiekrise zunchst behoben; reduzierende Elektronen mssen aber nach wie vor aus den schwindenden organischen Verbindungen der Umwelt bezogen werden. (4) Organismen lernen, Sonnenlicht auch fr die Produktion von reduzierenden Elektronen aus Wasser zu verwenden. Diese Organismen sind enorm erfolgreich und berwuchern grosse Teile der erkalteten Landmassen. Sie setzen dabei grosse Mengen von Sauerstoff frei und beginnen die Atmosphre mit dem fr die Zellen giftigen Gas zu verschmutzen. Etwa 99% aller Lebewesen sterben aus. (5) Die berlebenden Organismen haben Enzyme entwickelt, die sie gegen Sauerstoffgas schtzen (Katalase, Superoxiddismutase). Schliesslich beginnen Zellen, Sauerstoffgas als Elektronenakzeptor fr die Verbrennung organischer Substanzen zu bentzen. Fr diese Verbrennung muss die bereits bestehende photosynthetische Elektronentransportkette nur geringfgig modifiziert werden. Atmung und oxidative Phosphorylierung sind erfunden. Die Aehnlichkeit der verschiedenen Elektronentransportketten ist einer der vielen Hinweise dafr, dass die hier skizzierte Hypothese plausibel ist.

11. GLUCONEOGENESE

1. Anaplerotische Reaktionen Der Tricarbonsurezyklus ist nicht nur von Bedeutung fr die Energieproduktion, sondern ist auch zentraler "Rangierbahnhof" fr die Umwandlung von Aminosuren zu Glucose oder zu Fetten, und Ausgangspunkt fr die Synthese vieler Zellbestandteile. Damit der Zyklus nicht zum Stillstand kommt, wenn Zwischenprodukte durch andere Reaktionen abfliessen, mssen gewisse Komponenten in sog. anaplerotischen Reaktionen "nachgefllt" werden (Reaktionen 14 in der Figur):
G l u c o se Ser, Cys, Tyr,
Citrat

Gly, Phe, Trp


2 3 1

Fettsu r en PEP
Pyruvat

S ter o i de Iso pr en

Acetyl-CoA

Acetyl-CoA

Asn,

Asp

Oxaloacetat 4

Citrat

Purine

Malat

Aconitat

Fumarat

Isocitrat

Succinat

!-Ketoglutarat

Succinyl-CoA

Glu

Purine P o r ph yr i n e, Hm

Gln,

Pro,

Arg

1. Pyruvatcarboxylase: Pyruvat + CO2 + ATP

Oxaloacetat + ADP + Pi

2. Phosphoenolpyruvat-carboxykinase: Phosphopenolpyruvat + CO2 + GDP

Oxaloacetat + GTP

3. Phosphoenolpyruvat-carboxylase (Pflanzen, Hefe, Bakterien): Phosphopenolpyruvat + CO2 ! Oxaloacetat + Pi 4. Malatenzym: Pyruvat + CO2 + NADPH

Malat + NADP+

11. Gluconeogenese 2. Acetyl-CoA-Shuttle und Malatenzym Die Fettsuresynthese bentigt Acetyl-CoA ausserhalb der Mitochondrien. Dazu wird Citrat von den Mitochondrien ins Cytosol transportiert und dort durch die Citratlyase unter ATP-Hydrolyse wieder in Acetyl-CoA und Oxaloacetat gespalten. Oxaloacetat wird durch eine cytosolische Malatdehydrogenase zu Malat reduziert, das wieder importiert und zu Oxaloacetat zurckoxidiert werden kann. Mit AcetylCoA wird Citrat in den Mitochondrien wieder regeneriert. Netto wird dabei unter ATP-Hydrolyse AcetylCoA exportiert (und cytosolisches NADH in mitochondrielles umgewandelt).

Alternativ kann Malat im Cytosol durch das Malatenzym unter CO2 -Abspaltung zu Pyruvat oxidiert werden. Dies geschieht mit NADP+, das zu NADPH reduziert wird. Dies ist neben dem Pentosephosphatweg (siehe unten) der wichtigste Mechanismus, um NADPH fr die Biosynthese z.B. von Fettsuren zu produzieren. (Bei Pflanzen hauptschlich durch Photosynthese!) Pyruvat kann durch ATP-getriebene Carboxylierung in den Mitochondrien in Oxaloacetat bergefhrt und zu Malat reduziert werden. Die Pyruvatcarboxylase-Reaktion (Pyruvat ! Oxaloacetat) und die Malatenzym-Reaktion (Pyruvat ! Malat) sind auch eine wichtige anaplerotische Reaktionen.

11. Gluconeogenese 3. Malat-Aspartat-Shuttle In Leber, Niere und Herz werden die Reduktionsquivalente von cytosolischem NADH via den M a l a t Aspartat-Shuttle auf mitochondrielles NAD+ bertragen. Im Cytosol wird Oxaloacetat mit NADH zu Malat reduziert, das durch die innere Mitochondrienmembran transportiert wird und in der Matrix wieder zu Oxaloacetat oxidiert wird. Netto wird cytosolisches NADH in mitochondrielles "umgewechselt" und Oxaloacetat importiert. Letzteres wird recycliert, indem es zu Aspartat transaminiert und als solches wieder exportiert wird. Die Partner fr die Aminotransferasereaktionen, Glutamat/" -Ketoglutarat, sind gleichzeitig die Partner in den Antiportreaktionen durch die innere Membran: Malat gegen " -Ketoglutarat und Aspartat gegen Glutamat.

ber diesen Shuttle knnen aus cytosolischem NADH die vollen ~2.5 ATP gewonnen werden. Im Gegensatz dazu wird in Skelettmuskel und Hirn NADH mit dem Glycerin-3-Phosphat-Shuttle ber FADH2 in die Atmungskette gespeist und liefert so nur ~1.5 ATP.

11. Gluconeogenese 4. Neusynthese von Glucose aus Pyruvat oder Lactat


Pi 8

Glucose Glucose-6-P Fructose-6-P

ATP ADP

Pi

Glucose-1-P

Glycogen

Pi 7

ATP ADP

UTP 9

UDP + PPi

Fructose-1,6-bis-P Glycerinaldehyd-3-P 1,3-P-Glycerat


ADP ATP

Dihydroxyaceton-P
NAD+ + Pi NADH

3-P-Glycerat 2-P-Glycerat Phosphoenolpyruvat


6

CO2 + GDP GTP NADH NAD+

Oxaloacetat Malat

ADP NAD+ NADH ADP 5 CO2 + ATP

Malat Oxaloacetat
5

ATP

Phosphoenolpyruvat
CO2 + GDP GTP ADP CO2 + ATP 6

Oxaloacetat

Pyruvat Pyruvat

Pyruvat Pyruvat

NADH NAD+

Lactat

1 2 3 4

Hexokinase Phosphofructokinase Pyruvatkinase Glycogenphosphorylase

5 6 7 8 9

Pyruvatcarboxylase Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase Fructose-1,6-bisphosphatase Glucose-6-phosphatase UDP-Glucose-Pyrophosphorylase + Glycogensynthase

11. Gluconeogenese Bei der Neusynthese von Glucose (Glukoneogenese) mssen die drei irreversible Schritte der Glykolyse, Pyruvatkinase, Phosphofructokinase und Hexokinase, "umgangen" werden. Pyruvat wird in Mitochondrien durch Pyruvatcarboxylase zu Oxaloacetat carboxyliert:
COO C O + CO2 + ATP CH3 Pyruvatcarboxylase COO C O CH2 COO O -OOC

+ ADP + Pi

Als CO2 -bertragende prosthetische Gruppe fungiert Biotin, das kovalent an die # -Aminogruppe eines Lysinrestes im Enzym gebunden ist:

NH

S O

H N L ysin

Diese Reaktion findet in den Mitochondrien statt und ist auch eine der wichtigen anaplerotischen Reaktionen des Tricarbonsurezyklus. Fr den Transport ins Cytosol wird Oxaloacetat zu Malat reduziert und im Cytosol wieder zu Oxaloacetat oxidiert. Ein "Nebeneffekt" dieses Umwegs ber Malat ist der Export von Reduktionsquivalenten ins Cytosol. Dies ist sinnvoll, weil NADH fr die Umwandlung von 1,3-bis-Phosphoglycerat zu Glycerinaldehyd-3-Phosphat bentigt wird. Oxalacetat wird durch eine cytosolische Phosphoenolpyruvatcarboxykinase mit GTP zu Phosphoenolpyruvat umgewandelt:
C OO C O CH2 COO + GTP PEP-Carboxykinase COO C H2 -

C O PO32 + CO2 + GDP

Das Pyruvat fr die Gluconeogenese stammt aus dem Abbau verschiedener Aminouren (Ala, Cys, Ser, Gly) oder aus Lactat, dem Endprodukt der Glykolyse unter anaeroben Bedingungen. Lactat kann durch Lactatdehydrogenase leicht zu Pyruvat oxidiert werden, womit das cytosolische NADH fr die Glycerinaldehyd-3-Phosphatdehydrogenase-Reaktion schon gebildet wird. Deshalb wird das Pyruvat nach Carboxylierung zu Oxaloacetat noch in den Mitochondrien durch eine mitochondriale Phosphoenolpyruvatcarboxykinase zu Phosphoenolpyruvat umgewandelt und als solches exportiert. Die Phosphofructokinase und Hexokinase-Reaktionen knnen durch exergone Hydrolyse der Phosphate durch Fructose-1,6-bisphosphatase und Glucose-6-phosphatase berwunden werden. Zur Vermeidung von energieverbrauchenden, leeren Zyklen mssen die Enzyme der irreversiblen Schritte fr die Glykolyse und die Gluconeogenese reziprok reguliert werden. Ein gutes Beispiel ist der allosterische Effekt von Fructose-2,6-bisphosphat: aktivierend auf Phosphofructokinase und inhibierend auf Fructose-1,6-bisphosphatase (siehe Glykolyse).

11. Gluconeogenese Gluconeogenese ist teuer: 2 Pyruvat + 4 ATP + 2 GTP + 2 NADH ! Glucose + 4 ADP + 2 GDP + 6 Pi + 2 NAD+

Gluconeogenese braucht 6 ATP-quivalente. Glykolyse liefert nur 2. Gluconeogenese findet hauptschlich in der Leber statt. Ausgangsprodukte sind: Lactat, das ber die Blutbahn aus anaerob arbeitenden Muskeln stammt. Pyruvat aus dem Abbau von Aminosuren (Ala, Cys, Ser, Gly). Tricarbonsurezyklus-Intermediate aus dem Abbau anderer Aminosuren (z.B. " -Ketoglutarat aus Glu, Gln, Arg; Oxaloacetat aus Asp und Asn; Fumarat aus Phe und Tyr).

5. Glyoxylat-Zyklus In Wirbeltieren ist Gluconeogenese aus Acetat oder Acetyl-CoA (und somit aus Fettsuren) nicht mglich! Im Tricarbonsurezyklus werden fr jedes Acetyl, das eingebaut wird, zwei CO2 wieder freigesetzt. Viele andere Organismen z.B. Pflanzen, E. coli, Hefe besitzen den Glyoxylat-Zyklus, eine Variation des Tricarbonsurezyklus, die die decarboxylierenden Reaktionen "berspringt" und aus 2 Acetyl-CoA ein C4 -Molekl, Succinat, produziert:
S-CoA Acetyl-CoA NADH + H+ NAD+ C OO HO C H CH2 C OO Malat COO C O COOOxaloacetat CH2 C O C H3 CoA HO COOCH 2 C COO CH2 COOH2O COOCH2 C COOCH COOcis-Aconitat

Citrat

Glyoxylat-Zyklus
Malatsynthase

H2O

CO OCoA CH2 H C COO H O CH CO OIsocitrat

CHO S-CoA Acetyl-CoA C O CH 3 COO Glyoxylat

Isocitratlyase

C OO CH 2 CH 2 COO -

Glucose

Oxaloacetat

Succinat

Isocitratlyase spaltet Isocitrat zu Succinat und Glyoxylat (O=CHCOO ) . Malatsynthase kondensiert Glyoxylat mit Acetyl-CoA zu Malat.

11. Gluconeogenese Malat wird durch die Tricarbonsurezyklus-Reaktionen mit Acetyl-CoA wieder zu Isocitrat. Succinat kann durch die Tricarbonsurezyklus-Reaktionen zu Oxaloacetat und ber Phosphoenolpyruvat zu Glucose umgewandelt werden. In Pflanzen, besonders in fettreichen Samen, sind die Enzyme des Glyoxylatzyklus zusammen mit den Enzymen fr den Fettsureabbau in separaten Organellen, den Glyoxysomen , (mit einer einzigen Membran) lokalisiert. Succinat wird ins Cytosol exportiert und in die Mitochondrien importiert, um v i a Tricarbonsurezyklus in die Gluconeogenese zu fliessen.

6. Glycogen Die Speicherform von Glucose in Pflanzen ist die Strke bestehend aus Amylose , ein lineares,spiraliges Polymer von ("1! 4)-verknpfter Glucose, sowie Amylopectin, ein Polymer von ("1! 4)-verknpften und ("1! 6)-verzweigten Glucoseeinheiten.

In tierischen Zellen ist Glucose als G l y c o g e n gespeichert, das aus (" 1 ! 4)-verknpften Ketten besteht, die etwa alle 10 Glucoseeinheiten (" 1 ! 6)verzweigt sind. Riesige Glycogenmolekle bilden zusammen mit den Enzymen fr Auf- und Abbau Glycogengranula . Glycogen wird besonders in der Leber und in Muskel gespeichert.

3.1. Glycogensynthese Bei der Biosynthese von Glycogen werden glycosidische Verbindungen zwischen der C1-Hydroxylgruppe von Glucose-Moleklen (in der Pyranose-Ringform) und der C4-Hydroxylgruppe von terminalen Glucosen im Glycogen geknpft. Dazu wird Glucose in C1 aktiviert, zuerst zu Glucosephosphat, dann zu einem Glucosenukleotid:
ATP ADP UTP PP i Glycogen n UDP Glycogen n+1

Glucose-1-P Glucose Glucose-6-P UDP-Glucose Hexokinase Phosphogl ucoUDP-GlucoseGlycogenmutase pyrophosphor ylase synthase

Fr die Glycosylierung und die Synthese von Glycanen werden allgemein nukleotid-aktivierte Zucker gebraucht. Z.B. UDP-Glucose, UDP-Galactose, aber GDP-Mannose und CMP-Sialinsure.

11. Gluconeogenese Die erste Glucose bei der Synthese von Glycogen wird kovalent an ein Tyrosine des Proteins Glycogenin gebunden. Lineare ( " 1 ! 4)-Ketten werden mit Glycogensynthase synthetisiert. Die ( " 1 ! 6)-Verzweigungen entstehen durch das "Umhngen" von terminalen Oligo-Glucoseketten an eine interne C6-Hydroxylgruppe durch die Transglycosylase (englisch: Glycogen branching enzyme) .
Glycogenin

Tyr Transglycosylase (!1"6) Tyr

3.2. Glycogenmobilisation Fr die Addition einer Glucose an Glycogen werden 2 ATP-Aequivalente verbraucht. ein Teil dieser Energie wird beim Glycogenabbau gespeichert, weil nicht eine Hydrolyse zu Glucose, sondern eine P h o s p h o r o l y s e zu Glucose-1-phosphat stattfindet, katalysiert durch das Enzym Glycogenphosphorylase . Die Phosphorylase spaltet nur (" 1 ! 4)Bindungen bis zu einer gewissen Nhe zu einer ("1!6)-Verzweigung. Fr den weiteren Abbau braucht es das sog. Debranching enzyme , das eine Oligoglucosyltransferase- und eine (" 1 ! 6)-Glucosidase-Aktivitt besitzt.

Glycogenphosphorylase

Debranching enzyme [Transferase]

Debranching

enzyme

[(!1"6)-Glucosidase]

4. Der Cori-Zyklus Bei starker Muskelttigkeit wird die Sauerstoffzufuhr zur Muskulatur limitierend. ! Die Bedingungen werden partiell anaerob. ! Muskelglycogen wird mobilisiert. Die ATP-Produktion geschieht hauptschlich durch Glykolyse und Pyruvat wird zu Lactat reduziert. ! Das Lactat wird ber den Blutstrom abgefhrt, von der Leber aufgenommen und zur Gluconeogenese verwendet. ! Die entstandene Glucose wird in den Blutstrom entlassen ! und wieder von den Muskelzellen aufgenommen und durch Glykolyse zu Lactat oxidiert, etc. etc.. Diesen Kreislauf von Glucose/Lactat zwischen Muskel und Leber nennt man den Cori-Zyklus. Um die Glycogenspeicher wieder zu fllen, entnimmt der Muskel auch nach der Anstrengung weiter Glucose aus dem Blut, das aus der Leber stammt. Die Energie fr die Gluconeogenese und die Glycogensynthese kann jetzt wieder aerob gewonnen werden: erhhte Atmung nach der Anstrengung = "Sauerstoffschuld". Der Transport von Glucose zwischen Blut und Cytosol geschieht durch facilitated diffusion v i a Glucosetransporter in der Plasmamembran. Der Blutzucker wird im Menschen bei ~4.5 mM (60-90 mg/100 ml) durch die Leber konstant gehalten. Die Leber als hauptschliches Glucose produzierendes Organ und die verbrauchenden Organe mssen sich also bei gleicher Glucosekonzentration anders verhalten. Dies geschieht einerseits durch unterschiedliche hormonelle Regulation (siehe spter) und andererseits durch Isoenzyme (unterschiedliche, aber verwandte Enzyme):

11. Gluconeogenese

Glucose wird intrazellulr durch Hexokinase abgefhrt. Das Isoenzym im Muskel besitzt ein niedriges K M (<1 mM), wird aber allosterisch durch das Produkt Glucose-6-Phosphat gehemmt. Bei Bedarf (Glucose-6-P niedrig, weil verbraucht durch Glykolyse oder Glycogensynthese) ist die intrazellulre Glucosekonzentration tief und Glucose strmt ein. Das Isoenzym der Leber (Hexokinase D = Glucokinase) besitzt ein KM von ~10 mM, sodass nur bei hohem Blutzucker (nach dem Essen) Glucose aufgenommen wird, bei normalem Blutzucker aber immer noch abgegeben wird.
Muskel: Phosphorylase
(wenig

aktiv)

b
HO

OH

Adrenalin PhosphorylasePhosphatase Phosphor ylaseKinase Ca2+ AMP ATP Phosphorylase


(aktiv)

P P

Leber: Phosphorylase
(wenig

aktiv)

b
HO

OH

+ Glc Glc
HO

Glc Glc

OH

PhosphorylasePhosphatase

PhosphorylaseKinase

Glucagon

Phosphorylase
(aktiv)

P P

+ Glc Glc

Glc

Glc

Glycogen-Phosphorylase ist ein Dimer das in zwei Formen als wenig aktive Phosphorylase b und als aktive Phosphorylase a vorkommt. Aktivierung erfolgt ber die spezifische Phosphorylierung eines Serinrests durch Phosphorylase-Kinase , Inaktivierung ber Phosphorylase-Phosphatase . Das Isoenzym der Phosphorylase in der Leber wird zustzlich durch Glucose beeinflusst: Bindung von Glucose fhrt zu einer Konformationsnderung, die den phosphorylierten Rest exponiert und so die Dephosphorylierung durch die Phosphatase stimuliert. => Die Glycogenphosphorylase der Leber funktioniert als Glucose-Sensor.

11. Gluconeogenese 5. Der Pentosephosphat-Weg Neben der Rolle als Energielieferant ist Glucose wichtig als Vorlufer fr die Synthese von Ribose (! DNA und RNA). Im Pentosephosphat- oder Phosphogluconat-Weg wird Glucose zu Ribose oxidiert: Glucose-6-phosphatdehydrogenase oxidiert die Pyranoseform von Glucose-6-phosphat zu einem $ -Lacton (intramolekularer Ester, 6-Ring).
Glucose-6-P

10

HC OH HC OH HO C H HC OH HC CH 2 OPO3 NADP + NADPH


2

Glucose-6-PDehydrogenase

C O HC OH 6-Phosphogluconolacton HO C H HC OH HC CH 2 OPO3
2

Lactonase hydrolysiert das Lacton zur 6-Phosphogluconsure.

H2 O

Lactonase

COO HC OH 6-Phosphogluconat HO C H HC OH HC OH CH 2 OPO3


2

6-Phosphogluconatdehydrogenase oxidiert ein zweites Mal und setzt einen Kohlenstoff als CO2 frei.

NADP + CO2 + NADPH

6-PhosphogluconatDehydrogenase CH 2 OH C O

Ribulose-5-P

HC OH HC OH CH 2 OPO3
2

Phosphopentoseisomerase isomerisiert das Keton Ribulose-5phosphat zu Ribose-5-phosphat.

PhosphopentoseIsomerase CHO HC OH Ribose-5-P HC OH HC OH CH 2 OPO3


2

Man beachte, dass die Elektronen in Form von NADPH gewonnen werden, wie sie fr Biosynthesen gebraucht werden. In seiner zyklischen Form ist der Pentosephosphatweg (neben dem Malatenzym; siehe Kapitel 10) der wichtigste Mechanismus, um NADPH zu generieren. Ribose-5-Phosphat wird dabei durch Transketolasen (TK), Transaldolasen (TA), Isomerasen (I) und einen Abschnitt der Glykolyse (G) wieder zu Glucose-6-phosphat rezykliert. Aus 6 Ribose-5-phosphat entstehen so wieder 5 Glucose-6-phosphat.
C5 Ribose-5-P I Xylulose-5-P C5 TK Glyceraldehyd-3-P C3 C7 Sedoheptulose-7-P TA Erythrose-4-P C4 TK Xylulose-5-P C5 C6 Fructose-6-P C6 Glucose-6-P I Fructose-6-P C6 G Glyceraldehyd-3-P C3

11. Gluconeogenese

11

12. SIGNALBERTRAGUNG

1. Allgemeines Zellen kommunizieren miteinander durch direkten Kontakt von Oberflchenmoleklen oder mit diffusiblen Moleklen ber kurze (z.B. Neurotransmitter bei Synapsen) oder lange Distanzen (z.B Hormone via Blutkreislauf). Der Effekt des Signals ist letztlich die Regulation spezifischer Enzym- oder Transportaktivitten und/oder die vernderte Expression bestimmter Gene im Rahmen der Entwicklung oder der Anpassung an die metabolische Situation.

Spezifitt: Signale wirken meist nur auf ganz bestimmte Zielzellen, die fr dieses Signal spezifische Rezeptoren besitzen. Amplifikation: Die Komponenten von Signalbertragungsketten sind oft Enzyme, die durch ihre Aktivitt das Signal vervielfltigt. So kann die Bindung einzelner Hormone an ihre Rezeptoren die Zelle dramatisch beeinflussen. Adaptation/Desensitization/Down-regulation: Bei starker oder anhaltender Stimulation eines Signalbertragungswegs wird die Stimulierbarkeit reduziert, z.B. durch Endozytose der Rezeptoren. Integration: Verschiedene Signalbertragungswege knnen sich gegenseitig beeinflussen und so verschiedene Signale integrieren und die Signalantwort der Situation anpassen.

Signalsubstanzen binden an Rezeptoren in den Zielzellen mit hoher Spezifitt und meist hoher Affinitt (KD ~10-9 M). In vielen Fllen ist der Rezeptor ein Oligomer, und Ligandbindung kooperativ: Allosterie! Die resultierende sigmoidale Bindungskurve fhrt dazu, dass kleine Konzentrationsnderungen der Signalsubstanz in einem bestimmten Regelbereich grosse nderungen der Signalweitergabe bewirken.

Hydrophile Signalmolekle knnen die Plasmamembran der Zielzelle nicht durchdringen und binden an die ussere Domne von integralen Rezeptorproteinen in der Plasmamembran. Je nach Rezeptor oder Zelltyp knnen Zellen zwischen 500 und 100,000 Rezeptorproteine an ihrer Oberflche haben. Durch eine Konformationsnderung wird das Signal (nicht das Molekl) ins Zytosol und meist ber eine Kaskade von Signalbertrgern weitergeleitet.

12. Signalbertragung Diese sind entweder second messengers (intrazellulre Botenstoffe) wie cAMP, IP3, Diacylglycerin, PIP3 und Ca2+ oder Proteine, die zwischen zwei Zustnden ("aktiv" und "nicht-aktiv") wechseln knnen: Enzyme, die second messengers produzieren, wenn sie aktiviert werden Protein-Kinasen und -Phosphatasen, die das nchste Protein in der Kaskade aktivieren oder inaktivieren G-Proteine (GTPasen), die im GTP-bindenden Zustand ein Zielprotein binden und dadurch aktivieren oder inaktivieren knnen Adaptoren = Proteine, die durch Bindung eines ersten Partnerproteins so verndert werden, dass sie ein zweites binden und dadurch aktivieren oder inaktivieren knnen. Transkriptionsfaktoren

Hydrophobe Signalmolekle (z.B. Steroidhormone, Thyroxin) knnen durch die Plasmamembran in das Innere der Zielzelle diffundieren und an cytosolische oder nuklere Rezeptoren binden. Der Komplex wirkt meist direkt als Transkriptionsfaktor.

Vier Grundtypen von Signalrezeptoren Steroidrezeptoren im Cytosol und Zellkern Regulierte Ionenkanle: Ligandbindung oder eine nderung des Membranpotentials ffnet den Ionenkanal. Tyrosinkinase-Rezeptoren: Eine cytosolische Domne des Rezeptors wird enzymatisch aktiv (z.B. als Proteinkinase). G-Protein-abhngige Rezeptoren: Rezeptoren mit 7 Transmebranhelices, die ein Trimeres G-Protein aktivieren, das seinerseits die Produktion eines second messengers induziert.

2. Steroidrezeptoren Steroide sind im Serum grsstenteils an Transportproteine gebunden. Wegen ihres hydrophoben Charakters knnen sie durch Membranen diffundieren und im Cytosol oder im Nucleus an lsliche Rezeptoren binden. Die Steroidrezeptoren bestehen aus drei Domnen: eine Hormonbindungsdomne eine DNA-Bindungsdomne fr spezifische Promotorsequenzen eine Effektordomne, die mit mit anderen zellspezifischen Transkriptionsfaktoren interagiert und so die Transkription des Ziel-Gens stimuliert.

12. Signalbertragung 3. Regulierte Ionenkanle: Der nicotinische Acetylcholin-Rezeptor als Beispiel

Tierische Zellen besitzen in der Plasmamembran einen ATP-getriebenen Na+/K+Antiporter, die Na+/K+-ATPase. Diese Pumpe ist elektrogen, weil im Gegenzug zum Export von 3 Na+ 2 K+ importiert werden, d.h. es entsteht ein Na+-Gradient [aussen] > [innen], ein K+-Gradient [innen] > [aussen] und ein Membranpotential (aussen + vs. innen ) von ca. 70 mV. Der elektrochemische Gradient (die Kombination von Konzentrationsgradient und elektrischer Spannung) lassen Na+ und Ca2+ hineinund K+ und Cl- hinausfliessen, wenn entsprechende Kanle geffnet werden.

Der nicotinische Acetylcholin-Rezeptor befindet sich in der postsynaptischen Membran gewisser Neuronen und von Muskelzellen. Der Rezeptor besteht aus 5 homologen Untereinheiten mit der Stchiometrie !2"#$. Jede Untereinheit bildet ein Bndel von 4 Transmembranhelices. Im Rezeptorkomplex sind die M2-Helices jeweils in die Mitte gerichtet und bilden einen Kanal. Die engste Stelle wird durch Leucinreste gebildet und ist zu eng fr Ionen. Bindung von Acetylcholin (oder Nicotin) an zwei Bindungstellen in den !-Untereinheiten fhrt zu einer Konformationsnderung, die eine Drehung der M2Helices bewirkt. Die grossen Leucinreste bewegen sich aus dem Kanal und werden durch kleinere Serin-Reste ersetzt: Der Kanal ffnet sich und wird durchgehend hydrophil. Na+, Ca+ und K+ knnen passieren.

Ein Signal der prsynaptischen Zelle, d.h. die Ausschttung von Acetylcholin aus Vesikeln in den synaptischen Spalt, fhrt durch Bindung des Acetylcholins an den Rezeptor zum massiven Einfluss von Na+ und Ca+ in die postsynaptische Zelle: Die Membran wird lokal depolarisiert. Dies wird noch verstrkt, weil spannungsabhngige Na+-Kanle geffnet werden (die Konformationsnderung zum ffnen und Schliessen dieser Kanle wird durch die nderung des Membranpotentials ausgelst). Bei einer gewissen Depolarisation werden spannungsabhngige K+-Kanle geffnet und durch den Ausfluss von K+ wird die

12. Signalbertragung Membran wieder repolarisiert. So wandert eine transiente Depolarisation der Membran entlang als sog. Aktionspotential. Erreicht das Aktionspotential in Neuronen eine Synapse, werden dort spannungsabhngige Ca2+-Kanle geffnet. Das einfliessende Ca2+ lst die Fusion von synaptischen Vesikeln mit der Plasmamembran aus, wodurch die Ausschttung von Neurotransmitter das Signal an die nchste Zelle weitergibt. Im Muskel wird das Aktionspotential ins sarkoplasmatische Retikulum (ein spezialisiertes ER) geleitet, wo ebenfalls Ca2+-Kanle geffnet werden, was die Muskelkontraktion auslst. Normalerweise wird Acetylcholin sehr schnell durch die Acetylcholinesterase gespalten. Wenn die Konzentration aber mehrere Millisekunden hoch bleibt (lngere Stimulation), geht der Rezeptor in eine dritte Konformation mit gebundenem Acetylcholin aber geschlossenem Kanal ber: Die Rezeptoren sind desensitized.

4. Rezeptorenzyme: Der Insulinrezeptor als Beispiel Das Peptidhormon Insulin wird von den Inselzellen des Pankreas bei hohem Blutzucker sekretiert und stimuliert die Aufnahme von Glucose aus dem Blut in die Leber (Glucokinase %), die Muskeln und die Fettzellen (Glucosetransporter %) Glycogensynthese (Glycogensynthase %) Glykolyse (PFK2 % & PFK1 %) und Produktion von Acetyl-CoA (Pyruvatdehydrogenase %) Fettsuresynthese (Acetyl-CoA-Carboxylase %) und hemmt den Glycogenabbau (Glycogenphosphorylase ')

12. Signalbertragung Der Insulinrezeptor besteht aus einer !- und einer "-Untereinheit, die ber eine Disulfidbrcke verknpft sind und ein (!")2 Homodimer bilden. Die !-Untereinheiten sind extracellulr und enthalten die Insulinbindungsstellen. Die "-Untereinheiten durchspannen die Membran mit einer !-Helix und besitzen im cytosolischen Teil eine Tyrosinkinase-Domne. Durch die Bindung von Insulin an den Rezeptor wird dieses Enzym aktiviert und und die "-Untereinheiten phosphorylieren sowohl sich selbst, als auch spezifische andere Proteine, insbesondere IRS-1 (Insulinrezeptorsubstrat-1). Phosphoryliertes IRS-1 wird an einem Phosphotyrosin durch Grb2 gebunden (genauer: durch eine sog. SH2-Domne [src homology domain-2] in Grb2). An diesen Komplex kann das Protein Sos binden, das dadurch aktiv wird als Guanin nucleotide exchange factor (GEF) fr das G-Protein Ras: Sos ermglicht es, das an Ras gebundene GDP durch GTP auszutauschen. Ras-GTP kann nun durch Bindung die Proteinkinase Raf-1 aktivieren, die erste von 3 Proteinkinasen, die eine Phosporylierungskaskade bilden: Raf-1 phosphoryliert und aktiviert MEK, phosphoryliertes MEK phosphoryliert und aktiviert MAPK (mitogen-activated protein kinase), phosphorylierte MAPK wandert in den Zellkern und phosphoryliert und aktiviert dort Transkriptionsfaktoren, die die Transkription spezifischer Gene beeinflussen. IRS-1 aktiviert nicht nur Grb2 sondern auch eine PI-3-Kinase (wieder ber eine SH2Domne). Die PI-3-Kinase phosphoryliert Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat (PIP2), an der 3-Position zu PI-3,4,5trisphosphat (PIP3). Proteinkinase B (PKB) bindet an PIP3 und wird in dieser Form zu einem Substrat fr Phosphorylierung durch eine andere Kinase (PDK1). In phosphoryliertem Zustand ist PKB aktiv und phosphoryliert Serinund Threoninreste der Glycogensynthasekinase 3 (GSK3). Nicht-phosphorylierte GSK3 inaktiviert die Glycogensynthase. Durch Phosphorylierung wird GSK3 inhibiert, womit die Glycogensynthese nicht weiter gehemmt und so stimuliert wird. ber einen zweiten bertragungsweg stimuliert PKB auch die Exocytose von Vesikeln, die ein Reservoir von Glucosetransportern enthalten. So wird die Aufnahmekapazitt fr Glucose erhht.

Insulinbindung an den Rezeptor induziert Endozytose und damit "Down-regulation" des Rezeptors. Hormon und Rezeptor dissoziieren in Endosomen und werden grsstenteils in Lysosomen degradiert.

12. Signalbertragung 5. G-Protein-abhngige Rezeptoren Der ! -adrenerge Rezeptor als Beispiel: cAMP als second messenger Adrenalin (englisch: epinephrine) wird im Nebennieren-Mark synthetisiert und in speziellen Sekretionsgranula (chromaffine Granula) gespeichert. In Alarmsituationen lsen Nervensignale die Fusion der Granulamembranen mit der Plasmamembran aus und der Granulainhalt wird ins Blut entlassen (Exozytose). Adrenalin bewirkt auf verschiedene Zelltypen unterschiedliche Antworten (im Herzmuskel erhhte Kontraktion und Schlagfrequenz, in der Leber erhhter Glycogenabbau), die Primrreaktion ist jedoch stets die Bildung von cAMP.

Bindung von Adrenalin induziert eine Konformationsnderung im Rezeptorprotein. Das vernderte Rezeptorprotein wirkt als Guanine-nucleotide exchange factor (GEF) fr ein trimeres GProtein (G!"#): In nicht-stimuliertem Zustand hat G! ein GDP gebunden. Bindungen von G!"# an das Rezeptorprotein bewirkt den Austausch von GDP fr GTP und die Dissoziation von G"# von G!-GTP. G!-GTP bindet an die Adenylatcyclase und aktiviert sie: cAMP wird aus ATP gebildet, solange G! gebunden ist. Fr sich allein ist G! eine sehr schwache GTPase. Durch die Bindung an die Adenylatcyclase wird die GTPase-Aktivitt erhht; d.h. die Adenylatcyclase wirkt als GTPase activating protein (GAP). Sobald das gebundene GTP zu GDP hydrolysiert ist, dissoziiert G!GDP und bildet wieder einen Komplex mit G"#. Je hher die GTPase-Aktivitt von G!, desto krzer dauert die Aktivierung der Adenylatcyclase, desto weniger cAMP wird produziert. (Die GTPase wirkt als "Timer".). Der erhhte cAMP-Spiegel aktiviert eine cAMP-abhngige Proteinkinase = Proteinkinase A (PKA), die spezifische Proteine an Serin- oder Threoninresten phosphoryliert und dadurch aktiviert oder inaktiviert. cAMP bewirkt eine Dissoziation einer regulatorischen Untereinheit (R) von der katalytischen Untereinheit (C) und damit eine Aktivierung der Kinase:

12. Signalbertragung In der Leber wird Phosphorylase-Kinase durch PKA phosphoryliert und dadurch aktiviert. Glykogen-Phosphorylase b wird durch Phosphorylase-Kinase phosphoryliert und dadurch zu Phosphorylase a aktiviert. Glykogen wird durch Phosphorylase a phosphorolytisch gespalten. PKA phosphoryliert auch die Glycogensynthase, die dadurch inaktiviert wird.

12. Signalbertragung Der Vasopressinrezeptor als Beispiel: Diacylglycerin, IP3 und Ca2+ als second messengers Vasopressin ist ein Nonapeptidhormon, das durch die Neurohypophyse zur Regulation des Wasserhaushaltes ausgeschttet wird. In den Nierenzellen induziert es die Mobilisation von Wasserkanlen zur Rckresorption des Wassers aus dem Primrharn.

Der Vasopressinrezeptor ist ebenfalls ein 7Transmembranprotein und aktiviert auf der cytosolischen Seite ein trimeres G-Protein. Dieses aktiviert eine Phospholipase C, die Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat zu Ino und Diacylglycerin sitoltrisphosphat (IP3) hydrolysiert. Diacylglycerin stimuliert direkt Proteinkinase C (PKC) an der Plasmamembran. IP3 ist lslich und aktiviert Ca2+-Kanle in der ER-Membran was zu einer Erhhung der cytosolischen Ca2+-Konzentration von normalerweise ~0.1 M vorbergehend auf etwa 1-2 M fhrt. Dies stimuliert ebenfalls PKC. PKC phosphoryliert nun andere Zellproteine an Serin- oder Threonin-Seitenketten, die dadurch aktiviert oder gehemmt werden.

OH OH OH Phosphatidylinositol (PI) HO OH O

O P O O CH2 HC O H2 C O O O

PI-Kinasen
O O P O HO OH OH O O O P O O O O P O O CH2 HC O H2 C O O O

Phosphatidyl-inositol4,5-bisphosphat (PIP2)

PI-spezifische
OH OH O O

Phospholipase

O O P O O H

O P O O HO C H2 HC O H2C O O O

Inositoltrisphosphat O (IP 3) O P O
O

Diacylglycerin

12. Signalbertragung

Ca2+ beeinflusst Enzyme oft ber das Ca2+bindende Protein Calmodulin, das 4 Ca2+-bindende seine Stellen enthlt, bei Ca2+-Bindung Konformation ndert und permanent oder temporr an das durch Ca2+ regulierte Enzym gebunden ist. Calmodulin agiert als Ca2+-Sensor und reguliert so eine Reihe von Enzymen.

12. Signalbertragung 6. Onkogene Tumore und Krebs sind das Resultat unkontrollierter Zellteilung. Normalerweise wird das Zellwachstum durch das Wechselspiel verschiedener biologischer Signale reguliert, die durch Mutationen in Signalbertragungsproteinen aus dem Gleichgewicht geraten knnen. Die mutierten Gene werden als Tumorgene oder Onkogene bezeichnet, das entsprechende normale Gen als Proto-Onkogen.

10

Beispiele: EGF (epidermal growth factor) ist ein wichtiger Wachstumsfaktor. Der EGF-Rezeptor ist ein Transmembranprotein mit einer cytosolischen Tyrosinkinasedomne hnlich dem Insulinrezeptor. Das Onkogen ErbB codiert fr eine verkrzte Form des EGF-Rezeptors, dem ein grosser Teil der Ligandbindungsdomne fehlt. Weil die Tyrosinkinase jetzt hormonunabhngig (= konstitutiv) aktiv ist, wird Zellwachstum und Zellteilung permanent stimuliert. Ras ist ein monomeres G-Protein, das im Insulin-Signalweg, aber auch im Signalweg von Wachstumshormonen eine Rolle spielt. Aus Tumorzellen wurden verschiedene Ras-Onkogene isoliert, die ein Protein mit defekter GTPase-Aktivitt codieren. Die Ras-Onkoproteine bleiben deshalb konstitutiv in der GTPgebundenen, aktiven Form und stimulieren den Signalweg hormonunabhngig. Die ersten Onkogene wurden aus tumorinduzierenden Viren isoliert. Viren knnen kleine Abschnitte des Wirtsgenoms in ihr eigenes Genom integrieren. Retroviren (RNA-Viren, die ihr Genom zur Replikation in DNA "umkopieren") haben eine relativ hohe Mutationsrate wegen der Reverse-Transcriptase-Reaktion. Proto-Onkogene haben als Teil eines Virus deshalb eine relativ grosse Wahrscheinlichkeit Onkogene zu werden. Die Viren profitieren von der erhhten metabolischen Aktivitt in transformierten Zellen.