Potencial inhibitorio de trimipramina y sus principales metabolitos en monoaminas humanas y transportadores de cationes orgnicos.

Abstract
El antidepresivo trimipramina muestra un atpico perfil farmacolgico y su mecanismo de accin es aun oscuro. El presente estudio investig si la trimipramina y sus tres metabolitos interactan con blancos de otros antidepresivos, los transportadores humanos de monoaminas para noradrenalina, serotonina y dopamina y con los transportadores de cationes humanos (hOCT1, hOCT2 y hOCT3) los cuales son expresados en el cerebro y son conocidos por estar involucrados en la receptacin de monoaminas. Las clulas HEK293 heterlogas expresando los transportadores mencionados fueron utilizadas para determinar la inhibicin de [3H]Methyl Phenyl pyridinium catin para la recaptacin de trimipramina y sus principales metabolitos. En las concentraciones hasta de 30M, todos los transportadores, excepto hOCT3, fueron inhibidas por todas las sustancias examinadas. Con un Intervalo de Confianza (IC50) valores entre 2 y 10M, la trimipramina inhibi los transportadores de serotonina, noradrenalina, cationes orgnicos 1 y 2, mientras que claramente las concentraciones ms altas fueron necesarias para una inhibicin media mxima del transportador de dopamina. Desmetiltrimipramina demostr sobre las mismas potencias como trimipramina, mientras que 2-hidroxi-trimipramina era menos potente en los transportadores de noradrenalina, serotonina y de cationes orgnicos 1. xido-N-trimipramina inhibi preferencialmente el transportador de serotonina. La trimipramina ni sus metabolitos son altamente inhibidores de los transportadores de monoaminas examinados. Sin embargo, puesto que en un estado estacionario la suma de las concentraciones de los compuestos primarios y sus metabolitos activos son casi dos veces ms alto que la concentracin plasmtica de trimipramina y es conocido que la acumulacin en el cerebro (hasta diez veces), hasta la parcial inhibicin por trimipramina y sus metabolitos de los transportadores de serotonina y noradrenalina (pero no de los transportadores orgnicos de cationes 3) puede contribuir hacia la accin antidepresiva de la trimipramina.

Objetivo del artculo

El presente estudio investig si la trimipramina y sus tres metabolitos interactan con blancos de otros antidepresivos, los transportadores humanos de monoaminas para noradrenalina, serotonina y dopamina y con los transportadores de cationes humanos (hOCT1, hOCT2 y hOCT3) los cuales son expresados en el cerebro y son conocidos por estar involucrados en la receptacin de monoaminas.

Material y mtodos.
Cultivo celular y transfeccin Las clulas fueron creciendo como monocapas en 175cm 2 de frascos de cultivo tisular modificado en Dulbecco modificado en un medio de guila (DMEM) /F12 de jamn suplementado con 10% de suero fetal de ternera (FCS), conteniendo penicilina G (100U/ml) y estreptomicina (100ug/ml) en una atmsfera modificada con 5% de CO2 a 37C. Para las clulas de transfeccin transitoria fueron subcultivadas en 24 placas en DMEM/ F12 de jamn ms 10% dializado de FCS hasta obtener una densidad celular de 40 - 60% al da siguiente. Transfeccin con la cadena de DNA de transportadores de noradrenalina, dopamina, serotonina, cationes orgnicos 1, 2 3 (todos subclonados dentro la expresin del vector pcDNA 3) fue realizada por lipofeccin usando el reactivo de transfeccin TransIT-293 como se describe anteriormente. Para cada 0.4 g de cadena de DNA fue utilizada. Experimentos de receptacin fueron realizados 48 hrs despus de la transfeccin. Las medidas de recaptacin del catin metil-fenil-pyridinium fueron escencialmente como se describe anteriormente. En resumen, el medio de cultivo fue aspirado de las 24 placas 48 hrs. despus de la transfeccin y las clulas fueron lavadas 2 veces con el buffer Krebs-Ringer HEPES (KRH) buffer (125mM NaCl, 4,8mM KCl, 1.2 mM KH2PO4, 1.2 mM CaCl2, 1.2 mM MgSO4, 5.6 mM dglucosa y 25 mM HEPES, pH 7.4). Las clulas fueron pre-incubadas por 15 min con el buffer KRH. La solucin pre-incubadora fue entonces aspirada y la recaptacin del catin metil-fenil-pyridinium fue iniciada por la adicin de 15nM catin metil-fenil-pyridinium conteniendo buffer KRH incluyendo la prueba de substancia en la presencia o ausencia de decynium-22 (D-22; para transportador de catin orgnico 1, 2 o 3) o cocana (para transportador de noradrenalina, serotonina y dopamina). Despus de la incubacin de las clulas por 10 min. a 37C, la recaptacin fue terminada por el retiro del buffer de incubacin y el rpido lavado de las clulas tres veces con el buffer KRH congelado. Las clulas de cada una fue solubilizado con 500 ul Triton X-100 (0.1% en 10mM Tris, pH 7.5). Para el lisato, 300ul fueron mezclados con 5 ml de un coctl de centelleo Lumagel seguro y la radioactividad fue cuantificada usando un LS 5000 TD contador de centelleo lquido. Una alcuota de 100 ul de lisato fue usada para la protena de determinacin de acuerdo al mtodo de Lowry. La recaptacin no especfica del catin metil-fenil-pyridinium en la presencia de 30 nM D-22 (para transportadores de cationes orgnicos) o 50 uM de cocaina (para transportadores de monoaminas humanas) fue sustrada de la recaptacin total.

Medicamentos Los medicamentos usados en este estudio fueron la trimipramina, Desmetil trimipramina, 2-hidroxi-trimipramina y xido de N-trimipramina. El catin metil-fenilpyridinium yodado fue obtenido de Biotrend. Clculos y estadsticas Una regresin analtica no lineal fue usada para el clculo de los valores con un Intervalo de Confianza 50. El valor de la recaptacin del metil-fenil-pyridinium de los tres transportadores de monoaminas y de los cationes orgnicos en el rango micromolar y siendo concentraciones no saturadas de catin metil-fenil-pyridinium fueron usados.

Resultados
En las primeras series de experimentos, se puedo mostrar que la recaptacin del catin metil-fenil-pyridinium en las clulas HEK293 expresan cada transportador de monoaminas o transportadores de cationes orgnicos incrementan linealmente con el tiempo arriba de 10 min; unos 10 minutos de recaptacin fueron usados en los siguientes experimentos de la determinacin de los valores con un intervalo de confianza 50. Las potencias inhibitorias (aparentemente afinidades) de trimipramina y tres de sus principales metabolitos (Desmetil-trimipramina, 2-hidroxi-trimipramina y xido N-trimipramina) en los transportadores de monoaminas y los transportadores de cationes orgnicos fueron examinados determinando sus valores con un intervalo de confianza 50 por la inhibicin de mediadores de los transportadores de monoaminas para la recaptacin del catin metil-fenil-pyridinium. Todos los transportadores examinados fueron inhibidos por el incremento de concentraciones de las sustancias probadas con la excepcin del transportador de cationes orgnicos 3 (hOCT3) el cual no mostr ninguna inhibicin hasta una concentracin de 30uM por ninguna de las sustancias. Trimipramina mostr la ms alta potencia en los transportadores de serotonina, cationes orgnicos y noradrenalina con valores de intervalos de confianza 50. En los transportadores de cationes orgnicos 2 (hOCT2) su potencia inhibitoria fue igual muy alta, mientras que en los transportadores de dopamina la trimipramina fue solo un dbil inhibidor. La Desmetil-trimipramina exhibi valores similares en los transportadores de noradrenalina, cationes orgnicos 1 (hOCT1) y serotonina, donde su metabolito mostr menos efectos inhibitorios en el transportador de dopamina y cationes orgnicos 2 (hOCT2).

El metabolito de la trimipramina, 2-hidroxi-trimipramina inhibi los transportadores de noradrenalina, cationes orgnicos 1 y 2 (hOCT1, hOCT2) con casi la misma potencia. Una relativamente potencia baja inhibitoria de la 2-hidroxi-trimipramina fue encontrada en el transportador de dopamina y serotonina. El metabolito xido N-trimipramina mostr relativamente una potencia inhibitoria alta en los transportadores de serotonina mientras que efectos moderados fueron detectados en transportadores de cationes orgnicos 1 y 2 (hOCT1 hOCT2), dopamina y noradrenalina. En resumen, la trimipramina y los metabolitos examinados mostraron una alta potencia inhibitoria en los transportadores de noradrenalina, serotonina y cationes orgnicos 1, una potencia moderada en transportadores de dopamina y cationes orgnicos 2 y en concentraciones de hasta 30uM ninguna inhibicin de transportadores de cationes orgnicos 3.

Conclusiones
La trimipramina es un antidepresivo tricclico con sedante, ansioltico y efectos dbiles anti-psicticos. Su principal modo de accin como un antidepresivo no es claro y difiere de otros antidepresivos tricclicos. Debido a que la trimipramina es extensamente metabolizada, esto es justificable para preguntar en el presente estudio si los metabolitos de la trimipramina pueden ser inhibidores de los transportadores de la recaptacin neuronal para noradrenalina, serotonina o dopamina. Adems, se examin si la trimipramina y/o sus metabolitos pueden inhibir otras monoaminas transportando portadores expresados en el cerebro como transportadores orgnicos humanos para los cuales se ha demostrado la inhibicin del hOCT3 ha sido mostrado para exhibir efectos antidepresivos. La inhibicin por trimipramina de los transportadores de serotonina, noradrenalina y dopamina por valores con intervalos de confianza 50. As, la trimipramina es un inhibidor ms potente de los transportadores de serotonina y noradrenalina. Los valores de los transportadores de noradrenalina y serotonina son similares a los encontrados en los sinaptosomas de los cerebros de rata. Sin embargo, en estudios previos de enlaces con radio-ligandos, reportaron valores con un IC50 para trimipramina en los trasportadores de serotonina los cuales fueron por factor 15 y 55 ms bajos que los del experimento. La inhibicin por trimipramina de unin de radio ligando al transportador de dopamina fue claramente ms bajo que en nuestro estudio. Estas discrepancias pueden por lo menos, se debe al hecho de que haban sido medidos interacciones con los enlaces del radio ligando en membranas aisladas. en el presente estudio, la

trimipramina mostr el siguiente orden de potencia inhibitoria en los transportadores de: serotonina > cationes orgnicos 1 > noradrenalina > cationes orgnicos 2 > dopamina > cationes orgnicos 3. Por lo tanto, transportadores de serotonina y noradrenalina que son conocidos objetivos primarios de los antidepresivos son potentemente inhibidos, mientras que el hOCT3 fueron solo marginalmente inhibidos por la trimipramina hasta concentraciones de 30uM. Comparado con la trimipramina, la Desmetil-trimipramina mostr potencias inhibitorias similares en los transportadores examinados con inhibicin preferencial de los transportadores de noradrenalina, serotonina y cationes orgnicos 1, mientras que la 2-hidroxi-trimipramina fue menos potente en los transportadores de noradrenalina y cationes orgnicos 1. Sin inhibicin por la 2-hidroxitrimipramina de los transportadores de serotonina fue medida en una concentracin arriba de 30uM aunque la trimipramina y sus otros metabolitos mostraron inhibicin moderada del transportador de serotonina. Presentemente, nosotros no tenemos explicacin para ste resultado. El xido N-trimipramina mostr una inhibicin preferencial del transportador de serotonina. La potencia inhibitoria de la trimipramina de los transportadores de noradrenalina y serotonina por Desmetil-trimipramina y de los de serotonina por el xido N-trimipramina pudo eventualmente contribuir para el efecto antidepresivo de la trimipramina. Un rol potencial de los transportadores de cationes orgnicos en los efectos antidepresivos de la trimipramina parece poco probable, debido a que ni la trimipramina o sus metabolitos son capaces de inhibir el OCT3. Entre los OCTs, el OCT3 es el que se expresa ampliamente en el cerebro. El OCT2 que tambin se expresa en el cerebro es inhibido en una media mxima a concentraciones por debajo de 10uM solamente por la trimipramina pero menos potente por sus metabolitos. Si el OCT2 puede jugar un (mnimo) papel en la accin antidepresiva de la trimipramina an debe ser mostrada. Debido a que el OCT1 es escasamente expresado en el cerebro, su media mxima inhibitoria por concentraciones bajas micromolares de trimipramina y Desmetil-trimipramina probablemente no juega un papel en los efectos antidepresivos de la trimipramina. Concierne el involucramiento de los transportadores neuronales de noradrenalina, dopamina y serotonina en la accin principal de la trimipramina y/o sus metabolitos, que nosotros pudimos excluir el transportador de dopamina desde un IC50 para la trimipramina y sus metabolitos que estaban por encima de 30uM. Mientras Desmetil-trimipramina era un poco ms potente inhibidor del transportador de noradrenalina que del transportador de serotonina (como el xido N-trimipramina). Esto indica que el transportador de serotonina podra constituir un

blanco para los efectos antidepresivos de la trimipramina. Esto puede (en menor grado) tambin puede ser cierto para el transportador de noradrenalina, puesto que fue inhibido la media mxima a concentraciones por debajo de 10uM por la trimipramina y su principal metabolito Desmetil-trimipramina. La inhibicin de los transportadores de serotonina y noradrenalina, objetivos cuales fueron inhibidos por la trimipramina y su metabolito desmetilado con valores con IC50 por debajo de 10uM, puede jugar un rol en los efectos antidepresivos de la trimipramina depende de las concentraciones de esas sustancias pueden alcanzar en el cerebro dosis clnicos relevantes. En la periferia, las concentraciones plasmticas de la trimipramina deben estar entre 0.5 y 1.2uM. Adems, las concentraciones plasmticas de la Desmetil-trimipramina representan cerca del 50% de los principales compuestos bajo condiciones estacionarias. Por lo tanto, la suma de las concentraciones plasmticas de los compuestos activos, es decir de los principales compuestos es casi dos veces mayor que el de la trimipramina sola. Ya que se sabe que otros antidepresivos tricclicos y sus metabolitos desmetilados farmacolgicamente activos penetran la barrera hemato-encefalica y se acumula en el cerebro hasta 10 veces, hasta una parcial inhibicin por trimipramina y Desmetil-trimipramina de los transportadores de serotonina y en menor grado tambin de los transportadores de noradrenalina puede ser esperado para contribuir en parte a la accin antidepresiva de la trimipramina. Tomados juntos, se mostr que la trimipramina es un inhibidor de los transportadores de noradrenalina y serotonina, confirmando previos resultados en los transportadores de las ratas. El estudio por primera vez demuestra que esto tambin se sostiene para los metabolitos de la trimipramina; tambin se muestra (por primera vez) que el transportador de dopamina como los transportadores de cationes orgnicos son solo moderadamente inhibidos por la trimipramina y sus metabolitos. As, la moderada inhibicin de los transportadores de serotonina y noradrenalina por la trimipramina y sus metabolitos son actualmente solo conocidos las acciones las cuales pueden explicar o al menor pueden contribuir a los efectos antidepresivos de la trimipramina.

Ficha hemerogrfica
Haenisch B., Hiemke C., Bnisch H. (2011). Inhibitory potencies of trimipramine and its main metabolites at human monoamine and organic cation transporters Psychopharmacology. 217 (2), 289-295 pp.