INSTITUTO TECNOLOGICO DE MORELIA Jos Mara Morelos y Pavn Asignatura: MICROBIOLOGIA Alumno(a): Zaira Mora Mora TAREA 3: TRATAMIENTO

DE MUESTRAS PARA OBSERVACION EN MICROSCOPIA ELECTRONICA: MET y MEB.

Las clulas son las unidades bsicas de los seres vivos. La mayora de ellas son de pequeo tamao por lo que es indispensable el uso de instrumentos como los microscopios para su visualizacin. Los microscopios aumentan el poder resolutivo del ojo humano. La resolucin se refiere a la habilidad del microscopio de poder distinguir dos objetos (puntos) muy juntos (x distancia) como entidades separadas en lugar de un solo objeto. Entre ms pequea es la distancia (entre los dos objetos) que el microscopio puede distinguir, mejor es su resolucin. Por lo general el poder resolutivo del ojo humano es de 0.2 mm (20 0 m), o sea la menor distancia vista o resuelta por el ojo humano es de dos lneas separadas 0.5 mm de distancia; si hay dos lneas a 200 m de distancia, veremos una sola lnea. Existen dos tipos bsicos de microscopios: PTICOS y ELECTRNICOS. Preparacin de muestras biolgicas para microscopia electrnica. En general, la preparacin de estas muestras siempre sigue el mismo protocolo bsico: fijacin qumica, lavado, deshidratacin en series de concentraciones crecientes de alcohol o acetona, inclusin en resina y polimerizacin. Segn el objetivo perseguido, en alguno de estos pasos se incluye una etapa de tincin con metales pesados, tales como el osmio, el wolframio o el uranio.
MICROSCOPIO ELECTRONICO DE TRANSMICION (MET)

Las propiedades distintivas del MET limitan la naturaleza de las muestras que pueden observarse, y los mtodos para su preparacin. Como los electrones se absorben y dispersan con bastante facilidad por la materia slida solamente se pueden observar cortes extremadamente finos de muestras microbianas.

La muestra debe tener un grosor de 20 a 100 nm, un dimetro de alrededor 1/50 a 1/10 del de una bacteria tpica, y al mismo tiempo debe ser capaz de mantener su estructura cuando se bombardee con los electrones en alto vaco. Un corte tan fino no puede realizarse salvo que la muestra tenga algn tipo de soporte como el que ofrece un plstico. Despus de fijar la muestra con sustancias qumicas como glutaraldehIdo o tetrxido de osmio para estabilizar la estructura celular, se deshidrata con disolventes orgnicos (p. ej. acetona o etanol). Es fundamental conseguir una deshidratacin completa porque la mayora de los plsticos empleados en Ia inclusin no son hidrosolubles. A continuaci6n se incluye la muestra en un plstico epoxi lquido no polimerizado, hasta que queda totalmente impregnado y el plstico se endurece para formar un bloque slido. Los cortes se realizan de este bloque con una cuchilla de diamante o vidrio, utilizando un instrumento especial denominado ultra micrtomo.

Al igual que en microscopa ptica, tambin en el caso de utilizar MET la muestra debe ser teida para verla con claridad. Por tanto, hay que tener en cuenta la capacidad de dispersar los electrones por parte de la muestra y sta viene determinada por la densidad (nmero atmico) de los tomos de la muestra. Las molculas biolgicas estn compuestas de tomos de nmero atmico bajo (H, C. N y O) y la dispersin electrnica es bastante constante a lo largo de la clula no teida. Por ello las muestras se preparan para su observacin sumergiendo los cortes finos en soluciones de sales de metales pesados como citrato de plomo y acetato de uranilo.

Los iones de plomo y uranio se unen a las estructuras celulares y las hacen ms electrodensas (opacas), aumentado el contraste. Los tomos de osmio pesado del fijador tetrxido de osmio, tambin se utilizan para <teir> las clulas y aumentar su contraste. Finalmente, los cortes teidos se montan sobre rejillas finas de cobre y se observan.

Aunque el mtodo anterior de inclusin en plsticos y realizacin de cortes finos se emplea normalmente para revelar la estructura interna de las clulas, hay otros medios para preparar microorganismos y objetos pequeos para su observacin.

Una tcnica muy eficaz es la tincin negativa. Se extiende la muestra formando una pelcula fina con cido fosfotngstico o acetato de uranilo. De modo anlogo a la tincin negativa para microscopa ptica, los metales pesados no penetran la muestra, sino que crean un fondo oscuro, mientras que la muestra aparece brillante en las fotografas. La tincin negativa es una forma excelente de estudiar la estructura de virus, vesculas de gas bacterianas, y otros materiales similares. Un microorganismo se puede observar tambin despus de sombrearlo con metal. Se cubre con una pelcula fina de platino u otro metal pesado por evaporacin en un ngulo de 45 respecto de la horizontal, de manera que el metal incide sobre el microorganismo slo desde un lado. El rea cubierta con metal dispersa electrones y aparece brillante en las fotografas, mientras que el lado sin cubrir y la regin sombreada creada por el objeto aparece oscura. La muestra aparece como si la luz brillase sobre sta proyectando una sombra. Esta tcnica es particularmente eficaz para estudiar la morfologa de virus, flagelos bacterianos y plsmidos.

MICROSCOPIO ELECTRNICO DE BARRIDO (MEB)

Los microscopios descritos anteriormente crean una imagen a partir de la radiacin que ha pasado a travs de la muestra. Recientemente, se ha empleado el microscopio electrnico de barrido (MEB) para estudiar superficies de microorganismos con mayor detalle; normalmente, tienen una resolucin de 7 nm o inferior. El MEB se diferencia de otros microscopios electrnicos en que produce una imagen a partir de electrones emitidos por la superficie de un objeto. En lugar de a partir de electrones transmitidos. La preparacin de muestras es sencilla y en algunos casos se puede examinar directamente material secado al aire. Sin embargo, con mayor frecuencia, los microorganismos deben primero fijarse, deshidratarse y secarse para conservar la estructura de superficie y evitar el colapso de las clulas cuando se expongan a alto vaco en e l MEB. Antes de la observacin, se montan las muestras secas y se cubren con una capa fina de metal para evitar la formacin de carga elctrica superficial, formndose una imagen de mayor calidad.

El MEB realiza un escner con un estrecho haz de electrones en forma de prisma, de adelante hacia atrs sobre la muestra. Cuando el haz incide sobre una zona concreta de la muestra, los tomos de la superficie emiten una nube tenue de electrones

denominados electrones secundarios, que son atrapados por un detector especial. Los electrones secundarios que entran en el detector inciden sobre un centellador, causando la emisin por ste de centelleos de luz que un fotomultiplicador transforma en una corriente elctrica y la amplifica. La seal se enva a un tubo de rayos catdicos y se produce una imagen como en la pantalla de televisin, que puede verse y fotografiarse.

El nmero de electrones secundarios que alcanzan el detector depende de la naturaleza de la superficie de la muestra. Cuando el haz de electrones incide sobre un rea elevada, entra en el detector un nmero grande de electrones; por el contrario, pocos electrones podrn escapar de una depresin o valle llegando al detector. En consecuencia, las reas elevadas aparecen ms claras en la pantalla y las depresiones, ms oscuras. Se produce una imagen tridimensional realista de la superficie de un microorganismo con una gran profundidad de campo. Tambin se puede examinar la localizacin real de los microorganismos in situ, en nichos ecolgicos, como la piel humana y la pared intestinal.

PRESCOTT, John. HARLEY. (2002)Microbiologa. McGraw-Hill. 4 Edicin.

http://laboratorios.tap-ecosur.edu.mx/LMEB/APUNTES%20MEB%20CURSO%202010.pdf