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PG.1
Tendencia actual:
Calidad ovocitaria
Receptividad endometrial
Calidad seminal ?
Calidad embrionaria
PG.2
Swim-up
(1984)
Gradiente densidad
(1986 )
PG.3
Factor masculino
TRA: ICSI
Seleccin fisiolgica
PG.4
Citometra de flujo
Tcnica de anlisis celular, basada en la deteccin de luz tras pasar las clulas por un haz de luz
Analizador
PG.5
+ Separador (sorter)
PG.6
PG.7
PG.8
PG.9
PG.10
PG.11
Morfologa celular
Forward scatter Side scatter
Tamao celular
PG.12
Compuestos fluorescentes
LASER
PG.14
Parmetros seminales
- A multicenter study evaluating the flow cytometric-based kit for semen analysis. Shai S et al, 2005
Anlisis de: - Concentracin (partculas) - Movilidad (rodamina) - Vitalidad DCFDA) - Leucos (anti CD45) - Anticuerpos (anti IgA)
- A new multiparameter flow cytometric method for human semen analysis. Perticarari S et al, 2007
PG.15
PROBLEMAS: El estudio por luminiscencia no elimina factor leucocitario PG.16 de tratamientos con antioxidantes: seminograma y fragmentacin Anlisis
N = 58
r 0,574
- DHE
L in e a
- H2-DCFDA (Martinez MJ et al
7 5,0 0
5 0,0 0
2 5,0 0
0 ,00
0 ,00
1 0,0 0
2 0,0 0
3 0,0 0
4 0,0 0
Movilidad
r 0,352
DHE
A A A A AA A A A A A A A A A A A
80, 00
rr 0,286 0,496
L i ne a
60, 00
DHE
40, 00
20,00
20, 00
0,00
0,0 0
0,00
50,00
100,00
150,00
0,0 0 21, 25 42, 50 63, 75 85, 00
Concentracin
PG.17
Movilidad
R 0,458
L i ne a
R-S qua re = 0 ,1 4
R 0,526
C M -H 2D C FD A
60,00
50,00
dhe
40,00
25,00
20,00
0,00
0,00
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
Fra gmentacin
Fra gmentacin
La eficacia de los tratamientos con antioxidantes pueden monitorizarse tambin de manera directa con estudio de estrs oxidativo intracelular
PG.18
Otros compuestos:
JC-1: 5,5,6,6-tetrachloro-1,1, 3,3-tetraethylbenzimidazol carbocyanine iodide (Espinoza JA et al, 2008)
PG.19
L i ne a r Re gre ssi o n
R-S qua re = 0 ,3 4
R 0,852
L i ne
60,00
99,17
D ioc6
D IO C6
79,33
40,00
59,50
39,67
20,00
19,83
0,00
0,00
0,00
15,00
30,00
45,00
0,00
23,75
47,50
71,25
95,00
Fragmentacin
Movilidad
El estudio del potencial de membrana mitocondrial est muy relacionado con la movilidad espermtica: astenozoospermias !!
PG.20
Diferentes tcnicas
SCD (Fernndez et al, 2002) COMET (Morris et al, 2002) TUNEL (Sailer et al, 1995)
Diferente origen
Intrnseco (apoptosis, ROS, ) Extrnseco (frmacos, iatrognico,)
TUNEL y citometra flujo - T realizacin y anlisis: 1hora - Resultado sobre 20.000 cls
PG.21
Movilidad (%)
(r = -0,385)
Morfologa (%)
PG.23
80 70 60 50 40 30 20 10 0 <20% >20%
*
ICSI FIV
FERTILIZATION RATE ICSI <20 ICSI >20 FIV <20 FIV >20 Total
N 33 13 33 13 92
* = p < 0,05
Utilidad clnica - Nos permite escoger mejor el tratamiento - Cambio de mtodo de seleccin espermtica (MACS)
PG.24
Ha funcionado el MACS?
Marcaje Anexina-V FITC: 15 min
Muestra fresco 47 % Tras capacitacin 26 % MACS 3 %
PG.25
Anexina V y MACS
Es segura la tcnica MACS?
A
x=51,4
N = 30
x=75 x=45,1 x=67*
B
x=53,8
x=25,1 x=19
x=23,9
x=13,6*
Progresivos
x=29,1*
x=33,8*
AnexinaV
x=0,6
Fresco t0
Fresco t24
x=82,9
Rem t0
Rem t24
Fresco t0
Fresco t24
x=26
Rem t0
Rem t24
C
x=27,2
D Fragmentacin
x=28,4
x=34,9*
ERO
x=13
x=17,8
x=14,7*
x=23,8*
PG.26
Rem t0
Rem t24
Fresco t0
Fresco t24
Rem t0
Rem t24
Anexina V y MACS
Indicacin MACS: Muestras con fragmentacin elevada
MACS (n = 51 ) CT (n = 31 )
35,7 35,4
25,1 26,8
2,1 2,2
58 36,5
18 39
MACS (n = 45 )
CT (n = 37 )
PG.27
39,2
39,5
23,9
24,7
1,8
1,9
68,6
41,5
14
26
Sperm flow cytometric parameters are associated with ICSI outcome. Lazaros L et al. RBM online, 2013
PG.28
Otras aplicaciones
Peroxidacin lipdica (reactivo: BODIPY C11)
Analysis of lipid peroxidation in human spermatozoa using BODIPY C11. Aitken RJ et al. Mol Hum Reprod 2007.
PG.30
Conclusin
Fragmentacin ADN Apoptosis temprana Potencial membrana
ROS intracelular
Reaccin acrosmica
Prot unin zona pelcida
La citometra de flujo permite el estudio del nmero, morfologa, fenotipo y funcin celular.
Es mucho ms exacta que las tcnicas de estudio seminales actuales, y permite el anlisis de 20.000 -30.000 clulas en pocos minutos. Se pueden estudiar mltiples carctersticas funcionales contaminacin de otros tipos celulares), de manera simultanea. (sin
La mayor parte de las tcnicas requieren un bajo tiempo de realizacin por lo que pueden realizarse antes de la TRA.
PG.32
CONTACTO:
alberto.pacheco@ivi.es
PG.33