Programa Educativo: Qumico Farmacutico Bilogo Manual de Prcticas de Banco de Sangre.

Compiladores: M. en C. Baldemar Ak Canch y M. en C. Patricia Margarita Garma Qun.

UNIVERSIDAD AUTNOMA DE CAMPECHE

FACULTAD DE CIENCIAS QUMICO BIOLGICAS
PROGRAMA EDUCATIVO: QUMICO FARMACUTICO BILOGO

MANUAL DE PRCTICAS DE BANCO DE SANGRE

UNIDAD DE APRENDIZAJE: Banco de Sangre PERIODO ESCOLAR: agosto/enero COMPILADORES Y ACTUALIZADORES: M. en C. Baldemar Ak Canch y M. en C. Patricia Margarita Garma Qun. COMPILADOR ORIGINAL: M. en C. Baldemar Ak Canch y M. en C. Patricia Margarita Garma Qun. REVISIN: 01/2013. CAMPECHE, CAMP. JULIO 2013

DIRECTORIO

Lic. Adriana Ortz Lanz Rectora Lic. Gerardo Montero Prez Secretaria General Mtra. Mara Guadalupe Maldonado Velzquez Directora de la Facultad de Ciencias Qumico Biolgicas QFB Araceli Salinas Balderrabano Coordinador de la Licenciatura en Qumico Farmacutico Bilogo. M en C. Patricia Margarita Garma Quen Presidente de la Academia de Qumico Farmacutico Bilogo.

INTRODUCCON
El Banco de Sangre ha alcanzado una relevante posicin en la medicina moderna, especialmente por el aporte que ha significado la transfusin de sangre para el desarrollo de la ciruga y el uso teraputico de sus componentes en el tratamiento de las enfermedades que afectan el rea hematolgica. Todo ello ha conducido a su rpido desarrollo, a la tecnificacin de su personal, y ha permitido que no sea ms el simple servicio de transfusin con que fue concebido originalmente. Por lo anterior, se recomienda que el personal que trabaja en el rea de inmunohematologa, deba disponer de una metodologa uniforme y actualizada que facilite la pronta resolucin de los problemas que se presentan. Funcin de la sangre. La sangre es un tejido muy particular, que posee numerosas propiedades; constituye el medio de transporte del oxgeno y otras sustancias necesarias para el metabolismo celular. La sangre est constituida por: Una fase lquida que se conoce con el nombre de plasma Componentes celulares, que son: glbulos rojos, leucocitos y plaquetas.

Glbulos rojos (GR). Son las clulas ms numerosas y proporcionan a la sangre su caracterstico color rojo, tiene una gran capacidad de transporte de oxgeno. Existe una correlacin entre el nmero de hemates circulantes y su capacidad para transportar oxgeno. El nmero de hemates o GR. por litro de sangre se denomina recuento globular. Hematocrito. Es el porcentaje de hemates o GR por unidad de volumen de sangre. La concentracin de hemoglobina presente en una unidad de volumen de sangre se conoce como concentracin de hemoglobina.
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Antes de iniciar la jornada matutina se corren controles diarios de calibracin alto, normal y bajo, para poder validad la jornada de trabajo del da. Taba 1. Valores sobre el nivel del mar (0 a 1500 m). Masculino Hemoglobina Hematocrito 13.5 g/L 41% Femenino

12.5 g/L 38%

COMPETENCIAS Y SUBCOMPETENCIAS.

Elaborar un diagnstico clnico con base a los diferentes grupos COMPETENCIA DE LA sanguneos que se emplean en las pruebas pretransfusionales en los UNIDAD DE APRENDIZAJE diferentes procesos de banco de sangre y aplicarlos para fines teraputicos, tomando en cuenta los principios ticos. La ley General de Salud y la normatividad vigente.

1. Aplicar la NOM-253-SSA1-2012 Por la disposicin de sangre humana y sus componentes con fines teraputicos, mtodos y tcnicas de grupos sanguneos sistema Rh y otros sistemas de acuerdo a la normatividad vigente. 2. Describir las caractersticas de la prueba de anti globulina humano y el sistema de completo de prueba de compatibilidad e SUB-COMPETENCIAS incompatibilidad investigacin e identificacin de anticuerpos. Recoleccin y procedimientos de la sangre para realizar los procesos, preparacin, conservacin y transporte de los componentes sanguneos su empleo en la terapia transfuncional para contribuir la obtencin de un diagnstico clnico acertado de las pruebas de compatibilidad causadas por ellos, de acuerdo a la normatividad vigente.

Contenido
SUBCOMPETENCIA 1 ................................................................................................................................... 7 PRCTICA 1. TOMA DE MUESTRA SANGUINEA ....................................................................................... 7 CONTROL DE CALIDAD DE LOS SUEROS HEMOCLASIFICADORES ...................................................... 12 PRCTICA 3. DETERMINACIN DEL SISTEMA ABO (PRUEBA CELULAR Y SRICA ............................. 17 PRCTICA 4. PREPARACIN DE CLULAS CONOCIDAS ....................................................................... 22 PRCTICA 5. DETERMINACIN DE LOS SUBGRUPOS A1 Y A2 MEDIANTE EL USO DE LECTINA Y ANTI H LECTINA. ................................................................................................................................................. 25 PRCTICA 6. DETERMINACIN DE LA PRESENCIA DE HEMOLISINAS EN EL SUERO. ........................ 28 PRCTICA 7. TIPIFICACIN DEL ANTGENO D DEL SISTEMA Rh ........................................................... 31 PRCTICA 8. DETERMINACIN DEL ANTGENO D DBIL (Du) ............................................................... 34 PRCTICA 9. DETERMINACIN DEL FENOTIPO DEL GRUPO Rh ........................................................... 37 PRCTICA 10. PREPARACIN DE CLULAS CONTROL DE COOMBS O CLULAS SENSIBILIZADAS . 39 PRCTICA 11. DETERMINACIN DE VDRL (VENEREAL DISEASE RESEARCH LABORATORY) ............ 42 PRCTICA 12. DETERMINACIN DE Brucella CON ANTGENO ROSA DE BENGALA EN PLACA ......... 45

SUBCOMPETENCIA 1 PRCTICA 1. TOMA DE MUESTRA SANGUINEA

1.1. GENERALIDADES. La calidad de un procedimiento Pre analtico, analtico y post analtico en gran parte de la calidad de la muestra en estudio se ha comprobado que la fase Pre analtica consta de un 60% la totalidad del proceso, que se genera desde la solicitud de anlisis del laboratorio hasta la obtencin del resultado que es la parte Post analtica. El procedimiento de la toma de muestra, manejo, conservacin y transporte de muestra es en base a la norma (NOM 166-SSA 1997), que marca los lineamientos para el funcionamiento correcto de los laboratorios clnicos. Manejo y registro de anlisis de pacientes Un sistema de registro de anlisis de pacientes asegura que especmenes de un paciente no sean confundidos con aquellos de otro y los reportes de anlisis sean los ordenados por el mdico y recuperables. El manejo de anlisis de laboratorio se refiere a las acciones como: Etiquetado Nombre del paciente Edad Hora Fecha Solicitud de laboratorio enviada por el mdico Diagnstico
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Debe de existir una libreta de registro para los pacientes y el tipo de anlisis que se va a realizar o un sistema de cmputo para guardar la informacin si es que se pierde cuando la libreta se extrava. La libreta de laboratorio y el sistema cmputo es de ayuda para tener acceso a la informacin de los anlisis de los pacientes, para calcular mensual y anualmente los volmenes de pruebas que se realizan. La sangre consta de dos fases: una parte lquida que es el Plasma y un paquete globular en donde estn presentes los glbulos blancos, rojos y las plaquetas. La puncin de la vena deber hacerse con mucho cuidado para evitar formar un trombo, y evitar hemlisis y hemoconcentrado de la muestra y as evitar que las venas sufran lesin.

1.2 OBJETIVO Tomar la muestra de sangre en cantidad y condiciones necesarias para el estudio correcto del laboratorio de Hematologa.

1.3 MATERIALES Y REACTIVO Materiales Guantes Torundas Gasas Agujas Tubos de tapon lila Reactivo Jabn Alcohol al 70 % Isodine espuma (lodopovidona) Glutaraldehido al 2% 5 ml de sangre
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Ligaduras Gradillas Camisa vacutainer Torundas Tubos de ensaye de 13 mm x 100 mm Tubos de ensaye de 10 mm x 75 mm

1.4 PROCEDIMIENTO. 1. Aplicar un torniquete con una ligadura 2. Identificar el mejor sitio para la venopuntura y liberar el torniquete (Fig. 1).

Figura 1. Localizacin de las venas 3. Realizar la asepsia frotando vigorosamente el rea como mnimo 4cm de arriba hacia abajo y en un solo sentido, del sitio destinado para la venopuncion durante 30 segundos con una torunda de algodn humedecida con alcohol desnaturalizado al 70%. 4. Una vez realizada la asepsia del rea, sta no debe ser tocada nuevamente, es decir, no se volver a palpar la vena en el sitio destinado para la venopuntura.
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5. Volver a aplicar el torniquete 6. Realizar la venopuntura. 7. Una vez que el bisel ha penetrado la piel, se puede realizar la palpacin de la piel por encima del tallo de la aguja con un dedo enguantado, siempre que no se toque la aguja. 8. Una vez terminado el llenado de tubos, se retira la aguja del brazo disponente y se deposita directamente en el contenedor para residuos peligrosos biolgico infecciosos destinado para ese fin, para su posterior incineracin 1.5 TRATAMIENTOYDISPOSICION DE RESIDUOS

Extraccin de sangre con jeringa y aguja

D1

D2

Tubo lila

Sangre con tubo lila

D3

Figura 2. Tratamiento y disposicin de residuos de la Toma de muestra sangunea. D1. Basura comn D2: Ecomayab D3: Tratamiento con hipoclorito al 10% y Ecomayab.
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1.6 CUESTIONARIO Cul es la importancia de una correcta toma de muestra? Cul es el nombre de las venas del brazo tomando en cuenta la figura de arriba? Para qu sirve una toma de muestra? Explique Qu factores pueden interferir en una correcta toma de muestra?

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SUBCOMPETENCIA 1 Practica 2.CONTROL DE CALIDAD DE LOS SUEROS HEMOCLASIFICADORES

2.1. GENERALIDADES. Con el fin de evitar interpretaciones errneas que se deban a reactivos que no cumplen con las especificaciones adecuadas, debe realizarse el control de calidad laboratorio. 2.2. OBJETIVO A travs de esta prctica el alumno, tendr el conocimiento respectivo a la importancia para verificar que las caractersticas fsicas de los reactivos hemoclasificadores del sistema ABO y suero de coombs, y la albmina bovina, sean los adecuados de acuerdo a la norma y criterios aceptados. 2.3 MATERIAL Y REACTIVOS Materiales Reactivo Proceso A Placas de vidrio Cronmetro Gradilla Aplicadores Pipetas Pasteur Proceso B Tubos 12 x 75 Gradillas Cronmetro. Pipetas Pasteur
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todos los das en el

Solucin salina Eritrocitos lavados de los grupos A1, A2, B y O Antisueros comerciales: Anti A, Anti B, Anti AB Anti D, Anti IgG, C3d

Anti A, Anti B, Anti AB, Anti D, y suero de Coombs Eritrocitos del grupo: A1, A2, B y O

2.4 PROCEDIMIENTO A. Proceso de Avidez. El Procedimiento de Avidez es una medida de la capacidad de unin y la velocidad con el cual el anticuerpo (Ac) se combina con su correspondiente antgeno (Ag). Se determina usando la tcnica de placa. 1. Tomar de 2 a 3 gotas de clulas de los grupos A1, A2, B, y O, lavar tres veces con 4ml de solucin salina. 2. Homogenizar. 3. Preparar suspensiones al 10% para determinar la avidez del sistema AB. En tanto que para el sistema Rh y suero de Coombs se emplear suspensin al 40% (Tabla 2).

Suspensin al 10% 9 gotas de solucin salina + 1 gota de eritrocitos

Suspensin al 40% 3 gotas de solucin salina + 2 gotas de eritrocitos

Tabla 2. Preparacin de suspensiones. 4. Colocar en la placa de vidrio, una gota del reactivo a probar y una gota de la suspensin, sin llegar a tocarse dichas gotas. 5. Mezclar las dos gotas con aplicador de madera en un rea de aproximadamente 25mm de dimetro. Al mismo tiempo poner en marcha el cronmetro y pararlo al iniciarse la aglutinacin. 6. Rotar la placa de lado a lado durante el perodo de observacin. Anotar resultados de acuerdo con la Tabla 3.
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Tabla 3. Tiempo promedio de Avidez para los diferentes sueros y clulas frescas

Antisuero Anti A Anti B Anti AB Anti D Coombs A1 y A2 B

Clulas

Tiempo promedio de reaccin De 4 a 10 seg De 4 a 10 seg De 4 a 10 seg De 9 a 15 seg. De 10 a 15 seg.

A1, A2 y B, A1B, A2B. R1r Clulas Sensibilizadas

Nota: Para la realizacin de las suspensiones, utilizar eritrocitos frescos. B. Proceso de especificidad. 1. Especificidad, es la reactividad selectiva de un anticuerpo (Ac) con su correspondiente antgeno (Ag). 2. Preparacin de suspensin al 5%; (19 gotas de solucin salina ms una gota de eritrocitos). 3. En tubos del tamao adecuado, colocar en cada uno de ellos una gota del reactivo a probar, ms una gota de clulas. 4. Centrifugar 20 segundos a 3400 rpm. 5. Leer de acuerdo con la Tabla 4. Tabla 4.- Especificidad para los diferentes sueros y clulas reactivo. Reactivo Anti A Anti B Anti AB Anti D + + Cel A1 + Cel A2 + + + + Cel B Cel R1r

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Reactivo Anti IgG,C3d

Clulas Sensibilizadas +

Clulas No Sensibilizadas -

Grados de aglutinacin. 4+ Botn slido, fondo claro 3+ Grumo grande y varios pequeos o. varios grumos grandes, fondo claro 2+ grumos de tamao mediano, fondo claro. 1+ Grumos pequeos y eritrocitos libres. Fondo turbio (+) Grumos muy pequeos y eritrocitos libres, fondo turbio Negativo: sin grumos, fondo totalmente turbio Valoracin de los diferentes grados de aglutinacin 4+ = 12 Puntos 3+ = 10 Puntos 2+ = 8 puntos 1+ = 5 Puntos (+) = 3 Puntos

1.5 CUESTIONARIO Para que sirve realizar el control de calidad de los reactivos mencionados anteriormente en el laboratorio? Cual es la utilidad del rectivos de Commbs? A que se debe los doferentes grados de aglutinacion? Cual es la utilidad de la ulbumina bovina?

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1.6 TRATAMIENTO Y DISPOSICION DE RESIDUOS

D1

D2

D1. Basura comn D2: Ecomayab D3: Tratamiento con hipoclorito al 10% y Ecomayab

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SUBCOMPETENCIA 1 PRCTICA 3. DETERMINACIN DEL SISTEMA ABO (PRUEBA CELULAR Y SRICA

3.1 GENERALIDADES. Los procedimientos se basan en el principio de la aglutinacin. Los glbulos rojos sanguneos humanos normales (HRBCs) que posean antgenos se aglutinarn en presencia de los anticuerpos especficos dirigidos contra sus antgenos, mientras que los glbulos rojos (HRBCs) que carezcan de antgenos no aglutinarn. La determinacin del sistema ABO debe realizarse con glbulos rojos (prueba directa o celular), y con suero o plasma (prueba inversa o srica); los reactivos Anti-A, Anti-B y Anti-AB aglutinarn los glbulos rojos que posean antgenos de grupo sanguneo A y/o B, mientras que las clulas del grupo O no reaccionarn. Los resultados de los grupos sanguneos debern confirmarse con la prueba inversa, probando el suero individual con glbulos rojos de grupos conocidos A1, A2, B y O. Para evitar los errores de trascripcin en la tipificacin directa, es esencial la determinacin de los anticuerpos naturales de los grupos sanguneos, como estudio comprobatorio 3.2 OBJETIVO A travs de esta prctica el alumno, tendr el conocimiento respectivo a la importancia de la determinacin del sistema ABO

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3.3 MATERIAL Y REACTIVOS Materiales Tubos 12 x 75 mm. Gradilla Pipetas Pasteur y bulbos Centrfuga serolgica de mesa Reactivos Sangre con o sin anticoagulante (5 ml) Suspensin al 5% de: Eritrocitos A1, Eritrocitos A2, Eritrocitos B, Eritrocitos O Suero hemotipificador Anti A Suero hemotipificador Anti B Suero hemotipificador Anti AB Suero hemoclasificador Anti D Solucin isotnica de cloruro de sodio (NaCl) al 0.9%

3.4 PROCEDIMIENTO A. Tcnica Directa en Tubo (15 a 25C) 1. Preparar una suspensin al 5% de los glbulos rojos en solucin salina fisiolgica 0.9% o en su propio suero o plasma. 2. Marcar cada uno de los tubos como Anti-A, Anti-B y Anti-AB y a cada tubo adicione una gota de antisuero apropiado. 3. Adicionar una gota de la suspensin de glbulos rojos a cada tubo. 4. Mezclar por agitacin suave el contenido del tubo y centrifugar: 1 minuto a 450g (1000rpm), o bien, 20 segundos a 3400rpm. Alternativamente dejar reposar los tubos a temperatura ambiente durante un perodo de 15 a 60 minutos. 5. Suavemente resuspender cada botn de clulas del fondo del tubo y observar macroscpicamente la aglutinacin. B. Tcnica Inversa en Tubo 1. Rotular los tubos con el nmero y la letra de los eritrocitos correspondientes.
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2. Agregar 2 gotas del Suero problema a cada tubo. 3. Aadir 1 gota de suspensin al 5% de clulas conocidas (A1, A2, B y O) al tubo correspondiente. 4. Mezclar suavemente y centrifugar 20 segundos a 3400rpm o 1000rpm por 1 minuto. 5. Observar y anotar los resultados de acuerdo con la Tabla 5a y 5b.

C. Interpretacin de los resultados. Tabla 5a. Interpretacin de la prueba directa o celular. Grupo Sanguneo A B AB O Prueba Directa o Celular Anti-A + + Anti-B + + Anti-AB + + + -

Tabla 5b. Interpretacin de la prueba inversa o srica. Grupo Sanguneo A B AB O A1 + + Prueba Inversa o Srica A2 + + B + + O -

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3.5 CUESTIONARIO. Cul es la importancia del sistema ABO? Describa cmo funciona el sistema ABO Para qu sirve la prueba inversa? Describa el funcionamiento de la prueba inversa y directa

3.6 TRATAMIENTO Y DISPOSICIN DE RESIDUOS.

D1. Basura comn D2: Ecomayab D3: Tratamiento con hipoclorito al 10% y Ecomayab

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SUBCOMPETENCIA 1 PRCTICA 4. PREPARACIN DE CLULAS CONOCIDAS

4.1 GENERALIDADES Para la identificacin de los anticuerpos naturales del sistema ABO se realiza utilizando antgenos conocidos como: Eritrocitos A1 Eritrocitos A2 Eritrocitos B Eritrocitos O .6 OBJETIVO

El alumno aprender a preparar y a utilizar soluciones de clulas conocidas para su correcto funcionamiento en el laboratorio .7 Material Gradilla Tubos de ensayo de 13 x 100 mm Piseta Pipetas pasteur MATERIAL Y REACTIVOS Reactivos 5 ml de sagre tipo A,B y O Suero de Coombs Solucin salina

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4.4 PROCEDIMIENTO 1. 2. 3. Tomar 3 gotas de eritrocitos A1, A2, B y O lo ms frescas posibles. Lavar 3 veces con Solucin Salina Fisiolgica 0.9% Preparar una suspensin al 5% (19 gotas de solucin salina + 1 gota de Eritrocitos previamente lavados). 4. 5. Utilizar. Comprobacin con una gota de la suspensin al 5% y dos gotas de suero de Coombs. Interpretacin de resultados por valoracin de los diferentes grados de aglutinacin. 4+ = 12 Puntos 3+ = 10 Puntos 2+ = 8 puntos 1+ = 5 Puntos (+) = 3 Puntos

CUESTIONARIO. Para qu sirve la preparacin de clulas conocas y qu importancia tiene? Que funcin tiene el suero de Coombs en esta prctica? Qu relacin tiene esta prctica con las pruebas cruzadas? En qu otras pruebas pueden usarse clulas conocidas?

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1.6

TRATAMIENTO Y DISPOSICIN DE RESIDUOS.

D1. Basura comn D2: Ecomayab D3: Tratamiento con hipoclorito al 10% y Ecomayab

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SUBCOMPETENCIA 1 PRCTICA 5. DETERMINACIN DE LOS SUBGRUPOS A1 Y A2 MEDIANTE EL USO DE LECTINA Y ANTI H LECTINA.

5.1 GENERALIDADES El antgeno A puede presentarse bajo varias formas que difieren entre s, cualitativa y cuantitativamente en el antgeno A presente en el glbulo rojo. Las dos formas ms comunes son A1 y A2. De stos, el subgrupo A1 es el ms frecuente (80%) y todos aquellos grupos ms dbiles de A se clasifican como A2 (20%). 5.2 OBJETIVO El alumno determinar la presencia de los distintos subgrupos de Anti A, a travs de la lectinas y cul es la ms frecuente. 5.3 MATERIAL Y REACTIVO Material Pipetas pasteur Tubos 12 x 75 mm. Gradilla Lectina Anti A1 Lectina Anti H. Reactivo

5.4 PROCEDIMIENTO 1. Depositar en un tubo marcado, 1 gota de Lectina Anti-A1, Anti H. 2. Agregar una gota de suspensin de Glbulos Rojos al 5%. 3. Mezclar y centrifugar a 3400rpm por 20 segundos 4. Observar aglutinacin resuspendiendo suavemente los glbulos rojos sedimentados,
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5. Analizar de acuerdo con la Tabla 6. Tabla 6. Anlisis de resultados. Grupo A AB A AB Lectina Anti A1 + + Lectina Anti H + + Subgrupo A1 A1B A2 A2B

5.5

CUESTIONARIO

Mencione cual es la importancia de la practica Explique por qu los resultados del cuadro 6 Cmo funciona la lectina anti A? Cmo funciona la lectina anti H?

5.6 TRATAMIENTO Y DISPOSICIN DE RESIDUOS.

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D1. Basura comn D2: Ecomayab D3: Tratamiento con hipoclorito al 10% y Ecomayab

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PRCTICA 6. DETERMINACIN DE LA PRESENCIA DE

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HEMOLISINAS EN EL SUERO.

6.1 GENERALIDADES Las hemolisinas son anticuerpos que al reaccionar con su antgeno correspondiente, activan la va clsica del complemento a 37 C y producen la ruptura de la membrana de los glbulos rojos con la consecuente hemlisis de las mismas. 6.2 OBJETIVO El alumno determinar la presencia de las hemolisinas en el suero de un donante del grupo O y la importancia de la misma; adems deber verificar que los reactivos hemoclasificadores no contengan hemolisinas. 6.3 MATERIAL EQUIPO Y REACTIVO Bao mara a 37 C Tubos 12 x 75 mm. Nota: Realizar la prueba en las dos primeras horas de haber extrado la sangre. 6.4PROCEDIMIENTO 1. Marcar 2 tubos, uno con letra A y otro con letra B. 2. Colocar a cada tubo 2 gotas del suero en estudio. 3. Agregar a cada tubo 1 gota de eritrocitos al 5% segn la letra que corresponda. 4. Incubar a 37C durante 2 horas. 5. Retirar del Bao Mara, mezclar, centrifugar y observar la presencia de hemlisis. 6. Anotar resultados, de acuerdo con la Tabla 7. Suero sanguneo

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Tabla 7. Interpretacin de resultados. Hemolisis Ausente Presente Suero sanguneo 5.5 CUESTIONARIO. Interpretacin Ausencia de hemolisinas Presencia de hemolisinas solucin de jabn

5.6 TRATAMIENTO Y DISPOSICIN DE RESIDUOS.

D1. Basura comn D2: Ecomayab D3: Tratamiento con hipoclorito al 10% y Ecomayab

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PRCTICA 7. TIPIFICACIN DEL ANTGENO D DEL SISTEMA Rh

7.1 GENERALIDADES Determinar la presencia o ausencia del Ag D, es una prueba muy importante en la rutina del Banco de Sangre, para asegurarse que los pacientes Rh Negativos reciban esta sangre (Rh negativa), as como tambin evitar la inmunizacin en aquellas madres Rh Negativo 7.2 OBJETIVO En esta prctica el alumno identificar correctamente la presencia o ausencia del antgeno D y la importancia para evitar la inmunizacin en aquellas madres con Rh Negativas. 7.3 MATERIAL REACYIVOS Y EQUIPO Tubo 12 x 75 mm. Centrfuga serolgica de mesa Antisuero comercial Anti D Suero control Rh

Material biolgico 5 ml. de sangre con o sin anticoagulante 7.4 PROCEDIMIENTO 1. Prepare una suspensin de glbulos rojos al 5% usando el propio suero o plasma de la muestra de sangre (o con suero o plasma de un grupo compatible), o bien en solucin salina fisiolgica. 2. Adicione una gota de la suspensin o una cantidad equivalente de sangre total con uno o dos aplicadores de madera a un tubo de ensayo pequeo. 3. Agregue una gota de suero Anti-D albuminoso. 4. Mezcle suavemente y centrifugue a 1000rpm por un minuto o bien a 3400rpm por 20 segundos.

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5. Resuspenda los glbulos con agitacin ligera del tubo. Observe si hay aglutinacin 6. Interprete los resultados acorde con la Tabla 8. Tabla 8. Interpretacin de resultados. Tubo con Anti Rh + + Tubo con Control Rh + Rh Positivo Rh Negativo o posible Du* Aglutinacin (investigar dicha situacin) * En estos casos se debe proceder a descartar la presencia del Ag D Dbil (Du). 5.5 CUESTIONARIO. Interpretacin

5.6 TRATAMIENTO Y DISPOSICIN DE RESIDUOS.

D1. Basura comn D2: Ecomayab

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D3: Tratamiento con hipoclorito al 10% y Ecomayab

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PRCTICA 8. DETERMINACIN DEL ANTGENO D DBIL (Du)

8.1 GENERALIDADES No todos los glbulos rojos pueden ser clasificados como Rh (+) o Rh (-), mediante las pruebas directas de aglutinacin con antisueros comerciales y a temperatura ambiente, ya que el Ag D puede estar dbilmente expresado, requirindose de pruebas adicionales como la prueba de antiglobulina. 8.2 OBJETIVO. En esta prctica el alumno determinar correctamente el antgeno D dbil con antisueros comerciales. 8.3. EQUIPOS MATERIALES Y REACTIVOS Bao mara a 37 C Centrfuga serolgica 8.4. PROCEDIMIENTO 1. Incubar a 37C por 30 minutos el tubo que est realizando la prueba de Rh y el tubo Control. 2. Lavar ambos tubos 3 veces con solucin salina durante 3 minutos decantando completamente la salina despus de cada lavado y homogeneizar. 3. Agregar 2 gotas del Suero de Coombs. 4. Centrifugar a 3400rpm durante 20 segundos y observar. 5. Anotar Resultados. 6. Agregar una gota de Clulas Control de Coombs (Fig. Suero sanguneo

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7. Interpretacin de la prueba Du de acuerdo con la Tabla 9.

Figura. Esquema de la determinacin del Ag D y el Ag dbil Du Tabla 9. Interpretacin de resultados. Tubo con Anti Rh + Tubo Con Control Rh Rh Negativo Rh Positivo Interpretacin

5.5 CUESTIONARIO.

5.6 TRATAMIENTO Y DISPOSICIN DE RESIDUOS.

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D1. Basura comn D2: Ecomayab D3: Tratamiento con hipoclorito al 10% y Ecomayab

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PRCTICA 9. DETERMINACIN DEL FENOTIPO DEL GRUPO Rh

9.1 GENERALIDADES Contar con la informacin de otros antgenos del sistema Rh que, en ausencia del Ag D, pueden ser inmunolgicamente importantes, ya que pueden provocar una respuesta inmune en aquellos sujetos que carecen de ellos y le son transfundidos. 9.2 OBJETIVO. En esta prctica el alumno conocer la importancia de otros antgenos del sistema Rh 9.3 MATERIAL EQUIPO Y REACTIVOS Tubos 12 x 75 mm Centrfuga serolgica de mesa Antisueros comerciales Anti C Anti c

Glbulos rojos al 5 % Solucin de jabn 9.4 PROCEDIMIENTO 1. Hacer una suspensin al 5% de la muestra. 2. Marcar 4 tubos con la letra del reactivo correspondiente. 3. Adicionar una gota del Antisuero en el orden correspondiente (Anti C, Anti c, Anti E, Anti e). 4. Agregar 1 gota de la Suspensin de Glbulos Rojos al 5% a cada tubo. 5. Mezclar y centrifugar 3400rpm durante 20 segundos y observar. 6. Interpretacin de resultados de acuerdo a la Tabla 10.
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Tabla 10. Interpretacin de resultados. Aglutinacin Presente Ausente 5.5 CUESTIONARIO. Interpretacin Ag. presente Ag. Ausente

5.6 TRATAMIENTO Y DISPOSICIN DE RESIDUOS.

D1. Basura comn D2: Ecomayab D3: Tratamiento con hipoclorito al 10% y Ecomayab

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PRCTICA 10. PREPARACIN DE CLULAS CONTROL DE COOMBS O CLULAS SENSIBILIZADAS

10.1 GENERALIDADES Las clulas control de Coombs (CCC) se utilizan como validacin de las pruebas de antiglobulina humana (AGH) o prueba de Coombs, as como para el control diario del reactivo de antiglobulina, establecidos por las normas de control de calidad en el Banco de Sangre. 10.2 OBJETIVO El alumno conocer la importancia de la preparacin de clulas control de Coombs o clulas conocidas y la validacin de las pruebas cruzadas y el control de los reactivos y el lavado del material de vidrio 10.3 MATERIAL EQUIPO Y RECATIVO Tubos de ensaye Parafilm Centrfuga Serolgica de mesa Bao Mara a 37C 10.4 PROCEDIMIENTO Titulacin del anti-d comercial IgM+ IgG Debido a que en el comercio no existe el anti D IgG es necesario realizar una titilacin al anti D IgM+IgG. 1. Tomar un segmento de clulas O Rh POSITIVO y lavar 3 veces con Solucin Salina Fisiolgica al 0.9%.
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Suero Anti D Suero de Coombs Anti IgG, C3d Glbulos rojos NaCl

2. Preparar 1 mililitro de dilucin, de la siguiente manera: 18 gotas de Solucin Salina + 2 gotas de Anti D. 3. Al paso 2, aadirle 10 gotas de Glbulos Rojos previamente lavados. 4. Incubar durante 1 hora a 37C. 5. Sacar y lavar 3 veces con Solucin Salina Fisiolgica al 0.9%. 6. Preparar una suspensin al 5% (1 gota de Glbulos Rojos Sensibilizados + 19 gotas de Solucin Salina Fisiolgica al 0.9%). Tubo 1 control (-) Aadir 2 gotas de NaCl + una gota de suspensin de G.R. al 5% Tubo 2 Aadir 2 gotas de Suero de Coombs + una gota de de suspensin de G.R al 5 %. Se conservan en el refrigerador durante 7 das, siempre y cuando no presente hemlisis. 5.5 CUESTIONARIO.

5.6 TRATAMIENTO Y DISPOSICIN DE RESIDUOS.

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D1. Basura comn D2: Ecomayab D3: Tratamiento con hipoclorito al 10% y Ecomayab

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PRCTICA 11. DETERMINACIN DE VDRL (VENEREAL DISEASE RESEARCH LABORATORY)

11.1 GENERALIDADES La sfilis es una enfermedad generalizada, producida Treponema pallidum, transmitida habitualmente por contacto sexual. El diagnstico descansa en la serologa, los mtodos determinan dos clases de anticuerpos: 1) Tipo cardiolipina , no treponema e inespecficos y 2) Los antitreponemas especficos 11.2 OBJETIVO El alumno determinar la prueba de VDRL que es una enfermedad venrea transmitida por contacto sexual. 11.3 MATERIAL EQUIPO Y REACTIVOS Placa cncava Pipetas de plstico Centrifugar y separar el suero Agitador Mecnico Microscopio 11.4 PROCEDIMIENTO 1. Colocar una gota (0.05ml) del Suero problema, as como de los Controles Positivo y Negativo, en los anillos de una Placa. 2. Extender las muestras y los controles sobre la superficie del anillo. 3 ml de sangre Reactivo de V.D.R.L.

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3. Aadir una gota del Antgeno (Reactivo1). 4. Colocar la placa sobre un agitador mecnico a 180 rpm durante 4 minutos. 5. Leer inmediatamente al microscopio con el Objetivo 10x. 6. Resultados. La presencia de aglutinacin indica resultado positivo. La ausencia de aglutinacin indica resultado negativo2. 5.5 CUESTIONARIO.

5.6 TRATAMIENTO Y DISPOSICIN DE RESIDUOS.

7. D1. Basura comn D2: Ecomayab

El reactivo debe estar a Temperatura Ambiente antes de ser utilizado. No utilizar sueros

turbios o superlipmicos, hemolizados, etc.

2

Si la prueba es positiva se tiene que hacer diluciones 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32, 1:64. Reportar la

ltima dilucin.

43

D3: Tratamiento con hipoclorito al 10% y Ecomayab

44

PRCTICA 12. DETERMINACIN DE Brucella CON ANTGENO ROSA DE BENGALA EN PLACA

12.1 GENERALIDADES Brucella. Cocobacilo gramnegativo, comprende tres especies, cada una difiere en sus reservorios animales. Brucella mellitensis: Cabras y Ovejas. Brucella abortus: Ganado Vacuno Brucella suis: Cerdos

12.2OBJETIVO. El alumno determinar la prueba de rosa de bengala y su importancia clnica aplicado en el servicio de medicina transfusional. 12. 3MATERIAL Y EQUIPO Y REACTIVOS Placa de vidrio o desechable Pipeta automtica o desechable Agitador mecnico Fuente de luz 12.4 PROCEDIMIENTO Suero del disponente Antgeno Rosa de Bengala Control positivo y negativo de Brucella

1. Colocar una gota (0.05ml) del suero en estudio, as como una gota de controles positivo y negativo en los crculos de una placa. 2. Mezclar suavemente el antgeno con la muestra hasta que se encuentre totalmente homogneo. 3. Agitar la placa durante 4 minutos a 180 rpm.
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4. La lectura debe llevarse a cabo exactamente a los 4 minutos. 5. Resultados. No aglutinacin: Suero negativo. Cualquier cantidad de aglutinacin: Presencia de anticuerpos especficos. Suero positivo. Suero sanguneo + Reactivo de rosa de beng

Sangre sin anticoagulante + Frasco Hermtico rojo 5.5 CUESTIONARIO.

5.6 TRATAMIENTO Y DISPOSICIN DE RESIDUOS.

1. D1. Basura comn D2: Ecomayab D3: Tratamiento con hipoclorito al 10% y Ecomayab

46

SUBCOMPETENCIA 2 PRCTICA No. 13 PRUEBAS CRUZADAS DE COMPATIBILIDAD

13.1 GENERALIDADES Las pruebas cruzadas es la prueba ms importante efectuada en el servicio de transfusin. Por lo tanto, es necesario ser sumamente cuidadoso en su procedimiento para asegurar el mximo beneficio al paciente. Objetivos clnicos de la prueba de compatibilidad a. Procurar que el paciente reciba el mximo beneficio de la transfusin b. Prevenir una reaccin hemoltica transfusional. c. Detectar anticuerpos irregulares en el suero del paciente contra los glbulos rojos del donante (Prueba Mayor), y detectar anticuerpos en el suero del donante contra los glbulos rojos del paciente (Prueba Menor). d. Detectar discrepancias en la determinacin del sistema ABO. e. Detectar errores en la identificacin de las muestras de donantes y receptores. Las pruebas cruzadas son dos: Prueba mayor. Es la ms importante, en ella se pone en contacto los glbulos rojos del donante con el suero del receptor. Se detecta anticuerpos en el receptor que puedan daar los glbulos rojos que se van a transfundir. Prueba menor. Detecta anticuerpos en el suero del donante que puedan afectar los glbulos rojos del receptor, debido a que los anticuerpos presentes en el donante se van a diluir en la volemia del receptor.
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Las pruebas cruzadas se realizan en tres fases 1. Primera fase salina. Detecta anticuerpos fros (IgM). 2. Segunda fase albuminoso. Detecta anticuerpos calientes (IgG). 3. Tercera faseantiglobulina indirecta. Detecta anticuerpos irregulares circulantes. Las pruebas cruzadas deben de realizarse con sangre fresca del receptor, sin anticoagulante. 13.2 OBJETIVO El alumno realizar las pruebas de compatibilidad y conocer la importancia en el servicio de transfusin 13.3 MATERIAL EQUIPO Y REACTIVOS Tubos de ensayo Centrifuga serofuge Bao Mara a 37 13.4 PROCEDIMIENTO 1. Lavar los eritrocitos del Donador y del Receptor, y preparar una suspensin al 5%. 2. Verificar Grupo y Rh del Donador y del Receptor. 3. Rotular 3 tubos con las letras: D, R y AT. 4. Dispensar las muestras de la siguiente manera: 5. En el tubo D colocar 2 gotas del Suero del Receptor y 1 gota del Glbulos Rojos al 5% del Donador. 6. En el tubo R dispensar 2 gotas del Suero del Donador con 1 gota del Glbulos Rojos al 5% del Receptor. 7. En el tubo AT dispensar 2 gotas del Suero del Receptor y 1 gota del Glbulos Rojos al 5% del mismo Receptor. 8. Centrifugar 20 segundos a 3400rpm y observar.
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Suero de Coombs poli especfico Albmina boina al 22 % Antisueros comerciales

9. Posterior a esta lectura, en lugar de 3 gotas de Albmina bovina al 22%, aadir 2 gotas de LISS-Gamma LO-ION (solucin de baja fuerza inica). 10. .- Si se utiliza albmina la incubacin ser de una hora, si se utiliza Gamma LO-ION la incubacin ser 15 min. 11. .- Sacar del bao mara. 12. ). centrifugar 90 segundos para albmina, Gamma LO-ION 15 segundos. 13. . lavar 4 veces para albmina, Gamma LO-ION 3 veces. 14. Aadir 2 gotas de Antiglobulina Humana a cada tubo 15. Centrifugar 20 segundos. Dar lectura. Reportar. 16. Aadir 1 gota de Clulas Control de Coombs. 17. Centrifugar. Leer. Reportar. 18. Comprobacin de la prueba cruzada agregar a cada tubo una gota de clulas control de Coombs y centrifugar 20 segundos. 19. El resultado debe ser positivo para dar validez a la prueba, de lo contrario la prueba se debe de repetir. 5.5 CUESTIONARIO.

5.6 TRATAMIENTO Y DISPOSICIN DE RESIDUOS.

1.
49

D1. Basura comn D2: Ecomayab D3: Tratamiento con hipoclorito al 10% y Ecomayab

50

PRCTICA 14. PRUEBA DIRECTA DE COOMBS

14.1 GENERALIDADES La prueba directa de Coombs se usa para demostrar la presencia de los anticuerpos que han fijado en las clulas del paciente in vivo, por ejemplo en la enfermedad hemoltica del recin nacido, en la anemia hemoltica adquirida, etc. 14.2 OBJETIVO. El alumno demostrar la presencia de los anticuerpos que se han fijado en las clulas del paciente en vivo. 14.3 MATERIAL RECATIVOS Y EQUIPO Tubos de ensayo Centrifuga serofuge Bao Mara a 37C Solucin salina isotnico Suero de Coombs poli especifico Albmina boina al 22 % Antisueros comerciales Material biolgico: 5 ml de sangre venosa sin anticoagulante. Suero sanguneo y glbulos rojos al 5 % 12.4 PROCEDIMIENTO 1. Preparar una suspensin al 5% en solucin salina normal de las clulas probadas. 2. Agregar dos gotas de la suspensin de las clulas preparadas a un tubo de 13 x 75mm 3. Lavar con solucin salina y centrifugue a 3500 rpm durante 3 minutos. Efectuar este lavado tres veces. 4. Despus del ltimo lavado, decantar lo ms posible.

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5. Agregar dos gotas de Suero de Coombs. 6. Mezclar bien y centrifugue por 20 segundos a 3400rpm. 7. Resuspender los eritrocitos de los tubos y examinar el resultado. 5.5 CUESTIONARIO.

5.6 TRATAMIENTO Y DISPOSICIN DE RESIDUOS.

1. D1. Basura comn D2: Ecomayab D3: Tratamiento con hipoclorito al 10% y Ecomayab

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PRCTICA 15 PRUEBA INDIRECTA DE COOMBS

15.1 GENERALIDADES La prueba indirecta de Coombs es utilizada para demostrar la presencia de los anticuerpos circulares que cubren, pero que no aglutinan, a las clulas suspendidas en salina. Se efecta esta prueba combinando invitro a un anticuerpo con antgeno especfico. Ejemplo, cuando se hace una prueba Anti-D en un suero materno, las clulas de la prueba debern contener el antgeno D. 15.2 OBJETIVO. El alumno podr demostrar la presencia de los anticuerpos que cubren, pero no aglutinan, a las clulas suspendidas en salina. 15.3 MATERIAL EQUIPO Y REACTIVOS Tubos de ensayo Centrifuga serofuge Bao Mara a 37C Suero de Coombs poli especfico Albmina bovina al 22 % Antisueros comerciales

Material biolgico: Suero sanguneo y glbulos rojos al 5 % 15.4 PROCEDIMIENTO 1. Presentar el suero en estudio con por lo menos tres sangres Grupo O con Coombs Directo Negativo, para ello, rotular tres tubos y en cada tubo, colocar 2 gotas del Suero problema + 1 gota de glbulos rojos de Grupo O al 5%. 2. Agregar 2 gotas de Albmina Srica Bovina 22%. 3. Incubar a una temperatura de 37C por 30 minutos.

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4. Lavar las clulas por lo menos tres veces con solucin salina fisiolgica, teniendo cuidado de decantar la solucin salina entre cada lavado. 5. Aadir 2 gotas de suero de antiglobulina humana y centrifugar. 6. Incubar a 37C por 5 minutos. 7. Centrifugar 20 segundos a 3400 rpm. 8. Resuspender y observar la formacin de aglutinacin. 5.5 CUESTIONARIO.

5.6 TRATAMIENTO Y DISPOSICIN DE RESIDUOS.

1. D1. Basura comn D2: Ecomayab D3: Tratamiento con hipoclorito al 10% y Ecomayab

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PRCTICA 16 MONOLISA HBs Ag ULTRA

16.1 GENERALIDADES La presencia del Antgeno HBs en el suero indica una infeccin por el Virus de la Hepatitis B. es el primer marcador que aparece y puede preceder de 2 a 3 semanas a los signos clnicos y biolgicos de la enfermedad. Su presencia puede ser muy breve (algunos das) o muy larga (varios aos). Cuando la presencia del Ag HBs supera los 6 meses, la Hepatitis se considera crnica. 16.2 OBJETIVO El alumno determina la presencia del Antgeno HBs, en el suero indica una infeccin por el Virus de la Hepatitis B16.3 PROCEDIMIENTO 1. Distribuir en los pocillos las muestras, manteniendo el orden siguiente: a. Pocil b. c. d. Pocillo G1, H1 2. Agitar la solucin del conjugado antes de usar. Homogeneizar. Distribuir L de Control Negativo (R3)

pocillos (los pocillos con muestras se colorean en rojo). Homogeneizar la mezcla de reaccin. 3. Cuando sea posible, cubrir con una pelcula autoadhesiva e incubar durante 1:30 horas 5 minutos a 37 1C.

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4. Retirar la pelcula autoadhesiva. Aspirar el contenido de todos los pocillos y lavar un

necesario, secar la placa dndole la vuelta sobre una hoja de papel absorbente). 5. actividad enzimtica (R8 + R9) previamente preparada (solucin de color rosa). Dejar que la reaccin se desarrolle en la oscuridad durante 30 5 minutos a temperatura ambiente (18 a 30C). durante esta incubacin, no utilizar pelcula adhesiva. 6. mismo ritmo de distribucin que para la solucin de revelado. Homogeneizar la mezcla de reaccin: la coloracin del sustrato, rosa (en caso de muestras negativas) o azul (en caso de muestras positivas), desaparece de los pocillos que se vuelven incoloros (si las muestras son negativas) o amarillos (si las muestras son positivas) tras la adicin de la solucin de parada. 7. Limpiar cuidadosamente la parte inferior de las placas. Esperar un mnimo de 4 minutos entre la distribucin de la solucin de parada y la lectura y en los 30 minutos siguientes a la parada de la reaccin leer la densidad ptica a 450/620nm con un lector de placas. Tabla 1 AGHB NC1 AGHB NC2 AGHB NC3 AGHB NC4 AGHB PC1 Muestra Muestra 2 3

A B C D E F G H

8. Clculo de la Densidad ptica media del Control Negativo

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DOR3

DO( A1) DO( B1) DO(C1) DO( D1) 4

9. Clculo del Valor Umbral

(VS ) DOR 3 0.050

10. Condiciones de Validacin de la Prueba. Todos los valores del Control Negativo deben ser inferiores o guales al valor del Control Positivo (DOR4), el cual debe ser superior o igual a 1.0. 11. Si el valor del Control Negativo no respeta la norma o es superior en Controles Negativos ( DOR3 ), eliminar ese valor y repetir el clculo de 3 valores. Slo se puede eliminar un valor. 5.5 CUESTIONARIO.

5.6 TRATAMIENTO Y DISPOSICIN DE RESIDUOS.

1. D1. Basura comn D2: Ecomayab

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D3: Tratamiento con hipoclorito al 10% y Ecomayab

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PRCTICA 17. ORTHO HCV 3.0 ELISA Test System with Enhanced SAVe (Sample Addition Verification)

17.1 GENERALIDADES El procedimiento del ensayo es una prueba de tres etapas que se lleva a cabo en un pocillo recubierto con una combinacin de antgenos recombinantes del Virus de la Hepatitis C (rHCV) (c22-3, c200 y NS5). 17.2 OBJETIVO El alumno determinar la presencia del virus de la hepatitis C, como una enfermedad de transmisin sexual. 17.3 PROCEDIMIENTO 1. Dispensacin directa de la muestra: a. b. trol Positivo. c. 2. Leer la microplaca a una longitud de onda de 610nm. Cada control, calibrador o muestra debe dar un valor igual o mayor que 0.315. si un pocillo presenta un valor inferior a 0.315, debe anularse y realizarse una nueva prueba. 3. Cubrir el soporte de la tira de los pocillos con un adhesivo para microplacas. Posteriormente, incubar a 37 1C durante 60 5 minutos. 4. Con un lavador de microplacas, aspirar y lavar todos lo pocillos cinco veces con Tampn de Lavado (x1). En caso necesario, invertir la placa y dar un golpe firme sobre una toalla de papel seca para eliminar el exceso de tampn de lavado. L de diluyente de la muestra a todos los pocillos.

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5. onda de 490-492nm, o en doble longitud de onda a 620-630nm. Cada control, calibrador o muestra debe dar un valor igual o mayor que 0.700. si un pocillo presenta un valor inferior a 0.700, debe anularse y realizarse una nueva prueba. 6. Cubrir de nuevo el soporte de la tira de los pocillos con un adhesivo para microplacas. Posteriormente, incubar a 37 1C durante 60 5 minutos. 7. Preparar suficiente solucin sustrato antes de utilizarla en el paso 9 para esperar que las pastillas OPD se disuelvan completamente. 8. Con un lavador de microplacas, aspirar y lavar todos lo pocillos cinco veces con Tampn de Lavado (x1). En caso necesario, invertir la placa y dar un golpe firme sobre una toalla de papel seca para eliminar el exceso de tampn de lavado. 9. ucin sustrato a todos los pocillos e incubar a temperatura ambiente en la oscuridad durante 30 1 minuto. 10. Aadir 50mL de H2SO4 4N a todos los pocillos. Leer la microplaca a una longitud de onda de 490-492 nm, o en doble longitud de onda a 620-630 nm, antes de 60 minutos desde la dispensacin de la solucin de parada 4N. 1 Blanco HCV NC1 HCV NC2 HCV NC3 HCV PC1 HCV PC2 Muestra 2 3

A B C D E F G H

11. Criterios de aceptacin del reactivo en blanco. Se considera vlido el reactivo en blanco si el valor de la absorbancia es mayor o igual que -0.020 y menor o igual que 0.050. 12. Criterios de aceptacin del Calibrador Negativo. Los valores individuales de Calibrador Negativo deben ser mayores o iguales que -0.005 y menores o iguales que 0.120.
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NCal x

DOB1 DOC1 DOD1 3

13. Criterios de aceptacin del Calibrador Negativo. Se considera vlida la placa respecto al Calibrador Positivo si ambos son mayores o iguales que 0.800 y estn dentro del intervalo lineal del lector de microplacas y no difieren entre s en ms de 0.600. 14. Clculo del Valor de Corte

VC NCal x 0.600
17.5 CUESTIONARIO. 17.6 TRATAMIENTO Y DISPOSICIN DE RESIDUOS.

D1. Basura comn D2: Ecomayab D3: Tratamiento con hipoclorito al 10% y Ecomayab

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PRCTICA 18 MONOLISA Anti-HBc PLUS

18. 1 GENERALIDADES Durante la infeccin primaria por el virus de la Hepatitis B, los primeros anticuerpos en aparecer despus de los anticuerpos contra los antgenos HBs y HBe con los anticuerpos AntiHBc. Los anticuerpos IgM constituyen la respuesta primaria a la infeccin y continan siendo detectables durante varias semanas, desapareciendo durante el perodo de convalecencia. Los anticuerpos IgG, que se producen posteriormente, continan presentes durante muchos aos tras la recuperacin. 18.2 OBJETIVO El alumno conocer la infeccin primaria por el virus de la Hepatitis B, los primeros anticuerpos en aparecer despus de los anticuerpos contra los antgenos HBs y HBe con los anticuerpos Anti-HBc. 18.3 PROCEDIMIENTO 1. Aadir rpida y directamente, y en sucesin: a. b. c. d. e. NOTA: Tras la distribucin de las muestras, el diluyente prpura pasa a azul. Tambin se puede verificar la presencia de muestras mediante la lectura en el Espectrofotmetro a 620nm. L de diluyente (R6) en cada pocillo.

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2. Cubrir los pocillos con pelcula adhesiva, presionando sobre toda la superficie para garantizar la hermeticidad. 3. Incubar la microplaca en seco durante 30 5 minutos a 37 1C. 4. Retirar la pelcula autoadhesiva. Aspirar el contenido de todos los pocillos y lavar un

necesario, secar la placa dndole la vuelta sobre una hoja de papel absorbente). 5. los pocillos. Debe agitarse suavemente el conjugado antes de su uso. 6. Cubrir los pocillos con pelcula adhesiva e incubar en seco durante 60 5 minutos a 37 1C. 7. Retirar la pelcula autoadhesiva. Aspirar el contenido de todos los pocillos y lavar un

necesario, secar la placa dndole la vuelta sobre una hoja de papel absorbente). 8. Preparar la solucin de sustrato (Reactivos R8 + R9 que presentarn una coloracin

que la reaccin se desarrolle en la oscuridad durante 30 5 minutos a temperatura ambiente (18 a 30C). Durante esta incubacin no utilizar pelcula adhesiva. 9. de distribucin que para la solucin de revelado. Homogeneizar la mezcla de reaccin. NOTA: La coloracin del sustrato, rosa (muestras negativas) o azul (muestras positivas), desaparece de los pocillos que se vuelven incoloros (muestras negativas) o amarillos (muestras positivas). 10. Esperar un mnimo de 4 minutos tras la distribucin de la solucin de parada y en los 30 minutos siguientes a la parada de la reaccin, leer la Densidad ptica a 450/620700nm con un lector de placas. Tabla

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1 A B C D E F G H CORE NC1 CORE NC2 CORE PC1 CORE PC2 CORE PC3 Muestra Muestra

11. Criterio de Validacin para el Control Negativo. Cada valor de la absorbancia individual medido debe ser menor que 0.100. 12. Clculo de la media de la Densidad ptica del Control Positivo. Cada valor de la absorbancia debe ser mayor o igual que 1.000 y menor o igual que 2.900. Si uno de los valores difiere en ms del 30% con la norma, descartar el valor y hacer el clculo con los dos restantes.
DOR4 DOC1 DOD1 DOE1 3

13. Clculo del Valor del Punto de Corte (Vs)

Vs DOR4 5

18.5 CUESTIONARIO. 18.6 TRATAMIENTO Y DISPOSICIN DE RESIDUOS.

64

D1. Basura comn D2: Ecomayab D3: Tratamiento con hipoclorito al 10% y Ecomayab

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PRCTICA 19. GENSCREEN HIV 1/2 versin 2

19.1 GENERALIDADES El sndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) es una enfermedad infecciosa de origen vrico que se traduce en un dficit profundo de la inmunidad celular. Los conocimientos sobre la variabilidad gentica de las cepas de los virus HIV se adquirieron mediante la secuenciacin de los genes GAG, POL y ENV de las cepas representativas de cada uno de los subtipos. Los virus HIV1 se dividen en 2 grupos: el grupo M (que incluye 9 subtipos (del A al I) y el grupo O. El virus HIV2 incluye 5 subtipos. 19.2 OBJETIVO: El alumno conocer la tcnica de la prueba de HIV y su interpretacin clnica 19.3 PROCEDIMIENTO 1. Deposite directamente, sin lavar antes la placa, de forma sucesiva: a. 25 b. c. d. e. f. 2. Si es posible, cubra la microplaca con una pelcula autoadhesiva, presionando bien sobre toda la superficie para garantizar su estanqueidad. 3. Incube la microplaca al Bao Mara con termostato o en una incubadora seca de microplacas durante 30 5 minutos a 37 1C. e suero de Control Umbral (R4) en B1, C1 y D1. de diluyente en cada pocillo.

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4. Retire la pelcula adhesiva. Aspire el contenido de todos los pocillos en un contenedor para desechos contaminados (con NaClO) y aada inmediatamente en cada uno de ellos un mnimo de 0.370mL de solucin de Lavado. Djela actuar durante un mnimo de 30 segundos. Aspire de nuevo. Repita el lavado 2 veces por lo menos. El volumen residu dndole la vuelta sobre una hoja de papel absorbente). 5. los pocillos. El conjugado debe agitarse antes de usarlo. 6. Si es posible, recubra la microplaca con una nueva pelcula. Incbela 30 5 minutos a temperatura ambiente (18 30C). 7. Retire la pelcula adhesiva, vace todos los pocillos mediante aspiracin y lvelos 5 veces por lo menos. 8. Distribuir rpidamente en actividad enzimtica (R8 + R9, de color rosa) previamente preparada. Dejar que la reaccin se desarrolle en la oscuridad durante 30 5 minutos a temperatura ambiente (18 30C). 9. ucin de parada (R10) manteniendo la misma secuencia y el mismo ritmo de distribucin que para la solucin de revelado. Homogeneizar la mezcla de reaccin. NOTA: En esta etapa la coloracin es rosa (muestras negativas) o azul (muestras positivas) del sustrato, desaparece de los pocillos que se vuelven incoloros (muestras negativas) o amarillos (muestras positivas) tras la adicin de la solucin de parada. 10. Limpiar cuidadosamente la parte inferior de la placa. Esperar un mnimo de 4 minutos tras la distribucin de la solucin de parada y, en los 30 minutos siguientes a la parada de la reaccin, leer la Densidad ptica a 450/620-700 nm con un lector de placas.

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Tabla 1 A B C D E F G H HIV NC HIV CO1 HIV CO2 HIV CO3 HIV PC Muestra Muestra 2 3

Clculo de la media de las absorbancias. Para el suero Control Umbral. Clculo del Valor Umbral. Validacin de la Prueba. 18.5 CUESTIONARIO. 18.6 TRATAMIENTO Y DISPOSICIN DE RESIDUOS.

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D1. Basura comn D2: Ecomayab D3: Tratamiento con hipoclorito al 10% y Ecomayab

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PRCTICA 20. GHAGASCREEN ELISA

20.1 GENERALIDADES La Enfermedad de Chagas, es una infeccin parasitaria producida por Trypanosoma cruzi. El diagnstico de Laboratorio depende del estadio en el cual se encuentre la enfermedad, si bien la Infeccin por T. cruzi estimula la produccin de anticuerpos de tipo IgG especficos en el husped, dichos anticuerpos se encuentran en muy bajas concentraciones en el suero de pacientes con Chagas Agudo. Celeste. La reaccin se detiene con H2SO4, con lo que el color celeste vira al amarillo. 20.2 OBJETIVO El alumno conocer la importancia de la Enfermedad de Chagas, en el cual es una infeccin parasitaria producida por Trypanosoma cruzi y sus complicaciones en el diagnstico clnico. 20.3 PROCEDIMIENTO 1. Aadir rpida y directamente, y en sucesin: a. 200 b. c. d. e. 2. Mezclar aplicando suaves golpes en los laterales de la microplaca durante 10 segundos. 3. Para evitar la evaporacin, cubrir la placa con una cinta autoadhesiva e incubar 30 minutos a 37C.
70

de diluyente (R6) en cada pocillo.

Control Positivo en E1 y F1.

4. Aspirar cuidadosamente el lquido de cada pozo recibindolo en un recipiente para desechos biolgicos que contenga 5% de NaClO. A continuacin, lavar cinco veces pocillo. Despus de cada lavado se descartar tambin en el recipiente con Hipoclorito. 5. Al finalizar el ltimo lavado, eliminar por completo el lquido residual, invirtiendo la microplaca y golpendola varias veces sobre papel absorbente. 6. Aadir 1 gota (60 7. Mezclar aplicando suaves golpes en los laterales de la microplaca durante 10 segundos. 8. Para evitar la evaporacin, cubrir la placa con una cinta autoadhesiva e incubar 30 minutos a 37C. 9. Realizar nuevamente 5 lavados a cada pocillo de la microplaca y al finalizar el ltimo lavado, eliminar por completo el lquido residual. 10. Agregar cada pocillo. 11. Mezclar aplicando suaves golpes en los laterales de la microplaca durante 10 segundos. 12. Incubar en obscuridad, 30 minutos a temperatura ambiente. 13. 14. Mezclar aplicando suaves golpes en los laterales de la microplaca durante 10 segundos. 15. Leer en Espectrofotmetro a 450 nm o bicromtica a 450/620-650 nm y evaluar el resultado a simple vista por comparacin con los Controles Negativos y Positivos.

A B C D E

1 Blanco CHAG NC1 CHAG NC2 CHAG NC3 CHAG PC1

71

F G H

CHAG PC2 Muestra

16. Criterios de Validacin del Control Negativo. Las lectura de al menos 2 de los 3 Controles Negativos corregidos contra el Blanco de Reactivo deben ser menores o iguales a 0.150.
DOCN DOB1 DOC1 DOD1 3

17. Criterios de Validacin del Control Positivo. La lectura media de los Controles Positivos corregida contra el Blanco de Reactivo deben ser mayor o igual a 0.600. 18. Clculo del Valor Cut-Off.
CutOff DOCN 0.200

19. Con una Zona de Indeterminacin de Cut-Off 10%. Preparacin de las soluciones de lavado Solucin de Lavado Bio-Rad 10x. Preparar aadiendo 100mL de la solucin 10x y aforar a 1L con Agua Bidestilada. Solucin de Lavado HCV ORTHO 20x. Aadir 50mL de la solucin 20x, posteriormente aforando a 1L con Agua Bidestilada. Solucin de Lavado CHAGASCREEN 20x. Preparar con 200mL de la solucin 20x y aforar a 1L con Agua Bidestilada.

20.5 CUESTIONARIO. 20.6 TRATAMIENTO Y DISPOSICIN DE RESIDUOS.

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D1. Basura comn D2: Ecomayab D3: Tratamiento con hipoclorito al 10% y Ecomayab

73

ANEXOS

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LINEAMIENTOS GENERALES EN MATERIA DE SEGURIDAD E HIGIENE A SEGUIR EN LOS LABORATORIOS

Las actividades de carcter docente e investigador que se llevan a cabo en las prcticas de laboratorios del Programa Educativo de Qumico Farmacutico Bilogo de la Facultad de Ciencias Qumico Biolgicas (FCQB) de la Universidad Autnoma de Campeche (UAC) conllevan, en determinados casos, un riesgo dependiendo del tipo de trabajo que se desarrolle. Este documento recoge los lineamientos necesarios para llevar a cabo un trabajo seguro y eficiente atendiendo a las indicaciones del Reglamento Federal de Seguridad e Higiene y Medio ambiente de Trabajo, publicado en el Diario Oficial de la Federacin, el 21 de enero de 1997, Normatividad en materia de Seguridad e Higiene de la Secretaria del Trabajo y Previsin Social, Sistema de Gestin Ambiental Yum Kaax ISO 14001:2004 de la Universidad Autnoma de Campeche y Reglamento Interno de los Laboratorios en los que se realizan prcticas de docencia de la FCQB de la UAC.

Solo se permitir trabajar a los alumnos bajo la responsabilidad de un profesor o de la persona asignada de manera previa por el Coordinador del Programa Educativo o de Posgrado e Investigacin.

Realizar nicamente tareas enmarcadas en el mbito de trabajo del laboratorio para las que ha sido autorizado.

Se deber llevar siempre la bata de manga larga y los equipos de proteccin individual exigidos segn el tipo de trabajo que se realice (goggles, mascarilla protectora, guantes de latex, calzado cerrado que cubra el empeine, de tacn ancho o corrido con altura mxima de 4 cm, de piel, que no sea de tela ni de material plstico, incluida la suela) segn lo solicite el profesor.

No se permite ingresar con bermudas o short y, en el caso de las mujeres, el largo de la falda debe ser debajo de la rodilla.

Hombres y mujeres con cabello largo debern portar el pelo recogido hacia atrs.
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No llevar pulseras, colgantes, mangas anchas ni prendas sueltas que puedan trabarse en montajes, equipos o mquinas.

No fumar, comer ni beber. No realizar reuniones o celebraciones. No guardar alimentos ni bebidas en los frigorficos del laboratorio. Mantener el orden en las sesiones de laboratorio y tratar con respeto al laboratorista, compaeros y profesores.

Verificar que el material y los equipos de laboratorio a emplear se encuentren en ptimas condiciones de funcionamiento.

Antes de hacer uso de cualquier material y/o equipo consulte su operatividad con el laboratorista.

Mantener las mesas de trabajo limpias y sin objetos personales en las superficies (libros, cajas o accesorios innecesarios) para el trabajo que se est realizando.

Tener la autorizacin para el uso de un producto, equipo o instalacin concreta. Lavar y enjuagar todo el material de vidrio con agua destilada y secarlo. Leer la etiqueta o consultar las fichas de seguridad de productos qumicos antes de utilizarlos por primera vez.

Para efectuar pipeteos utilice siempre propipeta o perilla No tocar ni probar, sin el uso de guantes a los productos qumicos. Calentar tubos de ensayo de lado y utilizando pinzas. Por su seguridad utilizar gradillas y soportes. Comprobar la temperatura de los materiales antes de sujetarlos directamente con las manos.

En caso de ser necesario utilizar las campanas de extraccin. Etiquetar adecuadamente los frascos y recipientes a los que se haya transvasado algn producto o donde se hayan preparado mezclas, identificando su contenido, a quin pertenece y la informacin sobre su peligrosidad (reproducir el etiquetado original).

Reportar cualquier accidente o anomala ocurrida durante la prctica, de manera inmediata al laboratorista.

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Salvaguardar todos los implementos y dispositivos de seguridad e higiene (extintor, sealamientos, regadera y lavaojos de emergencia, etc.) habilitados en el interior del laboratorio.

Revisar la Normativa correspondiente de acuerdo a la NOM-062-ZOO-1999, Cuidado y uso de animales de laboratorios y la NOM-087-SEMARNAT-SSA1-2002, Proteccin ambiental-Salud ambiental-Residuos peligrosos biolgico-infecciosos-Clasificacin y especificaciones de manejo para el caso de emplear animales de laboratorio muestras biolgico-infecciosas respectivamente. y

El material y equipo que se rompa o sufra desperfectos en el transcurso de la prctica, se deber reportar al laboratorista de inmediato.

Asegurar la desconexin de equipos, agua y gas al terminar el trabajo. Recoger materiales, reactivos, equipos, y depositar los residuos en los contenedores correspondientes.

Lavarse las manos antes de dejar el laboratorio. MARCO JURDICO Reglamento Federal de Seguridad e Higiene y Medio ambiente de Trabajo. Publicado en el Diario Oficial de la Federacin (D.O.F.), el 21 de enero de 1997. NOM-002-STPS-2010, Condiciones de seguridad - Prevencin y proteccin contra incendios en los centros de trabajo. D.O.F. 9-XII-2010. NOM-005-STPS-1998, Relativa a las condiciones de seguridad e higiene en los centros de trabajo para el manejo, transporte y almacenamiento de sustancias qumicas peligrosas. D.O.F. 2-II-1999 NOM-010-STPS-1999, Condiciones de seguridad e higiene en los centros de trabajo donde se manejen, transporten, procesen o almacenen sustancias qumicas capaces de generar contaminacin en el medio ambiente laboral. D.O.F. 13-III-2000.

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