I. TUJUAN PERCOBAAN Dapat memahami metode identifikasi lipid.

II. PRINSIP DASAR Lipid adalah nama suatu golongan senyawa organik yang meliputi sejumlah senyawa yang terdapat di alam yang semuanya dapat larut dalam pelarut-pelarut organik tetapi sukar larut atau tidak larut dalam air. Pelarut organik yang dimaksud adalah pelarut organik nonpolar, seperti benzen, pentana, dietil eter,dan karbon tetraklorida. Dengan pelarut-pelarut tersebut lipid dapat diekstraksi dari sel dan jaringan tumbuhan ataupun hewan. Lipid merupakan salah satu makromolekul yang menjadi building block dalam tubuh makhluk hidup. Lipid banyak terdapat pada komponen struktural sel. Dalam sel, lipid ditemukan bergabung dengan molekul posfat yang menjadi komponen utama membran plasma. Selain itu, lipid juga merupakan senyawa yang penting sebagai sumber biosintesis molekul biologis lainnya. Lipid akan terhidrolisis jika dilarutkan dalam asam atau basa, air, dan enzim lipase. Hidrolisis lipid oleh asam akan menghasilkan gliserol dan asam-asam lemak penyusunnya. Hidrolisis lipid oleh basa kuat (KOH atau NaOH) akan menghasilkan campuran sabun K+ atau Na+ dan gliserol. Proses hidrolisis ini disebut penyabunan atau saponifikasi. Hidrolisis oleh air akan terjadi jika lemak/minyak dipanaskan dengan air pada suhu 180 C dan tekanan 10 atm, kemudian akan terhidrolisis menjadi gliserol dan asam-asam lemak. Gliserol larut dalam air, sedangkan asam lemak terapung di atas air.

Lipid secara umum dapat dibagi ke dalam dua kelas besar, yaitu lipid sederhana dan lipid kompleks. Yang termasuk lipid sederhana antara lain adalah: 1. Trigliserida dari lemak atau minyak seperti ester asam lemak dan gliserol, contohnya adalah lemak babi, minyak jagung, minyak biji kapas, dan butter, 2. Lilin yang merupakan ester asam lemak dari rantai panjang alkohol, contohnya adalah beeswax, spermaceti, dan carnauba wax, dan 3. Sterol yang didapat dari hidrogenasi parsial atau menyeluruh fenantrena, contohnya adalah kolesterol dan ergosterol.

BIOKIMIA

Klasifikasi lipid ke dalam lipid majemuk karena lipid tersebut mengandung asam lemak yang dapat disabunkan, sedangkan lipid sederhana tidak mengandung asam lemak dan tidak dapat disabunkan. Komponen-komponen campuran lipid dapat difraksionasi lebih lanjut dengan menggunakan perbedaan kelarutannya didalam berbagai pelarut organik. Sebagai contoh: fosfolipid dapat dipisahkan dari sterol dan lemak netral atas dasar ketidaklarutannya di dalam aseton. Pada umumnya lemak tidak larut dalam air, yang berarti juga tidak larut dalam plasma darah. Agar lemak dapat diangkut ke dalam peredaran darah, maka lemak tersebut harus dibuat larut dengan cara mengikatkannya pada protein yang larut dalam air. Ikatan antara lemak (kolesterol, trigliserida, dan fosfolipid) dengan protein ini disebut Lipoprotein (dari kata Lipo=lemak, dan protein). Lipoprotein bertugas mengangkut lemak dari tempat pembentukannya menuju tempat penggunaannya. Bila lemak atau minyak dipanaskan dengan alkali, ester terkonversi menjadi gliserol dan garam dari asam lemak. Reaksi tersebut digambarkan dengan penyabunan gliseril tripalmitat (Hart, harold, at al. 2003).
O CH2OC(CH2)14CH3 CH2OH

O CH2OC(CH2)14CH3

Na+ - OH

CHOH

3 CH3(CH2)14CO2- Na+ natrium palmitrat

O CH2OC(CH2)14CH3 gliseril tripalmitrat CH2OH gliserol

Asam palmitat adalah dua di antara asam lemak jenuh yang dapat diubah menjadi asam lemak tak jenuh. Cara pengubahannya tergantung dari jenis jasad hidup. Pada tanaman pembentukan asam lemak tak jenuh berlangsung seperti pada hewan, hanya ada perbedaan pada rantai transpor elektron mikrosomalnya. Asam aplmitat yang dihasilkan dalam sistem multienzim sintase dapat diperpanjang menjadi asam lemak yang lebih panjang rantainya. Pemanjangan itu terjadi pada mithokondria dan pada endoplasmik retikulum (Martoharsono, 1983).

BIOKIMIA

Lemak merupakan komponen utama dari membrane sistem kehidupan, Dua tipe lemak yang dapat tersaponifikasi dalam membrane memiliki suatu gugusan fosfat dalam strukturnya dan dengan demikian disebut fosfolipid. Salah satu jenis memiliki gliserol sebagai senyawa induk (fosfogliserida) dan yang lain memiliki sfingosin (sfingolipid). Dua komponen lemak lain yang penting dari membrane adalah glikolipid yang mengandung karbohidrat dan steroid kolesterol, yang disebut terakhir ini merupakan suatu lemak non-saponifikasi yang berasal dari eukariotik yang ditemukan dalam membrane seluler hewan (Armstrong, 1995).

Asam lemak adalah asam lemah. Apabila larut dalam air molekul asam lemak akan terionisasi sebagian dan melepaskan ion H+. Dalam hal ini pH larutan tergantung pada konstanta keasaman dan derajat ionisasi masing-masing asam lemak. Rumus pH untuk asam lemah pada umumnya telah dikemukakan oleh Henderson-Hasselbach. Asam lemak dapat bereaksi dengan basa, membentuk garam. R-COOH+ NaOH -> R-COONa + H2O. Salah satu pembangun khas lipid yaitu asam lemak. Asam lemak merupakan asam organik berantai panjang yang mempunyai atom karbon dari 4 sampai 24. Asam lemak mempunyai gugus hidrokarbon hidrofob yang banyak sekali dan hanya sedikit, jika ada, gugus hidrokarbon hidrofil yang menyebabkan kebanyakan lipida bersifat tidak larut di dalam air dan tampak berminyak atau berlemak. Asam lemak tidak terdapat secara bebas atau berbentuk tunggal di dalam sel atau jaringan, tetapi terdapat dalam bentuk yang terikat secara kovalen pada berbagai kelas lipida berbeda, asam lemak dapat dibebaskan dari ikatan ini oleh hidrolisis kimia atau enzimatik.

Triasilgliserol adalah komponen utama dari lemak penyimpan atau depot lemak pada sel tumbuhan dan hewan, tetapi umumnya tidak dijumpai pada membran. Triasilgliserol adalah molekul hidrofobik nonpolar, karena molekul ini tidak mengandung muatan listrik atau gugus fungsional dengan polaritas tinggi. (Lehninger 1982). Triasilgliserol terakumulasi di dalam beberapa area, seperti jaringan adiposa, dalam tubuh manusia dan biji tanaman, dan triasilgliserol ini mewakili bentuk penyimpanan energi. Lipid yang lebih kompleks berada dekat dan berhubungan dengan protein dalam membran sel dan partikel subselular. Jaringan yang lebih aktif mengandung lipid

BIOKIMIA

kompleks yang lebih banyak, contohnya adalah dalam otak, ginjal, paru-paru, dan darah yang mengandung konsentrasi fosfatida dalam jumlah tinggi pada mamalia.

Uji kualitatif lipid dilakukan untuk mengetahui bahwa dalam suatu sampel percobaan terkandung senyawa lipid. Banyak sekali metode yang bisa dilakukan untuk menguji keberadaan senyawa lipid dalam sebuah sampel. :

a. Tes kelarutan Dapat dilakukan untuk menguji keberadaan lipid dalam suatu sampel. Tes kelarutan dapat digunakan untuk mengekstraksi dan isolasi lipid dari sampel biologis, misalnya telur atau jaringan hewan.

b. Tes Penyabunan Saponifikasi Saponifikasi merupakan proses terbentuknya garam asam lemak dan gliserol saat minyak atau lemak dipanaskan dengan penambahan alkali.

c.

Uji gliserol Uji gliserol didasarkan pada sifat lecitin atau gliserol yang bila dipanaskan dan ditambah kalsium bisulfit akan menghasilkan bau yang khas.

d. Uji Lieberman-Burchard Tes ini didasarkan pada sifat sterol yang berikatan rangkap bila direaksikan dalam kondisi kering dengan asam anhidris dan asam sulfat pekat, akan menghasilkan suatu warna. Warna yang muncul merupakan gradasi antara merah biru dan hijau.

e. Uji posfat dan posfolipid Posfolipid bila direaksikan dengan amonium molibdat akan menghasilkan kompleks amonium posfomolibdat yang berwarna biru.

BIOKIMIA

III. ALAT DAN BAHAN

Alat : 1. Erlenmeyer 2. Pipet ukur 3. Kloroform 4. Tabung reaksi

Bahan : 1. Minyak kelapa 2. Alkohol 96% 3. Eter 4. Aquadest 5. Larutan Na2CO3 0,5% 6. Margarine 7. Lemak padat 8. Air brom 9. NaOH 10. Olive oil 11. Gliserol 12. Asam palmitat

BIOKIMIA

IV. PROSEDUR PEKERJAAN

NO 1 Uji Kelarutan

PROSEDUR -

PENGAMATAN Di tambahkan aquadest 1ml Tidak larut. Di tambahkan alkohol 96% Tidak larut. Di tambahkan eter 1ml Kloroform larut. Larut.

Masukan Aquadest, alkohol 96%, eter, kloroform, dan larutan Na2CO3 0,5% sebanyak 1ml ke dalam 5 tabung reaksi Ke dalam tiap tabung masukkan 2 tetes minyak

Di tambahkan 5 larutan Na2CO3 0,5% 1ml terbentuk emulsi.

Kocok hingga terjadi homogen dan biarkan beberapa saat

Amati sifat kelarutan larut/terbentuk emulsi)

(larut/tidak

Uji penyabungan minyak (saponifikasi) 5 ml minyak kelapa dilarutkan ke dalam erelnmeyer

5 ml minyak kelapa : Setelah minyak alkohol NaOH di campurkan warna larutan tetap bening dan minyak terpisah serta padatan NaOH. 1,5 g NaOH dan 25 ml alkohol 95% : Lalu dipanaskan sampai mendidih, lalu larutkan menjadi padat dan di uji menggunakan aquadest hasilnya menimbulkan busa.

Di tambahkan 1,5 g NaOH dan 25 ml alcohol 96% Dipanaskan sampai mendidih selama 15 menit

3 tetes pipet larutan untuk mengetahui reaksi penyabunan telah sempurna

Kemudian larutkan dalam air, bila larut menunjukkan reaksi telah sempurna
BIOKIMIA

NO

PROSEDUR

PENGAMATAN

Setalah sempurna, alcohol diuapkan samoai habis. Lalu dinginkan dan tambahkan 75 ml aquadest, panaskan sampai sabun larut 3 Uji Akrolein Siapkan 3 tabung reaksi bersih dan kering, lalu masukkan 10 tetes olive oil, gliserol/sedikit asam palmitat. Dari hasil pengamatan : Olive oil + KHSO4 tidak larut (kuning bening) Gliserol + + KHSO4 larut bening Asam palmita + KHSO4 tidak larut Setelah dipanaskan : Olive oil bau belerang (tidak menyengat) Gliserol bau menyengat (bau obat), (larut) Asam palmitat tidak bau (larut) Tambahkan sedikit kolesterol, ditambahkan kloroform 6 tetes = larut Lalu ditambahkan dengan CH3COOH anhidrat sebanyak 10 tetes warnanya bening agak jenuh Dan pada saat ditambahkan 2 tetes asam sulfat warnanya pink muda dan hasilnya positif

Ditambahkan masing-masing ke dalam tabung sejumlah volume KHSO4, lalu dipanaskan di atas api

Perhatikan bau akrolein, bedakan dengan bau SO4 4 Uji Lieberman Burchard untuk kolesterol Larutkan sedikit kolesterol dalam kloroform hingga larut -

Ditambahkan 10 tetes asam asetat anhidrid dan 2 tetes asam sulfat pekat, kocok dan biarkan beberapa menit

Perhatikan perubahan warna yg terjadi

BIOKIMIA

V. PEMBAHASAN

1. Uji Kelarutan Pada uji kelarutan lipid, minyak mampu melarut sempurna dalam kloroform dan sama sekali tidak terlarut dalam air. Kelarutan minyak tersebut dipengaruhi oleh perbedaan sifat kepolaran pada masing-masing senyawa nya. Ketika masing-masing sampel diteteskan pada kertas saring, minyak dengan bahan pelarut air meninggalkan noda sedangkan minyak dengan pelarut organik lain tidak. Noda yang ditimbulkan pada penetesan air-minyak tersebut menunjukkan bahwa minyak tidak terlarut dalam air. Hampir semua lemak yang diujikan, dapat larut dalam eter dan kloroform. Adanya ekor hidrokarbon panjang yang bersifat nonpolar menyebabkan lemak bersifat nonpolar. Oleh karena itu, lemak dapat larut dalam pelarut nonpolar seperti eter dan kloroform. Alkali dan asam encer dapat mengubah asam lemak menjadi sabun yang berupa garam asam lemak. Selain bergantung pada kepolaran pelarut, kelarutan lipid juga bergantung pada panjang rantai hidrokarbon yang dikandungnya. Semakin panjang rantai, kelarutannya akan semakin berkurang.

2. Uji Penyabunan Minyak (Saponifikasi) Pada uji penyabunan minyak (saponifikasi) bertujuan untuk pengambilan asam-asam lemak dari minyak, sehingga dihasilkan campuran sabun dan gliserol yang mudah larut dalam air dan alkohol membentuk reaksi esterifikasi menghasilkan ester dan eternya, berikatan dengan NaOH membentuk reaksi saponifikasi. Jika ester-ester besar yang terdapat dalam lemak dan minyak hewani dan nabati dipanaskan dengan larutan natrium hdiroksida pekat, reaksi yang terjadi persis sama dengan reaksi pada ester-ester sederhana. Hal ini disebabkan karena adanya fase minyak yang terperangkap bisa lepas. R1 R2 R3 + alkohol + CH3CH2OH OCH2CH3

CH2 HC

CH3 CH2 CH2

NaOH

CH2

Asam lemak
BIOKIMIA

Esterifikasi

Ester+NaOH 8

Terbentuk asam karboksilat karena garam natrium dari sebuah asam besar seperti asam oktadekanoat (asam stearat). Garam-garam ini merupakan komponen sabun yang penting yaitu komponen yang melakukan pembersihan dan berfungsi sebagai elmugator pada pengelmusi kotoran berminyak.

3. Uji Akrolein Pengujian akrolein pada gliserol mampu menghasilkan gas berbau, sedang pada olive oil tidak. Hal ini terjadi karena struktur gliserol tidak memiliki ekor, sehingga ekornya yang kosong itu terisi oleh gugus SO4 dari KHSO4 dan membentuk senyawa dalam bentuk gas. Sedang pada olive oil, strukturnya sudah memiliki gugus tertentu di bagian ekor, sehingga ditambahkan KHSO4 tidak ada ruas bagian yang terisi oleh gugus SO4. Gliserol dalam bentuk bebas atau yang terdapat dalam lemak/minyak akan mengalami dehidrasi membentuk aldehid akrilat atau akrolein. Hasil uji akrolein menunjukkan bahwa semua bahan yang diuji memberikan bau yang tajam yang diidentifikasi sebagai bau akrolein. Hal ini ditandai dengan adanya asap putih ketika lipid dipanaskan diatas pembakar gas. Bila mengalami dehidrasi, gliserol bebas atau gliserol yang terdapat dalam lipid dapat membentuk aldehid akrilat atau akrolein yang menimbulkan bau ketika dipanaskan . Oleh karena itu, dapat diketahui bahwa terdapat gliserol di dalam lipid yang diuji. Reaksi uji akrolein:

BIOKIMIA

4. Uji Liebermann Burchard untuk kolesterol Dalam uji Lieberman - Buchard, steroid diubah menjadi hidrokarbon polimer tak jenuh. Di perlakuan kolesterol dalam kloroform dengan penambahan asam sulfat dapat menambahkan substansi air membentuk bikolestadienil. Senyawa ini dapat merupakan campuran dari 3,3- biskolesta -3,5- dienil dan 3,3- biskolesta -2,4 dienil. Mekanisme kerja Lieberman - Burchard ini ketika H2SO4 ditambahkan kolesterol kemudian kolesterol teroksidasi membentuk 3 5 kolestadiena produk ini dikonfersi menjadi polimer yang mengandung kloroform warna pink yang menghasilkan warna hijau. Uji Lieberman Burchard berfungsi untuk melarutkan sampel kolesterol. Ketika penambahan asam sulfat pekat, terbentuk dua fasa cair yang terpisah, pada tepi garis pemisah antara kedua fasa cair tersebut terbentuk cincin berwarna merah kecoklatan gelap, cincin ini terbentuk akibat reaksi antasa asam sulfat pekat dengan kolesterol yang terlarut dalam kloroform. Setelah ditambahkan asam asetat dan dilakukan pengocokan, salah satu bagian dari fasa cair kemudian berubah warna menjadi merah pink. Hal ini menandakan bahwa kolesterol yang terlarut dalam kloroform sudah bereaksi dengan asam asetat dan asam sulfat pekat yang ditambahkan. Reaksi kolesterol :

BIOKIMIA

10

VI. KESIMPULAN Lipid terlarut dengan baik pada pelarut-pelarut organik seperti kloroform dan alkohol. Kemampuan kelarutan ini didasarkan pada kesamaan sifat kepolaran antara solute dan solvent nya. Prinsip uji penyabunan minyak adalah asam lemak berikatan dengan alcohol membentuk reaksi esterifikasi menghasilkan campuran gliserol dan sabun. Sabun bisa mengelmusi kotoran minyak karena sabun bersifat emulgator. Kandungan lipid pada sampel tertentu bisa diidentifikasi melalui penambahan KHSO4 dan menghasilkan senyawa berbentuk gas, akrolein yang berbau. Seperti gliserol yang menghasilkan gas tersebut setelah penambahan KHSO4. Lipid bisa juga diidentifikasi melalui uji Lieberman-Burchard dengan

pembentukan senyawa berwarna merah/merah muda sebagai detektor terjadinya reaksi antara lipid dengan asam pekat. Faktor yang mempengaruhi warna tidak bisa berubah karena pereaksi yang digunakan kurang baik.

BIOKIMIA

11

VII. DAFTAR PUSTAKA Pujiadi, Anna. 1994. Dasar-Dasar Biokimia. Jakarta : UI Press Fessenden, Ralph J. 1997. Fundamentals of OrganicChemistry. Jakarta : Binarupa Aksara. Winarno, F. G. 1992. Kimia Pangan dan Gizi. Jakarta : PT Gramedia Pustaka Utama. Murrey, Robert K. 2002. Biokimia. Jakarta : Harper Ecg. Lehninger.1982. Dasar-Dasar Biokimia. Penerjemah : Maggy Thenawijaya. Jakarta, Erlangga. Armstrong, Frank B. 1995. Buku Ajar Biokimia. Edisi ketiga. EGC: Jakarta. Gilvery, Goldstein. 1996. Biokimia Suatu Pendekatan Fungsional. Edisi 3. Airlangga University Press:

BIOKIMIA

12