Deteccin de Fluorescencia de ECL+ mediante el equipo Typhoon 9410

El kit para revelado de ECL+ contiene un sustrato que en presencia de la HRP (peroxidasa de rbano) que tenemos conjugada al anticuerpo secundario, genera una reaccin enzimtica que produce quimioluminiscencia y fluorescencia.
HRP

Lumigen PS3-acridan substrate

Condiciones alcalinas

Quimioluminiscencia Intermediarios fluorescentes exc 430nm em 503nm

Ajustamos estas condiciones en el Typhoon para obtener la imagen

Mediante el escaneo de la membrana en el Typhoon vamos a detectar la seal del ECL+ procedente de la fluorescencia (no quimioluminiscencia). En general, un fluorforo o producto fluorescente es aquel que tiene la capacidad de emitir fluorescencia. Estos compuestos tienen un pico mximo de excitacin y otro de emisin, lo que quiere decir que excitamos nuestro compuesto con un lser que tiene una longitud de onda igual o cercana al valor de la longitud de onda del pico mximo de excitacin del producto fluorescente. El fluorforo, para volver al estado de equilibrio en el que se encontraba antes de que lo excitramos, emite energa en forma de fluorescencia, teniendo esta emisin tambin un pico mximo. La longitud de onda de emisin siempre ser mayor que la de excitacin. La seal de emisin es la que recogeremos con el equipo para revelar el western blot. De este modo estamos detectando los lugares de unin del anticuerpo que es dnde se ha producido esta reaccin.

Seccin Anlisis de Imagen

Por lo tanto, antes de ponernos a trabajar con el equipo, debemos conocer bien las caractersticas de excitacin y emisin del ECL+.

Longitud de onda de excitacin: 430nm Longitud de onda de emisin: 503nm El Typhoon cuenta por una parte con varios lseres de excitacin, cada uno con una longitud de onda determinada y por otra, con varios filtros, para recoger la emisin ajustamos la parte de la seal que realmente nos interesa y que coincide con el pico del espectro de emisin. Tenemos 4 lseres de excitacin Green: 532 nm Red: 633 nm Azul 2: 488 nm Azul 1: 457 nm 457 Azul1 488 azul2 532 Green 633 Red

y varios filtros, que segn el espectro que dejen pasar, los podemos clasificar en: LP: long-pass, filtros de paso alto, longitudes de onda mayores que las indicadas. SP: short-pass. Filtros de paso bajo. Deja pasar longitudes de onda menores que las indicadas BP: Band-pass. Filtros de paso de banda. Dejan pasar un determinado rango de longitud de onda. El nmero nos indica el punto central del rango. Ejemplo: 520 BP 40 BP LP

SP El fotomultiplicador (PMT) Otra de las variables que afectarn a la calidad del escaneo de nuestra membrana es el voltaje del fotomultiplicador. El fotomultiplicador detecta y ampla nuestra seal y cuanto mayor sea su voltaje, mayor ser la sensibilidad. Lineal entre 300-600PMT. Su importancia radica en que al cambiar su valor podemos evitar la saturacin de nuestras bandas o aumentar su intensidad en caso de que estas sean muy dbiles. Aplicaciones Adems de revelado con ECL+, podremos revelar cualquier western con un anticuerpo secundario conjugado con un fluorforo siempre que tengamos de los sistemas de excitacin y emisin apropiados con la combinacin del lser y filtros.

Seccin Anlisis de Imagen

ANEXO

Medidas de fluorescencia en el equipo Typhoon

BP

LP

SP

457 Azul1 488 azul2 532 Green 633 Red

Seccin Anlisis de Imagen

Deteccin de quimioluminiscencia de ECL+ mediante el equipo ImageQuant LAS500

La quimioluminiscencia es la emisin de luz por una reaccin qumica. Algunas reacciones enzimticas producen luz y sta puede ser medida para detectar la formacin de producto. Estos tipos de ensayo pueden ser extremadamente sensibles, ya que la luz producida puede ser registrada en una pelcula fotogrfica por das e incluso semanas, pero al mismo tiempo son de difcil cuantificacin, porque no toda la luz emitida por la reaccin ser detectada. La deteccin de la peroxidasa de rbano por quimioluminiscencia enzimtica (ECL, enzymatic chemiluminiscence) es un mtodo comn para detectar anticuerpos en el western blot. Otro ejemplo de quimioluminiscencia es la luciferasa, enzima presente en las lucirnagas que produce luz de forma natural a partir de su sustrato, luciferina (Wikipedia)

Comparativa del mismo blot revelado con la seal fluorescente de ECL+ en Typhoon y quimioluminiscente de ECL en ImageQuant LAS500
Importante: Sensibilidad del sistema de captura de la seal Rango de niveles en el software de medida Seguridad en la saturacin del marcaje

Imagen Typhoon Fluorescencia ECL

Sensibilidad-rango de niveles de gris_ 4096

Imagen ImageQuant LAS500 Quimioluminiscencia ECL

Sensibilidad-rango de niveles de gris_ 65536

Seccin Anlisis de Imagen