UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE CENTRO DE CINCIAS MDICAS PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM MEDICINA VETERINRIA MESTRADO EM MEDICINA VETERINRIA REA DE CONCENTRAO

EM HIGIENE VETERINRIA E PROCESSAMENTO TECNOLGICO DE PRODUTOS DE ORIGEM ANIMAL

AVALIAO FSICO-QUMICA E BACTERIOLCICA DE PEIXES ANCHOVADOS

CECLIA RISCADO POMBO

NITERI/RJ 2007

CECLIA RISCADO POMBO

AVALIAO FSICO-QUMICA E BACTERIOLCICA DE PEIXES ANCHOVADOS

Dissertao apresentada ao Programa de PsGraduao em Medicina Veterinria da Universidade Federal Fluminense, como requisito parcial para obteno de Grau de Mestre. rea de Concentrao: Higiene Veterinria e Processamento Tecnolgico de Produtos de Origem Animal, Sub-rea de e Processamento Higiene Veterinria Tecnolgico de Pescado e Derivados.

Orientador: Prof. Dra. Eliane Teixeira Mrsico Co-orientador: Prof. Dr. Robson Maia Franco

NITERI/RJ 2007

CECLIA RISCADO POMBO

Dissertao apresentada ao Programa de PsGraduao em Medicina Veterinria da Universidade Federal Fluminense, como requisito parcial para obteno de Grau de Mestre. rea de Concentrao: Higiene Veterinria e Processamento Tecnolgico de Produtos de Origem Animal, Sub-rea de Higiene Veterinria e Processamento Tecnolgico de Pescado e Derivados. Aprovada em Novembro de 2007. BANCA EXAMINADORA

Prof. . Dra. Eliane Teixeira Mrsico Universidade Federal Fluminense UFF

Prof. Dr. Srgio Carmona de So Clemente Universidade Federal Fluminense - UFF

Prof. Dr. Pedro Paulo de Oliveira Silva Instituto de Tecnologia - Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro UFRRJ

Prof. MSc Geraldo Abreu de Oliveira Universidade Federal Fluminense - UFF

NITERI/RJ 2007

AGRADECIMENTOS minha famlia por sempre estar me apoiando e incentivando. Sempre se fizeram presentes nos momentos em que mais precisei. Ao Renato Chagas, meu companheiro, amigo, cmplice e por quem tenho grande admirao. Desculpe-me pelos momentos em que fui pssima companheira. minha orientadora, Eliane Teixeira Mrsico, pelo estmulo constante, apoio, carinho e ateno. Obrigada por todas as oportunidades que me foram oferecidas de crescer e amadurecer. Um beijo no corao. Ao meu co-orientador, Robson Maia Franco, pelo apoio constante e palavras de carinho e descontrao. Agradeo tambm pelos puxes de orelha que foram muito importantes para minha formao. Ao Sr. Gilberto DElia e a Dra Ana Maria Paschoal pelo apoio, fundamental, na realizao desta pesquisa. Aos companheiros de laboratrio e novos amigos, Nbia de Aguiar e Carlos Frederico, sem vocs toda esta caminhada teria sido muito mais difcil. Vocs foram, muitas vezes, meus braos e pernas. Faculdade de Veterinria da Universidade Federal Fluminense pelo apoio material e humano, CAPES e PROPP pelo apoio financeiro.

BIOGRAFIA Ceclia Riscado Pombo, filha de Ronaldo Pessanha Pombo e Virgnia Riscado Pombo, nascida em Niteri RJ, em 03 de abril de 1979, cursou o primeiro grau no Curso Marly Cury e o segundo grau no Colgio Salesianos Santa Rosa, ambos em Niteri. Ingressou na Faculdade de Biologia da Universidade Federal do Rio de Janeiro em maro de 1999, trancando sua matrcula para dar incio ao curso de Medicina Veterinria, sonho de criana, na Universidade Federal Fluminense em agosto do mesmo ano. Durante a graduao foi estagiria e bolsista PIBIC FENORTE, entre os anos de 2003 e 2005, exercendo suas atividades na rea de bacteriologia do Laboratrio de Biologia Animal da PESAGRO-RJ. Obteve o grau de Mdica Veterinria em janeiro de 2006, mesmo ano que ingressou no Programa de Ps-Graduao em Medicina Veterinria na Universidade Federal Fluminense.

SUMRIO LISTA DE ILUSTRAES LISTA DE TABELAS LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SMBOLOS RESUMO ABSTRACT 1 INTRODUO, p. 20 2 OBJETIVOS, p. 23 2.1 OBJETIVO GERAL, p. 23 2.2 OBJETIVOS ESPECFICOS, p. 23 3 REVISO BIBLIOGRFICA, p. 24 3.1 CONSERVAO DO PESCADO, p. 24 3.1.1 Sal, p. 25 3.2 SARDINHA VERDADEIRA (Sardinella bralisiensis), p. 28 3.3 TECNOLOGIA DE PRODUO DE SARDINHA ANCHOVADA, p. 30 3.3.1 Salga, p. 31 3.3.2 Processo de fermentao, p. 32 3.3.3 Indstria do anchovado, p. 33 3.4 HISTAMINA, p. 33 3.4.1 Mecanismos de formao, p. 35

3.4.2 Atuao da histamina e sintomatologia da intoxicao, p. 37 3.4.3 Padres nacionais e internacionais, p. 39 3.5 MICROBIOLOGIA DO PESCADO, p. 39 3.5.1 Microrganismos veiculados pelo pescado, p. 40 3.5.2 Bactrias halflicas e halotolerantes, p. 41 3.5.3 Bactrias acidolticas, p. 41 3.5.4 Salmonella spp., p. 42 3.5.5 Coliformes totais e fecais (Escherichia coli), p. 43 3.5.6 Staphylococcus coagulase positiva, p. 44 3.5.7 Enterococcus spp., p. 45 4 MATERIAL E MTODOS, p. 47 4.1AMOSTRAS OBTIDAS NO MERCADO VAREJISTA, p. 47 4.1.1 Anlises bacteriolgicas, p. 48 4.1.1.1 Preparo dos meios de cultura, p. 49 4.1.1.2 Enumerao de coliformes totais e fecal (Escherichia coli), p. 49 4.1.1.3 Enumerao de Enterococcus sp., p. 51 4.1.1.4 Contagem e Identificao de Staphylococcus coagulase positiva, p. 51 4.1.1.5 Isolamento e identificao de Salmonella sp., p. 52 4.1.2 Anlises fsico-qumicas, p. 54 4.1.2.1 Avaliao de histamina, p. 54 4.1.2.1.1 Mtodo de Cromatografia em Camada Delgada, p. 54 4.1.2.1.2 Mtodo Fluorimtrico, p. 56 4.1.2.2 Anlise da produo de Bases Volteis Totais, p.61 4.1.2.3 Percentual de cloretos, p. 63 4.1.2.4 Atividade de gua, p. 65 4.1.2.5 pH, p. 65 4.2. AMOSTRAS EXPERIMENTAIS, p. 65 4.2.1 Processamento usual da empresa, p. 66 4.2.2 Processamento com peixe inteiro, p. 68 4.2.3 Processamento com peixe eviscerado, p. 68 4.2.4 Delineamento experimental, p. 68 4.2.4.1 Matria-prima, p.69 4.2.4.1.1 Sal, p. 69

4.2.4.1.2 Sardinha fresca, p. 69 4.2.4.2 Produto em fermentao, p. 70 4.2.4.2.1 Anlises bacteriolgicas, p. 70 4.2.4.2.2 Anlises fsico-qumicas, p. 70 4.2.5 Tratamento estatstico dos resultados, p. 71 5 RESULTADOS E DISCUSSO, p. 72 5.1 AMOSTRAS OBTIDAS NO MERCADO VAREJISTA, p. 72 5.1.1 Anlises bacteriolgicas, p. 72 5.1.2 Anlises fsico-qumicas, p. 74 5.2 AMOSTRAS EXPERIMENTAIS, p. 76 5.2.1 Matrias-primas, p. 77 5.2.2 Processamentos tecnolgicos A, B e C, p. 77 5.2.2.1 Resultados das anlises bacteriolgicas, p. 77 5.2.2.2 Resultados das anlises fsico-qumicas, p. 80 6 CONCLUSES E CONSIDERAES, p. 87 7 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS, p. 88 8 APNDICES, p. 96 8.1 QUADRO DE COLETA DE AMOSTRAS, p. 96 8.2 FICHA DE COLETA DE DADOS DA MATRIA PRIMA, p. 98 8.3 FICHA DE COLETA DE DADOS DAS AMOSTRAS EM FERMENTAO, p. 99 9 ANEXOS, p. 100 9.1 FLUXOGRAMA DE PROCESSAMENTO, p. 100 9.1.1 Fluxograma do processamento usual da empresa (A), p. 101 9.1.2 Fluxograma do processamento com fermentao do peixe inteiro (B), p. 102 9.1.3 Fluxograma do processamento com fermentao do peixe eviscerado (C), p. 103

LISTA DE ILUSTRAES

Fig 1 Quadro 1

Representao grfica do Processo de produo do sal, p 27. Composio do sal de acordo com as especificaes do sal tipo II da NBR 10888 de dezembro de 1989 (ABNT), p. 27

Quadro 2

Composio

qumica

de

fils

de

sardinha

(Sardinella

brasiliensis) in natura., p. 29 Fig 2 Figura esquemtica da formao de aminas biognicas a partir dos respectivos aminocidos precursores, p. 34 Fig 3 Esquema ilustrativo da detoxificao da histamina e seus respectivos metablitos, p. 37 Fig 4 Diferentes embalagens de peixes anchovados encontradas no mercado varejista, p. 48 Fig 5 (A e B) Microtubos tipo eppendorf contendo os meios de cultura Fluorocult (A) e Chromocult (B), agrupados por amostras, p. 50 Fig 6 Tubo de ensaio contendo caldo Salmocyst suplemento antes de semeado (A) e aps a adio de 10 ml do caldo Salmocyst base (B), p. 52 Fig 7 (A, B, C e D) Crescimento bacteriano obtido no meio de Rambach a partir

de repique realizado do caldo Salmocyst suplemento onde, (A) apresenta crescimento suspeito de Citrobacter spp., (B e D) apresentam crescimento suspeito de Escherichia. spp e Klebsiella spp. e (C) apresenta crescimento suspeito de Proteus spp., p. 53 Fig 8 Placa de slica (Sigma ) aps revelao com soluo de ninhidrina a 0,3%. Destaque para a presena de histamina em todas a 5 amostras de sardinha anchovada analisadas, p. 56 Fig 9 Fluormetro (SequoiaTurner Modelo 450) registrando a leitura de uma das amostras analisadas, p. 57 Fig 10 (A, B e C) Preparao da coluna de filtrao, colocando-se primeiro o papel de filtro (Whaltman n 1) ao fundo da coluna (A), seguindo-se da adio de pequena quantidade de l de vidro (B) posteriormente adicionando a resina de troca inica (Dowex ) previamente convertida a forma alcalina (C), p. 58 Fig 11 Plano cartesiano contendo a Curva Padro da quantificao de histamina utilizada no mtodo Fluorimtrico, p. 61 Fig 12 (A, B e C) Titulometria de neutralizao das bases presentes no

compartimento interno da placa de microdifuso de Conway (A) onde a adio de soluo de cido clordrico 0,1 N, com auxlio de microbureta, vai alterando a cor do contedo (B) at completa viragem do mesmo (C), p. 62 Fig 13 Barricas contendo as sardinhas no perodo de fermentao do produto, p. 66 Fig 14 (A, B e C) Salo com temperatura controlada onde realizada a fermentao do produto (A). Destaque para os sensores de aferio da temperatura (B e C), p. 67 Fig 15 Prensa utilizada para a retirada do excesso de salmoura, p. 67

Fig 16

Plano cartesiano contendo as retas estabelecidas pelos valores mdios da concentrao de histamina dos trs lotes de cada processamento tecnolgico trabalhado, p. 86

LISTA DE TABELAS

Tabela 1

Resultados referentes contagem de coliformes totais e fecal (NMP/g), Staphylococcus coagulase positivo (UFC/g), Salmonella spp. e Enterococcus spp. (NMP/g) em peixes anchovados provenientes do mercado interno e externo, p. 73

Tabela 2

Resultados obtidos nas anlises de Bases Volteis Totais - BVT (mg N/100g), histamina (mg / 100g), outras aminas biognicas, pH, Atividade de gua Aa e cloretos (%) em peixes anchovados provenientes do mercado interno e externo, p. 75

Tabela 3

Teor de Bases Volteis Totais (mg de N/100g) e histamina (mg/100g) por Cromatografia em Camada Delgada (CCD) e Fluorimetria (F) em amostras de sardinha (S. brasiliensis) utilizadas no processamento tecnolgico de anchovagem, p. 77

Tabela 4

Resultados das anlises bacteriolgicas realizadas nas amostras coletadas dos nove lotes acompanhados ao longo do perodo de 90 dias de fermentao do produto, p. 78

Tabela 5

Resultados das provas bioqumicas realizadas em colnias suspeitas de Staphylococcus spp. repicadas do meio de Baird

Parker para o Caldo BHI, p. 80

Tabela 6

Valores

mdios

de

N-BVT

(mg de

N/100 sardinha

g) (S.

obtidos

nos

processamentos

tecnolgicos

brasiliensis)

anchovada atravs do mtodo de microdifuso em placa de Conway, por 90 dias, p. 81

Tabela 7

Valores mdios de pH obtidos nos processamentos tecnolgicos de sardinha (S. brasiliensis) anchovada, por 90 dias, p. 82

Tabela 8

Valores mdios de Aa obtidos nos processamentos tecnolgicos de sardinha (S. brasiliensis) anchovada atravs do aparelho PawKit , por 90 dias, p. 83

Tabela 9

Valores mdios de cloreto (%) obtidos nos processamentos tecnolgicos de sardinha (S. brasiliensis) anchovada, por 90 dias, p. 83

Tabela 10

Ordenao mdia das concentraes de histamina (ppm) nos processamentos tecnolgicos A, B e C testados e seus respectivos valores mnimos e mximos, sendo a DMS = 4,58, p. 84

Tabela 11

Concentraes mdias de histamina (ppm) dos trs lotes de cada processamento tecnolgico estudado, ao longo do perodo de fermentao da sardinha (S. brasiliensis), p. 85

LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SMBOLOS B C a. C. Aa AOAC ATCC CE DAO FAO FDA G+ IBAMA LANARA M MAO N N-HMT NMP OTMA pH ppm marca registrada grau Baum grau Celsius antes de Cristo Atividade de gua Association of Official Analitical Chemists American Type Culture Collection Comunidade Europia Diamino Oxidase Food and Agricultura Organization Food and Drug Administration Gram positivo Instituto Brasileiro de Meio Ambiente Laboratrio Nacional de Referncia Animal Molaridade Mono Amino Oxidase Normalidade Histamina N-Metiltransferase Nmero Mais Provvel xido de Trimetilamina potencial Hidrogeninico parte por milho

RDC R.I.I.S.P.O.A.

Resoluo da Diretoria Colegiada Regulamento de Inspeo Industrial e Sanitria de Produtos de Origem Animal Rio de Janeiro rotaes por minuto Santa Catarina Unidade Formadora de Colnia micrograma microlitro

RJ rpm SC UFC g L

RESUMO A anchovagem do pescado consiste em um processo de fermentao na qual enzimas tissulares e microbianas agem sobre os hidratos de carbono e protenas. Existe uma dificuldade para a normatizao do produto pela falta de padres oficiais que regulamentem o processamento tecnolgico. Assim sendo, o objetivo deste estudo foi avaliar a qualidade de peixes anchovadas comercializados no mercado interno, atravs de parmetros fsico-qumicos e bacteriolgicos, alm de avaliar trs processamentos tecnolgicos distintos para compar-los. Foram realizadas a enumerao de Coliformes e Escherichia coli; de Enterococcus spp., contagem e identificao de Staphylococcus aureus e isolamento e identificao de Salmonella spp..Os parmetros fsico-qumicos avaliados foram a produo de Bases Volteis Totais (BVT), a determinao do pH e a quantificao de cloretos, a presena de aminas biognicas foi determinada pelo mtodo de Cromatografia em Camada Delgada (CCD) e a quantificao de histamina pelo mtodo fluorimtrico (AOAC, 2002). No produto disponvel no mercado varejista, os valores de pH variaram entre 5,08 e 5,73, de Atividade de gua (Aa) entre 0,75 e 0,70. O percentual de cloretos observado foi de 9,78 a 17,50. Bacteriologicamente, as amostras analisadas encontram-se dentro do padro oficial, usando como referncia a RDC n 12, em relao Salmonella spp. e coliformes termotolerantes. Duas amostras apresentaram maiores valores de Staphylococcus coagulase positivo. A enumerao de Enterococcus spp. no prevista pela legislao, entretanto os resultados sugerem uma relao entre a presena desta

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bactria e a produo de histamina. Ao avaliar os distintos processamentos tecnolgicos, percebeu-se uma diferena significativa (p<0,05) na produo de histamina entre os lotes acompanhados. Isolou-se Escherichia spp., Klebsiella spp, Proteus spp., Shiguella spp., Citrobacter spp. e Pseudomonas spp.. No entanto, no houve isolamento de coliforme termotolerantes e dos gneros Enterococcus e Salmonella. O percentual de cloreto variou entre 15,65 e 18,87 % no havendo diferena significativa entre os processamentos testados (p>0,05). As variveis Aa e pH apresentaram diferenas significativas entre os processamentos (p<0,05) e obtiveram valores entre 0,71 e 0,75, e 5,54 e 5,93, respectivamente. Os valores de BVT variaram entre 15,1 e 62,1 mgN/100g, apresentando diferenas significativas entre os processamentos (p<0,05). Concluiu-se que h produo de histamina em concentraes preocupantes para a sade coletiva. Nas condies deste estudo, o processamento tecnolgico usual da empresa, mostrou ser o mais adequado para o processamento do produto pelos parmetros fisico-qumicos analisados apesar de haver produo de histamina em nveis que podero, em alguns casos, produzir sintomatologia de intoxicao em consumidores. No entanto, mais estudos com relao aos pontos crticos de controle so necessrios. Palavras chaves: Anchovado; Aminas biognicas; histamina, qualidade, padres bacteriolgicos.

ABSTRACT The process to obtain fish anchovies consist on the fermentation of the product in which microbiological and tissue enzimes act over proteins. There is a difficulty to standarlizate the product because of the nonexistence of official padrons to regulamentate the technological process. The aim of this study was avaliate the quality of fish anchovies comercialized through phisycal-chemical and bacteriological parameters and compare three differents technological process. The bacteriological analisys made were: colifornms, Enterococcus spp. and Escherichia coli enumerations, count and identification of Staphylococcus aureus and isolation ando identification of Salmonella spp.. The physical-chemical paremeter avaliated were: production of Total Volatile Base (N-TVB), determination of pH and salt (NaCl) quantification (%). The presence of biogenic amines were determinated by Thin Layer Cromatography (TLC) and the quantification of histamine was made by the fluorimetric method. In the comercialized products the values of pH were between 5,08 and 5,73 and the values of Activity of water (Aw) were between 0,70 and 0,75. The salt concentration (%) observed was beteween 9,78 and 17,50 %. Bacteriological results were saticfactory, using as reference the RDC n12 legislation (BRASIL, 2001) to avaliatethe presence of Salmonella spp., E. coli and coliforms. Two samples had counts of S. aureus above the value stablished by that lagislation. The enumeration of Enterococcus spp. isnt preview by RDC n 12 and the results obtained suggests a relation between the presence of this bacteria and the formation of histamine. When the different thecnological process were

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avaliated was stablished a significant difference in the formation of histamine (p<0,05). Eschericia spp., Klebsiella spp., Proteus spp., Shiguella spp., Citrobacter spp. and Pseudomonas spp. were isolated., but there was no isolation of Salmonella spp. and Enterococcus spp. The salt percentual values vary between 15,65 and 18,87 % and no significant difference was stablished (p> 0,05). Aw and pH data have shown significant differences between the three processes (p<0,05) and obtain values between 0,71 and 0,75, and 5,54 and 5,93 respectively. The values of N- TVB vary between 15,1 and 62,1 mgN/100g. In conclusion, the formation of histamine in this product occours in concern concentrations for public health. The usual process used by the industry present better resoults acording to the physical-chemical analises even though had histamine formation that might produce sintimatology of intoxication on consumer. However, more studies are necessary. Keywords: Anchovy, biogenic amines, histamine, quality, bacteriological standards

1 INTRODUO Desde pocas muito remotas o homem busca formas de conservar seu alimento. Com a fumaa produzida pelo fogo, aprendeu a defumar e, com o sol e o ar, aprendeu a secar sua comida. Tambm aprendeu a salgar e secar carnes e pescados (acreditase que a primeira salga foi realizada enterrando-se o alimento na praia, onde a gua do mar realizava a cura). Alguns registros mostram que os fencios, os egpcios e os gregos secavam, defumavam e salgavam seus peixes para transport-los na regio, que bastante quente. Os romanos tambm consumiam carnes salgadas e caas provenientes de distantes regies, conservadas no mel. Tambm na civilizao oriental, 3000 anos antes de Cristo (a.C.) os chineses j utilizavam o sal para conservar os peixes acumulados em pocas de fartura e, 1000 anos depois, j haviam desenvolvido tecnologia para a conservao de peixes utilizando gelo. Na salga, o produto final pode ser o pescado inteiro, em forma de pasta ou em forma de molhos. Dentro destas trs categorias esto englobados produtos comerciais caractersticos de cada regio de origem. Quando o produto final mantm a forma original do pescado o processo denominado anchovagem. A anchovagem do pescado consiste, fundamentalmente, num processo de cura prolongada, no qual as enzimas tissulares e microbianas compartilham suas aes sobre os diversos subcomponentes. A ao de algumas enzimas autolticas e de microrganismos capazes de produzir substncias bloqueadoras de decomposio atua sobre os hidratos de carbono e protenas, conferindo aos alimentos aspecto e aroma especiais.

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Os peixes fermentados podem ser considerados uma semiconserva pelo fato de no sofrerem nenhum tratamento trmico ao longo do processamento tecnolgico e antes de serem consumidos. Na regio sudeste da sia (Vietn, Camboja, Tailndia e Indonsia) os produtos mais populares so os bagoongs (pastas), o nuoc-man (molho), o prahoc, o trassi (pasta de camaro da Indonsia), o man-pla e o budu. Alguns destes produtos so consumidos em larga escala sendo, praticamente, a nica fonte de protena de boa qualidade, obtidos com tecnologia de baixo investimento. Na Frana, Alemanha e pases escandinavos, so comercializados produtos com flavour desenvolvido em fermentao por perodo longo e comercializado em embalagens pequenas e de alto custo. Os anchovados autnticos so feitos a partir de engrauldios (Engraulis encrasicholus, Engraulis ringens, Engraulis mordax). Porm, a sardinha (Sardinella brasiliensis) pode ser utilizada como matria prima, pois possui os componentes biolgicos necessrios para o desenvolvimento do aroma, do sabor, da cor e da textura prprios dos anchovados. A matria prima desta tecnologia pode ser veiculadora de uma grande variedade de microrganismos patognicos, a maior parte deles em funo da contaminao ambiental. Outra fonte de contaminao importante o manejo do pescado, desde o momento da captura, ainda nos barcos pesqueiros, at sua destinao final, aps passar por inmeras fases de processamento e transporte. Na indstria do pescado, alm de microrganismos patognicos, importante lembrar que a produo de histamina um importante ponto que deve ser avaliado, pelo fato de ser termoestvel e ter sua ao potencializada pela presena de outras aminas biognicas. A histamina produzida pela descarboxilao da histidina e est envolvida como mediadora primria de reaes alrgicas, sendo txica em alta concentrao. Peixes da famlia Scombridae, como a cavala, cavalinha e os atuns, e tambm da famlia Clupeidae, como a sardinha, so freqentemente envolvidos em surtos de intoxicao histamnica. O controle do alto nvel de histamina presente nestas espcies deve ser monitorizado a fim de prevenir intoxicaes no consumidor.

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Observando todos os fatores acima expostos e devido a presses do mercado para a produo de alimentos mais seguros e de baixo custo, as empresas da rea de alimentos, assim como as de outras reas, tm reconhecido s limitaes dos programas tradicionais de controle de qualidade e esto implementando novos sistemas de gerenciamento que permitam produzir alimentos efetivamente seguros e simultaneamente de melhor qualidade e com menor custo. No Brasil, o pescado fermentado ainda no se tornou um hbito de consumo significativo e, pela falta de padres oficiais que regulamente seu processamento tecnolgico, existe uma dificuldade para a classificao ou normatizao do produto. A legislao em que algumas das indstrias nacionais se baseiam para a elaborao de sardinhas anchovadas o Regulamento C.E. n 2073/2005 de 15 de novembro de 2005, relativo a critrios microbiolgicos aplicveis aos gneros alimentcios.

2 OBJETIVOS 2.1 OBJETIVO GERAL: Avaliar a qualidade de peixes anchovados comercializados no mercado interno, de origem nacional e internacional, alm de avaliar o processamento tecnolgico da anchovagem. 2.2 OBJETIVOS ESPECFICOS: - Avaliar a produo de Bases Volteis Totais, pH, Atividade de gua, produo de aminas biognicas (histamina, putrescina e cadaverina) e teor de cloreto de sdio. - Avaliar a presena de Coliformes fecais e totais, Staphylococcus coagulase positiva, Salmonella spp. e Enterococcus spp. - Comparar trs processamentos tecnolgicos: o utilizado pela indstria e outras duas variaes.

3 REVISO BIBLIOGRFICA 3.1 CONSERVAO DO PESCADO A conservao tem por objetivo preservar os alimentos ao longo do tempo, evitando a deteriorao para uso futuro. importante ressaltar que o alimento a ser conservado precisa chegar esta etapa com boa qualidade, uma vez que o processo de conservao no reverte o quadro de deteriorao, apenas o retarda (CAMARGO, 2007). A conservao de alimentos surgiu com a civilizao. Entretanto, todos os processos utilizados at o final do sculo XVIII foram desenvolvidos de forma totalmente emprica, sem nenhum conhecimento ou embasamento terico e, normalmente, utilizando ou simulando processos existentes na natureza (secagem, defumao, congelamento), Nessa poca, j se sabia que as frutas e algumas hortalias podiam ser conservadas em acar e certas hortalias toleravam o vinagre. Porm, todos esses procedimentos conservavam os alimentos por pouco tempo e com escassas garantias (BRANDO, 2007). Os ndios brasileiros, muito antes do descobrimento, costumavam assar as carnes, secar os peixes e depois armazen-los em caldo grosso de pimenta. A conservao por imerso na gordura tambm era utilizada pelos nossos ndios que deixavam os animais imersos em sua prpria gordura. Os Bandeirantes salgavam as caas para poder transport-las durante suas expedies (GOURMAND, 2007). A deteriorao do pescado um fenmeno decorrente da atividade metablica de microrganismos e de processos bioqumicos indesejveis. Por estas razes, para a preservao, so utilizados processos fsicos de controle, como desidratao,

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armazenamento a baixas temperaturas (refrigerao, congelamento) e processos trmicos (pasteurizao e esterilizao) (OGAWA; MAIA, 1999). Uma das formas de conservao do pescado a elaborao de semiconservas que, segundo Huss (1997), so produtos caracterizados por possurem teor de sal maior que 6% de NaCl (p/p) na fase aquosa ou pH menor que 5,0. O Regulamento de Inspeo Industrial e Sanitria de Produtos de Origem Animal R.I.I.S.P.O.A. (BRASIL, 1997a), no possui nenhuma definio e/ou conceituao referentes as semiconservas. O artigo 425 do Decreto n 38.757, do Governo do Estado do Rio de Janeiro, alnea I, define o pescado anchovado como a semiconserva de pescado obtida a partir da cura prolongada do pescado pelo sal (cloreto de sdio), com ou sem aditivos, substncias aromticas e vegetais, envasada em leos comestveis (GOVERNO DO ESTADO DO RIO DE JANEIRO, 2006). 3.1.1 Sal difcil localizar o incio do consumo e da utilizao do sal pelo Homem. Os primeiros testemunhos da sua utilizao datam de 2000 anos a.C., sendo transportado como mercadoria pelos fencios, empregue na salga do peixe consumido pelos troianos, usado na mumificao dos corpos no Egito e exigido pelo imperador chins Yu como tributo aos seus sditos (REIS; CHAVES, 2007). No entanto, bastante provvel que o incio da extrao deste produto, pela criao de permetros fechados para reteno da gua do mar, remonte a perodos prhistricos, pois o sal aparece relacionado com todas as manifestaes da vida humana. Foi a causa da riqueza de muitas civilizaes a ponto de ter assumido, por vezes, caractersticas monetrias (ibid). O sal conhecido, tecnicamente, como cloreto de sdio e sua frmula qumica o NaCl. Embora a maioria das pessoas esteja familiarizada com os vrios usos do sal na culinria, h o desconhecimento de suas outras aplicaes, como a manufatura de papel e a produo de sabo e detergentes. No norte dos Estados Unidos da Amrica e na Europa, grandes quantidades de sal so utilizadas para limpar as rodovias do gelo durante o inverno (WIKIPEDIA, 2007).

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Outra aplicao importante do sal feita na conservao de alimentos desde a antiguidade, quando foi utilizada pela primeira vez na preservao da carne, baseandose no fato do sal exercer o efeito de desidratao, tanto no alimento, como nos microrganismos (JAY, 2005). Pensando na conservao do pescado, observou-se que a composio qumica do sal, o grau de pureza e a constituio microbiolgica so elementos fundamentais para a obteno de um produto de alta qualidade (CARMO, 1991). O sal de alta pureza o que tem teor de cloreto de sdio (NaCl) superior a 96,5%, com menos de 3% de sais insolveis, tendo como impurezas o cloreto de clcio (CaCl2) e o cloreto de magnsio (MgCl2) no sal proveniente de salinas (OETTERER, 2005). A granulao do sal tambm um fator de grande importncia. Se esta for muito fina poder penetrar excessivamente na parte superficial da carne, havendo, como conseqncia, rpida perda de gua nos tecidos superficiais. Se for muito grossa, pode deixar escoriaes na superfcie do pescado (BEIRO, 1976; OETTERER, 2005). Esse ingrediente possui quatro denominaes conhecidas que o classifica, quanto a suas caractersticas granulomtricas em: sal grosso, sal peneirado, sal triturado e sal refinado (PARDI, 2001). O processo de produo do sal inicia em um brao de mar, onde a gua salgada captada e levada para o primeiro evaporador. Deste evaporador esta transferida para os demais evaporadores por gravidade, onde a evaporao natural provocada pelo sol e vento aumenta gradativamente a concentrao dos sais presentes na gua, at o ponto em que a salmoura est quase saturada de cloreto de sdio. Aps essa fase, a gua transferida para os cristalizadores, onde, aps a precipitao do sal, a gua drenada e o sal entra no processo de colheita (SALINA DIAMANTE BRANCO, 2007). Este sal cristalizado colhido submetido a uma lavagem com salmoura saturada para a retirada de impurezas. Aps a lavagem o sal transferido para o ptio de estoque. A partir da secagem, o sal est pronto para o embarque, como mostra a Figura 1 (SALINA DIAMANTE BRANCO, 2007).

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Fonte: http://www.salbrasil.com.br/produtos.php

Figura 1 Representao grfica do Processo de produo do sal No quadro 1 pode-se observar a composio do sal, de acordo com as especificaes do sal tipo II da NBR 10888 de Dezembro de 1989 (Cloreto de Sdio Sal para Alimentao Humana) (ibid). Quadro 1 Composio do sal de acordo com as especificaes do sal tipo II da NBR 10888 de Dezembro de 1989 (ABNT). Parmetro Cloreto de Sdio (Base Seca) Insolveis em H2O Umidade (*) Clcio Magnsio Sulfato Unidade % NaCl % m/m % H2O % Ca % Mg % SO4 Mnimo 99,00 Mximo 0,1 2,5 0,1 0,03 0,28

Fonte: http://www.salbrasil.com.br/prod-grossoensacado-int.htm

Para que a utilizao do sal seja eficiente como matria prima, as bactrias putrefativas no devem estar presentes. No entanto, a presena de bactrias halfilas produtoras de cido ltico podem ser favorveis produo (OETTERER; PERUJO, 2003). Oetterer (2005) ainda afirma que as bactrias haloflicas aerbicas so contaminantes naturais do sal, sendo a temperatura tima de crescimento entre 40 C e 50 C e de inibio abaixo de 7 C. O sal portador de uma microbiota contaminante, halfila ou haloresistente considervel, salientando-se entre estes microrganismos as sarcinas, bactrias halfilas

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cromognicas causadoras da colorao vermelha indesejvel em produtos proticos salgados. Nem todos os microrganismos halfilos so prejudiciais aos produtos salgados, verificando-se entre estes a ocorrncia de algumas espcies que contribuem para a fermentao desses produtos. Entre as espcies de interesse da indstria da salga, citam-se algumas pertencentes aos gneros Halobacterium e Micrococus. As primeiras so halfilos obrigatrios, crescendo em meios com 16 a 32% de cloreto de sdio, enquanto as Micrococceas crescem em meios contendo 5 a 15% deste sal (PINTO, 2007). 3.2. SARDINHA VERDADEIRA (Sardinella brasiliensis) A sardinha verdadeira pertence famlia Clupeidae e faz parte de um conjunto de espcies pelgicas (do latim pelagos, que significa o "mar aberto"). So peixes que vivem em cardumes, nadando livremente na coluna de gua, estando adaptados tanto gua fria como gua quente. So pequenos e podem medir entre 11 e 20 cm de cumprimento (SIKORSKI, 1990). A sardinha verdadeira (Sardinella brasiliensis) o mais tradicional recurso pesqueiro da regio sudeste-sul do Brasil. uma espcie de ocorrncia costeira e de fcil captura, sendo pescada entre o Cabo de So Tom (22S) /RJ e o Cabo de Santa Marta Grande (28S) /SC, entre 10 e 100 m de profundidade. A espcie exibe grande sensibilidade s variaes ambientais, sendo que esta situao se agrava quando associada ao intensivo esforo de pesca, o que pode acarretar numa grande reduo do estoque (IBAMA, 2007a). A sardinha foi capturada acima dos nveis aceitveis de sustentabilidade do recurso, sendo sobreexplotada, gerando intensa explorao comercial o que levou a reduo da biomassa (nmero de peixes) e, conseqentemente, comprometendo o potencial de desova. Os estoques pesqueiros de sardinha sofreram queda substancial e, para recuperar esta biomassa, em julho de 2004, foi implementado o defeso de recrutamento objetivando aumentar a populao reprodutiva ou biomassa desovante (ibid).

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Para o ano de 2007 foram definidos trs perodos de defeso: de 17 de novembro de 2006 a 24 de fevereiro de 2007, 21 de junho a 09 de agosto de 2007 e 17 de novembro de 2007 a 24 de fevereiro de 2008 (IBAMA, 2007b). Existem fatores que interferem na composio qumica das espcies. Entre estes fatores, citam-se a idade, estao do ano, sexo, desenvolvimento gonadal e alimentao, os quais interferem nos teores de gua, lipdeos, protena e minerais. Assim sendo, o pescado pode ser classificado por grupos, de acordo com a variao destes componentes (CONTRERAS-GUZMN, 1994). A principal classificao utilizada, visto que o teor de gordura influi de forma decisiva na reproduo, na vida til do produto e na aceitao geral pelos consumidores, : gordo (mnimo de 10%), semi-gordo (entre 2,5 e 10%) e magro (mximo 2,5 %) (JACQUOT1, 1961 apud CONTRERAS-GUZMN, 1994). No quadro 2, possvel observar a composio centesimal de fils de sardinha, de acordo como trabalho realizado por Santo et al. (2003), quando avaliou a atividade bacteriognica do Lactobacillus sakei na fermentao da sardinha brasileira (Sardinella brasiliensis). Quadro 2 Composio qumica de fils de sardinha (Sardinella brasiliensis) in natura. COMPOSIO CENTESIMAL (g/100g) A Umidade Lipdios Protenas Cinzas 72,9 2,0 19,7 2,0 B 73,5 3,0 19,6 1,9 C 13,7 4,2 17,7 1,9 X 73,4 3,1 19,0 1,9 Dp (+/-) 0,39 0,89 0,88 0,01

Fonte: SANTO et al., 2003. A, B, C = Lotes; X = mdias; Dp = Desvio padro.

A estao do ano exerce grande influncia na composio centesimal dos peixes pelgicos, pois estes tm seu teor de gordura aumentado ou diminudo, de acordo com a disponibilidade sazonal de alimentos. A fertilidade do mar ocorre nas reas de

JACQUOT, R. Organic constituents of fish and other aquatic foods. In: Fish and Food. V. 1. Ed. G. Borgsrom, Academy Press, New York, USA. p. 146-192, 1961

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ressurgncia e quando a luz diurna maior. Portanto, na regio subtropical h maior abundncia de peixes pelgicos na primavera e vero (CONTRERAS-GUZMN, 1994). O msculo esqueltico do pescado rico em protenas e lipdios. As protenas so de alto valor nutritivo com um balanceamento de aminocidos essenciais comparveis protena padro da FAO (Food and Agricultura Organization). Os lipdios, alm de fonte energtica, so ricos em cidos graxos polinsaturados da srie mega 3, especialmente o EPA (cido eicosapentaenico) e o DHA (cido docosacahexaenico), que apresentam efeitos redutores sobre os teores de triglicerdeos e colesterol sanguneo (OGAWA; MAIA, 1999). Em relao aos aminocidos presentes na musculatura do pescado, a histidina tem destaque em funo da media concentrao deste aminocido livre na musculatura e, em funo da sua descarboxilao que gera a histamina, amina biognica agente de intoxicao alimentar. As espcies pelgicas, de carne escura e sabor intenso, como o caso da sardinha, e possuem valores mdios de histidina livre na musculatura que variam entre 100 500 mg% (CONTRERAS-GUZMN, 1994). 3.3 TECNOLOGIA DE PRODUO DE SARDINHA ANCHOVADA A matria prima para os anchovados autnticos so os engraulidios, no entanto, tambm podem ser elaborados peixes anchovados a partir de sardinhas (Sardinella brasiliensis, Sardinella aurita), manjubas (Anchoviella sp.), lambaris (Astyanax fasciatus), cavalas (Scombrer japonicus), peixes-agulha (Belone belone), entre outros. Para tanto, so feitas adaptaes na tecnologia de processamento (BEIRO, 1976; OETTERER, 2005). O princpio desta tecnologia consiste em um processo misto onde h um aumento da presso osmtica do meio fazendo uso de sal e mantendo o sistema em anaerobiose. Conseqentemente, ocorre diminuio da atividade de gua, controlando o crescimento microbiano e selecionando o tipo de organismo que exercer a fermentao do produto. A anaerobiose freia os processos bioqumicos fermentativos que deterioram o pescado (OETTERER, 2005).

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Segundo Sikorski (1990), o cloreto de sdio um dos componentes mais importantes, tanto para a determinao do sabor como para os processos qumicos da fermentao ocorrer adequadamente. No item 4.2.1 do presente trabalho est descrito o fluxograma de anchovamento da sardinha sendo quatro os Pontos Crticos de Controle (PCC) podendo ser observados no Anexo 9.1.1. O primeiro na recepo do pescado, onde so observadas a presena de sardinhas deterioradas e a temperatura da matria-prima, a qual deve estar menor a 4,4 C (FDA, 2007a). O segundo PCC no perodo da fermentao onde se faz o controle da concentrao de sal. Dentro deste PCC, esto inclusos o no reaproveitamento das salmouras e a higienizao adequada das barricas. O terceiro PCC no momento da prensagem, onde se tem o cuidado de retirar o excesso da salmoura, adequadamente, atravs do controle da presso e do tempo. O ltimo PCC na fase de embalagem do produto. Neste ponto, feita a aferio das balanas para que no ocorra erro na pesagem do produto. O aparelho de vcuo aferido para que no ocorram problemas com a vedao das embalagens. E as embalagens prontas so inspecionadas para averiguar se a vedao esta adequada e/ou existem problemas na embalagem. 3.3.1 Salga A salga de pescados um dos mais antigos meios de conservao de alimentos. Seu princpio est baseado no emprego do sal que, em concentrao adequada, diminui ou at mesmo impede a decomposio do alimento, quer seja pela autlise, quer seja pela ao de microorganismos (SETOR 1, 2007). Na salga a ao do sal dupla, desidrata o pescado por diferena de presso osmtica entre o meio externo e interno, e penetra na carne, baixando a atividade de gua. O tempo em que os pescados so mantidos em contato com o sal ou salmoura conhecido como tempo de salga ou de cura. Muitas vezes o processo de salga somente uma operao preliminar dos processos de defumao, secagem ou marinagem, visando nesses casos conferir certo sabor ao produto final (ibid).

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3.3.2 Processo de fermentao A fermentao do pescado se inicia atravs da ao de bactrias, inclusive as intestinais. Alteraes enzimticas e qumicas (como a oxidao das gorduras) ocorrem mesmo em temperatura de refrigerao. Aps utilizarem os compostos solveis como a histidina livre, a uria e o xido de trimetilamina, as bactrias degradam as protenas (OETTERER, 1999). A hidrlise da protena tambm induzida por enzimas proteolticas tissulares do peixe, alm das enzimas proteolticas produzidas por bactrias haloflicas (DISSARAPHONG et al., 2007). Na fermentao ocorre a converso das protenas insolveis do pescado em formas solveis. Neste processo, ocorre a degradao gradual da actomiosina em peptdeos e aminocidos, que so solveis em baixa concentrao inica. Esses compostos nitrogenados solveis constituem uma frao precipitada por cido tricloractico e uma frao no coagulvel. As protenas degradadas da carne do pescado se difundem na salmoura, onde ocorre o aumento de nitrognio amnico e de nitrognio no protico no pescado, enquanto fraes de nitrognio protico passam para a salmoura. Ao final do processo de fermentao, esto presentes, entre outros, os aminocidos histidina, alanina, leucina, fenilanina, prolina, e cido glutmico (OETTERER, 2005). Bioquimicamente, a fermentao o processo metablico no qual carboidratos e compostos relacionados so parcialmente oxidados, resultando na liberao de energia, sem aceptores de eltrons externos. Os aceptores finais de eltrons, no produto fermentado, so compostos orgnicos produzidos da quebra de carboidratos. Conseqentemente, ocorre a oxidao incompleta do composto original, resultando na liberao de pequena quantidade de energia ao longo do processo (JAY, 2005). O flavour caracterstico do produto obtido de uma mistura basicamente constituda de aminas, cidos orgnicos e aminocidos. As aminas aparecem no produto final, pois alguns microrganismos possuem a capacidade de descarboxilar os aminocidos. A amnia est presente durante todo o processo, com pequena variao e, juntamente com a trimetilamina, constitui o nitrognio voltil total. Alm do mais, a relao entre a concentrao de aminas e de aminocidos usada como um indicador

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de qualidade em fermentados lquidos. Uma alta taxa de nitrognio voltil total indica deteriorao de origem bacteriana e um produto de m qualidade nutricional e sensorial. O aroma amoniacal excessivo no desejvel e, a presena de componentes sulfurados como as metilmercaptanas ou o cido sulfdrico, se presentes, mesmo em pequenas quantidades, promovem um aroma caracterstico do pescado fermentado (OETTERER, 2005). 3.3.3 Indstria do anchovado No Brasil, a produo de anchovados, utilizando como matria-prima a sardinha (Sardinella brasiliensis), ocorre em escala industrial pequena. um produto semelhante ao produzido em Portugal. O tempo de produo longo devido a fermentao e a cura necessrias para o produto atingir as caractersticas sensoriais desejveis (OETTERER; PERUJO, 2003). Geralmente o consumo restrito, pois um produto vendido como delicatessen, sendo pouco conhecido pela populao, a no ser os descendentes de europeus e orientais que ainda mantm hbitos dos pases de origem. O produto em questo mais conhecido como aliche, utilizados na elaborao de pizzas e produtos correlatos (ibid). 3.4 HISTAMINA A histamina uma amina biognica formada pela descarboxilao da histidina, aminocido essencial para animais em crescimento, que est presente em concentraes medianas a altas em peixes pelgicos (CONTRERAS-GUZMN, 1994). As aminas biognicas se formam, nos alimentos, pela descarboxilao microbiana de seus aminocidos precursores ou se formam, nos seres vivos, como conseqncia dos processos metablicos celulares normais (SANCHES CASCADO, 2005). So compostos orgnicos nitrogenados de carter bsico presentes em animais, plantas e microrganismos (BRINK2, 1990 apud SANCHES CASCADO, 2005).

BRINK, B.; DAMIRIK, C.; JOOSTEN, H. M. L. J.; HUIS INT VELD, J. H. J. Occurrence and formation of biologically active amines in foods. International Journal of Food Microbiology. v.11. p.73-84, 1990.
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Marint-Font et al. (1995) classificaram as aminas biognicas mais freqentes nos alimentos, de acordo com a estrutura qumica, como: aminas aromticas (histamina, -feniletilamina, tiramina, octopamina, dopamina, serotonina e triptamina), diaminas alifticas (putrescina e cadaverina) e poliaminas alifticas (agmatina, espermina e espermidina). Na caracterizao fsica feita por ContrerasGuzman (1994), a histamina possui peso molecular 111,2, a tiramina 137,18, a triptamina 160,2, a putrescina 88,15, a cadaverina 102,18, a agmatina 130,2, a espermina 202,35 e a espermidina 145,25. Na Figura 2, observa-se o esquema simplificado das rotas biossntticas, permitindo verificar os aminocidos precursores das diferentes aminas biognicas. A histamina um componente natural e fisiolgico dos mamferos, estando presente nos mastcitos e basfilos. Seus efeitos biolgicos so observados quando liberada em grande concentrao no organismo em conseqncia, principalmente, de reaes alrgicas (LEHANE; OLLEY, 2000; SHALABY, 1996).

Fonte: Sanches Cascado, 2005.

Figura 2 Figura esquemtica da formao de aminas biognicas a partir dos respectivos aminocidos precursores. Normalmente, a histamina est presente no corpo humano em baixos nveis de concentrao e tambm encontrada em alimentos como peixes, queijos, carnes, vinhos e produtos fermentados (ROSSANO et al., 2006). Existe grande preocupao com a presena da histamina nos alimentos devido as suas implicaes toxicolgicas para a sade humana quando ingeridas em

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quantidades que possam causar reaes adversas. Estas quantidades variam de acordo com a sensibilidade de cada indivduo bem como a presena de outras aminas biognicas que podem potencializar a ao intoxicante da histamina (LEHANE; OLLEY, 2000). Uma caracterstica importante a ser destacada em relao a histamina a sua capacidade de ser termoestvel (HUSS, 1997). 3.4.1 Mecanismos de formao Aminocidos livres no msculo e produzidos pela decomposio de protenas podem sofrer descarboxilao e desaminao por ao de enzimas bacterianas. A histidina descarboxilase age sobre o aminocido histidina transformando-a em histamina (HUSS, 1997; OGAWA; MAIA, 1999; LEHANE; OLLEY, 2000). As principais bactrias responsveis pela formao de histamina pertencem famlia Enterobacteriaceae (HALSZ et al., 1994; LEHANE; OLLEY, 2000). No entanto, outras bactrias tambm produzem enzimas descarboxilases, podendo ser citadas algumas bactrias cido lticas (SUZZI; GARDINI, 2003) como o Enterococcus spp. (GARDINI et al., 2001; GIRAFFA, 2002) e o Tetragenococcus muriaticus (KUDA et al., 2006; SATOMI et al., 1997). A histidina descarboxilase est amplamente distribuda nos gneros Escherichia, Salmonella, Clostridium, Bacillus e Lactobacillus (HALSZ et al., 1994). Segundo Nven et al. (1981), a responsabilidade das bactrias que contem a histidina descarboxilase pode ser difcil de detectar, pois estas fazem parte da minoria das microbiota do pescado fresco, alm de serem facilmente destrudas subseqentes ao congelamento. Contudo, existem alguns fatores que interferem na formao de histamina e de outras aminas biognicas como, a disponibilidade de substrato, o pH, a Atividade de gua, a concentrao de sal e a temperatura considerados fatores limitantes (BOVERCID et al., 2001; GKULU, 2003). O de pH um fator importante, pois interfere na descarboxilao dos aminocidos, que ocorre em maior concentrao em meio cido. O valor timo de pH est entre 4,0 e 5,5, pois nesta faixa a bactria estimulada a produzir mais descarboxilases como forma de defesa ao meio cido (HALSZ et al., 1994). Alm do

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mais, alguns microrganismos, como as bactrias cido lticas, so favorecidas pelo meio cido por promoverem inibio da microbiota acompanhante (FRANCO; LANDGRAF, 1996). A alta concentrao de cloreto de sdio (NaCl) influencia o metabolismo bacteriano e gera progressiva alterao na membrana onde esto localizadas as enzimas de descarboxilao. Concentraes de 3,5 a 5,5% de NaCl podem inibir a formao de histamina (HENRY e KOEHLER3, 1986 apud SUZZI; GARDINI, 2003). A temperatura influencia de diferentes maneiras na formao de aminas biognicas. So citados ainda como fatores intervenientes a curva de crescimento, o metabolismo e a atividade enzimtica bacteriana. Somado a isto, a temperatura tambm influi na atividade proteoltica e de descarboxilao bacteriana, alm da interrelao da populao microbiana. Temperaturas elevadas favorecem a protelise e a reao de descarboxilao, resultando no aumento da concentrao de aminas (SUZZI; GARDINI, 2003). No entanto, Huss (1997) relatou que, para os sistemas enzimticos, a temperatura tem dois papis que podem exercer efeitos opostos na velocidade da reao enzimtica. Ao mesmo tempo em que o aumento da temperatura acelera a velocidade da reao enzimtica, este aumento tambm pode gerar a desnaturao da enzima, diminuindo a reao. A Atividade de gua (Aa) influi na formao de aminas biognicas em funo da diminuio do metabolismo bacteriano. As bactrias necessitam de gua de forma disponvel para seu metabolismo e multiplicao (FRANCO; LANDGRAF, 1996). A adio de sais provoca a reduo do valor da Atividade de gua, que, juntamente com a temperatura, influem no metabolismo bacteriano. A Aa, temperatura e disponibilidade de nutrientes so interdependentes. Assim como o pH, a Aa desfavorveis provocam o aumento da fase lag de multiplicao bacteriana (FRANCO; LANDGRAF, 1996; JAY, 2005). Contudo, quando as clulas bacterianas crescem em meio com alta osmolaridade e sem osmoprotetores, esse organismo pode sintetizar trealose, acar que se liga aos fosfolipdios e serve como osmoprotetor (JAY, 2005).
HENRY, K. D.; KOEHLER, P. E. Effects of salt concentration and incubation temperature on formation of histamine, phenethilamine, tryptamine and tyramine during miso fermentation. Journal of Food Protection. v.49. p.423-427, 1986.
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3.4.2 Atuao da histamina e sintomatologia da intoxicao A histamina uma amina vasoativa que pode causar alteraes na presso sangnea, cefalia, hipertenso, complicaes renais e, em casos mais graves, pode causar hemorragia cerebral e morte (ANTILA, 1983; KUHN; LOVENBERG, 1982). Em muitos casos de intoxicao por histamina aps o consumo de peixes fermentados no h comunicao e registro, pois os sintomas da intoxicao muitas vezes so semelhantes a processos alrgicos (TSAI et al., 2006). Segundo Huss (1997), o corpo humano pode tolerar uma determinada quantidade de histamina sem que haja reao, pois duas enzimas (Diamina Oxidase DAO e Histamine N-metiltransferase - HMT) atuam sobre a histamina, sendo este o mecanismo de detoxificao da histamina (CONTRERAS-GUZMN, 1994). Para que a histamina possa atuar no organismo humano, esta deve passar pela barreira intestinal gerada pela enzima DAO, presente no intestino delgado. A DAO age sobre a histamina atravs da desaminao oxidativa. Em seguida, esta mesma amina biognica tem que ultrapassar a barreira da ao da HMT, enzima presente em todos os tecidos que possuem como mecanismo predominante a metilao, gerando compostos como a N Metil-histamina, o N Metilimidazol acetoaldedo e o N cido metil imidazolactico. (WETTERQVIST4, 1978 apud CONTRERAS-GUZMN, 1994). A Figura 3 demonstra a reao de detoxificao da histamina. HISTAMINA N Acetil Histamina N Metil Histamina

DAO

N- HMT

Imidazol Aceto Aldedo cido Imidazol Actico + ribose cido Ribose Imidazolactico
Fonte: TAYLOR , 1986.
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N t Metil Histamina N t Metilimidazol Acetaldedo N t cido Metil Imidazolactico

Figura 3 Esquema ilustrativo da detoxificao da histamina e seus respectivos metablitos.

WETTERQVIST, H. Histamine metabolism and excretion. In: Handbook of Experimental Pharmacology. Vol II. Editora M. Rocha e Silva: Springer-Verlag, New York, p.131-150, 1978.
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A histamina exerce sua toxicidade interagindo com os receptores de histamina (H1, H2 e H3) presentes nas membranas celulares. O sintoma mais comum resultante da ao cardiovascular da histamina, que gera dilatao dos vasos perifricos, causando urticria, hipotenso, eritema e cefalia. A histamina induz a contrao da musculatura intestinal promovendo dores abdominais, diarria e vmito (TAYLOR5, 1986 apud CONTRERAS-GUZMN, 1994). Mesmo havendo um consenso de que a histamina o principal agente desta intoxicao alimentar, no existe nenhuma relao dose-resposta estabelecida. Alm do mais, existem fatores individuais que interferem na ao intoxicante da histamina, como o peso dos indivduos, as diferenas no metabolismo, a ingesto de medicamentos que podem interferir nas enzimas DAO e HMT, as reaes idiossincrsicas e as reaes verdadeiramente alrgicas (LEHANE; OLLEY, 2000). Os sinais e sintomas da intoxicao pela histamina podem aparecer minutos ou horas aps o consumo do alimento. Os sintomas normalmente duram algumas horas, mas podem durar dias. Os primeiros sinais so cutneos (urticria, eritema, edema), seguidos por sinais gastrointestinais (nusea, vmito, diarria) e hemodinmicos (hipotenso). Por ltimo aparecem os sinais neurolgicos: cefalia, palpitao, queimao, prurido, formigamento, tremor e zumbido. Em muitos casos h broncoespasmo e alteraes respiratrias (SHALABY, 1996; WU et al., 1997) Muitos pesquisadores relatam que a histamina poderia ter sua ao intoxicante potencializada em funo do bloqueio ou diminuio da ao enzimtica sobre a histamina. A presena de outras aminas biognicas como cadaverina, putrescina e tiramina podem ser responsabilizadas pela potencializao da ao da histamina, pois estas inibem a DAO e N-HMT aumentando sua absoro intestinal. Algumas substncias farmacolgicas como a izoniazida (antibitico usado no tratamento de tuberculose), o cido clavulnico, o verapamil (medicamento utilizado em pacientes cardacos), medicamentos inibidores da MAO (utilizado em tratamentos de indivduos depressivos)

TAYLOR, S. L. Histamine food poisoning toxicology and clinical aspects. CRC Critical rev. in: Toxicology 17:91-117, 1986.

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e outros frmacos tambm podem inibir a ao da enzima DAO, aumentando a absoro de histamina (LEHANE; OLLEY, 2000; TAYLOR, 1990). 3.4.3 Padres nacionais e internacionais O Brasil no possui legislao especfica para normatizar a presena de histamina em sardinhas anchovadas. Por esta razo, algumas indstrias nacionais fazem uso de legislao europia (C.E. n 2073/2005 da Comisso de 15 de novembro de 2005), que estabelece o valor de 400 ppm como limite mximo de histamina presente e produtos da pesca que tenham sido submetidos a tratamento de fermentao enzimtica em salmoura, fabricados a partir de espcies de peixes associadas ao elevado teor de histidina. Aps extensa procura, no foi possvel encontrar outras legislaes estabelecendo limites para a presena de histaminas em peixes anchovados. Acreditase que este fato possa ocorrer pela simples falta desta legislao ou por alguma restrio lingstica, uma vez que este tipo de produto muito consumido na sia e as respectivas legislaes estejam escritas nos idiomas da regio. O R.I.I.S.P.O.A. (BRASIL, 1997a) e a Portaria n 185 - Regulamento Tcnico de Identidade e Qualidade de Peixe Fresco (BRASIL, 1997b) determinam como valor mximo para a concentrao de histamina, 100 ppm. Para o mesmo produto, o FDA (2007a) estabelece 50 ppm, e a Comunidade Europia, 200 ppm de histamina (C.E., 2005) como valores limtrofes mximos para produtos da pesca de espcies de peixes associadas ao elevado teor de histidina. 3.5 MICROBIOLOGIA DO PESCADO Segundo Vieira (2004), o peixe possui microbiota prpria que sofre alteraes dependentes de fatores externos como a contaminao ambiental conseqente do lanamento de esgotos e cursos de guas poludas. A biota do peixe reflete a gua onde vive (JAY, 2005). A microbiota do peixe marinho predominantemente haloflica. Porm, o uso de gelo como agente refrigerador promove diminuio da salinidade e permite que a

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populao euraliana (bactrias com habilidade para tolerar larga amplitude de salinidade) se desenvolva (VIEIRA, 2004). 3.5.1 Microrganismos veiculados pelo pescado Em trabalho realizado por Leito et al. (1983), com pescado de origem marinha, foi destacado que as bactrias presentes nos peixes encontram-se, predominantemente, na superfcie da pele e vsceras. Ogawa e Maia (1999) afirmam que, alm da pele e vsceras, as guelras tambm apresentam contaminao bacteriana quando o pescado est vivo passando os demais tecidos a serem infectados aps a morte do animal. Segundo Hagler e Hagler (1991), a maioria das bactrias marinhas so bacilos Gram negativos, mveis, anaerbios facultativos e psicroflicos. Estes autores afirmaram que os gneros prevalentes na gua do mar so Pseudomonas, Vibrio, Spirillum, Alcaligenes e Flavobacterium. Outros gneros que tambm fazem parte da microbiota natural do pescado so: Moraxella, Shewanella e Micrococcus (FRANCO; LANDGRAF, 1996). Novotny et al. (2004) realizaram um estudo sobre o potencial de contaminao humana por bactrias patognicas transmitidas pelos peixes e seu ambiente aqutico e afirmaram que infeces causadas por patgenos transmitidos pelo pescado so comuns e dependem do habitate, da localizao geogrfica, da forma como realizada a pesca, da temperatura da gua, da estao do ano, da qualidade e salinidade da gua e das condies, desde a produo at a comercializao do produto, estao do ano, alm dos hbitos alimentares e do estado imunolgico do consumidor. Dentre as bactrias patgenas associadas ao consumo de peixes e seus derivados destacam-se: Clostridium botulinum, Clostridium perfringens, Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus, Staphylococcus spp., Salmonella spp., Shigella spp., Escherichia coli (NOVOTNY et al., 2004). Observando que o ambiente marinho tem sofrido constante contaminao por causa da emisso de esgotos ao mar, importante ter em mente que algumas bactrias comuns ao trato gastrintestinal dos homens e animais, com capacidade de resistir a condies adversas, podem estar presentes neste ambiente (GIRAFFA, 2002).

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3.5.2 Bactrias halflicas e halotolerantes As bactrias que conseguem se desenvolver e mesmo necessitam de altas concentraes salinas so denominados halfilos e aqueles que sobrevivem, mas no crescem e nem se desenvolvem, so denominados halodricos (JAY, 2005). Os microrganismos ligeiramente halfilos, que crescem em meio contendo de 2% a 5% de sal, so de origem marinha, principalmente dos gneros Pseudomonas, Moraxella, Acinetobacter e Flavobacterium. Aqueles que crescem em meios contendo de 5% a 20% de sal so chamados de moderadamente halfilos tendo como exemplos as bactrias das famlias Bacillacceae e Micrococcaceae. Bactrias que crescem em meios contendo concentraes de 20% a 30% de sal so extremamente halfilas como o Halobacterium spp. e Halococcus spp.. J os patgenos Clostridium botulinum, C. perfringens e Staphylococcus aureus so halotolerantes (OETTERER, 2005). Em altas concentraes de sal a Atividade de gua cai, sendo o valor 0,70 o limite para o desenvolvimento de bactrias haloflicas em pescado. O pH timo para crescimento situa-se entre 0,5 e 7,5 (ibid). 3.5.3 Bactrias acidolticas Neste grupo de bactrias, atualmente, esto agrupados 12 gneros de bactrias Gram-positivas: Lactosphaera; Carnobacterium; Leuconostoc; Enterococcus; Oenococcus; Lactococcus; Pediococcus; Lactobacillus; Streptococcus;

Tetragenococcus; Vagococcus e Weissella . Este grupo no possui limites bem definidos, porm todos apresentam a mesma caracterstica de produzir cido ltico a partir de hexoses. Este grupo de bactrias fermentadoras caracterizado por no possuir sistemas hemiligados funcionais de transporte de eltrons ou de citocromos (JAY, 2005). Segundo Vicenzi (2007), as bactrias cidolticas so anaerbias facultativas e possuem as seguintes caractersticas: melhor crescimento em baixa tenso de oxignio; so basicamente sacarolticas; produzem grande quantidade de cido lctico; so divididas em homo e heterofermentativas em relao fermentao da lactose; possuem mecanismos biossintticos pobres, sendo necessrio o suprimento de carboidratos, aminocidos, lipdios, minerais, entre outros, para que se desenvolvam;

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no usam oxignio (O2) no seu metabolismo e, por isto, no decompem completamente o alimento e seus metablitos bsicos se acumulam no meio; e sua nica forma de metabolismo energtico a fermentao. Jay (2005) explica que as bactrias que produzem cido ltico como nico ou principal produto da fermentao da glicose so designadas como homofermentativas e, as bactrias que produzem a mesma quantidade molar de lactato, dixido de carbono e etanol, so as heterofermentativas. 3.5.4 Salmonella spp. O gnero Salmonella pertence famlia Enterobacteriaceae e compreende bacilos Gram-negativos no esporulados. So anaerbios facultativos, produzem gs a partir de glicose e so capazes de utilizar o citrato como nica fonte de carbono. Este gnero abriga as espcies causadoras da febre tifide (Salmonella typhi), das febres entricas (S. paratyphi A, B e C) e das enterocolites por Salmonella (salmoneloses) (DOYLE; CLIVER, 1990; FRANCO; LANDGRAF, 1996). O pH timo para a multiplicao das salmonelas fica prximo de 7,0, sendo que valores superiores a 9,0 e inferiores a 4,0 so bactericidas. Dependendo da natureza do cido presente no meio, o pH mnimo pode subir para 5,5. O cido actico, o cido propinico e o cido butrico so mais inibitrios que o cido clordrico para um mesmo pH. As salmonelas no toleram concentraes de sal superiores a 9% (FRANCO; LANDGRAF, 1996). Como a Salmonella spp. pode se multiplicar facilmente em alimentos de origem animal e sua dose infectante varia de 10 clulas a milhes delas, dependendo de fatores humanos e do tipo de alimento, fatores extrnsecos e intrnsecos, sua ausncia em produtos alimentcios exigida na maioria dos pases (AMSON et al., 2007). A salmonelose um srio problema para a sade coletiva. O gnero rene mais de 2300 sorovares diferentes, mas somente uma minoria est relacionada ocorrncia de infeces no homem (PIGNATO et al., 1995). Os sintomas incluem diarria, dores abdominais, vmito, cefalia, desidratao e febre. A severidade dos sintomas ir variar de acordo com a imunocompetncia do indivduo intoxicado (DOYLE; CLIVER, 1990).

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O trato intestinal de animais (pssaros, rpteis, animais de granja, homem e insetos) o habitat primrio da Salmonella spp. Desta forma, os microrganismos so excretados nas fezes, a partir das quais podem ser transmitidos por insetos e por outros organismos vivos para variados destinos. Assim sendo, a Salmonella spp. tambm pode ser encontrada na gua, especialmente a poluda por esgoto. (JAY, 2005), e a contaminao das guas torna o pescado uma fonte em potencial de bactrias patognicas como a Salmonella spp. (NOVOTY et al., 2004). Existem algumas metodologias descritas, que so demoradas e complexas, para o isolamento e identificao de Salmonella spp. dos alimentos, podendo levar at sete dias para realiz-las. No entanto, foi desenvolvido por Rambach (1990) um meio de cultura que facilita a diferenciao de Salmonella spp. de outros membros da famlia Enterobacteriaceae. Pignato et al. (1995), observando as caractersticas do meio de Rambach, desenvolveram metodologia que reduz o isolamento e identificao da Salmonella spp. em at 48 horas. 3.5.5 Coliformes totais e fecais (Escherichia coli) O grupo dos coliformes totais composto por bactrias da famlia Enterobacteriaceae caracterizados pela capacidade de fermentar a lactose produzindo gs quando estes so incubados a 35-37 C, por at 48 horas. So bacilos Gramnegativos no formadores de esporos. Dentre os pertencentes a este grupo, pode-se dizer que h predominncias dos gneros Escherichia, Enterobacter, Citrobacter e Klebsiella. So utilizados como indicadores microbiolgicos para a avaliao da qualidade dos alimentos (FRANCO; LANDGRAF, 1996; HARRIGAN, 1998; JAY, 2005). Os coliformes podem crescer em temperaturas que variam de -2 C a 50C. No entanto, nos alimentos, o crescimento deste grupo pobre e lento em temperaturas baixas. Podem crescem na faixa de pH entre 4,4 e 9,0. Uma caracterstica importante deste grupo e que favorece seu isolamento seletivo a capacidade de crescimento em presena de sais biliares, os quais inibem o crescimento de bactrias Gram-positivas (JAY, 2005). Dentro do grupo dos coliformes totais est o grupo dos coliformes fecais que possuem a capacidade de continuar fermentando a lactose com produo de gs,

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quando incubadas temperatura de 45 C +/- 0,5 C. O principal representante deste grupo a Escherichia coli (FRANCO; LANDGRAF, 1996). A E. coli o organismo aerbio mais freqente no trato digestivo do ser humano e dos animais de sangue quente. Em geral, as estirpes de E. coli que colonizam o trato gastrintestinal so comensais inofensivas ou desempenham um papel importante na manuteno da fisiologia intestinal (FDA, 2007b; HUSS, 1997). No entanto, mesmo no sendo patognicas, podem ser oportunistas e causar infeces em indivduos imunocomprometidos. Deve ser registrada ainda a existncia de algumas cepas de E. coli patognicas que, quando ingeridas, causam infeces gastrintestinais em indivduos saudveis (FDA, 2007b). Na RDC n 12 (BRASIL, 2001), do Ministrio da Sade, foi estipulado o valor mximo de 102 coliformes por grama de alimento, em trs, das cinco amostras de semiconservas de pescado colhidas. 3.5.6 Staphylococcus coagulase positiva As bactrias do gnero Staphylococcus so cocos Gram positivos pertencentes famlia Micrococcaceae. So anaerbios facultativos, tolerantes a concentraes de 10% a 20% de NaCl, produzem toxinas entre 10 C a 46 C, crescem na faixa de pH de 4 a 9,8 e em ambientes com Atividade de gua de at 0,83 (FRANCO; LANDGRAF, 1996). Segundo Vieira (2004) e Novotny et al. (2004), dentre as bactrias causadoras de intoxicaes ligadas ao consumo de pescado, destaca-se o Staphylococcus aureus, o melhor representante das estirpes enterotoxignicas de Staphylococcus coagulase positiva. Leito et al. (1983) dissertam que esta ltima bactria no faz parte da microbiota natural do ambiente marinho e do pescado, sendo sua presena neste alimento oriunda, principalmente, do manuseio ou do contato com superfcies higienizadas inadequadamente. Nos alimentos, podem se multiplicar e produzir enterotoxinas a partir de contagens de S. aureus em torno de 106 UFC/g. A ingesto da enterotoxina pode gerar intoxicao alimentar, tendo como sintomas nusea, vmitos, dores abdominais, diarria e sudorese. Em casos mais graves tambm pode ocorrer

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cefalia, calafrios, hipotenso arterial e, raramente, febre (AMSON et al., 2007; CAMACHO et al., 2007; FRANCO; LANDGRAF, 1996). Na RDC n 12 (BRASIL, 2001), do Ministrio da Sade, encontra-se como valor mximo 5x102 estafilococos coagulase positiva por grama do alimento, em duas, das cinco amostras de semiconservas colidas para anlise. Para a realizao desta contagem, na Instruo Normativa n 62 (BRASIL, 2003), da Secretaria de Defesa Agropecuria do Ministrio da Agricultura, determinou-se a utilizao do meio de Baird Parker suplementado com soluo de gema de ovo. 3.5.7 Enterococcus spp. Os Enterococcus spp. fazem parte do grupo das bactrias cidolticas (KLEIN, 2003; SUZZI; GARDINI, 2003). So cocos Gram positivos, anaerbios facultativos, dispostos aos pares ou pequenas correntes (DOMING et al., 2003; TENDOLKAR et al., 2003). Podem tolerar elevadas concentraes de sal (HUGAS et al., 2003). O gnero Enterococcus encontra-se dentro da famlia Enterococcaceae, junto com os gneros Melissococcus, Tetragenococcus e Vagococcus. Os membros tpicos do gnero Enterococcus (E. durans, E. faecalis, E. faecium, E. gallinarum, E. hirae e E. mundtii) so facilmente distinguveis, pois crescem em ambas as temperaturas, 10 e 45C, em caldo contendo at 6,5% de NaCl, em pH 9,6 e em presena de 40% de bile. Existem dados na literatura registrando a presena de Enterococcus spp. em pH 5,0 (FRANZ et al., 2003; HUGAS et al., 2003; TENDOLKAR et al., 2003). Este microrganismo pode ser utilizado como indicador de higiene do alimento, baseado na capacidade de sobreviver em condies ambientais adversas, somado possibilidade de estar presente no trato intestinal de homens e animais e resistncia a temperaturas elevadas (DOMING et al., 2003; GIRAFFA, 2002). Infeces do trato urinrio, abdmen, endocrdio e vias biliares podem ser causados pelo Enterococcus spp. Alm do mais, outro ponto que vem se tornando preocupante a capacidade que esta bactria vem desenvolvendo, no sentido do aumento da sua resistncia em relao aos antimicrobianos (DOMING et al., 2003). Porm, Hugas et al. (2003) destacaram que o Enterococcus spp. possui um papel importante em alimentos fermentados pois algumas espcies podem produzir

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enterocinas com atividade antimicrobiana que agem sobre a microbiota patognica possivelmente presente no alimento. Em contrapartida, a capacidade de produzir descarboxilases, com conseqente formao de aminas biognicas, tambm gera preocupao. Fatores como o pH, temperatura e concentrao de NaCl interferem na produo das aminas biognicas por intervirem na curva de crescimento do Enterococcus faecalis (GARDINI et al., 2001). Sob estes aspectos, os Enterococcus spp. tornaram-se o centro de muitas atividades de pesquisa e preocupao em relao sade coletiva. De um lado, participam de importantes funes em vrios produtos fermentados e, de outro, utilizado como indicador de contaminao fecal, alm da existncia de algumas espcies que tem algum potencial patognico (DOMING et al., 2003).

4 MATERIAL E MTODOS O trabalho foi realizado em duas etapas. A primeira consistiu na avaliao da qualidade de peixes anchovados disponveis no comrcio varejista, de origem nacional e importada. Estes produtos foram avaliados atravs de parmetros bacteriolgicos e fsico-qumicos, em um total de vinte amostras. A segunda etapa do trabalho consistiu no acompanhamento da produo de sardinhas anchovadas produzidas em uma indstria localizada em UbatubaSP, avaliando-se, atravs de parmetros fsico-qumicos e bacteriolgicos, diversas etapas at o produto final. Tambm foram elaborados, com participao da indstria, duas alternativas tecnolgicas distintas da usual da empresa as quais foram acompanhadas pelos mesmos parmetros anteriormente citados. O acompanhamento dos processos foi iniciado com a avaliao da matria prima e finalizado com a avaliao do produto final. As amostras foram analisadas nos Laboratrio de Controle Microbiolgico e Fsico-qumico do Departamento de Tecnologia de Alimentos da Faculdade de Veterinria da Universidade Federal Fluminense. 4.1 AMOSTRAS OBTIDAS NO MERCADO VAREJISTA No mercado varejista, possvel encontrar diferentes marcas de produtos anchovados de diferentes origens, tanto nacional como importados (Itlia, Marrocos, Peru e Argentina). So produtos elaborados com variadas matrias primas, tais como sardinhas (Sardinella brasiliensis), anchovas (Engraulis spp.) e anchovetas (Engraulis ringens).

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Figura 4 Diferentes embalagens de peixes anchovados encontradas no mercado varejista. As 20 (vinte) amostras foram adquiridas em supermercados e lojas de delicatessen da cidade de Niteri, Estado do Rio de Janeiro e transportadas para os Laboratrio de Controle Microbiolgico de Produtos de Origem Animal e para o Laboratrio de Controle Fsico-Qumico de Produtos de Origem Animal, nas condies de comercializao. Nos estabelecimentos, o produto pde ser encontrado sob diferentes formas de comercializao (Figura 4). Dentre estas, foram adquiridas amostras a granel, enlatadas, embaladas em vidro (com tampa rosqueada ou tampadas a vcuo) e embaladas em potes de plstico rgido possuindo tampas com lacre. 4.1.1 Anlises bacteriolgicas As anlises bacteriolgicas foram baseadas na resoluo RDC n 12 (BRASIL, 2001), sendo realizadas de acordo com a Instruo Normativa n 62 de 26 de agosto de 2003 (BRASIL, 2003). Segundo a RDC n 12 (BRASIL, 2001), para produtos de pesca como semiconservas de anchovados, so previstas as seguintes anlises bacteriolgicas: enumerao de coliformes, contagem e identificao de Staphylococcus coagulase positiva e isolamento e identificao de Salmonella sp. A enumerao de Enterococcus spp. no prevista na legislao supracitada e foi realizada devido resistncia da bactria a condies adversas.

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4.1.1.1 Preparo dos meios de cultura Para a realizao das anlises bacteriolgicas, os meios de cultura foram preparados de 15 em 15 dias, em quantidades proporcionais a cada amostragem, com a finalidade de manter as propriedades nutricionais e/ou bioqumicas dos meios de cultura. Para tanto, as indicaes fornecidas pelos fabricantes foram seguidas fidedignamente. Foram utilizados materiais esterilizados e descartveis para a realizao dos procedimentos analticos, tais como: eppendorfs, placas de Petri, ponteiras para pipetador e sacos de stomacher. Para averiguao da eficincia de esterilizao em autoclave (Fabbe ) foi utilizado o sistema bioindicador de checagem Sterikon da Merck (n 10284), constitudos de caldo nutriente, glicose, indicador de pH e esporos de Bacillus stearothermophilus DONK (ATCC 7953), atualmente denominado Geobacillus stearothermophilus (ATCC 7953). As ampolas foram colocadas no interior da autoclave juntamente com o material a ser esterilizado a 121 C por 15 minutos. Quando o material foi retirado da autoclave, as ampolas foram incubadas por 24 a 48 horas a 60 C. Uma ampola no esterilizada pode ser incubada em conjunto para servir de controle. Sendo a esterilizao adequada, os esporos de Bacillus stearothermophilus sero destrudos e o contedo da ampola ficar com colorao violeta clara (Figura 3). Se a esterilizao no for eficiente, o esporo passar a sua forma vegetativa e o contedo da ampola apresentar colorao amarela em funo da produo de cidos resultantes da fermentao da glicose. H tambm a turvao do meio pelo crescimento bacteriano. 4.1.1.2 Enumerao de Coliformes totais e fecal (Escherichia coli) A metodologia utilizada para esta anlise bacteriolgica (MERCK, 2002 modificada por FRANCO e MANTILLA, 2004) teve por objetivo, alm da Enumerao de Coliformes e Escherichia coli, reduzir o consumo do meio de cultura utilizado, o Fluorocult caldo LMX modificado por Manafi e Ossmer (Merck n 12588), atravs da tcnica de miniaturizao (MERCK, 2002).

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De cada amostra, foram obtidas subamostras de 25 g, pesadas assepticamente, acondicionadas em envelope de stomacher e homogeneizada com soluo salina peptonada a 0,1 % (SSP 0,1%), em stomacher (Seward ) por dois minutos em velocidade normal. A partir da diluio de 225 mL de SSP 0,1% e 25 g da amostra (diluio 10-1) preparou-se a diluio de 10-2 retirando-se uma alquota de 100 L da primeira diluio previamente homogeneizada e colocando-a em microtubos tipo eppendorf esterilizado contendo 900 L de SSP 0,1 %. Aps homogeneizao da segunda diluio, uma alquota de 100 L desta foi retirada e colocada em um terceiro eppendorf esterilizado contendo 900L de SSP 0,1%. Assim prepararam-se trs diluies de cada amostra (10-1, 10-2 e 10-3). Destas diluies, retiraram-se trs alquotas de 100 L e, cada uma delas, foi distribuda em microtubo tipo eppendorf contendo 1 mL de Fluorocult previamente preparado, esterilizado e distribudo em eppendorfs esterilizados de 1,5 mL. Assim sendo, de cada amostra obtiveram-se trs diluies em SSP 0,1%, e, de cada diluio, trs repeties na semeadura do Fluorocult (Figura 5), encubando-as por 24 a 48 horas a 35 37 C.

Figura 5 - Microtubos tipo eppendorf contendo os meios de cultura Fluorocult (A) e Chromocult (B), agrupados por amostras. O Flourocult caldo LMX modificado por Manafi e Ossmer (MERCK, 2002) um caldo de enriquecimento seletivo para a identificao simultnea de coliformes total e

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fecal (Escherichia coli). Para o crescimento de coliformes totais, o meio torna-se verdeazulado. Se houver a presena de coliforme fecal uma fluorescncia azul clara ser observada quando o cultivo exposto luz ultravioleta. Para a confirmao de E. coli, umas gotas do reativo de Kovacs so adicionadas para observar a presena de indol, sendo esta reao positiva na ocorrncia de colorao vermelho cereja. 4.1.1.3 Enumerao de Enterococcus spp. A metodologia utilizada para esta anlise bacteriolgica (MERCK, 2002 modificado por FRANCO e LEITE, 2005) teve por objetivo a Enumerao de Enterococcus sp. e reduo do consumo do meio de cultura utilizado, o Chromocult Enterococci Broth (Cat n 110294) (MERCK, 2002), atravs da tcnica de miniaturizao. As trs diluies de SSP 0,1% preparadas para a semeadura do Fluorocult tambm foram utilizadas para semear o Chromocult . Para tanto, foram realizadas de cada diluio, trs repeties (Figura 5) e os meios semeados foram incubados por 24 a 48 horas a 45 +/- 0,5 C. O Chromocult um caldo de enriquecimento seletivo que se torna azul esverdeado quando houver crescimento positivo. A turbidez do meio pode ser fraca. 4.1.1.4 Contagem e Identificao de Staphylococcus coagulase positiva A contagem e a identificao de Staphylococcus coagulase positiva foram realizadas de acordo com a Normativa n 62 da Secretaria de Defesa Agropecuria do Ministrio da Agricultura (BRASIL, 2003). As diluies iniciais, anteriormente citadas, tambm semeadas em placas de Petri contendo o meio de Agar Baird Parker (Merck n 5406). Inoculou-se uma alquota de 100 L de cada diluio na superfcie do meio espalhando-as sobre a superfcie de forma homognea com o auxilio de um basto de Hockey. As placas semeadas foram incubadas por 24 a 48 horas a 35 37 C. O meio de gar Baird Parker permite o crescimento seletivo de estafilococos por conter em sua formulao o cloreto de ltio e o telurito de potssio, ambos inibidores da microbiota acompanhante. A presena de gema de ovo no meio demonstra a

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caracterstica da produo de enzimas lipolticas e proteolticas atravs da formao de halos transparentes ao redor das colnias suspeitas que se mostram pretas pela reduo do telurito. As colnias suspeitas foram repicadas para o meio gar BHI (Brain and Heart Infusion) e incubadas por 24 a 48 horas a 35 37 C para a realizao de provas bioqumicas: catalase, coagulase, DNase, Termonuclease, oxidao e fermentao da glicose e verificao das caractersticas morfotintoriais pelo mtodo de Gram. 4.1.1.5 Isolamento e identificao de Salmonella spp. Para as anlises de isolamento e identificao de Salmonella, a metodologia utilizada foi a proposta por Pignato et al. (1995). De cada amostra, foram semeadas subamostras de 25g, pesadas assepticamente, acondicionadas em envelope de stomacher e homogeneizada por dois minutos em velocidade normal com caldo Salmocyst base em stomacher (Seward ), sendo incubado por seis a oito horas a 35 37 C, para obter o enriquecimento no seletivo. A partir do caldo base, retirou-se 10 mL do meio crescido transferindo-os para um tubo de ensaio contendo o caldo Salmocyst suplemento (Figuras 6 A e B). Esta etapa consiste no enriquecimento seletivo. A presena de verde brilhante e sais de bile bovina na formulao deste suplemento inibem a microbiota acompanhante Gram positiva. Os tubos foram incubados por 18 horas a 35 - 37 C.

Figura 6 (A e B) Tubo de ensaio contendo caldo Salmocyst suplemento antes de semeado (A) e aps a adio de 10ml do caldo Salmocyst base (B).

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Aps o perodo de incubao do caldo Salmocyst suplemento, foi realizado esfregao em lmina de vidro, corada pelo mtodo de Gram, para a observao microscpica das caractersticas morfo-tintoriais dos microrganismos presentes. A partir do mesmo caldo suplemento, foram semeadas placas de Petri contendo o meio cromognico Agar Rambach (Merck n 7500) para a realizao da etapa de plaqueamento seletivo e observao das caractersticas das colnias. A semeadura foi realizada atravs da tcnica de esgotamento para obteno de colnias isoladas com o auxlio de ala de platina (0,3 mm de dimetro) fixada em cabo de Coli. As placas foram incubadas por 24 48 horas a 35-37 C.

A A

B B

C C

D D

Figuras 7 (A, B, C, e D) Crescimento bacteriano obtido no meio de Rambach a partir de repique realizado do caldo Salmocyst suplemento onde, (A) apresenta crescimento suspeito de Citrobacter spp., (B e D) apresentam crescimento suspeito de Escherichia spp e Klebsiella spp. e (C) apresenta crescimento suspeito de Proteus spp. A presena do desoxicolato de sdio na formulao do meio inibe o crescimento da flora Gram positiva acompanhante. O meio utiliza a habilidade que a salmonela possui de produzir cido a partir do propilenoglicol para diferenci-la das outras

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enterobactericeas (Figuras 7 A, B, C e D). Somado a isto, o meio possui o cromgeno X-Gal que permite a deteco da galactosidase produzida pelas outras enterobactrias. Assim, as colnias suspeitas de Salmonella spp. mostram-se com colorao avermelhada em funo da produo de cido apontada pelo indicador de pH. 4.1.2 Anlises fsico-qumicas As anlises fsico-qumicas foram realizadas, a partir da musculatura dorsal das amostras de cada lote. Aps separao e cominuio da musculatura dorsal, pesou-se em balana analtica, as alquotas de acordo com os protocolos analticos de cada anlise fisico-qumica. Em seguida, estas foram embaladas em papel alumnio, identificadas (data, peso, anlise e lote) e congeladas. 4.1.2.1 Avaliao de histamina Para avaliao da produo de histamina, utilizou-se o mtodo de Cromatografia em Camada Delgada (CCD) segundo a metodologia proposta por Schutz, Chang e Bjeldanes (1976). Nas amostras, onde foi constatada a produo de histamina, realizou-se o mtodo quantitativo fluorimtrico segundo a metodologia preconizada pela AOAC (2002). 4.1.2.1.1 Mtodo de Cromatografia em Camada Delgada Pelo emprego desta metodologia, utilizou-se uma alquota de 1g da poro muscular transferindo-a para tubo de ensaio e adicionando-se 2mL de metanol. Com o auxilio de uma esptula fina foram homogenezadas as duas fases em vrtex (Certomat MV) a fim de aumentar a superfcie de contato entre a poro muscular e o metanol. O conjunto foi aquecido em banho-maria at fervura. Neste momento, transferiuse o tubo de ensaio para centrifuga (Hermle Z 360 K) para obteno de sobrenadante aps dois minutos a 3000 rpm. A placa de slica gel (Sigma ) foi cortada com cuidado para que no houvesse desprendimento da camada de slica (SiO2). As marcaes dos pontos de aplicaes

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das amostras e dos padres foram feitas com lpis sobre a slica a 1,5 cm da borda inferior. O tamanho da placa variou de acordo com o nmero de amostras analisadas. De cada amostra centrifugada retirou-se 10 L do sobrenadante, com o auxlio de pipetador automtico, aplicando-as na placa de slica. Foram aplicados, tambm, os padres de 2 L, 5 L e 10 L nos respectivos pontos da placa com o auxlio de microseringa de 10 L (Hamilton ). Estes padres equivalem aos valores de 2 mg de histamina/100 g da amostra (20 ppm), 5 mg/100 g (50 ppm)e 10 mg/100 g (100 ppm). Para a preparao do padro, foram utilizados 16,6 g da histamina 2 HCL Sigma diludos em 100 mL de metanol, em um balo volumtrico. As placas aplicadas com os padres e as amostras foram colocadas em cuba cromatogrfica com tampa, contendo um eluente previamente preparado (20 mL de Acetona P.A. e 1 mL de Hidrxido de Amnio P.A. 20:1 v/v). O eluente deve ser o suficiente para cobrir o fundo da cuba, com espessura de 0,5 a 1,0 cm. A soluo eluente se desloca por capilaridade sobre a placa de slica at 2 cm da borda superior carreando as aminas biognicas (histamina, putrescina e cadaverina) que, quando presentes, se ligam slica em diferentes deslocamentos. Ao ser retirada da cuba, a placa foi secada com ar fluente quente por um perodo de 20 minutos e em estufa 36 C, para a eliminao dos vapores de amnia. Para a visualizao das aminas, a placa foi revelada aspergindo-se uniformemente sobre a mesma, soluo de ninhidrina a 0,3 % em metanol. A placa foi secada novamente com ar fluente quente, para visualizao da colorao avermelhada que aparece em funo da complexao da ninhidrina com o radical NH3 das aminas biognicas. A quantificao da histamina foi feita pela comparao visual entre as manchas formadas pelos padres e pelas amostras, de mesmo deslocamento, alm da intensidade da cor (Figura 8).

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Figura 8 Placa de slica (Sigma ) aps revelao com soluo de ninhidrina a 0,3%. Destaque para a presena de histamina em todas a 5 amostras de sardinha anchovada analisadas. 4.1.2.1.2 Mtodo Fluorimtrico O mtodo fluorimtrico baseia-se na reao da histamina com o Ortoftaldedo (OPT), formando um composto fluorescente. Empregando esta metodologia, utilizou-se 10 g da amostra homogeneizando-a com 50 mL de metanol em liquidificador (Oster ). Com o auxlio de um funil de polipropileno, o homogeneizado foi transferido para um erlenmeyer de 125mL. Adicionou-se mais 50 mL de metanol no copo do liquidificador com a finalidade de remover os resduos da amostra que tambm foram transferidos para o erlenmeyer, sendo este tampado com um pequeno quadrado de folha de alumnio. Este extrato foi submetido a banho-maria por 15 minutos a 60C, e, decorrido este perodo, o conjunto foi filtrado em papel Whatman n1 para balo de 100 mL. Assim, foi obtido um extrato que pde ser conservado sob refrigerao at realizao do procedimento analtico. A purificao do extrato foi feita atravs da filtrao de 1 mL da soluo em coluna de troca inica. O filtrado foi transferido para um balo de 50 mL contendo 5 mL de HCl 1N. Aps a penetrao do extrato na coluna, foram acrescentados 5 mL de gua destilada, deixando-a fluir. Quando o nvel do lquido alcanou o nvel de 2 mm acima da resina, foram acrescentados mais 5 mL de gua destilada, sucessivamente,

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at o volume de 35 mL. O fluxo foi interrompido sem permitir que a resina ficasse seca. O volume do balo foi completado com gua destilada e o filtrado homogeneizado e, em seguida, refrigerado. Do filtrado refrigerado, retirou-se uma alquota de 5 mL e transferiu-se para um erlenmeyer. Em seguida, se adicionou 10 mL de HCl 0,1N, com a finalidade de homogeneizar a soluo. Nas etapas seguintes, foram adicionados 3 mL de hidrxido de Sdio (NaCl) 1N, 1 mL da soluo 0,1 % de OPT e 3 mL de cido Fosfrico (H3PO4) 1,78M. Entre uma etapa e outra, sempre se procedeu homogeneizao das solues, sendo que aps a adio da soluo de OPT, a soluo foi agitada de forma constante por 4 minutos. Tambm foi elaborada uma soluo branco da mesma forma como citado anteriormente, diferindo somente na no adio do filtrado resfriado. Utilizamos esta soluo para zerar o fluormetro. Transferida a soluo obtida aps a adio do cido fosfrico para uma cubeta, foi realizada a leitura no fluormetro (SequoiaTurner Modelo 450) e os valores obtidos foram anotados (Figura 9). Aps a aplicao destes valores frmula para a obteno do resultado em ppm, foram comparados os valores obtidos com a curva padro.

Figura 9 Fluormetro (Sequoia Turner Modelo 450) registrando a leitura de uma das amostras analisadas.

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Preparo da resina e da coluna de troca inica Na converso da resina Dowex (Sigma Aldrich ) para sua forma alcalina utilizou-se 15 mL de Hidrxido de Sdio 2M para cada grama de resina. A mistura foi vagarosamente homogeneizada em bquer e submetida a descanso por 30 minutos. Aps este perodo, a parte lquida foi dispensada e a resina lavada duas vezes com gua destilada. A coluna de vidro foi fixada em suporte prprio para vidrarias. Ao fundo desta, uma pequena circunferncia de filtro de papel Whatman n 1 foi colocada e, em seguida, uma camada muito fina de l de vidro, com a finalidade de no permitir o arraste da resina para o balo. Colocou-se a quantidade de resina suficiente para formar uma coluna de 8 cm de altura, e esta foi mantida submersa em gua destilada para que no perdesse a sua propriedade de troca inica (Figura 10 A, B e C).

Figuras 10 (A, B e C) - Preparao da coluna de filtrao, colocando-se primeiro o papel de filtro (Whaltman n 1) ao fundo da coluna (A), seguindo-se da adio de pequena quantidade de l de vidro (B) posteriormente adicionando a resina de troca inica (Dowex ) previamente convertida a forma alcalina (C).

Aps o uso, a resina pode ser re-utilizada atravs de sua regenerao. Este procedimento feito da mesma forma que a ativao da resina. Preparo das solues Hidrxido de sdio (NaOH) 1M e 2M Foram pesados 41,24 g e 82,48 g de NaOH P.A., respectivamente para as solues de 1M e 2M, e dissolvidas em 1000 mL de gua destilada.

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cido Clordrico (HCl) 1N e 0,1N Pipetou-se 93 mL de cido clordrico concentrado e transferiu-se para um balo volumtrico de 1000 mL, completando-se o volume com gua destilada, tendo, desta forma, a soluo 1 N. Pipetou-se 9,3 mL de cido clordrico concentrado e transferiu-se para um balo volumtrico de 1000 mL, completando-se o volume com gua destilada, obtendo a soluo 0,1 N. cido Fosfrico (H3PO4) 1,78M Foram diludos 243,6 mL de cido fosfrico para 1 L de gua destilada, e padronizou-se 500 mL do cido com soluo de hidrxido de sdio 1M, usando fenolftalena como indicador. Esta concentrao pode ser ajustada, se necessrio. Ortoftaldedo (OPT) 0,1% Foram dissolvidos 25 mg de OPT em 25 mL de metanol. Esta soluo foi armazenada em frasco mbar e sob refrigerao, com ateno para a sua validade, que de uma semana. Preparo das solues padres de histamina Soluo Stock 1 mg/mL em base livre Pesou-se 42,3 mg de histamina, transferindo-se para um balo de 25 mL, dissolvidos e diludos com cido clordrico 0,1 N at completar o volume. A soluo foi mantida sob refrigerao por um perodo de at uma semana. Soluo intermediria 10 g/ mL Foram pipetados 0,5 mL da soluo stock para um balo de 50 mL, com cido clordrico 0,1 N at completar o volume. A soluo foi mantida sob refrigerao.

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Soluo padro de trabalho Pipetou-se 1 mL da soluo intermediria, transferindo-se para um balo de 50 mL e diluindo-se com cido clordrico 0,1 N at completar o volume. A partir desta soluo, foram preparadas as seguintes solues para a curva padro, observado o seu preparo no dia de seu uso: 1) 0,1 g/5 mL - Pipetou-se 0,5 mL da soluo padro de trabalho, transferindoa para um erlenmeyer de 50 mL, onde acrescentou-se 4,5 mL de cido clordrico 0,1N. 2) 0,2 g/5 mL - Pipetou-se 1 mL da soluo padro de trabalho, transferindo-a para um erlenmeyer de 50 mL, onde acrescentou-se 4 mL de cido clordrico 0,1N. 3) 0,3 g/5 mL - Pipetou-se 1,5 mL da soluo padro de trabalho, transferindoa para um erlenmeyer de 50 mL, onde acrescentou-se 3,5 mL de cido clordrico 0,1N. 4) 0,4 g/5 mL - Pipetou-se 2 mL da soluo padro de trabalho, transferindo-a para um erlenmeyer de 50 mL, onde acrescentou-se 3 mL de cido clordrico 0,1N. 5) 0,5 g/5 mL - Pipetou-se 2,5 mL da soluo padro de trabalho, transferindoa para um erlenmeyer de 50 mL, onde acrescentou-se 2,5 mL de cido clordrico 0,1N. Obteno da Curva Padro As cindo solues de trabalho foram tratadas em erlenmeyer de 50 mL com solues qumicas atravs do mesmo procedimento realizado para o extrato purificado da coluna de troca inica das amostras (o filtrado). Cada soluo obtida foi transferida para uma cubeta, sendo realizada a leitura no fluormetro e anotados os valores obtidos. Estes valores foram aplicados na frmula a seguir para a obteno do resultado em mg de histamina por Kg da amostra. Os resultados foram transferidos para um grfico representado em plano cartesiano de dois eixos (x e y) por uma reta denominada Curva Padro, como demonstrado na Figura 11.

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0,12 0,1 0,08 0,06 0,04 0,02 0 0

ppm

y = 0,217x - 0,0061 R2 = 0,9676

g/5 mL
0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6

Figura11 - Plano cartesiano contendo a Curva Padro da quantificao de histamina utilizada no mtodo Fluorimtrico. Clculo da quantidade de histamina Histamina mg / Kg = (Is b) x 1000 Pxa
Is = leitura da fluorescncia no aparelho b = coeficiente linear da reta obtida a partir da Curva Padro P = massa da amostra em g a = coeficiente linear da reta obtida a partir da Curva Padro 1000 = fator de diluio

4.1.2.2 Anlise da produo de Bases Volteis Totais Para a anlise de Bases Volteis Totais, utilizou-se o mtodo de Microdifuso em Placas de Conway , descrito no Manual do LANARA (BRASIL, 1981). Em liquidificador, foram homogeneizados 10 g da amostra com 10 mL de soluo de cido Tricloroactico (TCA) 10%. Em seguida, foi realizada a filtrao a vcuo em funil de Buchner com papel Whatman acoplado um Kitasato, sendo assim obtido o extrato. Com pipeta volumtrica de 2 mL retirou-se uma alquota do extrato que foi colocada no compartimento externo da placa de microdifuso de Conway. No compartimento interno, adicionou-se 2 mL da soluo de cido brico de Conway. Foi colocada vaselina slida nas bordas da placa de microdifuso e sobre esta uma placa de vidro deixando uma pequena rea aberta para a adio de 2 mL de soluo saturada de carbonato de potssio (K2CO3) ao compartimento externo, junto com o extrato. Rapidamente, a placa de vidro foi deslizada para tampar a placa de

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microdifuso, girando-se suavemente o conjunto, com a finalidade de homogeneizar o contedo externo. As anlises foram realizadas em duplicata para cada amostra e as placas permaneceram por 2 horas em estufa 36 C. A ltima etapa do procedimento analtico foi a titulometria de neutralizao utilizando-se soluo de cido clordrico 0,1 N com auxlio de microbureta de 5 mL, para neutralizar as bases migradas para o compartimento interior da placa (Figura 12).

Figura 12 (A, B e C) Titulometria de neutralizao das bases presentes no compartimento interno da placa de microdifuso de Conway (A) onde a adio de soluo de cido clordrico 0,1 N, com auxlio de microbureta, vai alterando a cor do contedo (B) at completa viragem do mesmo (C). O clculo de mg de N-BVT por 100 g da amostra foi feito atravs da frmula: mg de N-BVT / 100 g = V x N x 14 x 100 (T + U) Va x P
V = volume de HCL gasto na titulao N = normalidade da soluo titulante 14 = equivalente grama do nitrognio T = volume de TCA utilizado na homogeneizao (10 a 50 mL) U = umidade da amostra em gramas Va = Volume do extrato analisado (2 mL) P = peso da amostra analisada (10 a 50 mL)

Preparo das solues Soluo de cido Brico de Conway Pesou-se 5 g de acido brico adicionando-se a 100 mL de lcool etlico e 300 mL de gua destilada. Aps dissoluo total, adicionou-se 5 mL do indicador de Tashiro.

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Em seguida, adicionou-se lentamente soluo de hidrxido de sdio 0,1 N at produo de colorao rsea e completou-se o volume a 500 mL . Indicador de Tashiro Misturou-se volume por volume de soluo de vermelho de metila a 0,2% em lcool etlico e soluo de azul de metileno a 0,1 % em gua destilada. Hidrxido de sdio 0,1N Dissolveu-se 4 g de NaOH em gua destilada, completando o volume a 1000 mL e, para eliminar o gs carbnico, adicionou-se 1 a 2 g de clotero de brio. Soluo de cido Tricloroactico a 10% Pesou-se 100g de cido tricloroactico em bquer de 500 mL e adicionou-se gua destilada at total dissoluo. Transferiu-se para balo volumtrico e completouse o volume com gua destilada at 1000 mL. Soluo saturada de Carbonato de Potssio Pesou-se 120 g de carbonato de potssio em bquer de 500 mL e adicionou-se 100 mL de gua destilada, agitando-se at dissoluo completa. 4.1.2.3 Percentual de cloretos A quantificao do teor de cloretos foi realizada pelo mtodo de Mhr, seguindo os procedimentos descritos no Manual do LANARA (BRASIL, 1981). Foram utilizados de 2 a 5 g da amostra anotando o valor numrico desta pesagem, para ser empregado posteriormente na frmula matemtica de clculo do percentual de cloreto. Esta massa foi colocada em cadinho de porcelana para carbonizao em bico de Bunsen, e posteriormente em forno mufla a 550 C para incinerao (obteno de cinzas claras). Objetivando facilitar a dissoluo das cinzas, adicionou-se ao contedo do cadinho duas a tres gotas de soluo de cido Ntrico P.A. e gua destilada quente (1:9), preparada momentos antes de sua utilizao, e 10 mL de gua destilada quente. Agitou-se com basto de vidro o contedo do cadinho e filtrou-se em papel Whatman para erlenmeyer de 250 mL. O cadinho e o filtro de papel foram meticulosamente

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lavados com gua destilada aquecida. Mensurou-se pH do filtrado, corrigindo-o para 8,0 com soluo de hidrxido de sdio 0,1N. Adicionou-se soluo filtrada 1 mL da soluo de Cromato de Potssio (K2CrO4) a 5% e titulou-se com soluo de Nitrato de Prata (AgNO3) 0,1N at o aparecimento da colorao vermelho tijolo. O clculo do percentual de cloretos foi feito com a utilizao das variveis V (volume de AgNO3 0,1N gasto na titulao) e P (peso inicial da amostra) na frmula que tambm utiliza o fator de correo (f) e a normalidade (N) da soluo de AgNO3 0,1N, descrito a seguir: % Cloretos = V x f x N x 0,0585 x 100 P

Preparo das solues Soluo de cido Ntrico Em gabinete de segurana, diluiu-se 1 mL de cido Ntrico concentrado em 9 mL de gua destilada quente. A soluo foi utilizada imediatamente aps o preparo, em funo da alta volatilidade do cido Ntrico. Cromato de potssio 5% Pesou-se 25 g de Cromato de potssio e diluiu-se em 500 mL de gua destilada. Soluo de Nitrato de Prata 0,1N A soluo de nitrato de prata foi preparada e utilizada no dia de realizao do procedimento analtico sendo acondicionado em frasco envolto em papel alumnio. A soluo foi preparada em gua destilada de acordo com a frmula a seguir: N = massa de Ag NO3 P.M. x V
N = normalidade da soluo P. M. = peso molecular do nitrato de prata V = volume da soluo a ser preparada.

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4.1.2.4 Atividade de gua Na avaliao da atividade de gua fez-se uso do PawKit (Decagon ) que possui um sensor dieltrico de umidade e faz a leitura da atividade de gua diretamente da amostra. Para este procedimento foi utilizado 5g da amostra, colocando-a cuidadosamente no recipiente prprio do aparelho, cobrindo todo o fundo. Tivemos o cuidado para que a amostra no passasse da metade da altura do recipiente, para evitar que o alimento entrasse em contato com a clula dieltrica e o aparelho descalibrasse. Depois de ligado o aparelho, a leitura foi feita automaticamente e, aps tres minutos, foi emitido um sinal sonoro que estabeleceu o fim da leitura. O resultado foi observado no visor digital onde fica registrada a leitura da atividade de gua da amostra. 4.1.2.5 pH A determinao do potencial hidrogeninico foi realizada segundo a metodologia oficial descrita no Manual do LANARA (BRASIL, 1981). 4.2. AMOSTRAS EXPERIMENTAIS As amostras experimentais foram elaboradas por uma indstria localizada no litoral norte do estado de So Paulo e inspecionada pelo Servio Federal. Nesta etapa do trabalho, foram realizados trs processamentos tecnolgicos de anchovagem da sardinha (Sardinella brasiliensis), as quais foram acompanhadas atravs de analises bacteriolgicas e fsico-qumicas, desde a matria prima at o fim da fermentao. Os processamentos realizados foram os seguintes: A - Processamento tecnolgico usual da empresa (Anexo 9.1.1) ; B - Processamento tecnolgico pelo qual o peixe fermentado inteiro (Anexo 9.1.2); e C - Processamento tecnolgico pelo qual o peixe fermentado eviscerado (Anexo 9.1.3).

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Foram acompanhados trs lotes de cada processamento, somando um total de nove lotes, identificados como: A1, A2, A3, B1, B2, B3, C1, C2 e C3. As matrias primas utilizadas para o processamento dos nove lotes foram as mesmas. 4.2.1 Processamento usual da empresa No processamento usual da empresa (processamento A), a primeira etapa aps a seleo da matria prima consiste na lavagem do pescado com gua hiperclorada (5ppm). Em seguida, a sardinha lavada e, inteira, disposta em barricas de plstico rgido com capacidade para 250 kg de peixe, em camadas alternadas de sal grosso, dando incio etapa da pr-salga. A primeira e ltima camada devem ser de sal, no sendo adicionada gua. A formao de salmoura ocorre a partir da gua da prpria sardinha (Figura 13). O pescado permanece nestas barricas por perodo que varia de cinco a dez dias, dependendo do percentual de gordura da sardinha e da demanda da empresa.

Figura 13 - Barricas contendo as sardinhas no perodo de fermentao do produto. Ao ser retirada da pr-salga, a sardinha descabeada e eviscerada manualmente, com o auxlio de uma faca, e passa para a fase de fermentao. Nesta etapa, o produto em processamento colocado em outra barrica limpa da mesma forma como na pr-salga (em camadas alternadas com o sal).

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O perodo de fermentao do produto de, no mnimo, 90 dias. Nesta fase, as barricas ficam acondicionadas em salo com temperatura ambiente controlada a 25 C (Figura 14), e as salmouras so controladas em relao concentrao de sal (mnimo: 24 B).

Figura 14 (A, B e C) - Salo com temperatura controlada onde realizada a fermentao do produto (A). Destaque para os sensores de aferio da temperatura (B e C). Seguindo o fluxograma de produo, aps o perodo de fermentao, as sardinhas so retiradas da salmoura e tm a pele extrada manualmente. Estas so empilhadas e acondicionadas em caixas de polipropileno rgido e de paredes espessas, especiais para a prensa. As caixas so colocadas na prensa (Figura 15) para a retirada do excesso de salmoura e so submetidas presso de duas a seis toneladas por 20 minutos.

Figura 15 - Prensa utilizada para a retirada do excesso de salmoura.

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Em seguida, feita a filetagem do produto fermentado e os fils so acondicionados nas embalagens. As embalagens so pesadas e recebem o leo de cobertura, sendo, por fim, fechadas a vcuo. 4.2.2 Processamento com peixe inteiro O processamento tecnolgico B (Anexo 9.1.2) difere do processamento usual da empresa em relao fase de pr-salga. Aqui a fase de pr-salga no realizada. Lava-se a matria prima com gua hiperclorada submetendo o produto inteiro a fermentao e no sendo realizada a etapa de descabeamento e eviscerao. A disposio do sal e da sardinha dentro das barricas limpas feita da mesma forma como descrito anteriormente, assim como o restante do processamento. 4.2.3 Processamento com peixe eviscerado O processamento tecnolgico C (Anexo 9.1.3) difere do processamento usual da empresa (A) em relao fase de pr-salga e do processamento B, em relao eviscerao. Neste, a fase de pr-salga no realizada, alm da matria prima lavada ser colocada para fermentar totalmente eviscerada e descabeada. A disposio do sal e da sardinha dentro das barricas limpas feita da mesma forma como descrito anteriormente, assim como o restante do processamento. 4.2.4 Delineamento experimental Os processamentos tecnolgicos foram identificados com A, B e C. Em cada processamento, foram realizadas trs repeties: A1, A2, A3, B1, B2, B3, C1, C2 e C3. As amostras coletadas aleatoriamente pesavam, no mnimo, 500g para a realizao das anlises bacteriolgicas e fsico-qumicas. A primeira coleta foi referente matria prima do processamento: o sal e a sardinha fresca. Assim, foi possvel avaliar a qualidade das matrias primas utilizadas nos processamentos. A segunda coleta foi realizada no dia em que as sardinhas do processamento usual da empresa (A) foram retiradas da pr-salga. Nesta mesma data de coleta dos lotes A1, A2 e A3, tambm foram coletadas amostras dos lotes B1, B2, B3, C1, C2 e C3. A

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data desta coleta foi anotada e a partir dela foram colhidas amostras dos nove lotes de 15 em 15 dias, at completar 90 dias de fermentao (Apndice 8.1). Junto com as amostras foi enviada uma ficha contendo os dados de cada uma das amostras (Apndices 8.2 e 8.3). 4.2.4.1 Matrias-primas As matrias primas foram coletadas e embaladas em saco plstico limpo e lacrada em seladora quente. A amostra de sardinha no foi lavada antes da coleta e foi colocada em caixa de polipropileno expandido, envolta por gelo e enviada ao Laboratrio de Controle Microbiolgico no dia de chegada da sardinha indstria. Segundo as informaes enviadas junto com as amostras, a sardinha, comprada de pescadores da regio, chegou indstria com temperatura igual a 0,6C. A amostra de sal foi enviada a temperatura ambiente e tem origem em uma salineira do Rio Grande do Norte. 4.2.4.1.1 Sal Para avaliar a qualidade do sal foram realizadas somente anlises

bacteriolgicas. As anlises realizadas foram: Enumerao de Coliformes totais e fecal, isolamento e identificao de Salmonella sp., Contagem e identificao de Staphylococcus coagulase positiva, Enumerao de Enterococcus sp. e Contagem Total de bactrias Halfilas. A contagem Total de bactrias Halfilas foi baseada na Instruo normativa n 62 (BRASIL, 2003). E o meio utilizado foi o Bacto Agar Marine 22116 da Difco . 4.2.4.1.2 Sardinha fresca A matria prima foi avaliada, bacteriologicamente, segundo os mtodos e legislaes j descritos anteriormente para os produtos adquiridos no mercado varejista.

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As anlises fsico-qumicas realizadas para pescado fresco foram a quantificao de histamina (mtodos de CCD e Fluorimetria) e a quantificao de Bases Volteis Totais, como j descritos. Os parmetros fsico-qumicos utilizados para a sardinha fresca foram determinados pela Portaria n 185 de 13 de maio de 1997 (BRASIL, 1997b). 4.2.4.2 Produto em fermentao As amostras coletadas dos produtos em fermentao foram embaladas junto com a salmoura em sacos plsticos limpos. Os sacos foram lacrados em mquina seladora a quente e acondicionados em potes de plsticos rgidos, com tampa e lacre. Cada pote foi identificado com os respectivos lotes (A1, A2, A3, B1, B2, B3, C1, C2 e C3) Os potes das amostras foram envoltos por folhas plsticas com pequenas bolhas de ar e colocadas em caixa de papelo. A caixa com as amostras foi enviada para a Faculdade de Veterinria da Universidade Federal Fluminense via SEDEX . 4.2.4.2.1 Anlises bacteriolgicas As anlises bacteriolgicas realizadas para o produto em fermentao foram as mesmas realizadas para as amostras adquiridas no mercado varejista, ou seja, Isolamento e identificao de Salmonella sp., Enumerao de Enterococcus sp, Enumerao de Coliformes Totais e Fecal (Escherichia coli) e Contagem e Identificao de Staphylococcus coagulase positiva. 4.2.4.2.2 Anlises fsico-qumicas As anlises fsico-qumicas realizadas para o produto em fermentao foram as mesmas realizadas para as amostras adquiridas no mercado varejista, ou seja, Avaliao de Histamina (Mtodo de Cromatografia em Camada Delgada e Mtodo Fluorimtrico), Anlise da produo de Bases Volteis Totais, Percentual de Cloretos, Atividade de gua e pH.

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4.2.5 Tratamento estatstico dos resultados Para o tratamento estatstico dos resultados obtidos no experimento, realizou-se anlise de varincia em arranjo fatorial de trs tratamentos por sete tempos, seguido de teste de comparao entre mdias (Tukeys Studentized Range) com 5 % de significncia. Para tal, utilizou-se o pacote estatstico SAS (SAS Institute, 1985). Para o tratamento estatstico da varivel quantitativa histamina, utilizou-se o Teste de Kruskal-Wallis para comparao dos tratamentos por no apresentar distribuio normal.

5 RESULTADOS E DISCUSSO A seguir sero apresentados os resultados encontrados na presente pesquisa. Entretanto, aps longa e cuidadosa reviso bibliogrfica sobre o mesmo tema, houve grande dificuldade para discutir os resultados em funo do reduzido nmero de referncias. 5.1 AMOSTRAS OBTIDAS NO MERCADO VAREJISTA Os resultados bacteriolgicos e fsico-qumicos obtidos nas 20 (vinte) amostras de diferentes marcas, nacionais e importadas (Brasil, Itlia, Marrocos, Per e Argentina) sero expostos e discutidos nos itens subseqentes. 5.1.1 Anlises bacteriolgicas Os resultados obtidos nas anlises bacteriolgicas podem ser observados na tabela 1. Segundo a RDC n 12 da Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria (BRASIL, 2001), no que se refere anlise qualitativa de Salmonella spp., 100% das amostras analisadas encontram-se dentro do padro estabelecido para as semiconservas de pescado. Utilizando a mesma legislao como referncia, os resultados das anlises para coliformes tambm se encontram adequados e, dentre as amostras analisadas, somente uma apresentou resultado inadequado quando avaliada a presena de Staphylococcus coagulase positivo.

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Tabela 1 - Resultados referentes contagem de coliformes totais e fecal (NMP/g), Staphylococcus coagulase positivo (UFC/g), Salmonella spp. e Enterococcus spp. (NMP/g) em peixes anchovados provenientes do mercado interno e externo.
Coliforme Amostra Total Fecal Staphylococcus Coagulase + UFC/g Salmonella spp. Enterococcus spp. NMP/g

NMP/g

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

NR Ausente Ausente <3 <3 <3 <3 <3 <3 <3 <3 <3 Aus Aus Aus Aus Aus

NR 1,9 x 10 3 Ausente Ausente 7,0 x 10 2 Ausente Ausente Ausente Ausente Ausente Ausente Ausente Ausente Ausente Ausente Ausente Ausente 7,0 x 10 2 Ausente Ausente

NR Ausente Ausente Ausente Ausente Ausente Ausente Ausente Ausente Ausente Ausente Ausente Ausente Ausente Ausente Ausente Ausente Ausente Ausente Ausente

NR NR NR 2,0 x 10 2,4 x 10 2 > 1,1 x 10 3 > 1,1 x 10 3 > 1,1 x 10 3 > 1,1 x 10 3 Ausente Ausente 3,0 x 10 3,0 x 10 3,0 x 10 3 7,0 x 10 4 Ausente 7,0 x 10 4 <3 Ausente 0,4 x 10 1

Ausente

Ausente Ausente Ausente Ausente Ausente Ausente <3 Aus Ausente Ausente

NR: No Realizado

A enumerao de Enterococcus spp. no prevista pela RDC n 12 (BRASIL, 2001). Entretanto, os resultados obtidos sugerem uma relao entre a produo de histamina e a presena desta bactria, a qual foi isolada em 76% das amostras nas quais foram realizadas anlises bacteriolgicas. Gardini et al. (2001) sugerem que a

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maior influncia na formao de aminas biognicas advem da atividade proteoltica do Enterococcus spp. e das enzimas de descarboxilao presentes neste microrganismo. Ao observar a tabela 1, possvel perceber que o crescimento bacteriano deste microrganismo bastante relevante. 5.1.2 Anlises fsico-qumicas Recordando o fato do produto em questo no possuir padro de qualidade, foi utilizada como parmetro para avaliao das bases volteis a portaria n 185 (BRASIL, 1997b), que estabelece um limite de 30 mg N/100 g de amostra para o pescado fresco. Na tabela 2, possvel observar que todos os resultados referentes s bases volteis esto acima do preconizado pela legislao supracitada. A formao de nveis significativos de aminas biognicas tem sido observada em muitos alimentos nos quais ocorre o crescimento bacteriano de Enterococci (como observado na tabela 1, estando presente em 76% das amostras). No entanto, existem outros fatores que podem influenciar na formao de aminas biognicas por estes microrganismos tais com a temperatura, o pH e a concentrao de sal (GARDINI et al; 2001). Ao avaliar os resultados da presena de histamina obtidos atravs da tcnica de Cromatografia em Camada Delgada (SCHUTZ, CHANG e BJELDANES, 1976) constatou-se a presena dessa amina biognica em todas as amostras. Somado a este fato, foi constatada a presena de outras aminas biognicas em 75% das amostras, caracterizando a possibilidade de potencializao da ao txica da histamina (MRSICO, 2002). Segundo a legislao europia (C.E., 2005), todos os valores determinados por esta anlise estariam dentro do preconizado, no entanto, esta legislao no faz referncias ao fato de outras aminas biognicas potencializarem a ao intoxicante da histamina, o que levaria casos de intoxicao e/ou casos alrgicos em decorrncia da ingesto de menores concentraes. Na Inglaterra, foram relatados casos com o desenvolvimento de sintomas em indivduos que consumiram pescados contendo concentraes pouco superiores a 50

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ppm (BARTHOLOMEW et al.6 ,1987 apud

LEHANE; OLLEY, 2000). Na tabela 2

observa-se que 90 % das amostras apresentaram valores maiores ou iguais a 50 ppm. Tabela 2 - Resultados obtidos nas anlises de Bases Volteis Totais - BVT (mg N/100g), histamina (ppm), outras aminas biognicas, pH, Atividade de gua Aa e cloretos (%) em peixes anchovados provenientes do mercado interno e externo.
Amostra 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Origem Brasil Desconhecida Per Per Itlia Itlia Itlia Marrocos Argentina Marrocos Argentina Brasil Brasil Brasil Per Argentina Brasil Per Argentina Brasil BVT
(mg N/100g)

Histamina (ppm)
100

Putrescina e Cadaverina Presente Presente Ausente Presente Presente Presente Presente Ausente Presente Presente Presente Presente Presente Presente Ausente Presente Presente Ausente Presente Ausente 5,17 5,73 5,64 5,31 5,23 5,08 5,32 5,49 5,55 5,67 5,35 5,37 5,30 5,46 5,40 5,55 5,54 5,68 5,19 0,68 0,67 0,68 0,66 0,67 0,67 0,67 0,67 0,55 0,70 0,70 pH Aa

Cloreto % 10,9 17,5 14,5 14,5 14,8 14,7 14,7 16,1 14,7 15,1 14,7 12,4 9,8 13,9 13,0 15,7 13,9 13,0 9,4 14,0

52,92 42,8 203,8 63,0 108,4 102,1 124,7 99,5 107,1 80,3 113,4 88,2 59,2 71,8 71,8 66,8 56,7 59,2 105,8 65,5

> 100 >> 100 >> 100 >> 100 > 50 < 100
100

>> 100 >20 < 50 >100 >> 100 > 100 > 100 >> 100 > 100 >> 100
100 20

> 100 > > 100

> = maior que; >> = muito maior que; aproximadamente;

Segundo Suzzi e Gardini (2003), o pH pode ser o fator chave que influencia na atividade de descarboxilao das enzimas formadoras de aminas biognicas. A mais de
BARTHOLOMEW, B. A.; BERRY, P. R.;RODHOUSE, J. C.; GILBERT, R. J.. Scombrotoxic fish poisoning in Britain: Features of over 250 suspect incidents from 1976 to 1986. Epidemiology and Infection. v.99, p. 775-782, 1987.
6

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setenta anos atrs, Koesseler et al.7 (1928), citados por Suzzi e Giardini (2003), sugeriram que a formao de aminas biognicas seria um mecanismo fisiolgico das bactrias em resposta ao meio cido. Buncic et al.8 e Maijala et al.9, ambos em 1993 e citados por Suzzi e Gardini (2003), afirmam que a alta produo de histamina pode estar relacionada ao decrscimo inadequado do pH nos primeiros dias da fermentao do produto. Na tabela 2, pode-se observar que o pH apresentou-se cido em 100% das amostras avaliadas, com valores variando entre 5,08 e 5,73. Os parmetros fsico-qumicos citados (pH e percentual de cloretos) parecem influenciar na formao de aminas biognicas, fato tambm sugerido nos estudos realizado por Gardini et al. (2001) com leite desnatado adicionado com diferentes concentraes de cloreto de sdio, onde a produo de aminas biognicas foi menor quando a concentrao de NaCl era maior. Alm do mais, a produo de aminas mostrou-se menor ainda na decorrncia de menores valores de pH. Entretanto, aps analisar os valores de pH e percentual de cloreto, demonstrados na tabela 2, no foi possvel estabelecer a mesma relao sugerida por Gardini et al. (2001) em peixes anchovados. 5.2 AMOSTRAS EXPERIMENTAIS A seguir, sero apresentados os resultados das anlises realizadas em amostras coletadas a partir dos trs processamentos tecnolgicos, aps tratamento estatstico dos dados. Foi avaliado o comportamento dos dados entre os processamentos e dentro de cada um destes.

KOESSELER, K. K.; HANKE,M. T.; SHEPPARD, M. S.. Production of histamine, tyramine, brochospastic and arteriospastic substance in blood broth by pure culture of microorganisms. Journal of Infectious Diseases. v.3, p. 363-377, 1928. 8 BUNCIC, S.; PAUNIVIC, L.; RADISIC, D.; VOJINOVIC, G. SMILJANIC, D.; BALTIC,M. Effects of gluconodeltalactone and Lactobacillus plantarum on the production of histamine and tyramine in fermented sausages. Intrnational Journal of Food Microbiology. v. 17, p. 303-309, 1993. 9 MAIJALA, R.; EEROLA, S.; AHO, M.; HIRN, J. The effect of GDL- induced pH degrease on the formation of biogenic amines in meat. Journal of Food Protection. v.56, p. 125-129, 1993.
7

77

5.2.1 Matrias-primas Ao observar os resultados apresentados na tabela 3, pde-se classificar a matria prima sardinha (S. brasiliensis) como adequada para a utilizao nos processamentos tecnolgicos. Para tal, foi utilizada como base a Portaria n 185 que se refere ao Regulamento Tcnico de Identidade e Qualidade de Peixe Fresco (BRASIL, 1997b). Tabela 3 Teor de Bases Volteis Totais BVT (mg de N/100g) e histamina (mg/100g) por Cromatografia em Camada Delgada (CCD) e Fluorimetria (F) sardinha (S. brasiliensis) utilizados no processamento tecnolgico de anchovagem. Coleta 1 BVT (mg de N/100g) 13,8 CCD (ppm) ND F (ppm) ND

De acordo com a RDC n 12 (BRASIL, 2001), os resultados das anlises bacteriolgicas realizadas com a sardinha (S. brasiliensis) apresentaram-se dentro do padro estabelecido, estando a matria prima apta para utilizao nos processamentos tecnolgicos estabelecidos. O sal utilizado na elaborao do produto tambm se apresentou adequado para uso, pois no houve crescimento bacteriano no que diz respeito Salmonella spp., Staphylococcus coagulase positivo, Coliformes totais e fecal e Enterococcus spp.. 5.2.2 Processamentos Tecnolgicos A, B e C A seguir sero apresentados os resultados das anlises bacteriolgicas e fsicoqumicas realizadas nas amostras dos processamentos A, B e C. 5.2.2.1 Resultados das anlises bacteriolgicas Ao longo do perodo de fermentao dos nove lotes, foram realizadas anlises bacteriolgicas em amostras coletadas de 15 em 15 dias. Houve crescimento bacteriano em algumas das anlises. Na tabela 4 podem ser observados os resultados. Houve o crescimento de Proteus spp., Shiguella spp., Escherichia spp., Klebsiella spp., Citrobacter spp., Pseudomonas spp. e Staphylococcus spp..

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Tabela 4 Resultados das anlises bacteriolgicas realizadas nas amostras coletadas dos nove lotes acompanhados ao longo do perodo de 90 dias de fermentao do produto. Lotes analisados Dias de Fermentao 0 15 30 45
Escherichia spp. Klebsiella spp. Escherichia spp. Klebsiella spp.

60

75

90

A1

A2

Proteus spp. Shiguella spp.

Citrobacter spp.

Crescimento no identificado Escherichia spp. Klebsiella spp. Escherichia spp. Klebsiella spp. -

A3

Proteus spp. Shiguella spp.

Escherichia spp. Klebsiella spp. Escherichia spp. Klebsiella spp. -

B1

Proteus spp. Shiguella spp.

B2

Proteus spp. Shiguella spp.

Escherichia spp. Klebsiella spp.

B3

C1

Pseudomona s spp. Klebsiella spp. Proteus spp.

Escherichia spp.

C2

Escherichia spp. Klebsiella spp. -

C3

Staphylococcus spp.

79

Alguns dos gneros bacterianos citados podem estar envolvidos na formao de histamina. Segundo trabalho realizado por Ababouch et al. (1991) foram isoladas 55 espcies bacterianas formadoras de histamina a partir de amostras de sardinha (Sardinella pilchardus) estocadas em gelo e a temperatura ambiente. Dentre as espcies isoladas, 51 pertenciam famlia Enterobacteriaceae, estando algumas implicadas na formao de histamina. Fez-se o isolamento das espcies bacterianas acima citadas no meio de Rambach , na fase de plaqueamento seletivo da metodologia utilizada para o isolamento e identificao de Salmonella spp.. Sendo assim, no foi possvel quantificar estas espcies nas amostras. Rambach (1990) descreveu este meio de cultura para a diferenciao da Salmonella spp. de outras espcies da famlia Enterobacteriaceae. Alguns dos gneros bacterianos isolados no presente trabalho so os mesmos apresentados por Niven et al. (1981), que elaboraram um meio de cultura para a deteco quantitativa de bactrias formadoras de histamina no qual foram isolados: Proteus morganii, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae, Edwardsiella sp. e Vibrio spp. Leito et al. (1983), estudando a ocorrncia de bactrias formadoras de histamina em pescado de origem marinha, constataram a presena de P. morganii, P. rettgeri, Vibrio spp. Aeromonas spp., Acinetobacter spp., Pseudomonas spp., Enterobacter spp. e Klebsiella spp. como algumas das espcies responsveis pela formao da amina em questo. Na amostra C3, coletada com 75 dias de fermentao, houve crescimento no meio de Baird Parker suspeito de Staphylococcus spp. e na tentativa de identificao da espcie foram realizadas as seguintes provas bioqumicas: catalase, coagulase, DNase, Termonuclease e oxidao e fermentao da glicose, alm da verificao das caractersticas morfotintoriais pelo mtodo de Gram. Na amostra C3, coletada com 75 dias de fermentao, houve crescimento no meio de Baird Parker suspeito de Staphylococcus spp. e na tentativa de identificao da espcie foram realizadas as seguintes provas bioqumicas: catalase, coagulase, DNase, Termonuclease e oxidao e fermentao da glicose, alm da verificao das caractersticas morfotintoriais pelo mtodo de Gram.

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Segundo o Manual Bergey (1994), o Staphylococcus coagulase positivo caracterizado por promover resultados positivos em todas as provas bioqumicas acima citadas, menos a da fermentao da glicose, que pode apresentar-se negativa, e possui caracterstica morfotintorial de coco Gram positivo. Na tabela 5, esto expostos os resultados obtidos das referidas provas bioqumicas sendo possvel verificar que a cultura testada apresentou caractersticas referentes ao gnero Staphylococcus, no sendo o S. aureus. Tabela 5 Resultados das provas bioqumicas realizadas em colnias suspeitas de Staphylococcus spp. repicadas do meio de Baird Parker para o Caldo BHI.
Provas bioqumicas
Caracterstica Morfotintorial (mtodo de Gram) Oxidao da glicose Fermentao da glicose Termonuclease

Catalase

Dnase

Coagulase

Resultado

Cocos G+

positivo negativo

positivo

positivo

negativo

negativo

Usando como base a RDC n 12 (BRASIL, 2001), na qual estabelecido o valor limtrofe mximo de 5 x 102 UFC/g da amostra para presena de estafilococos, a amostra C3 apresentou valor inferior estando dentro do padro estabelecido. 5.2.2.2 Resultados das anlises fsico-qumicas Na tabela 6, esto registrados os valores mdios obtidos das anlises fsicoqumicas realizadas com os trs processamentos tecnolgicos. Pode-se observar que no tempo 1, data de retirada do produto da pr-salga, o valor de BVT mais baixo foi de 18,6 16,9 mg de N/100 g da amostra, referente ao processamento em que a fermentao ocorreu sem a presena das vsceras, e no tempo 7, aps 90 dias de fermentao, o maio valor de BVT obtido foi de 62,1 mg de N/100 g do processamento usual da empresa. Ao longo dos trs processamentos realizados, os valores de BVT foram sempre crescentes. Os resultados da anlise de BVT se apresentam de acordo com os resultados obtidos por Oetterer et al. (2003) em pesquisa realizada no monitoramento do anchovamento de sardinhas, quando o valor inicial de BVT apresentou-se em 19,32 mg

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de N/100 g da amostra (sardinha fresca) e o final 56,79 mg de N/ 100 g da amostra, aps 60 dias de fermentao. Avaliando o comportamento das Bases Volteis nos trs processamentos, percebe-se que houve variao estatstica significante somente ao fim dos 90 dias de fermentao. Neste momento, os processamentos A e B obtiveram maiores valores de BVT, fato ocorrido em funo da presena das vsceras, pois no trato digestivo h presena de uma microbiota que influi na decomposio do pescado. Tabela 6 Valores mdios de N-BVT (mg N/100 g) obtidos nos processamentos tecnolgicos de sardinha (S. brasiliensis) anchovada atravs do mtodo de microdifuso em placa de Conway, por 90 dias. Processamentos Dias de fermentao A B C

23,1 16,9 a 19,7 16,9 a 18,6 16,9 a 0 23,5 12,7 a 17,6 12,7 a 15,1 12,7 a 15 a a 29,0 8,2 29,0 8,2 23,9 8,2 a 30 32,3 7,7 a 33,6 7,7 a 30,2 7,7 a 45 39,9 16,3 a 26,5 16,3 a 26,9 16,3 a 60 40,3 15,7 a 31,1 15,7a 34,4 15,7 a 75 62,1 17,3 a 50,8 17,3 ab 39,1 17,3 b 90 Mdias na mesma linha seguida de letras distintas diferem entre si no Teste Tukey (p<0,05). A presena do BVT resultante do efeito de vrias transformaes, originandose da degradao do OTMA e dos aminocidos livres por mecanismos diferentes, entre estes a decomposio pelas bactrias (CONTRERAS-GUZMN, 1994). Oetterer et al. (2003) compararam o processo de fermentao da sardinha (S. brasiliensis) com e sem vsceras e apresentaram valores bastante semelhantes aos demonstrados na tabela 9. Estes resultados apresentaram comportamento anlogo ao apresentado por Dissaraphong et al. (2005), que avaliaram a formao de BVT durante a fermentao de pescado e obtiveram maiores valores deste parmetro em presena das vsceras. Killine et al. (2006) apresentaram valores de BVT superiores ao exposto no presente trabalho, chegando a 210,58 mg de N em 100 g da amostra ao fim do perodo da fermentao. No entanto, o comportamento deste parmetro foi o mesmo, obtendo valores crescentes na medida em que o perodo de fermentao avanava.

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Os valores de pH, considerando todos os tratamentos, variaram entre 5,54 a 5,93. Inicialmente o valor do pH, no processamento A, foi de 5,67, sofrendo queda at 5,57 quando o produto estava com 45 dias de fermentao. Aps este perodo o pH aumentou, gradativamente, para 5,93 ao final dos 90 dias de fermentao. O comportamento destes dados ocorreu da mesma forma como apresentado por Oetterer et al. (2003). Tabela 7 Valores mdios de pH obtidos nos processamentos tecnolgicos de sardinha (S. brasiliensis) anchovada, por 90 dias. Processamentos Dias de fermentao A B C

5,67 0,14 a 5,54 0,14 a 5,61 0,14 a 0 5,60 0,17 a 5,56 0,17 a 5,56 0,17 a 15 5,57 0,16 a 5,63 0,16 a 5,56 0,16 a 30 5,64 0,11 b 5,86 0,11 a 5,71 0,11 b 45 5,76 0,14 a 5,81 0,14 a 5,84 0,14 a 60 a a 5,85 0,21 5,79 0,21 5,80 0,21 a 75 5,93 0,23 a 5,84 0,23 a 5,92 0,23 a 90 Mdias na mesma linha seguida de letras distintas diferem entre si no Teste Tukey (p< 0,05). Estatisticamente, as variaes dos valores de pH foram significantes somente aos 45 dias de fermentao. Os valores mdios de pH no processamento B variaram entre 5,54 e 5,86, no entanto, houve inverso no comportamento do pH quando comparado com o processamento A. Inicialmente, este parmetro apresentou valor de 5,54 e foi crescente at 60 dias de fermentao, quando chegou ao valor mximo de 5,86. Em seguida, houve ligeiro decrscimo do pH para 5,79 (75 dias de fermentao), chegando ao pH final de 5,84. No processamento C, a variao entre o pH inicial e o final foi amaior, estando entre 5,61 e 5,92. Inicialmente, o pH foi de 5,61 caindo par 5,56 aps 15 dias e aumentando gradativamente at 5,84 aos 60 dias de fermentao. Com 75 dias de fermentao, houve queda do pH sem significncia, seguida de aumento para 5,92 ao fim de 90 dias de fermentao.

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Houve variao estatstica para os valores de Aa encontrados no processamento A, como mostra a tabela 8. Alguns dos valores de Aa registrados esto abaixo do esperado para o produto fermentado em soluo saturada, como demonstra Jay (2005), que relata valores de 0,75 para produtos nesta condio. Tabela 8 Valores mdios de Aa obtidos nos processamentos tecnolgicos de sardinha (S. brasiliensis) anchovada atravs do aparelho PawKit , por 90 dias. Processamentos Dias de fermentao A B C

0,73 0,01 a 0,74 0,01 b 0,75 0,01 c 0 0,74 0,01 a 0,74 0,01 a 0,75 0,01 b 15 a b 0,75 0,02 0,75 0,02 0,74 0,02 a 30 0,72 0,02 a 0,73 0,02 a 0,73 0,02 a 45 0,71 0,02 a 0,73 0,02 a 0,74 0,02 a 60 0,72 0,01 b 0,73 0,01 ba 0,74 0,01a 75 0,72 0,01 b 0,73 0,01 ba 0,74 0,01a 90 Mdias na mesma linha seguida de letras distintas diferem entre si no Teste Tukey (p<0,05). O percentual de cloreto no apresentou diferena estatstica (p>0,05) ao longo de todo o perodo de fermentao, nos trs processamentos tecnolgicos, como pode ser observado na tabela 9, a seguir: Tabela 9 Valores mdios de cloreto (%) obtidos nos processamentos tecnolgicos de sardinha (S. brasiliensis) anchovada, por 90 dias. A B C

Processamentos Dias de fermentao

15,80 5,79 a 18,17 5,19 a 16,37 5,19 a 0 18,17 2,67 a 17,13 2,67 a 16,26 2,67 a 15 15,87 2,09 a 17,70 2,09 a 18,10 2,09 a 30 18,13 3,25 a 18,73 3,25 a 18,40 3,25 a 45 17,78 0,95 a 18,00 0,95 a 17,60 0,95 a 60 16,90 3,07 a 18,80 3,07 a 18,36 3,07 a 75 15,65 4,75 a 16,90 4,75 a 18,87 4,75 a 90 Mdias na mesma linha seguida de letras distintas diferem entre si no Teste Tukey (p<0,05). Aps extensa reviso bibliogrfica, no foi possvel encontrar resultados de pesquisas que avaliassem a formao de histamina ao longo da fermentao de produtos derivados do pescado.

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O Seafood Network Information Center (centro de informaes criado pela Universidade da Califrnia) apresenta parmetros sobre fermentao e salga de peixes e seus derivados. Entretanto, dentre os parmetros expostos no est prevista a quantificao de histamina como um procedimento analtico necessrio (TOM, 2007). Na tabela 10, observa-se o comportamento dos valores mdios da concentrao de histamina nos diferentes processamentos tecnolgicos elaborados, dando destaque aos valores mnimos e mximos encontrados em cada processamento. Tabela 10 - Ordenao mdia das concentraes de histamina (ppm) nos processamentos tecnolgicos A, B e C testados e seus respectivos valores mnimos e mximos, sendo a DMS = 4,58. Processamentos Mediana Valor Mnimo Valor Mximo Concentrao de histamina (ppm) A 11,0 a 0,0 24,8 B 6,4 b 0,0 197,6 C 1,8 c 0,0 43,3

Medianas na mesma linha seguida de letras distintas diferem entre si no Teste de Kruskal-Wallis (p<0,05). Os valores mnimos encontrados nos trs processamentos ocorreram em funo da utilizao de matria prima de boa qualidade. Mas quando observamos os valores mximos ocorridos, percebe-se que houve uma variao muito elevada dos valores. Estes intervalos demonstram que a distribuio estatstica dos dados da concentrao de histamina no normal (Curva de Gauss). Estatisticamente, houve diferena significativa entre os processamentos tecnolgicos, no que se refere quantificao de histamina. O processamento A, apesar de ter apresentado o valor mais elevado na mediana (11,0 ppm), foi o que apresentou menor intervalo dos dados entre a mnima (0,0 ppm) e a mxima (24,8 ppm). J o processamento B apresentou o valor mximo (197 ppm) mais elevado, e mediana (6,4 ppm) inferior ao processamento A. Este elevado valor est relacionado com o fato deste processamento conter vsceras ao longo de todo o perodo de fermentao do produto, possibilitando a presena de bactrias formadoras

85

de histamina, presentes no trato intestinal, vceras e brnquias, como relatam Ogawa e Maia (1999) e Leito (1983). O processamento C apresentou o menor valor da mediana (1,8 ppm), no entanto o valor mximo encontrado foi superior ao mesmo dado encontrado no processamento A, lembrando que foi realizada a toillete e eviscerao da sardinha (S. brasiliensis) antes do perodo de fermentao. A tabela 11 contm os valores mdios dos lotes de cada processamento onde pode ser observado o comportamento da concentrao de histamina ao longo do perodo de fermentao do produto. Houve a presena de histamina em valores crescentes ao longo de todos os perodos de fermentao. No processamento A, a mdia da concentrao de histamina nos lotes (A1, A2 e A3) apresentou valor inicial mdio 2,73 ppm e chegando a 21,73 ppm ao fim de 90 dias de fermentao. A histamina foi observada no processamento B em valores mdios (B1, B2 e B3) crescentes variando entre 2,13 ppm e 90,10 ppm. At 60 dias de fermentao, o produto apresentou 7,93 ppm de histamina. Em 15 dias este valor foi 2,5 vezes maior (18,65 ppm) e nos 15 dias finais da fermentao a concentrao de histamina aumentou 4,8 vezes chegando a 90,1 ppm de histamina. Tabela 11 Concentraes mdias de histamina (ppm) dos trs lotes de cada processamento tecnolgico estudado, ao longo do perodo de fermentao da sardinha (S. brasiliensis). Processamentos 0 15 30 45 60 75 90 Concentrao de histamina (ppm) A
2,73 4,87 7,93 9,48 14,07 14,07 21,73

B
2,13 4,87 6,40 7,93 7,93 18,67 90,10

C
0,00 0,60 1,20 1,8 1,80 11,00 32,50

Inicialmente, no processamento C, no foi determinada a presena de histamina na amostra, havendo, de forma lenta, aumento pouco significativo da concentrao desta amina biognica at a 5 coleta. Ao fim de 60 dias de fermentao, a

Dias de fermentao

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concentrao mdia (C1, C2 e C3) de histamina era de 0,80 ppm, aumentando para 11 ppm aos 75 dias de fermentao. Em 15 dias, a concentrao de histamina quase triplicou, chegando ao fim de 90 dias com 32,5 ppm. Observando os dados, no que se refere concentrao de histamina ao fim de 90 dias de fermentao, percebe-se que o produto contm concentraes desta amina em valores que podem causar reaes adversas nos indivduos que consumirem este produto, lembrando que a resposta fisiolgica presena da histamina idiossincrsica e no totalmente elucidada (LEHANE; OLLEY, 2000). Na Figura 16 pode ser observado o comportamento da concentrao mdia de histamina dos diferentes processamentos elaborados durante o perodo de fermentao atravs de um Plano Cartesiano.

Concentrao de histamina durante o perodo de maturao em parte por milho (ppm)

100 80 ppm 60 40 20 0 0 15 30 45 Dias 60 75 90
A
B
C

Figura 16 Plano cartesiano contendo as retas estabelecidas pelos valores mdios da concentrao de histamina dos trs lotes de cada processamento tecnolgico trabalhado.

6 CONCLUSES E CONSIDERAES Ao avaliar a qualidade dos peixes anchovados comercializados no mercado varejista, despertou-se grande preocupao com relao presena de histamina, pois esta ocorreu em elevadas concentraes. Este fato procede para os produtos nacionais e importados. Ao avaliar os processamentos tecnolgicos, o processamento usual da empresa com a qual se trabalhou apresentou melhor resultado, em funo da baixa concentrao de histamina ao fim do processo de fermentao, no havendo a necessidade de adequao do processamento. No entanto, devido ao isolamento de bactrias suspeitas de estarem envolvidas na formao de histamina, acredita-se que possam existir outros procedimentos que determinem a melhora do produto final, para tanto, seriam necessrios mais estudos especficos. Mais estudos sobre este processamento tecnolgico so necessrios pois ao observar os resultados da primeira etapa do presente trabalho, no que diz respeito concentrao de histamina, confrontando-os com os resultados da mesma varivel na segunda etapa, percebe-se que h uma diferena significativa entre os valores. Em face disto, acredita-se que o processo de produo de histamina continue no produto pronto, sendo necessrio acompanhar o produto ao longo de sua validade comercial para avaliao, at expirar a data da validade. Em paralelo ao acompanhamento da formao de histamina no produto pronto, sugere-se que sejam realizadas mais anlises bacteriolgicas na tentativa de identificar a presena de uma bactria cidoltica que pode estar envolvida na formao da histamina, o Tetragenococcus muriaticus.

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8 APNDICES 8.1 QUADRO DE COLETA DE AMOSTRAS

97

Imprimir quadro

98

8.2 FICHA DE COLETA DE DADOS DA MATRIA PRIMA

INFORMAO SOBRE AS AMOSTRAS DE MATRIA PRIMA

SARDINHA: Data de coleta: Origem da matria prima: Coletor da amostra (nome): Condies de transporte at a empresa: Temperatura da matria prima na recepo: Peso mnimo das amostras: 500 gramas. Observaes: ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________

SAL: Data de coleta: Origem da matria prima: Coletor da amostra (nome): Peso mnimo das amostras: 500 gramas. Observaes: ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________

99

8.3 FICHA DE COLETA DE DADOS DAS AMOSTRAS EM FERMENTAO

INFORMAO SOBRE AS AMOSTRAS

Data de coleta: Temperatura ambiente: Coletor da amostra (nome): Peso mnimo das amostras: 500 gramas. A. Processamento Tecnolgico usual da empresa; B. Processamento Tecnolgico maturando peixe inteiro; C. Processamento Tecnolgico maturando peixe eviscerado.

A1 Peso (g): Salinidade ( B): Temperatura da salmoura (C): A2 Peso (g): Salinidade ( B): Temperatura da salmoura (C): A3 Peso (g): Salinidade ( B): Temperatura da salmoura (C): B1 Peso (g): Salinidade ( B): Temperatura da salmoura (C): B2 Peso (g): Salinidade ( B): Temperatura da salmoura (C): B3 Peso (g): Salinidade ( B): Temperatura da salmoura (C): C1 Peso (g): Salinidade ( B): Temperatura da salmoura (C): C2 Peso (g): Salinidade ( B): Temperatura da salmoura (C): C3 Peso (g): Salinidade ( B): Temperatura da salmoura (C):

Obs:

Obs:

Obs:

Obs:

Obs:

Obs:

Obs:

Obs:

Obs:

100

9 ANEXOS 9.1 FLUXOGRAMAS DOS PROCESSAMENTOS

101

9.1.1 Fluxograma do Processamento usual da empresa (A) RECEPO (PCC 1) Averiguao da presena de peixes
deteriorados e controle da temperatura (< 4C)

SELEO

LAVAGEM (gua + 5ppm Cloro) PR-SALGA (PCC 2) Utilizao de tanques higienizados e

Controle da salinidade da salmoura com o mnimo de 24 B.

TOILLETE (eviscerao e descabeamento) FERMENTAO (etapa realizada em salmoura saturada por, no mnimo, 90 dias em ambiente com temperatura controlada: 25 C) PRENSAGEM (PCC 3) FILETAGEM EMBALAGEM (PCC 4) ESTOCAGEM EXPEDIO

Retirada do excesso de salmoura com presso de 2 a 6 T por 20 minutos.

Aferio do equipamento de formao de vcuo e recravao das embalagens.

102

9.1.2 Fluxograma do Processamento com fermentao de peixe inteiro (B)

RECEPO

SELEO

LAVAGEM (gua + 5ppm Cloro) FERMENTAO (etapa realizada em salmoura saturada por, no mnimo, 90 dias em ambiente com temperatura controlada: 25 C) TOILLETE (eviscerao, descabeamento e retirada da pele)

PRENSAGEM

FILETAGEM

EMBALAGEM

ESTOCAGEM

EXPEDIO

103

9.1.3 Fluxograma do Processamento com fermentao de peixe eviscerado (C)

RECEPO

SELEO

LAVAGEM (gua + 5ppm Cloro) TOILLETE (eviscerao e descabeamento) FERMENTAO (etapa realizada em salmoura saturada por, no mnimo, 90 dias em ambiente com temperatura controlada: 25 C) TOILLETE (retirada da pele)

PRENSAGEM

FILETAGEM

EMBALAGEM

ESTOCAGEM

EXPEDIO