UNIVERSIDAD AUTNOMA BENITO JUREZ DE OAXACA

Facultad de Ciencias Qumicas

Laboratorio de Inmunologa

Titular: QB. Antonio Girn

REPORTE DE PRCTICA N. 1 Pruebas Cruzadas

MESA # 4 Alumnos: Cruz Hernndez Diego Sait Patricio Jimnez Vctor Eduardo Ros Ros William de Jess Ruiz RosBrbara Zrate Ramos Rosa Andrea 6to Semestre Grupo: A

Ciclo Escolar: 2014 2014

Marzo de 2014, Oaxaca; Oaxaca

INTRODUCCIN

Las pruebas cruzadas son procedimientos relativamente sencillos pero de gran cuidado, que tienen como propsito garantizar la compatibilidad serolgica (in vitro) entre la muestra de sangre del receptor y la unidad de sangre que se le pretende transfundir. La validez de las pruebas cruzadas radica en la correlacin que existe entre las pruebas de compatibilidad realizadas in-vitro y la sobrevida de los hemates en la circulacin del paciente. Como mencionamos, el objetivo de las pruebas de compatibilidad es prevenir la transfusin de sangre incompatible (definimos como compatibilidad de transfusin como la falta de reaccin inmune entre antgenos (Ag) y anticuerpos (Ac) de donante y receptor, donde la compatibilidad no garantiza identidad entre ambos, solamente indica que, en ese momento, no habr disminucin de rendimiento transfusional por causa inmune) Desde este punto de vista las pruebas cruzadas deben garantizar: La compatibilidad de ABO y Rh entre el receptor y la unidad que se pretende transfundir. Que el suero del receptor no existan anticuerpos de importancia clnica contra los antgenos eritrocitarios del donante. Que en el plasma de la unidad de sangre no existan anticuerpos de importancia clnica contra los antgenos eritrocitarios del receptor.

Entre las medidas de seguridad transfusional estn aquellas encaminadas a evitar la reaccin hemoltica aguda, es decir, las que aseguran la compatibilidad entre donante-receptor.

OBJETIVOS Realizar pruebas cruzadas de compatibilidad sangunea para:

Garantizar que los eritrocitos a transfundir son ABO compatibles con el receptor. Detectar anticuerpos en el suero del receptor que estn dirigidos contra antgenos presentes en los eritrocitos del donante.

FUNDAMENTO

Las pruebas de compatibilidad sangunea se efectan rutinariamente en solucin salina al 0.85 %, en este medio los anticuerpos que aglutinan son principalmente de la clase IgM. Las pruebas cruzadas son dos y reciben este nombre porque se hace reaccionar en tubo: El plasma o suero del receptor con los glbulos rojos del donador (prueba mayor). El suero o plasma del donador con los glbulos rojos del receptor (prueba menor) Estas pruebas sirven para asegurar que todos los glbulos rojos transfundidos son compatibles con los anticuerpos que contiene el plasma del paciente. As como tambin, para evitar estimular la produccin de nuevos anticuerpos contra los glbulos rojos en el receptor especialmente anti-Rh D. Las pruebas cruzadas se dividen en: a) PRUEBA MAYOR: Consiste en poner a reaccionar el suero del receptor con los eritrocitos del donador. En la prueba mayor se verifica los anticuerpos del paciente (plasma o suero) que se encuentran en gran volumen, contra los glbulos rojos del receptor. b) PRUEBA MENOR: Consiste en poner a reaccionar el suero del donador con los eritrocitos del receptor. Esta prueba se realiza cuando se va a transfundir plasma. El empleo de albmina bovina facilita la deteccin de anticuerpos de la clase IgG. Ya que stos muy frecuentemente se ven impedidos en su efecto aglutinante por el potencial Z. Estas pruebas son requerimiento fundamental, porque es la mejor manera de detectar anticuerpos que puedan daar las clulas rojas transfundidas y causar una reaccin hemoltica transfusional.

PROCEDIMIENTO A. Equipo, Material y Reactivos Necesarios Reactivos Los reactivos debern de ser de grado analtico Solucin salina isotnica 0.9% Solucin de albumina bovina al 22% Materiales 4 tubos de ensaye de 13x100 Pipetas Pasteur desechables Parafilm Tubos Vacutainer con y sin EDTA Ajugas para venopuncion Torundas de alcohol Torniquete Material Biolgico Suero de donador y receptor. Suspensin de eritrocitos al 5% de donador y receptor Aparatos e instrumentos Centrfuga. Bao mara a 37 C B. Desarrollo de la Practica Preparacin de las Muestras Biolgicas 1. Extraccin de una muestra de sangre venosa. a) Realizar la extraccin de una muestra de sangre total por puncin venosa en un tubo con EDTA y uno sin anticoagulante. Ambas muestras debern obtenerse tanto para el donador como para el receptor.

b) Esperar 15 minutos para que la muestra sin aditivo coagule completamente.

c) Centrifugar la muestra sin anticoagulante para obtener el suero durante 5 minutos a 2500 r.p.m.

d) Concluido el proceso de centrifugacin verificar que el gel separador se encuentre entre las dos fases de la sangre total y que el suero sea transparente y no presente hemlisis.

2. Preparacin de la suspensin de eritrocitos. a) De la sangre total con EDTA bien mezclada colocar 10 gotas en un tubo de ensaye, agregar solucin salina isotnica hasta partes del tubo de ensaye, colocar parafilm en la boca del tubo, mezclar suavemente por inversin. b) Centrifugar durante 3 minutos a 1500 rpm. c) Transcurrido el tiempo de centrifugacin decantar con cuidado el sobrenadante y desecharlo. d) Volver a adicionar solucin salina isotnica como en el inciso a y repetir el mismo procedimiento que en b y c de manera que se deben realizar un total de 3 lavados. e) Una vez que se tenga el paquete de eritrocitos lavados, resuspenderlo en solucin salina isotnica para obtener una concentracin aproximada del 5%. Procedimiento. Fase I. Salina rpida. 1. En un tubo marcado como PM (Prueba Mayor), colocar dos gotas de la suspensin de eritrocitos del donador y dos gotas del suero del receptor. Mezclar suavemente.
2 Gotas de Suspensin eritrocitaria del Donador 2 Gotas de suero del Receptor

2. En un segundo tubo, marcado como pm (prueba menor), colocar dos gotas de la suspensin de eritrocitos del receptor y dos gotas del suero del donador. Mezclar suavemente.
2 Gotas de suero del Donador 2 Gotas de Suspensin eritrocitaria del Receptor

3. Centrifugar ambos tubos a 1000 rpm durante 60 segundos.

4. Observar el sobrenadante de ambos tubos en busca de hemlisis. Resuspender suavemente el, botn de los eritrocitos en busca de aglutinacin. Anotar los resultados.

Fase II. Albmina.

5. En caso de no observar aglutinacin en los tubos de la fase I, agregar a ambos tubos dos gotas de la solucin de albmina bovina al 22%. Mezclar suavemente. 6. Incubar a 37 C durante 15 minutos.

7. Transcurrido el periodo de incubacin centrifugar ambos tubos a 1000 rpm durante 60 segundos. 8. Resuspender suavemente el botn de eritrocitos y buscar la presencia de aglutinacin. Anotar sus resultados.

RESULTADOS

Dentro del desarrollo de la prctica usamos dos grupos sanguneos diferentes pertenecientes al sistema AB0, y se realizaron las pruebas de forma siguiente: Prueba Salina Rpida. 00 Donador (Vctor): Grupo 0 Receptor (Sal): Grupo 0
Paquete Eritrocitario. Donador. Grupo 0 Suero. Receptor. Grupo 0

En la Prueba Mayor (PM) entre grupos 00 no hay aglutinacin. Los anticuerpos y los antgenos son compatibles y por tanto la aglutinacin no se presentara.

Suero. Donador. Grupo 0

Paquete Eritrocitario. Receptor. Grupo 0

En la prueba menor (pm) entre los grupos 00 no se presento aglutinacin. Sucede el mismo caso que con la PM, sin embargo se realizaran a la PM y la pm la prueba de albumina.

Prueba Salina Rpida. A0 Donador (Vctor): Grupo 0 Receptor (Alan): Grupo A

Paquete Eritrocitario. Donador. Grupo 0 En la Prueba Mayor (PM) entre grupos A0 no hay aglutinacin. Los eritrocitos del grupo 0 no presentan antgenos que interacten con los anticuerpos del suero del grupo A y por tanto no hay aglutinacin.

Suero. Receptor. Grupo A

En la prueba menor (pm) entre los grupos 0A se presento aglutinacin. Esto se debe a que los antgenos presentes en los eritrocitos del grupo A interacciona con los anticuerpos presentes en el suero del grupo 0, puesto que el grupo 0 posee anticuerpos Anti-A y Anti-B, provocando as la aglutinacin en los eritrocitos.

Suero. Donador. Grupo 0

Paquete Eritrocitario. Receptor. Grupo A

Prueba. Albmina. Grupos 00 A los tubos de PM y pm de los grupos 00, donde no hubo aglutinacin se realizo la prueba de Albumina.

Se aaden 2 gotas de albumina a cada tubo, se llevan a bao mara a 37C por 15 min, y se centrifugan a 1000 rpm por 1 min.

PM

No hubo aglutinacin

pm

No hubo aglutinacin

Al no presentar aglutinacin significa que la sangre del receptor y el donador son COMPATIBLES.

DISCUSIN

Las determinaciones de grupos sanguneos son pruebas de alta demanda en cualquier laboratorio clnico, sea para el simple conocimiento del tipo de sangre o para un propsito determinado, sin que este siga algoritmos adecuados de control de calidad. Estos casos, sin aprobarlos, pueden pasar desapercibidos las simples tcnicas usadas. En banco de sangre esto no debe pasar por alto. En la prctica se han analizado las posibilidades de las diferentes reacciones antgeno-anticuerpo que se pueden presentar sangre, cuando se encuentran en contacto fluido sanguneo (tanto plasma como sangre) de diferentes individuos; se ha establecido que incluso individuos con sangre que en un principio parecen similares, pueden no ser compatibles y por tanto generar problemas de salud importantes. Por tal motivo se debe hacer nfasis en el control de calidad de los laboratorios mediante la aplicacin de tcnicas cruzadas (pruebas cruzadas) para evitar reacciones no deseables. Las pruebas cruzadas deben ser obligatorias, realizando toda la metodologa correspondiente. Un resultado negativo en una reaccin entre individuos de dos tipos de sangres diferentes no se puede considerar como una compatibilidad segura. Factores como el potencial Z, la variabilidad de grupos antignicos presentes en la membrana, el desequilibrio entre la concentracin Ag-Ac (postzona y persona) generan resultados ambiguos.

Las reacciones inmunolgicas entre antgenos y anticuerpos no son simples aglutinaciones como los que se analizan en las practicas, dentro del organismo, estas desencadenas patologas graves y es por eso la importancia de estas.

CONCLUSION

La respuesta inmune generada por el organismo frente a un antgeno se fundamenta en reacciones de los anticuerpos contra estos antgenos. La presencia de antgenos sobre la membrana de los eritrocitos permite obtener una visin clara de estas respuestas, cuando existe una interaccin de estos eritrocitos con anticuerpos xenbioticos o viceversa. Las reacciones antgeno-anticuerpo se pueden determinar mediantes pruebas bsicas y tpicas de laboratorio, como lo son las pruebas de grupo sanguneo comunes. Estas pruebas nos permiten cuantificar de manera cualitativa respuestas inmunolgicas sobre antgenos del sistema ABO, observando reacciones de aglutinacin o de hemlisis. El anlisis de estas reacciones aglutinantes y/o de hemlisis ilustran las una interaccin entre un antgeno y un anticuerpo, lo que est determinado por una respuestas inmune. Cuando no se observan estas caractersticas, podemos imaginar en un principio que no existe tal respuesta inmune. Hablando en trminos de una transfusin de sangre, estas reacciones se pueden traducir en compatibilidad o no compatibilidad de sangre entre donadores y receptores. En las prcticas de transfusin es importante no cometer errores en la determinacin de estas reacciones, as como en su apreciacin. Es por eso de la importancia de realizar pruebas cruzadas, en donde, a sabiendas de las diferentes interacciones que nos resultaran sin compatibilidad y por tanto una aglutinacin y/o hemlisis, debemos tener la absoluta certeza de una compatibilidad. Dos individuos con la mismo tipo de sangre no pueden estar descartados de una incompatibilidad. La membrana del eritrocito presenta una variedad de antgenos que pueden afectar la reaccin antgeno-anticuerpo, o antgenos que no son potencialmente inmunogenos; pueden existir factores como el potencial Z, que alteran en cierto grado la reaccin. Por tal motivo las pruebas cruzadas son tcnicas obligatorias para el control de calidad de un laboratorio de transfusin.

CUESTIONARIO

1. Menciona al menos cuatro sistemas de clasificacin de grupos sanguneos. Sistema ABO. Sistema Rh. Sistema MNS. Sistema Lutheran. Sistema Diego. Sistema Duffy.

2. Explica el concepto de potencial Z aplicado a las membranas de los eritrocitos. La superficie de los glbulos rojos tiene carga elctrica negativa debido a las molculas de cido silico de la membrana. Cuando los hemates estn en suspensin en soluciones que contienen iones libres, los cationes son atrados por las cargas negativas de la superficie del glbulo rojo, de modo que se forma una nube inica positiva alrededor de los glbulos rojos que, por estar constituida por cargas elctricas del mismo signo, crear una repulsin entre los eritrocitos. Esta repulsin se conoce con el nombre de potencial Zeta.

3. Cmo est constituida una inmunoglobulina? Una molcula de inmunoglobulina (Ig) o tambin llamada anticuerpo es una glicoprotena que se produce por los linfocitos B o sus clulas derivadas, las clulas plasmticas; tiene una estructura nuclear simtrica compuesta de dos cadenas ligeras idnticas y dos cadenas pesadas idnticas; dichas cadenas contienen una serie de unidades repetidas, homologas, de aproximadamente 110 aminocidos de longitud, que se pliegan en una estructura globular llamada dominio de Ig. Un dominio de Ig tiene dos capas de lmina plegadas en , ambas se mantiene unidas mediante un enlace disulfuro y hlices adyacentes a cada lamina se conectan mediante asas cortas. Las cadenas pesadas y ligeras constan de regiones amino terminales variables (V) que participan en el reconocimiento del antgeno y de

regiones carboxilo terminales constantes (C); las regiones C de las regiones pasadas median las funciones efectoras.

BIBLIOGRAFA

Abbas, Abul K. Inmunologa Celular y Molecular. 7 Edicion, Editorial ELSEVIER, Barcelona, Espaa, 2012. Murphy Kennet, Travers Paul, Walport Mark. Inmunobiologia de Janeway. 7 Edicion, Editorial McGraw-Hill. Espaa Roit. Inmunologa, Fundamentos. 10 Edicion, Editorial Medica Panamericana, Barcelona, Espaa. Kuby. Inmunologa. 6 Edicion. Editorial McGraw-Hill, Impreso en Mxico, 2007.