Indice

Tipos de agua .................................................................................................................... 4 . 4g a s naturales ................................................................................................................ -4 Parjmetros microbiolgicos en los anlisis de agua para consumo humano .......................7 . . Microorganismos indicadores .......................................................................................... 9

Principales rnicroorganismoc rndicadores ........................................................................ Toma de muestras ........................................................................................................... Analisis microbiolbgico del agua de distribucin para uso domstico e industrial ............ Examen niicrobiologico de aguas de Instalaciones recreativas ......................................... . . .. Biocorrosron en circuitos de agua ....................................................................................

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Mtodos de anlisis vnici+obiul@co ..................................................................... 21

Recuento de bacterias aerobias ........................................................................................ 22 Recuento dc colifonnes ................................................................................................ 24 Recuento por el metodo de los tubos rnultiples ...................................................... 24 Recuento por la tecnica de filtro de membrana ..................................................... 31 Recuento de coliformes con tcnicas de deteccin enzimatica ............................... 35 Recuento de mtert>cocos fecales ...................................... A7 41 Recuento de esporas de Clostridizim sulfim-reductores ................................................... Invedgacibn de Salmonella ............................................................................................ 43 hvesrigacion y recuento de Pseudomonas ....................................................................... 47 Investigacjn y recuento de Sr~phylococcusaureus ........................................................ 49 Investigacin y recuento de Ebrio .................................................................................. 51

Investigacin de bacterias sulfato-reductoras ................................................................... . . . Investigacion y recuento de hongos ............................................................................... Investigacin de bacteriofqos ........................................................................................ Tmica de epifluorescencia directa sobre a t r o de membrana para la cuantificacin rpida de bacterias e n agua................................................................................. Oms tecnicas de deteccion e identificacin.....................................................................

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TIPOS DE AGUA

Aguas naturales
Las aguas naturales se clasifican en:
Agua atmosferica: contenida en las nubes y que se precjpita corno lluvia, nieve s granizo. Agua superficialm lagos, torrentes, ros, cc8anos, etc. Ague subterrnea: situada en e l subsuelo y que,en ocacjones, puede brotar en fuentes

o manantiales u obtenerse mediante pozos.

Cada tipo de agua tiene sus micro~rganismss especificoc. Los del agua atmosfrica son organismos del aire. Losde las aguas cbtarineas estan afectados por el proceso de filtrach y es por ello que las aguas subterrneas profundas estn en muchas

ocasiones libres de microorganismos.

Las aguas superficiales, sin embargo, representan ecosistemas bioldgices muy complejos y son succeptib!es de contaminaciiin peridica con microorganismcs procedentes de agua atmosfrica, el arrastre de la supeficie de l a tierra y de Ics desechos indus:riafes y domsticos.
Los microorganismos se distribuyen en el medio acutico en todas las profundidades,
pero las mayores poblacionesdemimorganisrnos se haHan particularmenteenla capa

superficial y en los sedimentos del fondo.

La mayor parte de la poblaciori rnicrobiana de la capa sulperFicial est formada por microerganismos fotosintticos, tanto microalgas como bacterias fotosintticas. La poblacibn bentonlcesta fomiadafundarnentaimente por bacterias que intervienen en importantes procesos degradativos de la materia orgdnica y en proces3s de remineralizacibn que forman parte de los ciclos de los distintos elemertos. En este grupo se sitan todas las bacterias que presentan metabolismo anaerobio.
L-as aguas superficiales, tanto de torrentes como de los rias, son utilizadas para e[ suministra de agua a las ciudades, a la industria y a la agricultura y, tras su utilizaci6r1, son devueltas de nuevo a los ros, en los cueles posteriormente pueden ser utilizadas de nueva. Esto hace que la poblacin rnicrobiana de estos ras incluya una serie de micraorganismas que no le son propios.

-Y

Desde el punto d e vista del consumo existen distintos tipos de agua que se definen a canti1~usci0n.

Agua potable
Aquella cuyos caracteres estn por debajo de los valores mximos tolerables (Real Decreta 113811990; B.O.E. 20-9-1990).
Aguas potables de consuma publico

Son aquellas aguas potables utilizadas parz este fin, cualquiera que sea su
Afusrer en Ciencia c Tecna!on'a Amhi6~rol

origen, bien en su estado natural o despues de un tratamiento adecuado, ya sean aguas destinadas directamente al consumoo aguas utilizadas en la industria alimentaria para fines de fabricacin, tratamiento, conservacin o ~omercialiracion de productos o sustancias destinadas al consumo humano y que afecten a la salubBdad del producto afimentario final (Real Decreto 113811990; B.O.E. 20-9-1990).

Agua tratada o acondicionada

Es aquella que habiendo sido sometida a un tratamiento adecuado, rene las caractersticas propias de las aguas potables (Real Decreto 1138/1990; B.O.E. 20-93 990).
Aguas de bebida envasadas

Son las aguas que se comercializan envasadas y cumplen todas las especificaciones correspondientes al tipo de agua especfica. Estos tipos de agua se definen a continuacion.
Aguas minerales naturales

Son aquellas bacteriologicamente sanas que tienen su origen en un estrato o yacimiento subterraneo y que brotan de un manantial en uno o varios puntos de alumbramiento, naturales o perforados (Real Decreto 11641199q; B.O.E. 26-7-199 1). Estas pueden distinguirse claramente de las restantes aguas potables: a ) por su naturaleza, caracterizada por su cantenida en minerales, oligoelementos y otros componentes y, en ocasiones, por determinados efectos sobre la salud b) por su pureza original.
Estas caractersticas han S jetvadas intactas, dado el origen subterraneo del agua, mediante la proteccibn del acu ifero contra todo riesgo de contaminacin. . Aguas de manantial Son las aguas potablecde origen subterrneo que emergen espontneamente en la superficie de la tierra o se captan mediante labores practicadas al efeclo, con las caracteristicas naturales de pureza que permiten su consuma, previa aplicacion de los mnimos tratamientos fsicos requeridos para la separacin de los elementos materiales inestables (Real Decreto 1164/1991; B.O. E. 26-7-1991).

Aguas preparadas

Son las sometidas a los tratamientos fsico-qumicos autorizados necesarios para que renan !as caractersticas sanitarias adecuadas.Se diferencian los siguientes

tipos:

potables preparadas: cuando procedan de un manantial de captacin. de abastecimiento pUblico preparadas: en el supuesto de tener dicha procedencia.

Ana!isc n::crobio~ox:ca da cg:tn pisin:i c;

Aguas de c o n s u m e piblico envasadas

Son aquellas aguas potables d e consumo pblico, envasadas pasa distribucin

domiciliaria con el irnico objeto de suplir ausencias o insuficiencias accidentales de las aguas de consumo pblico distribuidas por la red general.

gua no potable nquella cuyas condiciones fsico-quimicas ylo caracteres microbiolgicos o de radiactividad impiden su inclusin en alguna de las anteriores. Se prohibe la distribucin y consumo de agua no potable.

M~ster en Cienna e TecnoloxiaAmbiental

PARMETRQS MICROB~OL~GICOS EN LOS ANALISIS DE AGUA PARA CONSUMO HUMANO Los anglicis rnicrobio!giws del agua tienen porobjeto ponerde manifiesto la presencia

de microorganicmoc que modifican la aptitud del agua para una utilizacibn determinada. Estas modificaciones son frecuentemente complejas y las variaciones pueden ser
simultneamente favorables y desfavorables, segun la utilizacibn pretendida. El aporte de materias fecales en un agua supericial vuelve este agua inepta para ciertos usos de orden higinico; por contra, el aporte de gran nimero de otros microorganicmoc acompaantes facilita la destniccibn de la materia organica de! agua y refuerza su capacidad de autodepuracion. Todo anlisis microbiol8gico no puede, pues, efectuarse e interpretarse correctamente ms que en funcibn de la utilizacin pretendida del agua.

Desde el punto devista de las aguas de consumo solo son de temer los rnicmorganismos patgenos para el hombre o los animales; sin embargo, cuando se encuentran en un agua su nrlrnero suele ser limitado y su puesta en evidencia difcil; adems, si su presencia se utiliza como criterio de no potabilidad del aaua, probablemente sta haya
sido consumida antes de que se haya hecho un diagnstico y tornado las medidas de proteccin adecuadas. Por tanto, ms que descubrir la presencia efectiva de microorganisrnos patogenos, se deben determinar las circunstancias en que esta presencia es posible.

La manifestaci~n de una contaminacin fecal constituye luna excelente seal de alarma. Un agua con contaminacin fecal se considera no apta para el consumo (no potable), ya que no se puede esperar a determinar si esa contaminacin fecal proviene de un individuo sano o enfermo. Siempre contaminacin fecal indica agua no potable. Una contaminacin de este tipo puede evidenciarse por la presencia de una bacterja que viva general o exclusivamente en el intestino humano y de los animales de sangre caliente. Este diagnbstico puede ser directo, por aislamiento en el agua de la propia bacteria, o bien indirecto, por la demostracin de la presencia de bacteribfagos. especficos. E. col, los coliformes fecales y los enterocos tienen un origen exclusivamente fecal. En el caso de los Clostndiurn sulfito seductores este origen es frecuentemente feca!, pero no es exclusivo. La presencia de los bacferifagos llamados fecales en un agua se considera igualmente como la prueba de su contaminacin por las bacterias fecales (estas ltimas pueden haber desaparecido del agua en el momento de manifestarse los bacterifagoc). Si la presencia de bacterias fecales en un agua es el signo de una contaminacin fecal cierta, es decir de una contaminacin posible por microorganismos patbgenoc, s u ausencia no significa que el agua no pueda estar contaminada.
Recientemente se ha demostrado la importante significacin de Pseudomonas

aeruginasa en !a calidad de un agua. Cuando est presente en el agua demuestra una

contaminacin inaceptable y, adems, puedejugar en ciertas condiciones (piscinas) un importante papel patgeno. Asimismo, se ha demostrado la importancia de la presencia de otro$ patgenos, coma Sfaphytococcus aureus, Sairmanella, etc.

Otro aspecto a tener en cuenta es la variacin de la poblacin rnicrobiana global de un agua, que puede deberse a diversas causas, una de ellas el aporte de bacterias

exgenas.
,Wsiar en C ~ n u e a Tecnoloxio Ambiental

Las tres grandes lneas de los anlisis microbio2gicos de agua son, por tanto, la investigacin de bacteflas patogenas, de bacterias d e origen fecal y el estudio de la poblacin microbiana global.
Otros examenes

Entre los exCimenes microbiolgicos mas utilizados, con fines no sanitarios, hay muchos relacionados con la corrosion de las canalizaciones, principalmente los recuentos de las bactedas culfatorreductoras. Adems de su inters sanitario, los recuentos de! conjunto d e las bacterias dan indicaciones tiles en este campo.

La presencia de actinomicotos en las aguas les da olores extremadamente desagradables, aunque en la practica no tienen consecuencias higinicas. Sin embargo, cada
vez se solicita mas la investigacin de estas bacterias.

La defeccin de organismos patbgenos es posible y cada vez ms asequible, pero nunca puede ser el Unico procedimiento utilizado en el exmen rutinario de aguas de bebida, piscinas, etc, ya que la aparicin de estos organismos es intermitente, la mayora de las veces de corta duracin y los organismos son pocos y suelen estar atenuados. En cualquier caco, el agua ya habr sido consumida cuando se realice la deteccin de los microorganismos patogenos. Los exmenes rutinarios deben basarse en mtodos mas prcticos, como la deteccin de microorganismos que revelen la presencia de sustancias excretadas por animales de sangre caliente e el hombre, o de
otro tipo de contaminacin, denominados microorganismoc indicadores.

Idealmente, las especies o comunidades de especies seleccionadas como indicadores deberan reflejar no solo !a presencia o ausencia de un contaminante especifico, sino tambin los niveles relativos de polucibn y sus fluctuaciones peridicas. Estas especies deberian ser validas tanto en Socalizaciones geogrhficas pequeas como en grandes masas de aguas. Este tipo ideal no existe, y los organismos en cuestin pueden agruparse funcionalmente en tres categonas, sin limites delimitados:
a.- organismos indicadores, utilizados primariamente para identificarcambios ambientales o factores que pueden ser desconocidos; b.- organismos monitores, utilizados para cuantificar niveles de contaminacin; c.- organismos de ensaya, estudiados en condiciones controladas en el laboratorio para interpretar y, posteriormente, evaluar la importancia de los datos de campo.
Algunas bacterias son tpicamente monitores de contaminacin fecal en e l medio acutico. Su utilidad muchas vecesse restringe a las reas proximasde contaminacibn (E. coli),si bien las formadoras de esporas, como C.perfringens, se distribuyen mas ampliamente y pueden, por tanto, identificar una contamjnacion distante en el tiempo y espacio. Algunas bacterias pueden indicar residuos industriales especficos o disting~iir la contaminacin humana de la animal. Una de las ventajas de las bacterias, y otros microorganismos, como indicadores es que pueden identificarse con tcnicas simples,se pueden manejar muchas muestras a la vez y Izs tcnicas son muy sensibles.

Cuando sc trata con bacterias monitoras, hay dos aspectos de particular importancia: precisin y exactitud de las medidas e identificacibn de 10s organismos. Dentro de ciertos [imites de error, debe ser posible hacer un recuento de miembros de uno o n4as
gnipostaxonmicos bien definidos y, al mismo tiempo, demostrar la identidadde estos. Los requerimientos ideales de un organismo indicador son los siguientes:
1.- Estar presente en agua contaminada y ausente en agua potable 2.- Estar presente en el agua cuando en ella hay patbgenas 3.- La cantidad de organismos indicadares debe estar en reracin con la cantidad de

contaminacibn
4.- Tenor mas capacidad de supervivencia que los patbgenos 5.- Tener propiedades estables y uniformes
Mu~ret en Crenciu e Tecmloxia Ainbiental

6.- No ser dainos para los animales y el hombre 7.- Estar presente en mayor nmero que los patgenos 8.- Ser fciles de detectar y cultivar en medios sencillos

La presencia de especies indicadosas indica contaminaci0r1, pero su ausencia no garantiza que esta no exista. Los organismos monitores ademac de cumplir 10s 8 requerimientos anteriores deben tambin variar en cantidad en relacin con los cambios en los factores que determinan la cantidad de contaminacin.
Principales microorganismos indicadores

El qmpo colifome.- Las bacterias del grupo coliforme han sido y con los indicadores ms utilizados. Sin embargo, a este grupo pertenecen tambin especies de muy poca
o dudosa importancia sanitaria y muchas especies sin ninguna irnpodancia desde el punto de vista higinico. No obstante, no hay ningtjn ensayo que permita al mismo tiempo una demostracin clara y fcil de estos diferentes grupos. E. coli se e l i g i ~ originalmente como indicador fecal porque su aparicin se relacionaba con la d e organismos tifoideos y paratifoideos, pero en mucha mayor cantidad.

Enterococos fecales.- Las enterococos fecales se estn utilizando cada vez m i s como indicadores d e contaminacin fecal, sobre todo en aguas salobresy marinas. En aguas saladas estas bacterias mueren a menor velocidad que las colifomes fecales, siendo indicadotes mas seguros de una posible contaminacin fecal reciente.

C.perf*qens.- Es un organismo fecal patgeno y un indicador, segn algunos autores, de mayor significacin que los coliformes. Es un valioso suplemento para otros metodos de ensayo.Cuando un agua es sanitariamente satisfactoria desde todos los puntos de vista, nunca ha sido posible detectar la presencia de C. perJn'ngens. La
deteccin de esta bacteria es parficulamentetil en casos en que la estimacin basada en coliformes falla.

C. perfmgens cumple perfectamente algunas de las condiciones para ser indicador:

- Debe dar reacciones simples y caractersticas, capacitando tanto como sea

posible una clara identificacion del grupo o la especie. C. pemnges cumple esta condicin en mucho mayor grado que cualquier otro indicador. C. perfnngens y E. col; son las nicas especies, ademas de E. faecalis y P. aemginosa, que pueden identificarse por mtodos rpidos y claros.

-Su crecimiento en medios artificiales debe ser independiente de la presencia de cualquier otro organismo, esto es, el crecimiento de la bacteria indicadora no debe ser inhibido seriamente por la presencia de otras especies. C. perfnngens cumple perfectamente esta condicin en agar culfito.
C.

p~rfnngens, segn algunos autores, debera utilizarse en lugar de E. coli en los

3 e! examen de

igui~ntes casos: muestras que contengan sustancias txicas, incluyendo muestras

hdOJtCr

en Ciencia e T~cnoloxio A m bitntal

de agua dorada - en el examen de muestras cuyo transporte al laboratorio dure 12 horas o rn - en el examen de muestras de naturaleza especial, como sedimentos que se sospeche que deriven de efluentescon contaminacin fecal.

Microorganismos en condiciones desfavorables Las bacterias indicadoras, como los coliformes y los enterococos fecales, pueden resultar alteradas o lesionadas en las aguas. Estas bacterias lesionadas con incapaces de crecer y formar colonias en condiciones normales, dada la alteracin que sufren en su estructura o en su metabolismo. En consecuencia, una parte importante de las bacterias indicadoras existentes, por ejemplo de un 1O a mas de un 90%, pueden pasas inadvertidas y no ser detectadas. Estos resultados bacteriolgicos negativos falsos pueden inducir una inexacta definicin de la calidad del agua o, lo que es peor, permitir una aceptacin errnea de condiciones potencialmente peligrosas resultantes de la presencia de patgenac resistentes. En condiciones normales se enciuentran microorganisrnos en condiciones desfavorables en aguas doradas, parcialrnente drssinfectadas, saladas, aguas contaminadas, etc. Otros factores, como temperatura y pH extremos, radiacin solar, etc., pueden provocar infravaloracones irnporiantes de las bacterias indicadoras viables. Algunas manipulaciones de laboratorio unavez tomada la muestra son tambien susceptibles de producir alteraciones o actuarcomo agresiones secundarias para los rnicsoorganisrnos (tiernpo de conservacin excesivo, formulas incorrectas en los medios, mezclado incorrecto de la muestra con el medio concentrado, exposicin a un medio licuado de a incorr.e&, eltc.). Un nijmero excesivo de bacterias no agar a iAna t e riperatur, indicadoiras tamt~ i inte n rferir eln su detioccin, ; 31 inducir alteraciones en las rnjsrnas.

Existen distintos procedimientos para la recuperacion de los organismos indicadores sometidos a condiciones desfavorables, que deben tenerse en cuenta a la hora de emitir un informe sobre la calidad de un agua.

AJster en C~encin e Tecnoloxio Anib

TOMA

DE MUESTRAS

Un examen microbiolgico no puede ser vailidamente interpretado mas que si se efectUa con una muestra correctamente tomada, en un recipiente esterilizado, segljn
un procedimiento precise, evitando toda contaminacin accidental, correctamente transportada al laboratorio y analizada sin demora o despues de un corto periodo de conservaciiin en condiciones satisfactorias.
El objeto de la toma de muestra es obtener una%-Zra representativdel agua para poder determinara partir de ella su calidad microbiolgica. La toma de muestras debe respetar, por consiguiente, la camposict8n micrabiolgica del agua captada.

y?! ,;

v,ffb

La muestra para anlisis microbiolOgico ha de ser siempre simple, esto es tomada en un tiempo y lugar determinado parasw anlisis individual, de modo que la muestra para el laboratorio sea la obtenida en el punto de muestreo. La muestra debe ser uniforme y recogida en condiciones asepticas.
Las normas respecto a la toma de muestras se aplican a todos los tipos de aguas, cualquiera que sea su procedencia: grifos, pozos, depsitos, lagunas, lagos, ros, manantiales, bocas de riego, etc.

Para obtener una muestra significativa del agua objeto de estudio, es necesario tener
en cuenta lo siguiente: snte adiestrada - utlizacin de frascos est4riles de boca ancha, generalmente de 7 litro de volumen si el agua a analizarcontieneindiciosde cloro (0.7 ppm) hay que anadiral frasco, antes deesterilizarlo, 0.5 rnl deuna solucin de tiosulfate sodico a 12%. El tiosulfato reduce el cloro e impide su actuacibn despus de efectuada la toma de muestra. . q + , -el traslado al laboratorio debe realizarse en condiciones que impidan la multiplicacin de los micraorganismos existentes - el anlisis nunca se retrasara mas de 24 h - si entre el muestreo y el anlisis transcurren m2s de 2 horas, la muestra debe mantenerse refrigerada i de inters - antes de la toma de muestra, se etiquetara con l(

- la toma debe ser realizada por una persona adec

Las cperacionec que comporta la toma de muestras varran segn la naturaleza del
agua a arializar y 6 1 punto de muestreo elegido.

Los estudias rnicrobiol6gicos deben hacerse sobre muestras recogidas en puntos

representativos de todo el sistema a estudiar. Hay que estabjecer la frecuencia de la toma de muestras y la localizacin de l o s puntos de la misma, de manera que quede garantizada la dsterminadbn precisa de la calidad microbiolgica del agua en cuestin, Se estabiacei-3 el nlimero mnimo de muestras que deben recogerse y estudiarse, teniendo en cuenta el uso al que va destinado el agua. Es irnpotante examinar rzpetidas muestras de un punto determinado, as como muestras procedentes de distiiitos puntos ampliamente repartidos. Las muestras se tomarn a intervalos du ticrnpa ra;lcinnb!omenfe distanciados.

r!foster

en Ciencia e TecnoloxioAmbienral

No se puede esperar del estudia de las muestras microbiolgicas habituales que proporcionen informacin completa sobre la calidad del agua. Hay que considerar siempre los resultados microbiolgicos a la luz de la infomacion de que se disponga sobre las condiciones sanitarias del lugar de donde procede la muestra. Se consideraran inadecuados los resultados de cualquier estudio que se realice sobre una nica muestra de una fuente determinada. Siempre que sea posible, la valoracin de la calidad del agua se basar en el analisic de una serie de muestras recogidzs durante un periodo de tiempo conocido.
'Sorna de muestra en agua canalizada:

- Una vez retirados filtros u otros accesotios, se procede a una cuidadosa limpieza con agua y alcohol. - Con el grifo cerrado se flamea el extremo del mismo, - Se abre el grifo para que el agua fluya abundantemente y se renueve la contenida en la tubera que lo alimenta (aproximadamente 5 minutos). - Se destapa e 3 frasco esterilizado sin tocar [a boca del mismo ni el interior de! tapn. - Se llena el envase hasta el cuello - Se tapa, precinta y etiqueta Toma de muestra en posos y depdsifos:
-Si sedispone de bomba de captacin seopera comose ha indicado en el caso del grifo. - En czso contrario, se introduce el frasco invertido y se gira hacia arriba aprovechando para obtener la muestra. -Sila toma es a gran profundidad se pueden utilizar aparatos especiales lastrados, que permiteti introducir el frasco esterilizado y destaparlo a la profundidad deseada.

Lagos, rios:
En rios O cursos de agua es preciso considerar diversos factores, como profundidad, caudal, distancia a [a orilla, etc. La muestra se toma lo ms lejos posible de la orilla; procurando no remover el fondo y evitando los remansos o zonas de estancamiento.

Para tomar una muestra del agua de un lago o de un ro se sujeta el frasco por el fondo en posicin invertida, sumergindolo completamente y dndole la vuelta en sentido contrario a la corriente {ro) o desplazndolo horizontalmente en la direccin de la boca del ~ T ~ S C (lago). O
Manantiales:

En manatiales naturales o fuentes de caudal continuo sin dispositivos de intermitencia se toma la muestra directamente sin adoptar medidas especiales de drenaje.

Bocas de riego:

S z utilizan aceplamientos especiales que permitan operar como en el caso de un grifo.

Master en Ciencia e TecnoIoxia Ambiental

En todos los cacos, la muestra de agua no deber llenar totalmente el frasco, siendo necesario dejar un espacio interior a fin de facilitar su hornogenizacionen el momento de iniciar los anlisis. Volumen de muestra

El volumen a tomar debe ser el adecuado para que en una sola muestra se pueda efectuar simuItneamentela totalidad de los anlisis microb~olgicos, y esta en funcion de las tcnicas a utilizar.

Cemdo y precintado
Las muestras se cierran convenientemente y se precintan, en su caso, de toma que quede garantizada su inviolabilidad.

Antes de la toma de muestra se masca e l frasco mediante rotuladorresistente al agua, con una referencia que permita su identificacin. En todo caso, la muestra se debe acompaar de una ficha o etiqueta en que se consignen como mnimo las siguientes datos:

Datos del solicitante: Nombre y direccion completa de !a persona o entidad solicitante Datcs del agua: Origen de !a muestra (pozo, grifo. manatial, ro, etc) DenorninaciOn y10 referencia Direccin o emplazamiento exacto, municipio y provincia Fecha y hora de la recogida Otros datos: Indicar si el agi.ia es natural o sometida a algn tratamiento de depuracion. Identificacin de la persona que ha fomade fa muestra

be acondicionar de forma que quede en oscuridad, I laboratorio. Es conveniente iniciar el anlisis antes debiendo remitirse cuanto de que transcurrari 8 horas desde la toma de la muestra. El transporte debe ser refrigerado si el analisis no se inicia antes de 2 horas de recogida la muestra, En cualquier caso el arilisis siempre se ha de realizar antes de las 24 horas de recogida la muestra, conservando 3 a muestra en refrigeracibn.

Una vez tomada la muestr

Mustcs en Ciencia e Tecnolaia Ambiental

ANALISIS MICROBIOL~GICO DEL AGUA MESTICO E INDUSTRIAL Anlisis mnimo

DE D I S T R I B U C I ~ N PARA USO

DO-

Deteminacibn de coliformes totales y fecales

Andlisis normal:

Recuento de aerobias totales a 37C Recuento d e aerobias a 2ZC

Cuantificacibn de cotiformes totales y fecales

Recuento de aerobias totales a 37% Recuento de aeiobias a 22% Cuantificacin de coliformes totales y Fecales Cuantificacihn de enterococos fecalec Cuantfficacinde esporas de CilosfidFum sulfiio-reductores Determinacin de patgenos y10 parasitos Observacin de elementos formes
AnAlisis ecasio

El anlisis ocasional consistir en la determinacin decuantos parametrassean fijados porla Administracin Sanitaria competente, en orden a garantizarla potabilidad del agua suministrada por un sistema deabastecimiento de aguas de consumo publico, en situaciones particulares o accidentales que requieran una especial vigilancia sanitaria del agua del sistema.
Anlisis inicial: El analisis incial consistir& en la determinacin, previa a la explotacin de un recurso hidrico potencialmente utilizable para abastecimiento de agua potable de consumo pblico, de los parametros que ntegsan el citado analisis normal a los cuales se aadirn los del anlisis completo o aquellos parametros que la Administracin Sanitaria competente considere oportunos. El numero mnimo de toma de muestras y los interva!oc entre ellas sern los adecuados para la representatividad del recursga

explotar.

Mdsrcr en Ciencia e TecnaloxioAmbianral

Periodicidad de los anlisis

Intenralo recomendado entre tomas y nmero mnimo anual de muestras a la saljda de la insfalacion del tratamiento (analisis mnimo)
Poblacidn (habitantes)
Hasta 2.000 Entre 2.000 y 5.000 Entre 5.000 y 10.000 Mas de -lO.OOO

Frecuencia

Muesfras/ao
12 24 52 360

Mensuai Quincenal Semanal Diario

Intervalo recomendado enfre fomas y nmero mnimo anual de muestras en la red de distribucidn (anlisis mnimo)

Poblacidn (habitantes) Hasta 5.000 Entre 5.000 y 7 0.000 Entre 10.000 y 50.000 Entre 50.000 y 100.000 Ms - de 100.000

F~cuencia
Mensual Quincenal Semanal Cada tres dias
m:.

Muestras/ao
12 24 48 120 2110.000 habitantes

Intervalo recomendado entre fomas y nmero mnimo anuat de muestras en la red de distribucidn (anAlisis normal y completo)
Poblaci6n (habitz Hasta 2.000 Entre 2.000 y 5 . 0 ~ ~ Entre 5.000 y 10.000 Entre 10.000 y 50.000 Entre 50.600 y 100.000 Entre 100.000 y 15B.OOC Entre 150.000 y 500.000 Entre 300.000y f Ms de 500.000

mal
ual semestral Cuatrimestral Bimensual Mensual Mensual Semanal

coinplefo
nual nual nual nual Semestral Cuatrimestral Bimensual lensual

P i

Semanal
Cada 4 dias

lensual

BMster en Crencia e TecnoIoxiu Ambiental

Las aguas recreativas pueden dividirse en aguas de piscinas, baos de hidromasaje, aguas dulces naturales y aguas marinas superficiales. Histricamente, se han analirado estas aguas en busca de bacterias colifomes, heterotr~ficas o de ambos tipos. Aunque la deteccibn de las bacterias coliformes en el agua indica la posibilidad de que no sean saludables para el consumo, se han aislado en las aguas recreativas otras bacterias que pueden suponer riesgos para la salud pWblica porcontacto con el cuerpo, ingestibn o inhalaci~n. Las bacterias recomendadas como indicadores de la calidad del agua recreativa son el grupo coliforme, especies de Pseudomonas, Enterococcus, Sfawhybcoccusy, ms raramente, Leganelia. Las enfermedades viricas asociadas con las aguas recreativas no tratadas son las producidas por Coxsackie A y 5, adenovirus tipos 3 y 4, hepatitis A y diversas gastroenteritis viricas. Este ultimo grupo podra ser responsable de una parte importan-

te de los casos de gastroenteritis indeterminada. Microorganismos como Mycobactenum, Candida albcans y especies de Naegleriz y Acanfharnoeba tambikti pueden adquirir importancia, sobre todo porque pueden producir esporas y quistes, mas resistentes que las bacterias indicadoras. No se recomiendan estudios sistematicos de microorganisrnos patbgenos, salvo en casos de estudios o investigaciones especiales de enfermedades de transmisin hdrica, en los que deben dirigirse los anlisis microbiolgicos al descubrimiento del patbgeno conocido o sospechado.
Piscinas:

Los microorganismosque tipicamente pueden producirproblemas SU J 1 " s rr'ocedentes delcuerpo d e los baistas y de sus orificos, enire 60s que se encuentran los que pueden producir infecciones del oido, las vas respiratorias superiores. fa piel y los aparatos digestivo y urinario. La calidad del agua depende de la eficacia d~ la desinfeccibn y del numero de baistas en un determinado momento, asi como del nmero diario de
baistas. Deben determinarse peribdicamente los niveles residuales de desinfectante y la turbidez en los periodos de rn5xirna actividad de baos. El recuento en placa de keterbtrofos es el indicador fundamental de la eficacia de la desinfecci~n.Otros indicadores suplementarios se refieren a la microbiota cutnea normal que se haya desprendido, entre la que se encuentran especies de Enterococc~s, Sfaphylococcus y Pseudornona.s. Estos micraorganismos son les responsables de un alto porcentaje dr! enfemcciadss asociadas al uso de las piscinas y pueden ser relativamente resistentes al efecto del cloro. En casos especiales pueden resultar significativosMycobacfenum, Legionelia o Candida albicans. Indicadores fundamentales son, asmismo, los colifmmes fecales.

Baiios; de hidromasaje: Son frec~~entes las infecciones contradas en los baos de hidromasaje. Para asegurar su inscuidad, hay que comprobar que tanto la concentracin de germicida en el agua como e 1 pM y la temperatura son adecuados. Se han descrito adems otras pautas de rnantenirni~ntr3 y operaciones de control, Los indic:?:; habituales de contaminacin, es decir, las bacterias coliformes, son insuficientes para valorar ia calidad microbiolbgica de un bao de hidromasaje. Los

anlisis de bacterias colifarmec pueden indicar la eficacia del desinfectante utilizado, pero con toda probabilidad no reflejarn al agente etiolgico de las infecciones asociadas a estos baos. Los anlisis microbiologicoc deben incluirun estudio directo de P. aeruginosa mediante una tcnica diferencial-selectiva o de enriquecimiento. Aunque P. aeruginosa es el patgeno ms frecuente en estos casos, es preciso tambin determinar la concenfraci6n de estafilococos y enterocococ.

Playas:

Son numerosos los microorganisrnos patbgenos que pueden transmitirse al hombre a

travs de la utilizacin con fines recreativos de aguac dulces y saladas susceptibles de contaminacin por aguac residuales. Esta contaminacion puede deberse a agentes enteropatbgenoc, como Salmonella, Shighella, enterovims, protozooc y par2sitos multicelulares;a patogenas humanos o a "oportunistas'~ como P. aeniginosa, Klebsiella, Vjbio para hemolyticus, V. vulnificus,A eromonas hydrophila, Staphy!ococcus aureus y C, albcans, que pueden multiplicarse en aguas recreativasen presencia de suficiente cantidad de nutrientes. No existen mtodos convencionales adecuados para el estudio cictemtico de las aguas recreativas, ni que permitan identificartodas los organismos reseados. Incluso con los mtodos descritos y, sobre todo, en e l caso de los ambientes marinos, pueden existir condiciones locales que pongan en peligro la exactitud, la selectividad y las caractersticas diferencialesde estos rnefodos. Se ha d e determinar la contaminacin fecal de las aguas recreativas naturales con las pruebas de ~olifomecfecales. Dada la posibilidad de resultados positivos falsos en las aguas temales,curnpmbense los resultados positivos de coliformes fecales rnediante sistemas multipmeba comerciales. Deben analizarse, asimismo, los enterococosfecales en las aguas naturales. Tambin es necesario analizar los micreasganicmosindicados anteriormente para el caso de las piscinas.

BIOCORROSION EN CIRCUITOS DE AGUA

Un aspecto importante denvado de la presencia de bacterias en aguais es aquel que hace referencia a los graves deterioros ocasionados en aquellas plan. tas industriales que utilizan agua como una materia prima bsica. Cuando el conrroi ue estas aguas no se verifica de una manera eficazsuele presentar algunos caracteres sintornaticoc que denotan a nivel organolptico elevadas concentraciones microbianas instaladasen los circuitos. En estos casos, fa solucin no consiste en el uso indiscriminado de antimicrobianos ya que de esta forma se obtiene, probablemente, la muerte d,e la mayoria de ellos, pero en cambio permanecen losflbculos y Iodos acurnwladosque son corsecuencia de su actividad.
I .

Las bacterias responsables de estas graves alteraciones pertenecen a distintos grupos, siendo la mayora de ellas del grupo de las bacterias del hierre, azufre y productores de limos. La experiencia indica que para la verificacin de un diagnostico correcto del grupo bacteriano responsable de un deterioro de los conductos, la tcnica mas adecuada es la que se basa en una observacin microscopica. Solo despus de esta obcervaci0n,
Mdsret en Ciencia s TecnoImOX3~ Rni bienrol

e! microbilogo optara hacia e! aislamiento e identificacin de los rnicroarganismos contaminantes. Estas consideraciones no se contradicen con la tecnica de la enumeracibn de microorganismos aerbicos totales capaces de desarrollarse en medios bacterio.ldgicosgenerales. Esta situacibn es puramente orientativa porque slose aisla la rnicrobiota acompaante. Los mcroorganismocverdaderamente responsables de la colonizacin primafia, al peitenecer a grupos fisiolgicos especiales, es muy probable que no se detecten. Precisamente, la obtencin de enumeraciones aeobicas relativamente bajas junto a caracteres organolpticos extraos, en aguas de circuitos, debe alertar al tecnico hacia la bsqueda de una microbiota bacteriana especializada.
En definitiva, en los circuitos de aguas seinstalan verdaderas poblaciones bacterianas especializadas, que cuentan con los componentes suficientes para su desarrollo, experimentando fluctuaciones de crecimiento dependientes de la temperatura, pH y concentracin de oxgeno.A efectos prcticos, las bacteBas se pueden distribuir en bacterias del azufre, bacterias del hierro y bacterias formadoras de limos, siendo las ms importantes en este aspecto las bacterias del grupo del azufre.
L2s bacterias del azufre mas importantes en las agua limpias y seciduales son las reductoras del azufre, entre las que se encuentra Desulfovibdo, ylas bacterias aerobias que oxidan el azufre del genero Thiobacillus. Las bacterias reductoras del sulfato contribuyen en gran medida a las turberculaciones y la corrosin galvnica de las conducciones de agua. ThEobaciItus,por su produccin de cido sulfrico, ha contribuido a la destruccin de alcantarillas de hormign y a la corrosin cida de metales. Los efectos corrosivos de estos microorganismos se producen adems en los sistemas de almacenaje y distribucibn de derivados del petrleo, ya que en dichos sistemas existe una pequefia cantidad de agua en la que pueden crecer estas bacterias, adems esta agua, por su densidad, se sitira en la parte inferior de los tanques en contacto direcio con las ~onducciones 10 que favorece y aumenta su efecto corrosivo.

En las bacterias del hierro se pueden considerar dos grupas: el primero constituido por bacterias que actan oxidando el ion ferroso hasta ion frrico precipitando en forma de ndulos, que pueden llegara obturar les conductos, y el segundo que est constituido por bacterias que dependen del hierro para su metabolismo ya que utilizan materia orgnica que se encuentra combinada con hierro. El efecto de su actividad es el mismo ya que al final de su actividad depositan ion ferrico. A1 primer grupo pertenecen los generos Gallionellay MetalIopenium,Otro gnero irnwolrtantees el gnero Sidemcapsa.

Las bacterias productoras de lirnos pertenecen a grupos fisiolgicos distintos, Algunas pueden alterar l o s circuitos de agua desiunizada, otras solo se desarollan en aguzs contaminadas. En algunos casos la alteracin se produce como consecuencia de acumulacin de limos procedentes de la actividad industrial y que estos sirvan de sustrato a las poblaciones rnicrobianas contaminantes. En circuitos que conducen aguas ligeramente contaminadas con materia orgsnica se produce la colonitacioi por bacterias heterotrofas que emplean las pequeas cantidades de materia orgnica como sustrato; en estos casos los limos se forman como consecuencia del crecimiento masivo de micr~organisrnostan distantes taxon6micamente coma los del grupo enterico y los bacilos esponilados. En algunos casos, las cepas responsables de la farmacibn da timos, al aislarse y resembrarse, pierden Ia capacidad de producirlos dando lugar a falsas conclusiones.
,'dasier en Ctancia e TecnaioxiaAmbiental

RECUENTO DE BACTERIAS AEROBIAS

Definicin:
Son todas las bacterias heterotrofas, aerobias y anaerobias facultativas, mes~filas y psicrfilas, capaces de crecer en un medio de agar nutritivo. Fmdamenfo: Se basa en contar el nmero de colonias decarralladas en una placa de medio de cultivo slido, en el que se ha sembrado un volumen conocido de agua o de la diluci~n correspondiente, transcurrido un tiempo y una temperatura de incubaciiin determinados. El medio de cultivo debe ser definido y no selectivo.

E l contenido total de bacterias aerobias nos proporciona algunos conocimientos

prcticos. Un recuento total elevado puede ser ndice de contaminacin por bacterias extrafias al ecosistema. Un contaje bajo es un buen Endice de la situacin del agua objeto de examen, si bien no por ello se descarta la presencia de bacterias patbgenas o indeseables,
El recuento puede realizarse por filtracibn cobre membrana (aconsejable para aguas poco contaminadas), por extensin en superficie de agar o por inclusin en agar.

Recuento de bacterias aerobias totales a 3T0C

Medios de cllltive Agar nutritivo:

Peptona bacteriolbgica Extracto de carne Agar-agar

Agua destilada
Procedimiento:

5 0g 3-0 g
750 g 1.O litro

1. Siembra por inc n agar. -B agar nutritivo se prepara y esteriliza dejndolo enfriar hasta una temperatura pr~xirna a 45 OC.Si est solidificado, se funde calentndole en un bao mara. -1 rnl de la muestra, o de las diluciones necesarias, se deposita, con una pipeta estril en una placa Petri vacia. -A continuacirjn y antes de transcurridos 10 minutos, en la misma placa se vierte la cantidad necesaria de agar nutritivo liquide a 4 5 " . -A contintsaci6n se hornogeniza con movimientos circulares impidiendo que el agar rebose a moje la tapa. -Una ver hornogeneizado se deja solidificar y, a continuacin, se invierte la placa e incuba. 2. Siembra por extensin en sbiperlicie de agar, -E! agar nutritivo se prepara, se esteriliza y se reparte en placas. -61.1 m l de !a rntiastra, o de las diluciones necesarias, se deposita con una pipeta estril ea una placa Pe%ri con el medio de cultivo.

-A ~ontinuacin se extiende la muestra sobre la superficie de la placa con un asa de vidrio. A continuacibn se invierte la placa e incuba.

Inc~bacin:
La incubacion se realiza durante 48 horas a una temperatura de 37OC.

Lectura de los resultados: Tranccufido el tiempo de incubacin, se cuentan las colonias formadas en la placa. Si se realizan valrias placas con distintas diluciones, se selecciona la que contenga entre 30 y 300 colonias, descartando las demas. Si se hacen rplicas, el valor se expresa como la medra de los recuentos de 12s placas con igual dilucin. Excepto cuando la muestra no se ha dituido, no se deben consideras placas con menos de 30 colonias. Si todas las placas tienen mas de 300 colonias el resultado se da coma aproximado.

Expresion de los resultados: Los resultados se expresan en nmero de bacterias aerobias totales/m!de agua a 37C en 48 horas.
Recuento de bacterias aerobiac a 22C

El medio de cultivo y procedimiento son iguales al recuento a 37C, variando

unicamente las condiciones de incubacion.

La incubacin se realiza a 22C durante 72 horas (3 dias). La lectura de resultados y expresin de los mismos es igual que en el caso anterior.

Recuento de bacterias aerobias por inelucir;

l
I

1 rnl de muestra

Incubar a:
37OC durrrnte 24.4 8 horas 22'C durante 72 horas

Masrer m Ciencia e T c i i d o r i ~ AmbienraE

RECUENTO DE COLIFORMES

Estas bacterias tienen una relacindirecta con la cbntaminaeion de aguas par materias fecales, ya que suelen habitas el intestina de mamiferos.
DefTniciones:
, '

Coliformes totales: Son aquellas bacterias de morfologia bacilar, Gram negativas ( 1 3 aerobias 1 . lqanaerobias facultativas, oxidasa negativas, no esporgenas. que fementan la lactosa con producci8n de cido y gas a 37C en un tiempo m&ximo de 48 horas. Este grupo comprende Ioc gneros EscherrAia, Klebsielia, Enfembacter, Citrobacfer, etc., perkenecientes a la familia Enterobacteriaceae.
Coliformes fecales: Son aquellas bacterias comprendidas en el grupo anterior que, adems, son capaces de fermentasla iactosa con produccibnde cido y gas a 44C en un tiempo rniximo de 24 h. Incluyen E. col;, Klebsielia.

Inters del a nilisis de c~lifomes:

Los rnicroorganisrnoacoliformesestan =si siempre presentes en aguas que contienen patogenos entricos. Por tanto, y dado que son relativamente fciles de aislar y que sobreviven normalmente ms tiempo que las organismos productores de enfermedades, los coliformes constituyen un indicador muy til para determinar ta posible presencia de virus y bacfeias patogenas entricas en las aguas. En la mayora de los casos el agua que no contiene coliformes totales se considera libre de bacterias productoras de enfermedades.
La determinacin de coliformes fecales en agua es un analisis m6s definitivo de contarninacirjn fecal reciente que la determinacin de coliformes totales; por eso, los colifomes fecales son los microorganismos p a t r ~ utilizados n por muchos laboratorios que analizan aguas residuales tratadas, fuentes publicas de suministros de aguas sn tratar y aguas de contacto primarias, como las zonas de bao.

Tecnicas para anlisis de colifomes totales y fecales: - Mtodo de los tubos mltiples (nmero ms probable, NMP) - Mktodri de filtracibn por membrana.

1 . Raccinnto por el mtodo de los tubos mltiples

El recuento porel mtodo de los tubos mltiples (NMP) se puede utilizar para cualquier tipo de agua y es el procedimiento oficial obligatorio en caso de litigio. Fi.~rica'amt$nto: Detrzrmiriacndel numero de coliformes mediante siembra de distintos volwmenes del agua a analizar en series de tubos conteniendo medio de cujtivo lquido lactosado, y resiembra en medio de cultivo selectivo con incubacin a iemperaluras adecuadas. El procedimiento comprende las pruebas: presuniiva, de confirmacin de coliformes t.r;l;ilt?s y d*? cc;nfirrnacin de colifomes fecales.

Medios de cuftvo :

Caldo lactosado:
Peptona bactenologica Extracto de carne Lactosa Agua destilada

5.0 g 3.0 g 5.0g f ,O litro

Agar EMB (Eosina-azul de metileno) o Teague-Levine Peptona bacteriolgica 70.0g Lactosa 10.0 g Fosfato dipotacico 2.0g Eosina 0.4 g Azul de metileno 0.065 g Agar-agar 15.0 g Agua destilada 1.O litro
Caldo lactosado verde brillante y bilis Sales biiiares 20.0 g Lactasa 70.0g Peptona ?Q.G Verde brillante 0.01 Agua destilada ?.O li

Es un proceaimiento de criba en e J que una reaccibn negativciexcluye la presencia del grupo colifome y una reaccin positiva indica su posible presencia.
una gradilla una serie de tubos de caldo Factosado correspondientes Se dispa a la tabla elegida de NMP, en este caco 3 series de tres tubos con 7 O ml de medio. cada' tubo contiene en su interior una campana de Pwrharn. Mediante pipetas estriles se siembran los tubos de cada serie con O.?,1 y 10 ml del agua problema. En 30s tubos en los que se siembran 1O ml, el media se encuentra a una concentracibn doble. Incubacina 37C durante 48 horas. En los tubos en que la positividad se manifieste a las24 horas no es necesario continuar la incubacin, pudiendo iniciarse con ellos las pruebas de confirmacin. Ledura resultados:
Tubos positivos: enturbiamiento y gas Tubos negativos: no gas en 48 haras

M h e r en Ciencia e T . o l o & Rmhieniot

Caldo lactosndo

PRUEBA PRESITWWA

Siembra en agar EMB

Siembra en calda lactosado bilis

Colonias carnctrristic~s

iiger nuvitivo

mldu IacttosUuo

Resultado negativo
Indol

Resultado positivo: 6-.O?idasa Gzs -

-.

c0.6

COLFOMS TOTALES
Prueba confirmativa de coliformes totales:

COLIFORVESF

.LES

Es un procedimiento mediante el cual una reaccibn negativa excluye la presencia del grupo coliforrne, mientras que una reaccin positiva indica su presencia inequvoca. Deben someterse a esta prueba todos los tubos que hayan resultado positivos en la prueba precuntiva. Es necesaria la prueba confirmativa porque existen bacterias, sobre todo Gram positivas (G+),que pueden producir gas. La eosina del medio Fnhibv el crecimiento de bacterias G+.
De cada tubo positivo en la prueba presuntiva se realiza un cultivo en placa de agac eosina azul de metileno, incubando a 37C durante 24h.

Las bacfcria~fermentadoras de iactosa dan colonias caractersticas opacas y pigmantadas en rosa, azul o violeta oscuro, con o sin seflejo metlico. Las colonizs
distintas a las descritas corresponden a bacterias no fermentadoras de lactosa.
kecfum de ~suftadas:

Rec;u!tada posi?ivs:apaBci6n de colonias lactosa positivas con coloracin negra o violzla, csn iiisaciones metlicas o no.
~Msrer en Crencta e TecnciloiciaAmbiental

Resultado negativo: ne presencia de colonias Zipicas.

Test final:
De cada placa seleccionar una colonia de cada uno de los diferentes aspectos descritos como caractersticos y resembrar mediante asa sobre agar nutritivo inclinado. A continuacin, y sin recargar, resembrar un tubo de calda lactosado con campana Durham.

Incubar a 37C durante 24 h.

En el caco d e que el aspecto de las colonias ofrezca dudas respecto a las caractersticas antes descritas, tomar una o dos de las ms similares y proceder como se ha indicado. Al tennino de la incubacibn, comprobar la formacin de gas en el tubo de caldo lactosado y, caso de ser positiva, tomar una porcin del cultivo desarolilado sobre el agar inclinado y realizar la prueba de la oxidasa. Confirmar la morfofogia y caracteres tintoriales de [as bacterias mediante la tincion Gram. Las colifomes son bacilos G-.

Lectum e inlepretacin de resultados:

Si en la placa de EMB no se han desarrollado colonias o las que han aparecido no son fermentadoras de lacfosa con produccin de gas, la prueba de confirmaciiin es negativa. Si la colonia aislada es fementadora de lacfosa con produccin de gas y oxidasa negativa, la presencia de colifomes se considera confirmada. Si la reaccibn de Ia oxdasa es positiva la pzsencia de coliformes totales se considera negativa, aunque la colonia aislada haya fermentado fa factosa con produccion de gas.

Para el cAlcula NMP de coliformes totales se cfintabilizaran como positivos aquellos tubos de la serie elegida que ha! yan dad o una prueba d ir confimnacin posjtiva.

Los resultados se obtienerr a panirde las tablas NMP, consideran que dan positivo en el test riresuntivo v en el test confirmativo. Los resultados se expre: 1 de agua

ivos los tubos

OBSERVACIONES:

A efectos de E a catificacin sanitaria de aguas de consumo pblico essuficiente realizar ia tcnica descrita. Sin embarga, en determinados casos es recomendable la identificacin de las colonias de coliformes aisladas, sobre todo de E. col. Pasa ello pueden seguirse las pruebas bioquimicas de la batera del IMViC y del agar de Kliglsr. Asmismo, existen actualmente en el mercado sistemas de kits para la identificacin de enterobacterias.

~Uxrer en Ciencia e Tecnoloro Ambienrai

Recuento de coliformes totales

Prueba presuntiva

caldo lactosado

Prueba confirmativa de coliformes totales

todos los tubos

colonias rajas, azules o violetx

Colonias caractersticas

Incubacibn 37C 24 horas

Afbsterrer en Ciencia e Tecnolcaia Ambicniol

Prueba de confirnaacidn de coliformes fecales

Es un procedimiento mediante el cual una reaccin negativa excluye la presencia de coliformes fecales, mientras que una reaccin positiva indica su presencia inequivoca. Deben someterse a esta prueba todos los tubos que hayan resultado positivos en la pnieba presuntiva. Esta prueba debe llevarse a cabo simultneamente a la de
confirmacin de coliformes totales.

A partir de cada tubo que di6 positivo en la prueba presuntiva se realiza un ~ultivo en calda lactosado verde brillante bilis y con campana de Durham.

Se incuba a 44C durante S4h.

Lectura de resulfados:
Tubos pocifivos: produccin de gas Tubos negativos: no p ~ o d u c c i ~ de n gas Paralelamente, se puede realizar una siembra de los tubos presuntivos en agua de peptona que se incuba simultneamente a 44C 24 h, determinando al cabo de este tiempo la produccin de indo!. Algunos coliformes, adems de E. col, dan resultado

Rec

tu de coliformec fecales

ba presuntiva (comUn con colifames totales)

10 ml de
xf

r;
Prueba confirmativa
Agua de peptona

m1 dc muestra hcubacicin 37% durantes 48 horas

1O

[Fksu1tado postivo;~ 1 formacin de gas ,

*-

/ ne\uiuuu p

[
i i

1
d I

caldo lactosado bilis verde brillante

hcubacibn 44C 24 horas

i Gv ~ + Sv

positivo en e l caldo lactosado verde brillante y bilis, de fama que la prueba del indol es necesaria para diferenciarlos. Si la prueba del indol es positiva se trata de E. coii.

Expresin de resulfados:

Los resultados se obtienen a partir de las tablas NMP considerando positivos los tubos
que dan positivo e n la prueba presuntiva y en la prueba confirmativa. Los resultados se expresan en coiifomes fecalesf f 00 ml de agua

La tcnica de! filtro de membrana, que implica una siembra directa para la deteccin
y clculo de la densidad de califomec, es tan eficaz como la fementacibn en tubos multiples para la deteccin de bacterias de este mismo grupo. Por tanto, se puede contar con 2 mtodos estndar para la deteccisi de las bacterias del grupo coliforme.

Esta tcnica es altamente reproducible, puede utilizarse para estudiar volmenes relativamente grandes de muestra y proporciona resultados numricos mas rpidos que el mtodo de los tubos mltiples. La tcnica del filtro de membrana es extraordinariamente Util para controlar las posibles situaciones de urgencia en relacin con el agua potable y para estudiar distintas aguas naturales. Sin embargo, esta tcnica tiene limitaciones. sobre todo para estudiar aguas con elevada turbidez o que contengan bacterias no co!iformes.
DefiniciOn: En lo que se refiere a la tcnica del filtro de membrana, e! grupo coliforme puede definirse corno el formado por bacterias aerobias y anaesobias facultativas, Gram-, no esporuladas y de forma bacilar, que desarrollan una colonia roja con un brillo metlico en un medio tipo Endo que contenga Iacfosa tras una incubaci~n de 24 horas a 3q"C. Al estudiar cultivos puros de bacterias colifomes se obsewa una reaccin citocromo oxidasa (CO) negativa y B-galacfocidasa (ONPG) positiva. En esta tcnica todas las colonias bfancas o inc,oloras que no tienen brillo suelen considerarse ne coiiformes.

L.a comparacin estadstica de los resultados obtenidas con el mtodo de los tubos mltiples y el del filtro de membrana muestran Ia mayor precisin de este ltimo. Aunque los datos de ambas pruebas dan recuttados bastante precisos sobre la calidad del agua, los resultados numricos no son idnticos.
COLIFBRMES TOTALES
Se consideran miembros del grupo coiiformes todos los microorganismos que producen colonias rojas con un briib metlicotras 24 horas de incubacibna 37C en un medio tipo Endo. El brillo puede cubrirtoda la colonia o aparecer uncamente en la zona centra t o en la peflferia. El grupo colifome as definido se caracteriza por producir aldehidos a partir de la fermentacin de la tactosa, caracterstica bioquimica que forma parte de la prodvccibn de gas en la prueba de los tubos mltiples.
Fundamento: El medio de cultivo tipo Endo contiene lactosa y reactivo de Schiff. En presencia de mlfomes, la fermentacin de la lactosa produce CQ,, cido y aldehido. El reactivo de Schiff reacciona can el aldehido produciendo un color iridiscente verdoso sobre las colonias de colifarmes.

Medio:

Endo agar Peptona Extracto de levadura Lactosa Cloruro sdico Fosfato dipotasico Fosfato monopotasico Sodio lauril sulfato Desoxicolato sdico Sulfito sdico Fucsina bsica Etanol95% Agar-agar Agua destilada

Despus de preparar el medio calentando a ebullicin, dejar enfriar hasta 45OC y repartir en placas. No esterilizar en autoclave.
Procedimiento:

Se filtra una cantidad adecuada del agua a analizar, previamente hornogeneizada, sobre un filtro de membrana steril. El volumen de agua filtrada no debe ser inferior a 30 ml. UtiIizando unas pinzas previamente flameadas se coloca la membrana sobre la placa con el medio de agar Endo.

lncubar las placas invertidas a 37C 24 horas

Al cabo d e este tiempo se realiza un recuento directo de las colonias recubiertas de un coror iridiscente verdoso. El brillo puede cubrir toda la superficie de la colonia o solo la parte central o la periferia.

Los resultados se expresan en no de coloni

100 rnl de muestra

Confirmacin de califormes totales Para evitar resultados positivos falsos debe verificarse la fermentacin de la tactosa mediante la reaccin de las colonias con brillo a citocromo oxidasa (CO) y l3galactasidasa (ONPG). Es preferible comprobartodas las colonias, o al menos un 10%de jas mismas cuando en una muestra mas de 50 sean de tipo colifome. La cornprabaci6n puederealizarsepor una fementacidn en tubos, que requiere rnedics de cultfvzi diferentes y se precisan de 48 a 96 horas, o por una prueba rpida (4 horas) d e dos reacciones bioqumicas clave. Tambin pueden utilizarse cisternas comerciales rriraltipnieba para Enterobactenaceae.

La verificaci~n rgpida de las colonias se basa en las reacciones de citocromo oxidasa (CO) y de 13-galactosidasa (ONPG = ortonitrofenia1-13-D-ga1aCtop~1a~sido). Lzs criliforrnes SF?caracterizan por carecer del enzima ~itocmrne oxidasa y por poseer el enzima fi-galactosidaca, necesaria para fermentar la lactosa.
whvrer

ee Ciencia c TfcnolmiaAmbrenral

La presencia de citocromo exidasa se verifica con NN-dimetil-p-fenilendii!mina. En presencia d e oxigeno y citocromo c las especies que producen enzima citocromo oxidasa oxidan al reaciivo para formar un compuesto coloreado. El ortonitrofenil-8-0-galactopiransido (ONPG) ratifica la presencia de 3-galactocidasa, pues el reactivo, incoloro, es hidrolizada en su presencia, liberando ortonitrofenol, compuesto cromogenica amarilla.

Expresin de resultados: La densidad de coliformes debe darse por 100 ml de muestra. Se debe calcular utilizando filtros de membrana que tengan 20-80 colonias de coliformes y no mas de 200 colonias de todos los iipos por membrana.

Para recuentos de coliformes comprobados, ajustese el recuento inicial, teniendo en cuenta el porcentaje de comprobacin positiva, y exprsese como recuento comprobado de colifomespor 700 ml.

COLIFORMES FECALES
Se utiliza un medio de Iactosa enriquecido y una temperatura de incubacin de 44.510.SC. Esta temperatura permite seleccionar los rnicroorganismos del grupo coliforrne ~rocedentes de fuentes fecalesde los procedentesde otrasfuentes ambientales.
Fundamento: Elmedio contiene lactosa y azul de anilina. Cuando el medio es cido, por fermentacin de la lactosa, el azul de anilina produce un color azul, oscuro o claro, sobre las colonias de coliformes fecales.

Medio: FC agar

Bacto-trptosa Proteosa peptona Extmcto de levadura Cloruro sdico

Lactosa Sales biliarec Azul de anilina

Agat-agar
Agua destilada
e ,

Despues de preparar e! medio aadir i O m! de una solucin de ciaci rosoiico al 1% en NaOH 1 1 . 2 N.Ajustar el pH hasta 7.4. Calentar hasta ebullicin, dejar enfriar y repartir en las placas. No esterilizar en autoclave.

Procedimiento: Se filtra una cantidad adecuada del agua a analizar, previamente hornogeneizada, sobre un filtro de membrana estril. E l volumen de agua filtrada no debe ser inferior a 3 C

Maxter en Ciencia e Tecnoloxln Ambiental

Utilizando unas pinzas previamenfe flameadac se coloca la membrana sobre !a placa con e[ medio de agar FC.

Incubar las placas invertidas a 44.510.2"C 24 horas

Al cabo de este tiempo se realiza un recuento directo de las colonias azules. Cualquier otra colonia de color crema claro o gris no son coliformes fecales. Normalmente se observan pocas colonias de colifomes no fecales en el medio FC debido a la accion selectiva de 'la elevada temperatura y a fa a d i c i ~ n de la sal del Acido roslico.

Expresin de resultados: 4S C I Las resultados se expresan en nirrneru depor 300 m 1 de muestra. Se debe calcular utilizando filtros de membrana que tengan 20-60 colonias de coliformes fecales. E/ lmite es ms restrictivo que el de colifomec totales (20-80) debido al mayor tarnafio de las colonias en el medio FC.
i*"

Los mtodos estndares que se usan para enumerar los coliformes totales y fecales se basan en la capacidad de estoc organismos para fermentar la Iaciosa, produccibn de gas, cido o aldohidos. Sin embargo, estoc mtodos necesitan tiempos de incubacin de 24-96 h, lo cual retrasa las posibles medidas sanitarias que deberan aplicarse. Las nuevas tbcnicas para la detecciiin e identificacibn bacterianas incluyen las denominadas tcnicas de deteccin enzimaticas utilizando compuestos cromognicos o fluorescentes. La hidrlisis enzimatica de 4-metilumbeliferil-LD-galactosido y de 4metilumbeliferil-13-Q-glucurnido(los cuales son sustratos fluorognicos) se ha utilizada para la rpida deteccin de indicadores de contaminacin fecal. Estos sustratos se emplean para detectar la presencia de co~ifomes y co!iformes termotolerantes en un tiempo de unos 25 minutos. E. colihidroliza el 4-metilurnbeliferi~-l3-D-~curnido para dar el compuesto fluorescente urnbeiiferona, e l cual puede ser fcilmente observado con luz ultravioleta; en ef caso del 4-metilumbeiiferil-E-5-galactosido, se usa en la deteccibn de coliformes totales gracias a la presencia en estos organismos de la enzima B-Galactosidasa que hidroliza dicha molcula para dar el compuesto fluorescente.
Especialmente importante es el reactivo 4-metilumbeliferil-M-gIucurnido (MUG), que SE-aade a los medios selectivos para colformes totales permitiendo identificar en ese mismo anlisis la presencia de E. col, sin la necesidad de recurrir a un analisis nuevo ni al uso de medios selectivos para E. coli.
Deteccin de E. coli por tcnicas enrimaticas usando reactivos fluorescentes (suplemento MUG)

Descripcin

Escherichia coli es prcticamente la nica especie del grupo de las enterobacterias

capaz de escindir el sustrato 4-rnetilumbeliferil-B-D-glucuronido (MUG), formando 4metilumbeliferuna.Esta sustancia se caracteriza por serfluorescente a la luz ultravioleta, le que permite su fcil deteccin. La presencia de fluorescencia azul-verdosa es, al mismo tiempo, un indicador de la presencia de E. coli.
Procedimiento

El suplemento MUG puede atiadirse a prcticamente cualquier medio de cultivo que permita el c~ecimiento de E, coli. Los resultados fiables se producen en aquellos medios de cultivo que ya de por s i son selectivos para coliformes.
Normalmente el suplemento MUG se aade al medio de cultivo a una concentracion de 50 m! e trata de un caldo, 100 rng 1-1 si el medio utilizado es con agar.

En este rru~eu~miento, se utilizar el medio VRBG (Violet Red Bile Glucose Agar), suplementado con el MUG. Este medio es selectivo para el crecimiento de entarobacteriac, lo cual permitir el crecimiento de todas las bacterias de este grupo, incluida E.col,inhibiendo el crecimiento de otras bacterias. La diferenciacin de E.col
A.l&ter en Ciencia e Tecnoloxiu Arn biental

colonias de dicho microoyanismo tendrn fluorescencia a consecuencia de la hidrliss del MUG. De esta manera en un mismo medio podemos distinguir el crecimiento de enterobacterias y realizar un recuento, y al mismo tiempo identificar si las que crecen son E. col&lo cual tradicionalmenterequera la preparacibn y la siembra de dos medios.
se produce porque las

El recuento se puede reelizar por filtracin de membrana, por siembra en inclusin o pos siembra en superficie. En este caso, se siembra en superficie O. 1 ml de la muestra o de la dilkici~n adecuada y se incuba a 37 "C durante 24-48 h.
Lectura de resultados
La apariencia de E. coli en este medio es de colonias rojo-granate con un halo de precipitacin a su alrededor y fluorescencia azul-verdosa a la luz UV.

hidstrir en Ciencia e Tacnoloxfa AmbientaI

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Anulise microbiolxica da

opa

paxina 36

Azida sdica Etil violeta Agua destilada

0.4 g 0.83 mg 1.O litro

Prueba presuntiva:

Se disponen en una gradilla una serie de tubos de caldo azida correspondientes a la tabla elegida de NMP, en este caso 3 series de tres tubos con 10 ml de medio. Mediante pipetas estriles se siembran los tubos de cada sefle con 0.1, 3 y 7 0 ml del agua problema. En los tubos en los que se siembran 10 m 1el medio se encuentra a una concentracion doble.
Incubacin a 37C durante 48 horas
Resultados:

Tubos positivos: Los que presentan enturbiamiento ylo sedimento. Tubos negativos: No sedimento ni enturbiamiento.
Prueba confirmativa: A partir de todos los tubos positivos, despus de homogeneizar su contenido, sembrar tres asas en medio Litsky.

Incubacin a 37C de 24 a 48 horas.

EI medio Lifsky es un media selectivo para la deteccin de enterococos en agua. La azida de sodio junto con el etil violeta hace el mecijo selectivo para enierococos. inhibienda otros mcroorganiamos G+ y G-.

Tubos positivos: Los que presentan enturbiamiento o sedimento violeta. Tubos negativos: La?;que no presentan crecimiento al cabo de 48 horas.

Expresin de resultados:
4-

Los re~uIfdorj 58 obtienen a partir de las tablas NMP considerando positivos los tubos que dan positivo en la prueba presuntiva y en la confimativa. Los resultadoi; se expresan en ertteroococos fecalesl100 ml de agua.
OBSERVACIONES:

Es toriyeniente completar la identificacin de los estreptococosfecales, adems de ccin la sbservaci4n morfol6gica y tincin Gram, con la prueba de Ia catalasa. Para ello, resembrar can asa en superficie sobre agar nutritivo en placa. Incubar a 37C 24h. Realizar al Giarn y fa prueba de la catalasa de las colonias que se obtengan en Ia placa.
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Recuento de enterococos fecales

Prueba presuntiva
IOmi de
Caldo Rothe

O. 1

1O m1 de muestra Inciibazion 3 7OC durante 48 horas

- ..-/Resultado positivo: L . enturbiamento .yin sedimei-ito
,

Prueba c~nfirmativa
Se realiza con cada tubo positivo de la prueba
presuntiva

10 mi de
caldo Litslq

37C durante 24 a 38 hora5

Resultado positivo:
crecimiento y precipitado

no crecirniei~to en 48 horas

Mtodo d e filtro de membrana

Fundamento

UtilizaciSn de lactoca y maltosa como carbohidratos fermentables, y azida sodica como agente selectivo. La adicin de cloruro de frifenil tetrazolio al 1%(TTC) hace que los
enterococos tengan un color rojo oscuro como resultado de la reduccin tetraziicz a

un azocolorante addo.
Medio: Agar KF Streptococcus Extracto de casena Extracto de carne Extracto de levadura Clroruro sdico Glicerofosfato sdico Maltosa Lactosa Azida sdica Agar-agar Agua destilada

5.0 g 5.0 g 10.0 g 5.0 g 10.0 g 20.0 g 1.0 g 0.4 g 20 g 1.O litro

Disolver calentando hasta ebullcin. Dejar htrvir durante 5 minutos enfriar hasta 50 60C y aadir 10 ml de una solucin steril de TTC (cloruro de trifenil tetrazolio) al 1YO. No esterilizar en autoclave.

Procedimiento
Se filtra una cantidad adecuada del agua a analizar, previamente hornogeneizada, sobre uri filtro de membrana estril. El volumen de agua filtrada no debe ser inferior a 30 ml. Utilizando unas pinzas previamente flamedas se coloca la membrana sobre la placa con el medio de agar KF Strepfococcus.
Incubar las placas invertidas a 3 7 48 ~horas

Al cabo d e este tiempo se realiza un recuento directo de las colonias rojas o rosas. El color puede cubrir totalmente o solo en parfe la superficie de la colonia. Las colonias de color naranja, amarillo, blanco u otros colores no se cuentan.
Expresibn de los resultados: 4i boa resultados se expresan en numero de colonias por 1O0 rnt de muestra. Se debe calcular utilizando filtros de membrana que tengan 20-60 colonias de enterococos fecales

Es conveniente completar la identificacin de los enterococos fecales,adems d e con la obsewacibn morfolgica y tincin Gram, con la prueba de la catalasa. Para ello, resembrar can asa en superficie sobre agar nutritivo en placa. Incubar a 37C 24h. Reaisar el Gram y la prueba de la catalasa de las colonias que se obtengan en la placa.
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RECUENTO DE ESPORAS DE Clostridium SULF ITO-REDUCTORES

Definicin: Los Closfndium sulfito reductores son aquellas bacterias de morfologa bacilar, G+: anaerobias estrictas, capaces de formar esporas y con capacidad de reducir el sulfito a sulfuro.
Fundamento: La tcnica se basa en contar el nmero de colonias de bacterias esporuladas y con capacidad sulfito reductora desarrolladas en medio de cultivo slido glucosado con sulfito sdico y una sal d e hierro. T*j kJbmr~t& L.t k ,a ib51'i. Especies del gnero Clostndiumtienen una supervivencia mucho mayor que cualquier otro ndicadorbacteriano de contaminacion fecal debido a su capacidad formadora de esporas. Si se evidencian simultneamente coliformes y Closfndium es evidente el origen fecal de la contaminacin. S solo se detectaran Closfridium indicara una contaminadn fecal remota.
Medio:

Agar SPS: Sulfito sodico Polimixina sulfato Sulfadiana sodica Peptona de casena Extracto de levadura Ctrato frrico Tioglicolato sdico Paliaorbato 80 Agrir-agar Agua destilada

0.5g 0.01 g 0.12 g 75 9 Og 0.5 g 0.7g 0.05 g 15.0 g 1.Olitro

20 mi del medio base se reparlen en tubos de 50 ml. En el momento de realizar el analisis, entre 1 a 5 tubos SE! funden en un bao mara.
Can el objeto de destruir las formas vegetativas, calentar [a muestra de agua en bafb terrnorregutado a 80C durante 5 minutos, dejando enfriar a continuacin hasta 60C aproximadamente.

Sembrar cada tubo de medio preparado con 20 ml del agua a 60C. Se hornogeniza la muestra, se enfra rapidamente y despus de que el medio este solido se incuba.

La incubacin se realiza a 37 "C durante 48 horas.

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El Cdigo Alimentado espaol exige para las aguas de consumo la verificacin de ausencia de bacteriofagos especificos d e E. coliy Shgelia.

Los bacteriofagos de inters susceptibles de encontrarse en las aguas son los bacteri6fa~ocfecaies. Estos se encuentran en las deposiciones humanaseasi constantemente y estn igualmente presentes en las heces de los animales. Debido a ello pueden considerarse como testigos de una contaminacion fecal, ya que so10 se encuentran en las aguas contaminadas por materias fecales. El inters de su investigacin proviene de que pueden subsistir en el agua cuando las bacterias fecales ya han desaparecido.

Se utilizan generalmente como bacterias reveladoras de la presencia de estos bacteriofagos fecales Escherichia coli y Shigella.
Fundamento: Los bacteriofagos fecales estn generalmente en cantidad demasiado pequea para poder deseubnrlos directamente en la muestra,por lo que se enriqueceesta inoculndola, despus de la adicin de un caldo nutritivo, con un cultivo de la clula hospedadora (Eschenchia col o Shigella disenteriae) para favorecer la multiplicacin de los fagos. Despus de la multiplicacion de los fagos, se obtiene una suspensin de estos libre d e bacterias y otros contaminantes si los hubiera. A continuaci~n, la actividad fagjca se coniprueba respecto a un cultivo joven de la bacteria hospedadora.

Medios de culfivo
Caldo nutritivo:

Peptona bacteriolgica
Extracto de carne Agua destilada

5.0 g 3.0 g 1.0 litro

Agar nutritivo:

Peptona bacteriolgica Extracto d e carne

Agar-agar Agua destilada Se distribuye en placas.

5.0 g 3.0g 75.0 g 1.0 litro

Agar blando: Peptona bacteriolgica 5.0 g Extracto de carne 3.0g Agar-agar 7.0 g Agua destilada i .Olitro Se prepara en tubos con , l O m! cada uno.

Procedimiento

El anlisis se hace por duplicado, par una parte con una cepa de Shigella ypor otra con la de Eschen'chia coli, pero para simplificarno se indica aqu ms que la tcnica de E.
MLisrer en Ciencia e Tecnolmiz AmbienfuI

mlj, entendendose que el analisis debe realizarse de modo paralelo con la cepa de Shigella. Multiplicacin de

los fagos

En un matraz que contiene 50 ml de caldo nutritivo, a doble concentracion, aadir 50 m l de la muestra de agua a analizar. Agitar.
Aadir 5 ml de un cultivo de E. col en crecimiento exponencial. incubar a 37C durante un tiempo mximo de 24 horas, pudiendo ser suficiente una incubacin de 6-8 horas.

Obtencibn de la suspensin de fagos libre de bacterias

Finalizada Ia incubacibn, tomar de 5 a 1O ml del cultivoen untubo de ensayo, centrifugar a 2500 rpm durante 10 minutos y filtrar el sobrenadante sobre un filtro de 0.22 pm. El filtrado contiene la suspensin de fagos.
Manifestacin de la actividad fagica

La actividad fgica se investiga en la suspensin obtenida, pudiendo prepararss diluciones de ia misma. Asimismo, se incluye un blanco de caldo nutritivo esteril.
Fundir los tubos de agar blando y mantenerlos a 45C. Aadir 0.5 ml de un cultvo de E. col en crecimiento exponencial a cada uno d e los tubos de agar blando. Aadir inmediatamente 0.1 ml de la suspensin de fagos, o de la dilucin correspondiente, asi como del blanco, a los tubos de agar blando inoculados con E. col/. Mezclar bien sin agitar, rotandolos vigorosamente con las manos procurando que no se produzcan burbujas. Verter inmediatamente cada tubo de agar blando inoculado sobre la correspondiente placa de agar nutritivo. Debe hacerse antes de que el agar empiece a solidificar. Se hornogeniza con movimientos circulares impidiendo que el agar rebose o moje Ia tapa. Si el agar comienza a solidificar antes de verterla en I a placa o no forma una capa iiciifarrne, debe descartarse esa placa y empezar de nuevo.

La adicin d e E. coliyde cuspensibn de fagos debe hacerse a un tubo de agar blando de cada vez, para no someter a las clulas bacterianas a una temperatura elevada m&.b~srripri del necesaria.

Una vez hornsgeneiaado se deja solidificar y, a continuacin, se invierte la pIaca e incuba a 37C hasta que las calvas sean visibles, generalmente despus de 6 horas. Si el tiempo de incubacion es excesivo no se observaran calvas individuales, sino que se el~minarin todas las c6lulas de la placa, observndose lo que se denomina una lisis

confluente.

Mdsrer en Ciencia e Tecnoloxa Ambrenrnl

rlnlrse microb~oiox~crca da ocuu. psina 5 9

Lectura

La presencia d e un bacteriofago se caracteriza por la aparicin de una o varias zonas de Iisis en la placa. La ausencia de bacterifagos se traduce por una capa microbiana homogenea, similar a la del blanco.

Expresin de los resultados

Si aparecen zonas de lisis: presencia de bactehfagos de E. col; en 50 ml de agua. Si no se observa ninguna zona de lisis: ausencia de bacterifagos de E. col en 50 rnl de
agua Determinacin cuantitativa de los bacterifagos fecales

Utilizando la tcnica anteriorse puede determinar la menor cantidad de agua en la que, despues de la multiplicacin, se pone de manifiesto la presencia de bacterifagos.

Investigacin de bacterifagos de E. coli

50 mide muestra 4 50 m1 de caldo nutritivo + 5 m 1 de E. coli

1
Cenhifugacion 2500 rpm 10 min
&
I

Filtracin 0.22 p

0.1 rnl filtrado

E, coli
0.5 m 1 > Tubo agar blando

0.1 ml de caldo nutritivo (blanco)

Tubo agar blalido

Homogeneizar y vmer v 1 flaca de agar nutritivo Placa de agar nutritivo

37C 6-10 Ii

E. "di 0.5 m1

Recuento

Ausencia

Master en Cienciu e Tecnoloxia Ambiental

TECNICA DE EPlFLUORESCENClA DIRECTA SOBRE FILTRO DE MEMBRANA PARA LA C U A N T ~ F I C A C I ~ N PIDA DE BACTERIAS EN AGUA.

Esta tcnica fue desarrollada a principios de los ochenta por G.L. Pettipher, como solucin a un problema de anlisis microbiolgico rpido de la leche que se transportaba en camiones a las industrias lcteas. Este mtodo de epifluorescencia es rpido, sensible, preciso y econmico y ha sido adaptado para el anlisis microbiolgico de otros fluidos.
Consideracones generales

El tamao de poro de las membranas recomendadopara estosanalisis microbiolgicos es 0.45 mrn, ya que permite un buen compromiso entre la capacidad de retencin de
bacterias y la tasa o flujo de filtracin. Estas membranas pueden ser de steres de celulosa o bien de policarbonato. Aunque se pueden utilizar ambos tipos de membranas, las de policarbonato son las que dan mejores resultados en el campo de la e pifluorescencia. En general, las membranas que se utilicen en epifluorescencia deben tener una supericie muy plana, para evitar los problemas de profundidad de campo a la hora de utilizar el microscopio de fluorescencia con mucho aumento. Adems estas mernbranas deben presentar poca autofluorescencia (ruido de fondo) por encima de 500 nm y poca afinidad por los fluorocromos.
La fluorescencia es unfenmeno 8ptico porel cual la energa de la luz es absorbida por una sustancia, conocida como fluoroforo, y casi instantneamente esta energia es reemitida corno luz de una mayor longitud de onda (menor energa). La fluorescencia cesa casi inmediatamente despues de que se apaga la iuz de excitacibn (<0.0001 segundo).

Algunosfiuorocromos bsicos, cuando estn muy prximos,agregados en el espacio, sufren un proceso de polimerizacin. El polimero resultante mostrar un pico de excitacin (absorcin) de menor longitud de onda y un pico de emision de mayor longitud de onda que la que presentaria el monmero. Este fenmeno se conoce con el nombre de metacrornasia.
La naranja de aeridina ( A 0 del ingles acridine orange) es uno de los fluorocromos metacromaticos ms comunmente utilizado. La longitud de onda media de excitacin de esta compuesto es470 nm (450-490 r,m, luz azul); el monmero erniteflu~rescencia~~ verde (525 nm), mientras que el polimero emite en el rojo (650 nm).

La naranja de acridina se une a las cadenas de cidos nucleicos de bacterias mediante dos mecanismos: 1. iriteraeci6n electrosttica con los grupos fosfato acidicos de los polinuc~eotidos (RNA), Y 2. mediante la intercalacin dentro de la estructura de doble helice de DNA.

Corno las mdsnas de RNA pueden flexionarse, las molculas de naranja de acridna que se unan a 8 1 entran en contacto unas con otras y se "potimerizarn" (interaccin
Mhxi'er en Ciencia e Tr:nobxiaArnbienial

electriinica de los monmeros, no una union covalente), dando fluorescencia roja (metacromasia). Por el contrario, las molculas de naranja de acridina que se unen a DNA permanecen separadas debido a la estructura mas rigida de doble hlice del DNA y, por tanto, la fluorescencia resultante es verde (ortocromasia). Sin embargo, es importante sealar que este fenmeno solo se produce cuando la concentracin intracelular de naranja de acridina es lo suficientemente alta como para saturar los grupos fosfato de las molculas de RNA. Si la concentracion intracefular de fluorocromo es muy baja, las pocas molculas de naranja de acridina unidas a los grupos fasfato del RNA estarn muy separadas unas de otms y no se produce la palimerizacin y, por tanto, la fluorescencia resultante sera verde.

En aquellas condiciones en las que la concentracibn intracelular de naranja de acridina

es suficientemente elevada, el RNA emitir fluorescencia roja y el DNA verde. En base a esto, seria posible distinguir entre mcroorganisrnos vivos (elevada concentracin de RNAlfluorescencia roja) y microorganismos muertos (baja concentracon de RNA: la mayora de la fluorescencia proviene del DNA/fluorescencia verde).
En la practica, se recomienda contar todas las bacterias tanto si tienen fluorescencia verde o roja.
Procedimiento

LOS portafiltros deben limpiarse con una solucin deetanol al 70% antes de la filtracin
En el portafiltros debe colocarse primero un filtro ms grueso (por ejemplo, un filtro de fibra de vidrio) y por encima el filtro de membrana oscuro (Isopore). Este filtro ms grueso acta como filtro de amortiguacin ya que el filtro de membrana puede estropearse al ejercer sobre el un vaco importante Para el recuento debe haber entre 1y 100microorganismos porcampo. Esto nos puede dar una idea de! volumen de agua a filtrar. TinciBn: 1.-Sobre la membrana con los microorganismos retenidos se vierte 1 ml de una solbici6r1de naranja de acridina. %.-El tiempo de tincin es de 5 minutos a temperatura ambiente. 3.-Eliminar el lquido mediante vaco. 4.-El exceso de colorante se retira aadiendo 1 mi de una solucin de citrato sdico -. acidificada (pH 3.3) durante 5 minutos. 5.-Par ultimo, algunos autores recomiendan un paso de fijacin final aadiendo alcc?holisopropilico durante 1 minuto.

La membrana con los microorganisrnos ya teidos se coloca en un porta en el que previamente se ha colocado una gota de aceite de inmersin especial para epifluorescencia. Por encima del filtro se coloca otra gota de aceite de inmersin y finalmente un cubre lo suficientemente grande como para cubrir el filtro.

Afasrsr r n

2:cncio e Tecnoloxio Ambiental

Test de aglutinacin
Se denomina aglutinacidn al fenbmono que se observa cuando se mezclan antigenos (compuestos capaces de inducir una respuesta inmunitaria) en suspensi8n con un suero que contenga anticuerpos especficos de ese antigeno. El resultado de esta aglutinacion es la formacion de agregados que aumentan de tamao y tienden a sedimentar (similar a una reaccin de precipitacin).

Esta propiedad se puede usar para detectar la presencia de determinadas bacterias o incluso para identificarlas, puesto que cada especie bacteriana lleva en su superficie antigenos especificos los cuales reaccionan con anticuerpos tambien especificos.

Sondas moleculares
Una sonda de cido nucleco es un pequeo fragmento de DNA 3 RNA cuya secuencia de bases es complementaria de un gen con el que puede hibridar. Se han utilizado algunassondas que utilizan secuencizs de RNAr 76s para diferenciar microorganismos en medios naturales. Algunas secuencias del RNAr 16s son secuencias de identidad lo que permite construir sondas muy especificas capaces de diferenciar distintos organismos. Utilizarido una coleccin de estas sondas es posible identificar diferentes especies en la misma muestra.

Hay muchas protocolos para la realizacin de esta prueba, pero de forma general la metodologia es la siguiente:las celulas se fijan con formaldehdo y se inmovilizan sobre filtros de fibra de vidrio; se tratan para que se hagan permeables y permitan la entrada de la sonda o se lisan; si Ia sonda es de DNA se trata el DNA celular para separar las cadenas, con sondas RNA esto no es necesario. A continuacin se aade la sonda marcada; los dos tipos de marcajes mas utilizados son: radioistopos (35SO ?2P) O colorantes fluorescentes. Se dejan hibridar, se lava para eliminar la sonda en exceso y se detecta la hibridacin por autorradiografia o microscopa de fluorescencia. Utiiizando sondas marcadas con fluorocromos que emitan a distinta longitud de onda es posible tratar la misma muestra con varias sondas a la vez e identificar y cuantificar diferentes tipos celulares utilizandofiltros apropiados en el microscopio de fluorescencia (o utilizando un fluormetroj.

Amplificacion de DNA (PCR

..

SE ha comentado a aplicar la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR = polymerase chain reaction) a la defeccion de microorganismos. Una aplicacin de esta tecnica es aumentarexponencialmente una secuencia blanco, lo que aumenta significativamente la probabilidad de detectarla p ~sondas r genicas especificas.
La reaccibn en cadena de la polimerasa implica calentar el DNA para separar las cadenas, aadirlos cebadoresespecifcos al DNA blanco y extenderel DNA por adicin de nucle~tidos a 10s cebadores por accin de la DNA polimerasa. Los cebadores se disean para que hibriden en regiones de DNA que flanquean a la secuencia blanca deseada y se extienden a lo largo de esta secuencia por accin de la Taq polimerasa

en presencia de desoxirribonucletidos libres. Cuando se forman las dobles cadenas se calientan de nuevo para separarlas y el proceso se repite muchas veces, resultando un incremento exponencial en la cantidad del DNA blanco. Estos ciclos repetitivos se automatizan en los termocicladores. Una vez realizados 20 ciclos se producirn mas de un milln de copias de la secuencia blanco de DNA, siempre que esta estuviera en la muestra. Se pueden detectar as microorganismos presentes en mnimas cantidades, una vez extraido el DNA del medio. Tambin se pueden hacer aproximaciones cuantitativas, pues sabiendo el numero de ciclos de PCR sabemos cuanto se ha amplificado el fragmento original, y una vez cuantificada ta hibridacin se deduce el valor inicial presente en el medio. Utilizando amplificacin por PCR e hibridaciiin por sondas se detectaron cantidades tan bajas como 1a 5 clulas viablesde E.colien 100 ml de agua. En muestras de sedimentos, la PCR permiti la deteccin de ' i00 clulas de P.cepacia ACI 100en 100 g de muestra de sedimento. frente a un fondode 1011 microorganismos distintos.
Las sondas de cidos nucleicos tienen algunas ventajas sobre los mtodos de cultivo y las mediciones de actividad microbiana en algunos casos:

- No se requiere el cultivo dei microorganismo deseado. Esto implica que los resultados que con las tcnicas de cultivo suelen requerir das, con estas tcnicas moleculares pueden obtenerse en horas. Adems es importante para bacterias que no son cultivables en laboratorio. -No se requiere la expresin del gen. Estotiene importancia porque las medidas de actividad pueden dar errores si la(s) enzima(s) responsable(s) para ia transformacin particular que se mide no existen o por alguna razn no son activas en la clula en el momento de ia medicin. - Los limites de deteccin estn muy por debajo de los de otras tcnicas. - La especificidad es mayor.
La utilizacin de las sondas de cido nudeico es de gran inters, sobre todo donde los metodos de cultivo son insatisfactorios o donde tos organismos deseados existen en cantidades muy bajas, inferiores a la sensibilidad de las medidas de actividad. Una cantidad baja de clulas puede no representar ningn problema para las pruebas con sondas de DNA in vitro, yaque el DNA aisfado se puede amplificar utilizando la reaccin en cadena de la polimerasa a un nivel suficiente para la deteccin efectiva con sondas.
P .

APHA-AWWA-WPCF. 1992. "Mtodos Normalizados para el Anlisis de Aguas Potables y Residuales". Diaz de Santos. Madrid
BABCOCK,

R.H.1985. "lnstrumentaciiin y Control en el Tratamiento de Aguas Potables,

Industriales y de Desecho". Ed. Lmusa. Mejico.BORREGO, J.J. (ed) 1992. "Metodos Microbiolgicos Rpidos para el Anlisis de Aguas y Alimentos". Secretara de publicaciones de la Universidad de Mlaga.

COLLINS, C.H., LYNE, P.M. & GRANGE, J.M. 1989. "Microbiological Methods". 6th ed. Butterworths Pub. London.
ESTRADA, P. 1986. "Manual de Control Analtico de la Potabilidad de las Aguas d e Consumo Humano". Ed. Diaz de Santos S.A. Madrid.

GUINEA, J., SANCHO, J. y PARES, R. 1979. "Anilisis Mcrobiologico de Aguas. Aspectos ApIicados".Ed. Omega. Barcelona.
JAMES, A. & EVISON, L. (Eds). 1979."Biological lndicatorsof Water Quality".John Wiley & Son. Chischester.

LYNCH, J.M. & HOBBIE, J.E. 1988. "Micro-organisms in Action: Concepts and Applications in Microbial Ecalogy". Blackwell Scientific Publications. 0)xford.
MADIGAN, M.T., MARTIKO, J.M. & PARKER, J . 1998. Brock Biologa de los microorganismos. 8a Ed. Prentice-Hall Iberica. Madrid
PASCUAL ANDERSON, M.R. 1992. "Microbiologa Aiirnentaria". Ed. Diaz de Santos. Madrid.

PEREZ LOPEZ, J.A. & ESPjGARES GARC~A, M. (eds.) 1999. "Estudio sanitario del agua" 2" edicin. Editorial Universidad de Granada.

PRESCOTT, L.M., HARLEY, J.P. & KLEIN, D.A. 1999. Mcrobiologia. 4a Ed. McGraw-Hill
Interarnericana. Madrid. Espaa. RHEINHEIMER, E. 7G9l. "Aq~aticMicrobiology"4~ Ed. John Wiley and Sons. Chichester (U.K.)
RODIER, J. 7 978. "Anlisis de las Aguas". Ed. Omega. Barceiona.

WINKLER, M. 1986. "Tratamiento Biolgico de Aguas de Desecho". Ed. tirnusa. Mjico.

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