Chapitre IV

IV.2. VALIDATION IV.2.1. INTRODUCTION

Dans la pratique courante, aprs ltape doptimisation, il devient de plus en plus vident et essentiel de dmontrer au moyen de la validation quune mthode optimise correspond lusage attendu tout en fournissant, par ailleurs, des rsultats fiables. Pour valider la mthode de CLHP optimise dans ce travail, nous avons appliqu la stratgie base sur le profil dexactitude rcemment introduite et dcrite dans la littrature [50, 51]. Dun point de vue statistique, cette stratgie de validation rpond aux besoins des analystes quant la prise de dcision en rapport avec les rsultats fournis et en considrant des limites dacceptation prdfinies ainsi que le risque relatif lusage futur de la mthode. De ce fait, lutilisation du profil dexactitude se trouve tre en accord avec lobjectif dune mthode qui peut tre rsum en sa capacit quantifier le plus exactement possible chacune des quantits inconnues devant tre dtermines par le laboratoire. En ralit, ce qui est attendu dune procdure analytique lorsquun analyste lapplique est que la diffrence observe entre le rsultat dune mesure (xi) et la vraie valeur (T) de lchantillon (qui demeure toujours inconnue) soit infrieure la limite dacceptation prdfinie. De plus, lanalyste devra fournir la garantie quant lusage futur de la mthode. Au moyen du critre de lerreur totale sur laquelle se base cette stratgie de validation, lanalyste peut envisager de contrler le risque du consommateur indispensable dun point de vue garantie et confiance. En effet, des critres idaux dacceptation devraient assurer quune proportion leve des rsultats futurs sera comprise dans des limites acceptables avec un degr de confiance lev [233]. Le risque du consommateur (faux ngatif) est dfini comme tant le risque daccepter des rsultats mauvais et par contre le risque du producteur (faux positif) est celui de rejeter des rsultats corrects. Lobjectif de cette tude est deffectuer une validation complte de la mthode de CHLP pour la dtermination de limpuret R-timolol dans le S-timolol. Notre souhait tait deffectuer une validation complte de la mme mthode de CLHP pour les autres impurets spares par cette mthode. Malheureusement, nous tions limits en pratique par la quantit disponible de ces impurets.

91

Chapitre IV

IV.2.2. PRPARATION DES SOLUTIONS

IV.2.2.1. SOLUTIONS POUR LA VALIDATION DE LA MTHODE DE CLHP IV.2.2.1.1. Standards de calibration Une solution mre de R-timolol a t prpare par dissolution dans 25 mL de mlange de solvants (2-propanol contenant 1% de dithylamine) dune quantit exactement pese approximative de 11,25 mg de substance chimique de rfrence (SCR) de malate de Rtimolol. Pour permettre une dissolution complte, la solution mre tait place au bain ultrasons pendant au moins 15 min. Ensuite, des dilutions successives ont t ralises en vue dobtenir plusieurs solutions filles aux niveaux de concentration tels que mentionns dans le tableau IV.6. Ces solutions ont t utilises comme standards de calibration (SC). Chaque solution a t analyse trois fois. Selon le protocole dcrit dans la littrature [50], le nombre des niveaux de concentration est suffisant pour gnrer diffrents modles de rgression.

Tableau IV.6. - Solutions relatives au R-timolol

Niveaux de concentration (% relatif 1,5 mg/mL de malate de S-timolol) 0,1 % 0,2 % 0,4 % 0,8 % 1,6 % Total

Concentration en R-timolol (g/mL) Standards de calibration 1,5 3,0 12,0 24,0 12 chantillons / jour Standards de validation 1,5 3,0 6,0 12,0 24,0 15 chantillons / jour

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Chapitre IV IV.2.2.1.2. Standards de validation Des solutions mres indpendantes ont t prpares de la mme faon que pour celles des standards de calibration. Elles ont t successivement dilues en vue dobtenir des solutions intermdiaires. Les solutions filles dont les concentrations sont indiques dans le tableau IV.6 ont t obtenues par dilution de ces solutions intermdiaires dans des ballons jaugs volumtriques contenant pralablement environ 15 mg exactement pess de malate de S-timolol. Trois rptitions (n = 3) ont t prpares pour chaque niveau de concentration (m = 5). Lensemble de ltape de prparation a t rpte pendant trois jours (p = 3). Ces standards de validation (SV) ont t prpars de manire indpendante dans la matrice en vue de simuler le plus possible la procdure analytique pour la dtermination de limpuret Rtimolol dans des chantillons de malate de S-timolol. Pour cela, le lot dchantillon N8060 a t utilis comme matrice puisque ctait lun des lots les plus purs et quil tait disponible en quantit suffisante pour la ralisation des expriences. Lvaluation de la slectivit de la mthode a t faite avec une solution blanc du mlange des solvants et un mlange de S-timolol, de R-timolol, disotimolol, de dimre de timolol et du dimorpholinothiadiazole aux concentrations denviron 10 g/mL.

IV.2.2.2. SOLUTIONS UTILISES POUR LA DTERMINATION QUANTITATIVE Plusieurs solutions dchantillons examiner de malate de S-timolol ont t prpares des concentrations de 1,5 mg/mL. Chaque chantillon a t analys en trois rptitions. Une solution mre contenant 1,5 mg/mL de malate de R-timolol SCR a t prpare puis dilue cent fois pour obtenir une solution de rfrence contenant 0,015 mg/mL de malate de R-timolol correspondant 1,0 %. Dautre part, une solution mre contenant 1,5 mg/mL de malate de S-timolol a t prpare puis dilue 250 fois en vue dobtenir une deuxime solution de rfrence contenant 0,006 mg/mL de malate de S-timolol correspondant 0,4 %. Ces deux solutions de rfrence ont t utilises pour dterminer respectivement le malate de R-timolol et les substances apparentes dans les diffrents lots dchantillons de malate de S-timolol.

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Chapitre IV Les diffrentes solutions mres ont t passes au bain ultrasons pendant environ 15 min en vue dassurer une dissolution complte des substances.

IV.2.3. RESULTATS ET DISCUSSION

IV.2.3.1. STRATGIE DU PROFIL DEXACTITUDE La validation a pour but de dmontrer que la procdure analytique correspond lusage pour lequel elle est prvue [234, 235]. La stratgie couramment utilise pour la validation dune procdure analytique est base sur les critres dacceptation qui considrent de manire dissocie le biais et la variance [50, 123]. Cependant, dans ltude prsente, nous avons appliqu une nouvelle stratgie base sur lintervalle de tolrance desprance de lerreur totale dune mesure (en anglais expectation tolerance intervals for the total error measurement ), erreur qui prend en compte la justesse (biais) et la fidlit intermdiaire (cart-type). Comme prcdemment mentionn dans la partie introductive, cette stratgie prsente la possibilit de contrler le risque dacceptation dune mthode non adquate et ce, au moyen des profils dexactitude. Un autre avantage prsent par cette stratgie est de fournir la garantie que les rsultats des mesures qui seront obtenus lors de lapplication future de la mthode valide seront inclus dans les limites dacceptation fixes priori selon les exigences dfinies. En consquence, le profil dexactitude peut tre considr comme un outil de dcision trs utile pour accepter ou rejeter une mthode selon son usage prvu. De plus, le profil dexactitude peut tre utilis pour slectionner le modle de rgression le plus appropri pour la calibration, pour dterminer les limites de quantification suprieure et infrieure, et subsquemment pour slectionner lintervalle de concentration pour le dosage. Dun point de vue pratique, cette stratgie de validation peut se rsumer en six tapes reprises ci-aprs : a. slection des limites dacceptation considrant lusage attendu de la mthode, b. ajustement dun modle de rgression partir des standards de calibration, c. calcul des concentrations des standards de validation partir du modle slectionn,

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Chapitre IV d. dtermination du biais moyen chaque niveau de concentration, e. calcul des limites de tolrance bilatrales pour les rsultats attendus au niveau chaque niveau de concentration en considrant le biais et lcart-type de fidlit intermdiaire, et f. tablissement du profil dexactitude, reprsentant comme fonction de la concentration, le biais moyen, lintervalle de tolrance des valeurs attendues au niveau et les limites dacceptation.

IV.2.3.2. CRITRES DE VALIDATION Les critres de validation sont ceux couramment utiliss dans les procdures analytiques de sparation et repris dans le document Q2A de la Confrence Internationale sur lHarmonisation [40]. Il sagit de la slectivit, de la justesse, de la prcision (rptabilit et fidlit intermdiaire), de lexactitude, de la linarit, des limites de dtection et de quantification.

IV.2.3.3. VALIDATION DE LA MTHODE DE DOSAGE DU R-TIMOLOL IV.2.3.3.1. Slectivit Il nous a tout dabord sembl indispensable de vrifier labsence de toute interfrence au niveau du temps de rtention du R-timolol ainsi quau niveau de ceux des autres impurets spares par la mthode de CLHP dveloppe dans ce travail. Pour cela, la slectivit de la mthode a t vrifie en comparant des chromatogrammes typiques obtenus en analysant dune part, une solution dun blanc de 2-propanol contenant 1 % de dithylamine, et dautre part, une solution dilue dun mlange de S-timolol, de R-timolol, disotimolol, de dimre de timolol et du dimorpholinothiadiazole. Comme illustr dans la figure IV.9, aucun pic ni interfrence na t observ aux temps de rtention correspondant ces cinq composs. De plus, le pic correspondant au Rtimolol au niveau de concentration de 0,2 % peut tre facilement intgr et par consquent tre quantifi en prsence du pic correspondant au S-timolol 1,5 mg/mL.

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Chapitre IV

A
6 Absorbance (mAU) 1 4 5 2 2 3 4

0 0 5 10 Temps (min) 15 20

B
6 Absorbance (mAU)

0 0 5 10 Temps (min) 15 20

96

Chapitre IV

C
6 Absorbance (mAU)

4 2 2 6

0 0 5 10 Temps (min) 15 20

Figure IV.9. Chromatogrammes dune solution contenant le dimre de timolol, le Rtimolol, lisotimolol, le S-timolol et le DMTDZ (A), du mlange des solvants de dissolution (B) et dun standard de validation 0,2 % (C). Pics: 1.- Dimre de timolol; 2.- R-timolol; 3.- isotimolol; 4.- S-timolol; 5.- DMTDZ; 6.- Front de solvant. Concentrations des analytes : Entre 5 et 10 g/mL en (A) et environ 3 g/mL de R-timolol calcul par rapport au malate de S-timolol dans (C).

Un autre aspect de la slectivit a consist en lvaluation dune quelconque interfrence au temps de rtention du R-timolol avec la solution chantillon de malate de Stimolol utilise comme matrice. Nous avons observ un faible pic identifi comme tant le Rtimolol et dont le signal tait infrieur la limite de quantification cible (0,1%). Par consquent, nous avons valu son influence sur les rsultats en appliquant la stratgie conventionnelle du test t de Student en vue de comparer les pentes ainsi que les ordonnes lorigine des droites de rgression dtermines entre la concentration en R-timolol et la rponse analytique (aire du pic du R-timolol) obtenues dune part, en prsence de la matrice et dautre part, en absence de celle-ci [236]. Gnralement, une diffrence significative observe 97

Chapitre IV entre les pentes indique une erreur systmatique proportionnelle alors quune diffrence significative des ordonnes lorigine correspond une erreur systmatique constante. Si les pentes et les ordonnes lorigine sont significativement diffrentes, les erreurs proportionnelles et systmatiques ont une influence sur les rsultats obtenus avec la matrice. Dans le cas qui nous concerne, aucune erreur systmatique na t note puisque aucune diffrence significative na t observe entre les ordonnes lorigine (diffrence = -218,98, p-value = 0,311) ni entre les pentes (diffrence = 29,377, p-value = 0,075).

IV.2.3.3.2. Analyse de la fonction de rponse et slection du modle de rgression appropri Cette tape constitue lune des plus importantes du fait que la fiabilit des rsultats de validation qui seront obtenus dpend du modle de rgression slectionn. La fonction de rponse a t value au moyen de trois courbes de calibration construites partir des standards de calibration et utilisant quatre niveaux de concentration (voir tableau IV.6). Ensuite, plusieurs modles de rgression ont t ajusts au moyen du logiciel utilis en vue danalyser la relation entre la concentration en R-timolol (g/mL) et la rponse analytique (surface de pic du R-timolol) et de dcider lequel est le plus appropri. Les concentrations des standards de validation ont t calcules partir de chaque courbe obtenue, ce qui a permis dobtenir pour chaque niveau de concentration le biais relatif moyen, les limites de tolrance suprieures et infrieures des valeurs attendues au niveau et ce, en considrant lcart-type pour la fidlit intermdiaire. Ensuite, diffrents profils dexactitude (figures IV.10 IV.12) ont t construits partir de ces donnes. Par souci de clart dans notre texte, nous crirons limites de tolrance (ou intervalles de tolrance) pour faire allusion aux limites de tolrance des rsultats attendus au niveau (ou intervalles de tolrance). Comme il sagit dune dtermination dimpurets, les limites dacceptation ont t fixes 10 % [53]. Nous avons considr la variabilit de 10 % communment admise par les organismes rglementaires pour la dtermination dimpurets. Comme il est couramment pratiqu dans les monographies des pharmacopes, un seul niveau de concentration est utilis pour la calibration en vue de dterminer des impurets. Dans ce contexte, nous avons examin les profils dexactitude obtenus en considrant les concentrations de 24 g/mL et de 12 g/mL pour la calibration. Ainsi que lillustre la figure IV.10.A, en considrant la concentration de 24 g/mL et un risque de 5 %, le profil 98

Chapitre IV dexactitude excde les limites dacceptation, avec une erreur relative importante observe aux faibles niveaux de concentration, alors quavec la concentration de 12 g/mL (figure IV.10.B) et le mme risque, le profil dexactitude est lintrieur des limites dacceptation. Mme si une augmentation de lerreur relative a t observe aux faibles niveaux de concentration, lobjectif de la mthode demeure atteint. Cet objectif se rsume en la capacit de quantifier limpuret R-timolol dans les chantillons de malate de S-timolol des faibles niveaux de concentration sachant que la teneur maximum de cette impuret chirale tolre par la monographie est 1,0 % [209]. En consquence, nous avons slectionn ce modle de rgression qui dune part, rencontre les objectifs de la mthode et dautre part, correspond lutilisation en analyse de routine. Ce modle a t ainsi utilis pour valuer les diffrents critres de validation. De plus, il garantit que 95 fois sur 100 les futures mesures seront incluses dans les limites dacceptation.

15 10 Erreur relative (%) 5 0 -5 -10 -15 0

Biais (%) Limites d'acceptation 10 %

10 15 Concentration (g/mL)

20

25

Intervalle de tolrance (%) Mesures individuelles

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Chapitre IV

15 10 Erreur relative (%) 5 0 -5 -10 -15 0

Biais (%) Limites d'acceptation 10%

10 15 Concentration (g/mL)

20

25

Intervalle de tolrance (%) Mesures individuelles

Figure IV.10. Profils dexactitude obtenus avec un risque de 5 % et en considrant le modle de rgression linaire passant par 0 et ajust avec 24,0 g/mL (A) et 12,0 g/mL (B).

Nous avons aussi examin dautres modles notamment les linaires simples (pondrs ou non), le quadratique et ceux obtenus aprs une transformation logarithmique ou racine carre. En considrant le modle de rgression linaire et prenant un risque de 5 % (Figure IV.11.A), nous avons constat que les intervalles de tolrance se trouvent en dehors des limites dacceptation pour le niveau de concentration le plus faible. Mme en prenant un risque de 10 % (Figure IV.11.B), la limite de tolrance infrieure se retrouve toujours en dehors des limites dacceptation alors quune amlioration est observe pour la limite de tolrance suprieure au plus faibles niveaux de concentration.

100

Chapitre IV

15 10 Erreur relative (%) 5 0 -5 -10 -15 0

Biais (%) Limites d'acceptation 10%

10

15

20

25

Concentration (g/mL)
Intervalle de tolrance (%) Mesures individuelles

15 10 Erreur relative (%) 5 0 -5 -10 -15 0

Biais (%) Limites d'acceptation 10%

10 15 Concentration (g/mL)

20

25

Intervalle de tolrance (%) Mesures individuelles

Figure IV.11. Profils dexactitude obtenus en considrant le modle de rgression linaire avec un risque de 5 % (A) et un risque de 10 % (B).

Le modle de rgression linaire pondre appliquant un facteur de pondration de 1/X (X tant la concentration en R-timolol) et associ un risque de 5 % a t trouv appropri comme lillustre la figure IV.12. En effet, les intervalles de tolrance sont compris 101

Chapitre IV dans les limites dacceptation et ce, dans tout lintervalle de concentration utilis pour la validation. Mme si ce modle de rgression semble tre le plus appropri pour dcrire adquatement la relation entre la concentration et la rponse analytique, son application en routine peut tre longue parce quelle ncessite la prparation et lanalyse de plusieurs solutions de rfrence en vue dtablir des courbes de calibration pour le dosage des impurets.

15 10 Erreur relative (%) 5 0 -5 -10 -15 0

Biais (%) Limites d'acceptation 10%

10

15

20

25

Concentration (g/mL)
Intervalle de tolrance (%) Mesures individuelles

Figure IV.12. Profil dexactitude obtenu en considrant le modle de rgression linaire pondr (1/X) et un risque de 5%

Les autres modles de rgression linaire ou linaire pondre obtenus aprs transformation au moyen dune fonction racine carre ou logarithmique ne conviennent pas puisque les profils dexactitude correspondants sont en dehors des limites dacceptation quel que soit le risque considr.

102

Chapitre IV

IV.2.3.3.3. Justesse La justesse fournit une indication sur les erreurs systmatiques de la procdure analytique [123]. Elle est exprime en termes de biais (en g/mL) ou de biais relatif (%) et a t estime au moyen des standards de validation dans la matrice cinq niveaux de concentration (de 1,5 24 g/mL). Comme le montre le tableau IV.7, les biais relatifs de la mthode dveloppe ont t trouvs acceptables puisquils sont relativement proches de zro et que les rcuprations sont comprises entre 98,5 et 105,5 %. Cependant, pour les niveaux de concentration les plus faibles, nous avons not des biais relatifs aux alentours de 4 ou 5 %.

Tableau IV.7. - Justesse de la mthode Niveaux de concentration (n = 3, p = 3) 1,5 g/mL 3,0 g/mL 6,0 g/mL 12,0 g/mL 24,0 g/mL Biais absolu : g/mL (biais relatif : %) 0,082 (5,4) 0,106 (3,5) 0,042 (0,7) -0,002 (0,0) -0,303 (-1,3)

Rcupration 105,4 % 103,5 % 100,7 % 100,0 % 98,7 %

IV.2.3.3.4. Fidlit La fidlit fournit une indication sur les erreurs dues au hasard [123]. Elle a t estime en calculant la rptabilit et la fidlit intermdiaire chaque niveau de concentration utilis en validation. Comme montr dans le tableau IV.8., les coefficients de variation de rptabilit qui refltent la fidlit intra-jour pour chaque niveau de concentration ne dpassent pas 1,3 %. Pour la fidlit intermdiaire qui reflte la fidlit inter-jour, les coefficients de variation ne dpassent pas 2,0 %, ce qui dmontre lexcellence de la fidlit de la mthode de CLHP dveloppe. 103

Chapitre IV

Tableau IV.8. - Fidlit de la mthode Niveaux de concentration (n = 3, p = 3) 1,5 g/mL 3,0 g/mL 6,0 g/mL 12,0 g/mL 24,0 g/mL

Rptabilit (coefficients de variation %) 1,2 1,2 1,2 0,6 0,9

Fidlit intermdiaire (coefficients de variation %) 1,2 1,7 1,9 0,6 1,0

IV.2.3.3.5. Exactitude Lexactitude se rfre ltroitesse dagrment entre le rsultat obtenu et la valeur de rfrence accepte notamment par convention ou la vraie valeur [123]. Lexactitude tient compte de lerreur totale lie au rsultat, cest--dire des erreurs systmatique et alatoire. Lexactitude de la mthode est reprsente partir du profil dexactitude tel quillustr la figure IV.10.B. Au vu des rsultats prsents dans le tableau IV.9, la mthode CLHP propose est exacte tant donn qu chaque niveau de concentration, les diffrentes limites de tolrance des rsultats restent incluses dans les limites dacceptation de 10 %. Selon le test de puret nantiomrique dcrit dans la monographie du malate de S-timolol dans la Pharmacope Europenne [209], la teneur maximum tolre pour le R-timolol (1 % correspondant 15 g/mL) est la valeur cible pour la prise de dcision sur lacceptation ou le rejet dun lot dchantillon de malate de S-timolol. Remarquons quaux alentours de cette valeur cible, lexactitude de la mthode CLHP est particulirement bonne.

104

Chapitre IV

Tableau IV.9. - Exactitude de la mthode Niveaux de concentration (n = 3, p = 3) 1,5 g/mL 3,0 g/mL 6,0 g/mL 12,0 g/mL 24,0 g/mL

Limites de tolrance (en g/mL) 1,55 1,64 2,98 3,28 5,71 6,48 11,9 12,3 23,3 24,5

Limites de tolrance (en %) 2,5 8,4 -1,4 8,5 -5,6 7,0 -1,5 1,5 -3,8 1,3

IV.2.3.3.6. Linarit La linarit dune procdure analytique est sa capacit obtenir, lintrieure dun certain intervalle de dosage, des rsultats (et non des signaux) directement proportionnels la concentration (quantit) de la substance examiner dans lchantillon [237]. Pour toutes les sries (jours) de validation, une droite de rgression a t ajuste sur les concentrations calcules par rapport aux concentrations introduites en appliquant le modle de rgression linaire pour lequel le coefficient de dtermination (r), la pente et lordonne lorigine sont prsents dans le tableau IV.10.

Tableau IV.10. - Linarit de la mthode

n =3 rptitions m = 5 niveaux de concentration p = 3 sries (ou jours) N = 45 observations totales

Intervalle de dosage Pente Ordonne lorigine r

1,5 24 0,9825 0,1492 0,9998

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Chapitre IV Dans la pratique courante, trs souvent le coefficient de dtermination (r) est utilis erronment pour valuer la qualit de la linarit dune procdure analytique. En effet, Van Loco et coll. [238] ainsi que Hibbert [239] ont mis en lumire cet aspect en dmontrant que la valeur du coefficient de dtermination approchant lunit ne peut que donner une certaine approximation de la qualit de la linarit tant donn quune relation curviligne pourrait aussi prsenter un r proche de lunit. Dans ce cas, un des moyens est dappliquer une analyse de variance (ANOVA) [240] ou lapproche considrant la rgion de confiance de joint elliptique (en anglais Elliptic Joint Confidence region) de Mandel et Linnig [241]. Lapproche statistique pour lajustement de la droite de la linarit en utilisant une ANOVA compare lerreur dajustement (en anglais Lack-of-Fit ou LOF ) lerreur pure (alatoire). Lhypothse dun ajustement adquat est rejete si le rapport Fobserv qui quivaut LOF/Erreur pure est suprieur la valeur F de la statistique pour un nombre dfini de degrs de libert et un niveau de signification appropri. Toutefois, le problme de cette approche est que plus la variance est grande, plus ce rapport Fobserv est petit, et par consquent plus il y a de chance de considrer dune manire errone lajustement comme adquat et in fine daccepter la linarit de la mthode analytique. Ainsi, cette approche ne convient pas pour valuer la linarit de la mthode dans le cas prsent. De mme, lapproche considrant la rgion de confiance de joint elliptique ne convient pas pour les raisons voques avec lANOVA. Cest pourquoi nous avons appliqu lapproche base sur les limites de tolrance absolues. Pour quune droite de rgression soit dmontre linaire, il faudrait que les limites de tolrance absolues soient comprises dans les limites dacceptation prdfinies. Puisque les limites de tolrance absolues telles quillustres dans la figure IV.12 sont comprises dans les limites dacceptation de 10 %, la linarit de la mthode de CLHP dveloppe est ainsi dmontre.

106

Chapitre IV

28

Concentration calcule (g/mL)

26 24 22 20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 0,0 2,5 5,0 7,5 10,0 12,5 15,0 17,5 20,0 22,5 25,0

Concentration introduite (g/mL)

Figure IV.12. Graphe de la linarit se rapportant la mthode de CLHP pour la dtermination du R-timolol Lgendes : La ligne continue est la droite didentit (y = x) sur laquelle les points devraient se retrouver dans le cas dune mthode valide; Les lignes en traits (vert) correspondent au profil dexactitude, par exemple, les limites de tolrance exprimes en valeur absolue, et les lignes pointilles (rouge) reprsentent les limites dacceptation 10 %.

IV.2.3.3.7. Limites de dtection et de quantification La limite de dtection (LD) est la plus petite quantit de la substance cible qui peut tre dtecte, mais pas exactement quantifie dans un chantillon [50, 46]. La LD a t estime en utilisant lordonne lorigine moyenne du modle de calibration et lcart-type rsiduel de la rgression. En appliquant cette mthode de calcul, la

107

Chapitre IV LD de la mthode CLHP vaut 0,27 g/mL (ou 0,02 % par rapport la concentration de 1,5 mg/mL). La limite de quantification infrieure (LQ) est la plus petite quantit de la substance cible dans un chantillon qui peut tre dtermine dans des conditions exprimentales prescrites avec une exactitude bien dfinie [50, 46]. La LQ a t obtenue en calculant la plus petite concentration en dessous de laquelle les limites dexactitude ou les limites de tolrance sont en dehors des limites dacceptation. Etant donn que le profil dexactitude obtenu en considrant le modle de rgression slectionn est inclus dans les limites dacceptation, le premier niveau de concentration (1,51 g/mL ou 0,1 % par rapport la concentration de 1,5 mg/mL) qui est le niveau le plus bas investigu correspond la limite de quantification. Selon ICH [40], il est recommand de vrifier si la LD obtenue avec dautres stratgies comme par exemple celle du profil dexactitude quivaut celle dtermine suivant lapproche classique base sur lvaluation du rapport signal/bruit. Un rapport compris entre 3 :1 ou 2 :1 est gnralement considr comme acceptable pour lestimation de la LD [40]. Pour cela, nous avons effectu quelques expriences supplmentaires en vue danalyser six solutions de malate de S-timolol contenant du R-timolol des concentrations proches de la LD estimes au moyen du profil dexactitude. En appliquant cette approche, la LD vaut 0,173 g/mL ce qui correspond 0,012 % par rapport 1,5 mg/mL. Cette valeur tant trs proche de celle obtenue avec la stratgie du profil dexactitude, nous pouvons admettre que la concentration de 0,27 g/mL correspond la LD.

IV.2.3.4. PROFIL DE RISQUE Le profil de risque exprime par niveau de concentration investigu, la probabilit pour que le rsultat dune mesure effectue en analyse de routine puisse tomber en dehors des limites dacceptation, en considrant le biais estim ainsi que les paramtres de prcision obtenus en phase de validation. Trs rcemment, la Food and Drug Administration (FDA) a introduit travers le Process Analytical Technology (PAT) [242] la notion de gestion du risque dans le domaine des procds de fabrication. Dans ce mme ordre dide, la notion de la gestion du risque au moyen dun profil a t introduite dans le domaine de validation des procdures analytiques. Le profil de risque peut fournir un moyen utile et efficace pour lacquisition des informations 108

Chapitre IV en vue de faciliter la comprhension des procds et datteindre des amliorations de la procdure analytique [242]. En effet, il permet de contrler le risque consommateur laide de critres adquats obtenus en validation (erreur systmatique et erreur alatoire) [233]. Lorsque plusieurs dterminations sont envisages en analyse de routine, le risque exprime la proportion des mesures qui sont susceptibles dtre en dehors des limites dacceptation si toutes les conditions demeurent quivalentes, par exemple aucun changement napparat dans la procdure analytique. Dans ce travail, nous avons investigu le profil de risque chaque niveau de concentration utilis en validation et calcul selon Mee [55]. Puisqu ltape de validation nous avons slectionn le modle de rgression passant par zro et utilisant 12 g/mL et que le modle de rgression linaire pondre tait aussi trouv adquat, nous avons considr ces deux modles pour tablir les profils de risque (figure IV.13).

Risque des mesures en dehors des limites d'acceptation (%)

0 0 3 6 9 12 15 18 21 24 Concentration introduite (g/mL)

Figure IV.13. Graphe des profils de risque considrant le modle de rgression linaire pondre (ligne en pointill) et le modle de rgression ajust avec 12 g/mL comme niveau de concentration (ligne continue), avec un niveau de risque fix priori 5 %.

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Chapitre IV Comme le montre la figure IV.12, le risque davoir des mesures futures en dehors des limites dacceptation de 10 % est pratiquement nul aux niveaux de concentration suprieurs 12 g/mL alors que ce risque augmente et culmine 6 g/mL (risque valant 4,1 %) et 3 g/mL (risque valant 2,3 %) en considrant respectivement le modle de rgression linaire pondr et celui ajust avec 12 g/mL comme niveau de concentration. Dans tous les cas, les risques ne dpassent par 5 % et sont mme plus faibles en considrant ce dernier modle de rgression, confortant ainsi la justification de sa slection pour la calibration en vue du dosage de limpuret R-timolol. De ce fait, en analysant les chantillons de malate de S-timolol aux concentrations quivalant environ 3,0 g/mL (0,2 %), 97,5 fois sur 100 les mesures futures obtenues avec la mthode de CLHP chirale valide seront incluses dans les limites dacceptation de 10 %. Cette proportion crot pour des teneurs suprieures 0,4 % en impuret chirale. Par ailleurs, les critres dacceptation obtenus avec le modle de rgression passant par zro sont adquats tant donn quils assurent le risque consommateur en garantissant quune proportion leve ( = 97,5 %) des rsultats des mesures futures seront compris dans les limites dacceptation fixes pour les impurets ( = 10 %).

IV.2.3.5. DTERMINATION QUANTITATIVE DES IMPURETS Aprs avoir valid la mthode de CLHP optimise, nous lavons applique pour lusage requis qui est la dtermination de la teneur du R-timolol ainsi que des autres impurets dans le malate de S-timolol. Puisque nous disposions de plusieurs lots dchantillons de malate de S-timolol, nous en avons test la puret. La dtermination a t faite en comparant la rponse chromatographique (aire de pic) du R-timolol obtenue avec la solution examiner la rponse chromatographique de la solution de rfrence de R-timolol 1,0 %. Pour les autres impurets, la comparaison de leurs rponses chromatographiques a t faite avec la solution de rfrence de S-timolol 0,4 %. Le facteur de rponse na pas t considr. Les rsultats prsents dans le tableau IV.11 montre que les chantillons N8059, 8060, 11350 et A5798 sont les plus purs alors que les autres contiennent surtout le R-timolol. En aucun cas la teneur de cette impuret chirale ntait suprieure 0,5 %. Dautre part, aucune des autres impurets na t trouvs prsente des concentrations suprieures 0,1 %.

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Chapitre IV Table IV.11. Contenu de dix lots dchantillon de malate de S-timolol ; moyenne (%) et coefficient de variation (%) Echantillons de malate de S-timolol N 8059 N 8060 N 11350 N A5798 N 11351 N 11486 N A5799 N 11483 N 11484 N A5800 R-timolol (%) (RSD en %) * * * * 0,11 (2,1) 0,11 (4,7) 0,24 (3,7) 0,25 (0,6) 0,31 (3,4) 0,49 (1,2) Impurets dtermines Isotimolol DMTDZ Dimre de timolol -

Lgende : * = infrieur 0,1 % ; - = non dtect

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Chapitre IV

IV.2.4. CONCLUSION
Nous venons de prsenter les rsultats de ltude consacre la validation de la mthode de CLHP que nous avons prcdemment optimise. A cet effet, une nouvelle stratgie base sur le profil dexactitude a t applique avec succs pour dmontrer la capacit de la mthode quantifier le R-timolol dans le malate de S-timolol. En considrant les risques de 5 % et 10 % ainsi, plusieurs profils dexactitude ont t construits. A partir de ces profils, le modle de rgression le plus adquat a t slectionn : le modle de rgression linaire passant par zro et utilisant un seul standard de calibration (12 g/mL). Les diffrents critres de validation examins en appliquant ce modle de rgression slectionn ont t trouvs acceptables. Cependant, dautres modles de rgression ont t aussi tests. A lexception du modle de rgression linaire pondr, ces modles ntaient pas adquats. Le profil de risque a t investigu comme nouvel outil de gestion de risque dans le domaine de la validation des procdures analytiques en vue dvaluer la probabilit dobtenir des mesures futures en dehors des limites dacceptation. La mthode a t applique avec succs pour dterminer limpuret R-timolol ainsi que les autres impurets dans dix lots dchantillons de malate de S-timolol. Aucun lot na prsent des impurets des teneurs suprieures aux valeurs tolres par la monographie pour ces impurets.

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