DNA REPETITIVO Y NO REPETITIVO

Secuencias no codificantes

Existen dos tipos se secuencias genmicas:

- DNA no repetitivo: copias nicas en un genoma haploide. - DNA repetitivo: secuencias representadas con ms de una copia

Complejidad del genoma eucaritico -Varias secuencias nucleotidicas en fragmentos de DNA eucaritico estn presentes en concentraciones muy diferentes. -Primera indicacin de que el DNA eucaritico tiene una organizacin compleja.

DNAs REPETIDOS MODERADOS QUE CARECEN DE FUNCIONES CODIFICANTES

- Representan la mayor parte del DNA repetido moderado - Distribuidos de forma uniforme, no en tandem.
- SINEs (short interspersed elements) generalmente de < 500 pb de longitud, ej en humanos: Alu. -LINEs (long interspersed elements) generalmente > 1000 pb de lonitud ej. En humanos L1. -Ambos tipos de repetidos varan entre especies. - Funcin desconocida.

MARCADORES MOLECULARES

Aloenzimas RFLP Restriction fragment RAPD-PCR AFLP Amplified fragment VNTR (minisatelites). STR (microsatelites). SNP Single nucleotide polymorphism

Aloenzimas Protenas no desnaturalizadas que poseen cargas netas diferentes y migran de forma diferencial en un gel cundo se aplica corriente elctrica.

La carga en las protenas se confiere por la presencia de los aminoacidos : Acido aspartico Arginina Acido glutamico Histidina Lisina

La carga neta de la protena determina el movimiento relativo de la protena, sin embargo el tamao y la estructura tridimensional tambin influyen en la migracin. La actividad bioqumica se detecta sumergiendo el gel en un amortiguador que contenga un colorante y cofactores que permitan detectar la actividad enzimtica como bandas discretas. El patrn de bandeo fenotipico (zimograma) se interpreta como el genotipo.

Ventajas: Rpido, seguro y barato. Desventajas: Limitado a la deteccin de polimorfismo de enzimas solubles en agua.

RANDOM APLIFIED POLYMORPHIC DNA (RAPD) Los RAPDs utilizan un solo oligo (decamero) con secuencia arbitraria para amplificar regiones del genoma por PCR. El alineamiento del oligo ocurre en todo el genoma y en todas las clases de DNA desde genes de una sola copia, mltiples copias, regiones codificantes y no codificantes

Cada banda en el gel se asume que representa un locus dialelico. Esta definicin significa que los marcadores RAPDs son dominantes, por lo tanto en presencia de banda se tiene al homocigtico (presenciapresencia) dominante y al heterocigtico y (presencia-ausencia).

La ausencia significa un homocigtico recesivo

1
4

Ventajas: Tcnica barata y simple que no requiere secuenciacin, se necesitan pocas cantidades de tejido. Desventajas: Reproducibilidad, dominancia de los marcadores, competencia de primers, variacin alelica.

Las secuencias repetitivas se pueden dividir en:

- Moderadamente repetitivas: secuencias cortas de 10-1000 X. - Altamente repetitivas: secuencias cortas < 100 pb presentes en miles de copias en el genoma y organizadas en tandem.

Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLPs) El RFLP estima la variacin que afecta la posicin relativa de un sitio de restriccin

Marcador molecular utilizado para mapeo gentico de loci cromosomales y diagnostico de enfermedades genticas humanas Esta tcnica se basa en la capacidad de las enzimas de restriccin de cortar al DNA en secuencias especificas que existen al azar en los genomas. Generalmente, los sitios blanco se localizan en la misma posicin en diferentes individuos dentro de una poblacin (DNA en cromosomas homlogos). Frecuentemente, un sitio especifico falta por causa de una mutacin silenciosa. La mutacin puede localizarse en un gen o en una regin intergnica.

Si un individuo es heterocigoto para la presencia (+) y ausencia (+/ -) de un sitio de restriction, el locus puede ser usado para mapeo. Los sitios (+ / -) son detectados por anlisis de Southern blot usando como sonda un producto derivado de esa regin.
El anlisis de Southern blot de un individuo puede detectar tres fragmentos de 3, 2, y 1kb

Homologo 1 Homologo 2
Zona de hibridacin de la sonda

3 kb
2 kb 1 kb

3kb 2kb 1kb

Otro individuo puede ser homocigtico para el fragmento grande y entonces solo muestra una banda de 3 kb en un Southern blot. El anlisis de Southern blot de un individuo puede detectar un solo fragmento de 3 kb

Homologo 1
Homologo 2
Extent of probe

3 kb 3 kb

3kb

Mltiples formas de esta regin constituyen un RFLP

Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) Analysis

Suspect

Evidence

DNA Fingerprintingused in modern forensics

Victim

Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP) Estos loci se generan usando un procedimiento que combina la digestin con enzimas de restriccin y la amplificacin por PCR. Genera una gran cantidad de loci que sirven para mapeo

Los fragmentos se generan por doble digestin con una enzima de corte frecuente y una de corte raro. Los extremos de los fragmentos se modifican por la adicin de adaptadores de doble cadena que proporcionan el sitio de anclaje para oligos para la subsecuente PCR. Los fragmentos generados se separan en un gel de poliacrilamida. Se cuantifican como marcadores dialelicos

Transposones en genomas: frecuencia y distribucin

De manera general, los transposones eucariotas se agrupan en dos clases:

en

Clase I, cuando el elemento se transpone a travs de una copia de RNA, y Clase II, cuando el elemento se transpone de manera directa.

Clase I: Retrotransposones
Tambin llamados elementos de RNA porque el elemento del DNA en el genoma se transcribe generando RNA que luego la transcriptasa inversa copia a DNA. Este DNA se reinserta en el genoma anfitrin en una nueva localizacin (sitio diana).
El nmero de copias de estos elementos en el genoma del anfitrin puede ser enorme.

Muchos presentan largas repeticiones terminales (LTRs: LongTerminal Repeats) de hasta 1000 pares de bases cada una. Suponen el 40% del genoma humano. Existen dos grandes grupos de retrotransposones en humano: Retrotransposones de poli-A Las secuencias LINE (Long Interpersed Nuclear Elements) y Las SINE (Short Interpersed Nuclear Elements).

La mayora de los retrotransposones presentes en el genoma humano son de tipo LINE,que incluyen en su secuencia un gen que codifica transcriptasa inversa.

una

Presentan una gran diversidad en su secuencia que permite utilizarlas como fingerprint (huella dactilar) de especie. Los elementos LINE pueden jugar un importante papel en la regulacin de la transcripcin de numerosos genes. En los seres humanos los LINE de longitud completa tienen aproximadamente 6kb de largo.
L1 es uno de los LINE mejor conocidos en los seres humanos. Adems de promover su propia movilidad, los LINE tambin aportan las protenas necesarias para la transcripcin inversa y la integracin de otra clase relacionada de secuencias repetidas

Retrotransposones semejantes a virus

Portan secuencias terminales invertidas que son los sitios de unin y accin de la recombinasa. Las repeticiones invertidas terminales estn incluidas dentro de las secuencias repetidas ms largas (LTRs). Estos codifican dos protenas necesarias para su movilidad: la integrasa (la transposasa) y la transcriptasa inversa.

Elementos transponibles en el genoma humano

Casi la mitad del genoma humano esta formado de elementos transponibles. La mayoria de stos son de dos tipos de retrotransposones llamados LINEs y SINEs, tambien lllamados retrotransposones de poli-A
No tiene las repeticiones invertidas terminales Los dos extremos tienen secuencias distintas, un extremo se llama UTR 5 (regin no traducida) mientras que el otro tiene una regin denominada UTR 3 seguida por un segmento de pares de bases A-T que reciben el nombre de secuencias de poli-A Portan dos genes conocidos como ORF1(codifica a una protena de unin al RNA) y ORF2 (codifica a una protena con actividad de transcriptasa inversa y de endonucleasa). Suelen hallarse en las formas autnoma (LINEs) y no autnoma (SINEs).

ORGANIZACIN GENTICA DE UN LINE

En su extremo 3 los LINEs poseen regiones de secuencias ricas en A. Al igual que otros elementos transponibles los LINEs se encuentran flanqueados por pequeas repeticiones directas del punto diana del DNA, indicando que la integracin implica cortes escalonados y reparacin por sntesis.

ORGANIZACIN GENTICA DE UN SINE Las secuencias SINE (elementos nucleares intercalados cortos) son otro tipo de retrotransposones de poli-A no autnomos de secuencia ms corta (de unas 100 a 400 pares de bases). Los elementos SINE son transcritos por la RNA polimerasa III y en el genoma humano representan el 11% del genoma. Son derivados de genes estructurales del RNA. La mayora contienen una secuencia rica en A/T en su extremo 3. Los SINEs tienen las caractersticas estructurales de LINEs pero no codifican su propia transcriptasa inversa. Probablemente, son movilizadas por las enzimas codificadas por LINEs que residen en el genoma.

Clase II: Transposones DNA Son fragmentos de DNA que se mueven de un lugar a otro del genoma mediante un mecanismo de "cortar y pegar. stos, a diferencia de los elementos de clase I, pueden desprenderse del sitio donador, lo que significa que, si su insersin en un gen ha creado una mutacin, su excisin puede conducir a la reversin de la mutacin original. Una enzima especfica, generalmente codificada por el transposn y llamada trasposasa, acta en una secuencia especfica del DNA

en cada extremo del transposn, primero lo desconecta del DNA que flanquea y en seguida lo inserta en un sitio nuevo del DNA blanco.

Secuencias Alu
El nmero de copias de estos transposones en un genoma puede ser enorme. Un ejemplo en el genoma humano es el elemento Alu, del que existen casi un milln de copias. Los elementos Alu son retrotransposones no autnomos que suelen situarse cerca de LINEs porque dependen de las enzimas de estos ltimos para llevar a cabo la movilizacin. Este proceso es similar a una transcripcin inversa.

A diferencia de los otros transposones, los Alu tienden a insertarse en la proximidad de los genes. Y tienen la curiosa propiedad de activarse en respuesta a ciertas seales muy comunes en las clulas, incluidas algunas hormonas, y de extender su activacin a los genes adyacentes. han propuesto que los Alu pueden ser una fuente esencial de variabilidad evolutiva.

Estas secuencias de Alu corresponde a ms del 10 % del genoma humano.

Son secuencias ricas en segmentos de poli-A en sus extremos 3 y estn flanqueadas por duplicaciones cortas de las secuencias diana del DNA.

Muy pocas Alu tienen la capacidad de transponerse. Las que lo hacen renen las siguientes condiciones:
Presencia del promotor Transcriptasa inversa Secuencias flanqueadoras Estructura secundaria Estado de metilacin y Longitud de la cola poli-A determinadas

Se llaman Alu porque tienen una diana para la endonucleasa de restriccin Alu1.
Son las secuencias mviles ms abundantes del genoma humano. Derivan probablemente del gen 7SL ARN, que forma parte del complejo ribosomal. Inserciones con esta secuencia han sido vinculados con varias enfermedades heredables en humanos, incluyendo varias formas de cncer.

Algunas patologas asociadas a inserciones Alu Ataques cardacos: La protena activadora del plasmingeno tisular (TPA) disuelve los cogulos sanguneos, siendo una primera lnea de defensa contra la formacin de los mismos. La insercin Alu en el intrn del gen activador del plasmingeno tisular en el cromosoma 8 incrementa el riesgo de ataque cardiaco: En individuos heterocigotos se duplica el riesgo de ataque cardaco. En individuos homocigotos se cuadruplica el riesgo de sufrir un infarto.

Hemofilia A y B: La hemofilia A se debe a la deficiencia del factor VIII (cromosoma X) y la hemofilia B est asociada a la deficiencia del factor IX de coagulacin (cromosoma X). Esta enfermedad afecta a los hombres, siendo las mujeres portadoras. La insercin de un elemento Alu en el intrn 18 del gen del factor VIII, origina un entrecruzamiento inapropiado, saltndose el exn 19. Se traduce en una forma grave de la hemofilia A. La hemofilia B es originada en algunos casos por una insercin Alu que provoca una delecin en parte de la protena codificada por el factor IX.

Cncer de mama: La heredabilidad del cncer de mama es atribuible a mutaciones en genes supresores de tumores. Una de las mutaciones en la lnea germinal del gen BRCA2 (relacionado con la patologa) situado en el cromosoma 13 se debe a la insercin de un elemento Alu en el exn 22, que se traduce en la omisin de dicho exn.

Neurofibromatosis tipo 1: La neurofibromatosis tipo 1 es el ms comn de los sndromes neurocutneos. Es un trastorno gentico del sistema nervioso que provoca el crecimiento de tumores no cancergenos a lo largo de los nervios debido a un gen anormal del cromosoma 17.
En el gen de la neurofibromatosis tipo 1 (NF1), una secuencia Alu se inserta en el intrn 5. Esto evita un entrecruzamiento apropiado por lo que el exn 6 queda fuera del mRNA maduro, originando un cambio en la pauta de lectura y un codn stop prematuro.

Hipercolesterolemia familiar: Esta enfermedad se caracteriza por la elevacin del colesterol plasmtico transportado por LDL (Light density lipoprotein), principal protena de transporte de colesterol en el plasma. Mutaciones en el gen estructural del cromosoma 19 que codifica para el receptor de LDL. Una recombinacin incorrecta debida al alineamiento desigual y recombinacin entre secuencias Alu repetidas causa una delecin en la parte del gen que codifica para el dominio del enlace de LDL.

Importancia de los transposones Los transposones pueden promover rearreglos del genoma. Se cree que podran ser la mayor fuente de mutaciones en el genoma, tanto de manera directa como indirecta:

Desde el punto de vista de la Seleccin Natural, se podra considerar que los transposones, que no confieren ventajas o desventajas en el fenotipo, constituyen un tipo de "DNA egosta" interesado slo en su propia propagacin, aunque tambin podran verse como entidades independientes que residen en el genoma.

Utilidad de los transposones

mapeo gentico creacin de mutantes clonacin de genes produccin de organismos transgnicos terapia gnica

DNA MODERADAMENTE REPETIDO (codificante)

- Representa del 20 al 80% del DNA total dependiendo del organismo. - Los repetidos se pueden encontrar alguna veces a decenas de miles de veces: puede haber diferentes familias y algunos codifican para RNAs o protenas. - tRNAs, rRNAs, mRNAs de histonas. --- Tpicamente idnticos uno de otro. --- Localizados en arreglo de tandem. --- Los RNAs y las histonas se necesitan en grandes cantidades.

DNA ALTAMENTE REPETITIVO -Presente en al menos 105 copias por genoma. - Alrededor del 10 % del DNA total de un vertebrado. - Esta fraccin realinea muy rpido. -Generalmente cortos (algunos cientos de pb).

-Generalmente arreglados en tandem.

SATELITES, MICROSATELITES Y MINISATELITES

DNAs Satlites -De 5 a 100 pb de longitud. - Repetidos un gran nmero de veces en tandem. - Forman clusters muy grandes de hasta varios millones de pb. - Usualmente estn compuestos por una sola base. - Concentrados en la heterocromatina (centromeros).

DNAs Minisatlites (VNTRs)

-Se expanden de 500 a 30 kb de longitud. - Consisten de un repetido de 6-100 pb.

- Las regiones son ms cortas que las satlites.

- La longitud del locus es altamente variable en la poblacin incluso entre familiares. - Muy polimorfico: se emplea para huellas digitales.

- Distribuidos en todo el genoma, pero son predominantes en regiones subtelomericas.

VNTR
D
VNTRs :
Variation in the Number of Tandem Repeats or Mini-satellite Molecular Markers

d
La sonda se une a secuencias repetitivas

Los sitios de restriccin blanco estn fuera del arreglo repetitivo. La unidad bsica del arreglo esta indicada por las flechas.

EL numero de unidades repetidas en un arreglo de tandem es variable. Los individuos heterocigotos para diferentes nmeros de repetidos en tandem se pueden detectar, y el sitio (s) heterocigoto usado como un marcador (s) para mapeo. Este locus VNTR formara dos bandas en un Southern blot: una larga y una corta. Similar a un locus RFLP, este sitio es heterocigoto y puede ser usado para mapeo gentico. Actualmente los analisis para VNTRs se pueden hacer por PCR.

Genetic profiling using Mini-Satellite VNTRs

VNTRs amplificados por PCR y que se localizan sobre el brazo corto del cromosoma. Los productos de PCR se marcaron con azul o verde fluorescente y se resolvieron en un gel de poliacrilamida. Cada lnea exhibe el perfil gentico de un individuo diferente. No existen dos individuos con el mismo perfil gentico, ya que cada persona tiene un grupo diferente de variantes de mini-satlites variantes, el cual da lugar a bandas de Diferentes tamaos despus del PCR. Las bandas rojas son los marcadores de DNA.

 El estudio de la variabilidad gentica como medio de identificacin humana (Human ID) se inici con los estudios de grupos sanguneos de Hirschfield en 1919 En 1985 Alec Jeffreys describia el mtodo denominado como huella gentica (DNA fingerprint).

Para 1987 esta tcnica incursiona en el campo Forense y es admitida en Inglaterra como prueba de Paternidad (Gill y Werret, 1987).
Un ao despus es aceptada en los procesos penales tanto den los Estados Unidos de Norte Amrica como en Inglaterra.

 Para 1991 se registra la primera publicacin del empleo de repetidos de marcadores satelitales STR (Short Tandem Repeats) y marca el inicio de la poca moderna del empleo de tcnicas de Biologa Molecular y Gentica Humana para la identificacin humana, tanto para el campo forense como en estudios criminalsticos y procesos penales. La gentica Forense, en la actualidad es la rama biomdica que ha presentado el mayor desarrollo cientfico y tecnolgico. Su solidez cientfica basada en el anlisis del ADN (Acido Desoxi Ribonuclico) la convertido en una herrameinta de adopcin y aceptacin internacional, favoreciendo el intercambio de informacin pericial para la resolucin de asuntos de orden judicial y/o criminal

El Perfil Gentico de 13 marcadores para determinacin de la Identificacin Humana

TPOX
D3S1358 TH01 VWA

D5S818 D2S1338

D8S1179 D7S820

FGA
CSF1PO

AMEL

Tipificacin

D13S317

Penta E
D16S539

D19S433 D18S51 D21S11 Penta D AMEL

sexual

El locus para la amelogenina que codifica para el componente principal del esmalte dental (presente en X e Y) se ha incorporado a los marcadores STR (no es un STR).

Cromosoma X

106 pb
Eliminacin 6 pb

112 pb

Cromosoma Y

Informacin aportada por los 13 marcadores STRs

Locus CSF1PO FGA TH01 TPOX VWA D3S1358 D5S818 D7S820 Localizacin Cromosmica 5q33.3-34 4q28 11p15.5 2p23-pter 12p12-pter 3p 5q21-31 7q11.21-22 Repetido TAGA CTTT TCAT GAAT [TCTG][TCTA] [TCTG][TCTA] AGAT Accseso GenBank X14720 M64982 D00269 M68651 M25858 NT_005997 G08446 G08616 G08710 G09017 G07925 L18333 AP000433 Alelo en GenBank 12 21 9 11 18 18 11 12 Rango del Alelo 6-16 15-51.2 3-14 6-13 10-24 9-20 7-16 6-15 Nmero de Alelos * detectados 15 69 20 10 28 20 10 22

GATA
[TCTA][TCTG] TATC GATA AGAA Complex [TCTA][TCTG]

D8S1179
D13S317 D16S539 D18S51 D21S11

8
13q22-31 16q24-qter 18q21.3 21q21

12
13 11 13 29

8-19
5-15 5-15 7-27 24-38

13
14 10 43 70

Descripcin del proceso de obtencin de Huella Gnica

Biologa
DNA Extraccin
DNA Cuantificacin Amplificacin por PCR de Mltiples marcadores STR

Tecnologa
Separacin y Deteccin de los Productos de PCR (STR Alelos) Determinacin del Genotipo

Gentica
Comparacin del genotipo contra otras muestras Reporte en base a clculo de Probabilidades

Si hay coincidencia comparar contra la base de datos de secuencias

Descripcin del proceso de obtencin de Huella Gnica

Colecin
Almacenaje Sangre Raspado Bucal

Slot Blot 1 ng 0.3 ng No DNA 0.5 ng 0.5 ng 0.7 ng 1 ng

Cuantificacin
Multiplex PCR

Biologa

Extraccin

Recoleccion de Muestra

DNA DNA extraccin cuantificacin

1 ng

PCR Multiplex
DNA separation and sizing

STR Typing

Base de Datos
Clculo de Probabilidades

Bsqueda en bases de datos

Tecnologa

Interpretacin de resultados

STR Typing

Ejemplo de STR

D8S1179

D21S11
D7S820 CSF1PO

D3S1358

TH01

D13S317

D16S539

D2S1338

D19S433

VWA

TPOX
D18S51

AMEL

D5S818

FGA

16 STR loci 0.5 ng de DNA

Identifiler STR Kit from Applied Biosystems

12

14

Nio

10

14

Mam

10

Pap

12

Periodiquero

SNP

Un polimorfismo de un solo nucletido o SNP (Single Nucleotide Polymorphism) es una variacin en la secuencia de DNA. Los SNP se presentan cuando existen errores ( mutaciones) en clulas durante la replicacin en la meiosis. Algunas regiones del genoma son ms ricas en SNP que otras . Por ejemplo el cromosoma 1 contiene un SNP en promedio cada 1.45 kb, comparado con el con el cromosoma 19 que un SNP cada 2.18 kb. El SNP normalmente tiene solo dos alelos y por lo tanto no son muy polimorficos.