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Departamento de Fisiologa, Biologa Molecular y Celular Facultad de Ciencias Exactas y Naturales Universidad de Buenos Aires
Sumario
Tcnicas del cultivo de clulas y tejidos vegetales Micropropagacin vegetal Consideraciones tcnicas de la propagacin clonal masiva de plantas Etapas del cultivo in vitro de plantas superiores Vas morfogenticas: organognesis y embriognesis
Agrobiotecnologa
Cultivo de tejidos vegetales
Existen tres conceptos bsicos que fundamentan el cultivo in vitro de clulas y tejidos vegetales:
- Totipotencialidad celular
- Desdiferenciacin / Rediferenciacin
Agrobiotecnologa
Cultivo de tejidos vegetales
La teora de la totipotencialidad celular, enunciada por Haberlandt a principios del siglo XX, postula que toda clula vegetal individual es capaz de regenerar una planta entera a partir de un cultivo in vitro, sin importar el grado de diferenciacin alcanzado. Para ello se requieren condiciones especficas referidas al medio del cultivo, relaciones hormonales, temperatura, fotoperodo, etc. La desdiferenciacin consiste en la transformacin y prdida de las caractersticas de especializacin de un tipo celular para dar lugar a clulas de tipo meristemtico. El siguiente paso involucrado en la regeneracin de una planta es la redifereciacin de las clulas previamente desdiferenciadas.
Agrobiotecnologa
Cultivo de tejidos vegetales
Todo proceso de diferenciacin est regulado por el balance entre diferentes tipos de reguladores del crecimiento, fundamentalmente de auxinas y citocininas.
Micropropagacin vegetal
Agrobiotecnologa
Cultivo de tejidos vegetales
Micropropagacin vegetal
Agrobiotecnologa
Cultivo de tejidos vegetales
La micropropagacin vegetal, o propagacin clonal masiva de plantas superiores, posibilita la obtencin y cultivo de plantas a gran escala.
Se realiza bajo estrictas condiciones de esterilidad en un medio sinttico nutritivo y con control de temperatura, luz y fotoperodo.
Agrobiotecnologa
Cultivo de tejidos vegetales
Propagacin vegetativa rpida y a gran escala Uniformidad seleccionada del material clonado Multiplicacin de plantas recalcitrantes a las tcnicas convencionales Reduccin en el tiempo de multiplicacin y en el espacio requerido para tal fin
Agrobiotecnologa
Cultivo de tejidos vegetales
Laboratorio
- Area de preparacin de medios - Area de lavado y esterilizacin - Cuarto estril - Cmara de cultivo - Area de rusticacin
Material vegetal
- Plantas madres seleccionadas (preacondicionamiento) - Explantos (eleccin, diseccin, esterilizacin, etc.)
Condiciones de cultivo
Agrobiotecnologa
Cultivo de tejidos vegetales
Compuestos inorgnicos Macronutrientes: NO4- , PO43- , K+, Ca2+, Mg2+, SO42Micronutrientes: Fe2+, Cu2+, Zn2+, Mn2+, Mo2+, Co2+, ICarbohidratos Sacarosa, glucosa, mio-inositol Vitaminas Tiamina (B1) Piridoxina Acido nicotnico (C) Biotina Aminocidos Glicina
Agrobiotecnologa
Cultivo de tejidos vegetales
Lquido
El metabolismo de los tejidos puede modificarse dependiendo de las caractersticas del medio de cultivo (lquido o semi-slido). En el caso de un medio slido, la concentracin y calidad del gar pueden tener importantes efectos en el desarrollo del cultivo (hiperhidricidad, crecimiento lento, etc.) El cultivo en medio lquido resulta imprescindible cuando la propagacin in vitro es desarrollada a travs de las siguientes vas: - Induccin de embriognesis - Cultivo de protoplastos - Cultivo de suspensiones celulares
Agrobiotecnologa
Cultivo de tejidos vegetales
Intercambio gaseoso:
Los recipientes de cultivo se tapan con un film de polietieleno (Resinite) para posibilitar el intercambio de gases. La organognesis puede verse modificada si el intercambio de gases se ve dificultado.
- La induccin de yemas a partir de callos de tabaco se reduce si no hay suficiente oxgeno - La acumulacin de etileno puede inhibir la regeneracin de brotes
pH:
- Constituye un factor crtico - Se ajusta en el rango 5,5-5,8 - Se modifica durante el crecimiento de los cultivos
Agrobiotecnologa
Cultivo de tejidos vegetales
Giberelina
Acido giberelico
GA3
364,4
10-7-5x10-6
Soluble en agua
Grupos bsicos de reguladores del crecimiento: - Auxinas - Citoquininas - Giberelinas - Acido abscsico - Etileno
Generalidades:
- Actan a bajas concentraciones - Interactan unos con otros (los resultados estn determinados por las concentraciones relativas entre las diferentes fitohormonas). - Los reguladores endgenos del crecimiento estn presentes en la planta durante todo su ciclo de vida pero su concentracin flucta. Su concentracin relativa vara en funcin del estado fisiolgico de la planta y en cada uno de los rganos de sta. - Estn involucrados en numerosos procesos fisiolgicos.
Agrobiotecnologa
Cultivo de tejidos vegetales
OH N
Las auxinas fueron descubiertas entre 1933 y 1935 a partir de bioensayos realizados para caracterizar el mensajero responsable de la elongacin y de la respuesta fototrpica del coleoptile de gramneas.
- Alargamiento y divisin celular - Crecimiento de secciones de hojas, tallos y frutos - Formacin de races adventcias - Dominancia apical - Accin herbicida - Estimulacin de la produccin de etileno
Se sintetizan en las yemas, hojas jvenes, frutos y en el embrin. La concentracin endgena en la planta vara entre 0,001 y 0,1 mg/Kg.
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Cultivo de tejidos vegetales
Su transporte es polar Auxinas sintticas: - Acido indol butrico (IBA) - Acido naftalen actico (ANA) - 2,4-diclorofenoxiactico (2,4-D)
Las citoquininas determinan diferentes respuestas morfogenticas en combinacin con las auxinas
Fueron descubiertas en 1955 estudiando sustancias promotoras de la divisin celular in vitro. Estn involucradas en variadas respuestas fisiolgicas: - Promocin de la divisin celular - Promocin de la organognesis (relacin auxinas/citoquininas) - Retardo de la senescencia - Sntesis de clorofila y desarrollo de cloroplastos Citoquininas endgenas:
Se sintetizan en el embrin y las races; se encuentran en todos los tejidos. La concentracin endgena en plantas vara entre 0,1 y 500 g/Kg. Su transporte es no polar.
Fueron aisladas del hongo Gibberella fujikuroi, a partir de plantas de arroz infectadas. Estas plantas presentaban marcada clorosis y largos entrenudos. Los primeros ensayos se llevaron a cabo usando extractos solubles del hongo. El cido giberlico (GA3) fue la primera giberelina identificada. En la actualidad se conocen alrededor de 50 giberelinas diferentes. Algunos efectos mediados por las giberelinas son:
- Promocin del crecimiento en plantas de genotipos enanos o plantas bianuales - Crecimiento de yemas latentes - Germinacin de semillas en dormicin - Floracin - Movilizacin de reservas en la semilla
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Cultivo de tejidos vegetales
Su transporte no es polar.
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Cultivo de tejidos vegetales
Desinfeccin superficial
Formacin de brotes o embrioides Transferencia a un medio para el enraizamiento de los brotes Pasaje a maceta en un invernculo
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Cultivo de tejidos vegetales
ETAPA 3
ETAPA 4
Los explantos deben ser esterilizados antes de ser establecidos en condiciones de cultivo
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Cultivo de tejidos vegetales
- En el caso del HgCl2, el material se debe enjuagar sucesivas veces pues es difcil de eliminar.
Agrobiotecnologa
Cultivo de tejidos vegetales
Existen dos posibles vas morfogenticas para la diferenciacin de novo de brotes o plantas completas
- Embriognesis
Diferencias entre las dos posibles vas:
- La organognesis es de origen pluricelular. Un grupo o cluster de clulas del explanto inicial se desdiferencia inicialmente para luego rediferenciarse dando lugar a un rgano vegetal. No se obtienen por esta va plantas completas.
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Cultivo de tejidos vegetales
- La embriognesis se presupone de origen unicelular. Una clula del explanto se asla y constituye el punto de partida para la obtencin de un embrin somtico. Se diferencian embriones o estructuras bipolares que completan cada una de las etapas implicadas en la ontogenia de un embrin cigtico. El resultado es una planta completa.
Embriognesis
av
cv
ar
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Cultivo de tejidos vegetales
Agrobiotecnologa
Cultivo de tejidos vegetales
Resulta posible regenerar brotes o yemas a partir de tejidos vegetales desdiferenciados in vitro
Consideraciones generales:
- Callo: masa de clulas desdiferenciadas obtenidas a partir de un explanto cultivado in vitro (disco de hoja, meristema, clulas en suspensin, etc.) - Es posible regenerar brotes o vstagos a partir de estos callos. - Las plantas diferenciadas pueden no ser uniformes, debido al posible desarrollo de variantes somaclonales. Esto debe tenerse en cuenta, especialmente cuando se trabaja en propagacin clonal a gran escala.
Agrobiotecnologa
Cultivo de tejidos vegetales
Agrobiotecnologa
Cultivo de tejidos vegetales
Agrobiotecnologa
Cultivo de tejidos vegetales
El empleo de meristemas como explantos es una posible herramienta para el saneamiento de plantas infectadas
Cultivo de meristemas
Meristema apical
Meristema axilar
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Cultivo de tejidos vegetales
Domo meristemtico
Los meristemas son grupos de clulas indiferenciadas que retienen la capacidad de dividirse durante todo el ciclo de vida de una planta
Los meristemas determinan el crecimiento de la planta y dan origen a sus diferentes rganos
Constituyen el explanto ideal para liberar de patgenos in vitro a plantas infectadas por virus, hongos o bacterias. Son ampliamente utilizados como explantos para la criopreservacin y conservacin de germoplasma.
Agrobiotecnologa
Aplicaciones del cultivo de tejidos
La transformacin gentica vegetal implica la regeneracin de plantas completas a partir de las clulas transformadas
-Entre las tecnologas de transformacin gentica de plantas de uso ms difundido se incluyen la biobalstica y la transformacin mediada por vectores biolgicos (gro. Agrobacterium spp).
-Se transforman clulas, tejidos u rganos vegetales. - Una vez transferido e insertado el ADN forneo al genoma de la clula vegetal blanco de la transformacin resulta necesario regenerar una planta completa que resulte transformada de manera estable. -La regeneracin de una planta transgnica puede tener lugar por organognesis o embriognesis. -Debe priorizarse una via morfogentica directa de manera de evitar eventos quimricos y posibles variantes
La obtencin de plantas transgnicas involucra la aplicacin exitosa de diferentes tecnologas de cultivo in vitro
Se resumen la etapas implicadas en la obtencin de plantas transgnicas de soja que incluyen la infeccin e incubacin de explantos con A. tumefaciens (a y b), la regeneracin de brotes de novo (c), su enraizamiento y rusticacin as como la caracterizacin genotpica y fenotpica de las plantas obtenidas (d-f).
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Aplicaciones del cultivo de tejidos
e d f
Liberacin de patgenos
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Aplicaciones del cultivo de tejidos
- El domo meristemtico no est vascularizado (muchos patgenos se translocan por los tejidos de conduccin).
- El nmero de partculas virales es menor en los meristemas que en otros tejidos (White, 1934).
- La velocidad de divisin celular a nivel del meristema es mayor que la velocidad de replicacin de un virus.
- Las primeras plantas saneadas a partir del cultivo de meristemas fueron obtenidas por Morel y Martin entre 1952 y 1957 a partir de cultivos de papa y Dahlia.
Mediante esta tcnica es posible sanear plantas infectadas sistmicamente por diferentes tipos de patgenos como bacterias, hongos, virus y viroides.
Sntomas producidos por el Tomato mosaic virus.
Agrobiotecnologa
Aplicaciones del cultivo de tejidos
El material vegetal infectado por virus, bacterias, hongos y/o micoplasmas puede ser tratado con diferentes tcnicas: Termoterapia Quimioterapia Cultivo de meristemas
Agrobiotecnologa
Aplicaciones del cultivo de tejidos
Estos tratamientos pueden usarse por separado, pero incrementan su efectividad notablemente cuando se los combina, trabajando in vivo e in vitro.
Termoterapia
El tratamiento por calor es un mtodo eficaz para inactivar algunos virus y viroides. Se debe elegir una temperatura y tiempo de tratamiento tales que la planta sea capaz de sobrevivir, pero que permita la inactivacin del virus.
Ejemplo: El tratamiento de plantas madres de Solanum tuberosum a 8C durante 4 meses permiten obtener un 30% de platas libres de Potato spindle tuber viroid (PSTV).
Agrobiotecnologa
Aplicaciones del cultivo de tejidos
Quimioterapia
Esta tcnica implica el tratamiento de las plantas madres o explantos (in vivo o in vitro) con las siguientes sustancias: - Fungicidas en el caso de hongos - Insecticidas frente al ataque de insectos - Antibiticos en el caso de bacterias - Inhibidores metablicos (actinomicina D)
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Aplicaciones del cultivo de tejidos
Las plantas regeneradas in vitro deben ser evaluadas para comprobar si ha sido eliminado el patgeno considerado. Estas pruebas se denominan ensayos de indizacin (indexing) y difieren segn el sistema huesped-patgeno de que se trate. Se incluyen entre estas pruebas:
- Seleccin visual u observacin de sntomas - Empleo de hospedantes indicadores
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Aplicaciones del cultivo de tejidos
Observacin visual
Consiste en la observacin de sntomas. Se trata de un mtodo impreciso. Resulta confiable en el caso de enfermedades que inducen sntomas muy caractersticos o conspcuos.
Potato Virus X
Sntomas de pie negro y podredumbre blanda causados por Erwinia carotovora en papa.
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Aplicaciones del cultivo de tejidos
Pie negro
Tuberculo no inoculado
Sntomas en estolones
Sntomas en frutos
Agrobiotecnologa
Aplicaciones del cultivo de tejidos
Agrobiotecnologa
Aplicaciones del cultivo de tejidos
Micrografas de un nematode del gnero Trichodorus (tamao aproximado: 0,5 M de dimetro, 1 mm de largo).
Es una tcnica frecuentemente utilizada para detectar virus que pueden transmitirse mediante el jugo infeccioso extrado de plantas enfermas. Se usan como indicadoras variedades muy susceptibles de la especie estudiada u otras especies que desarrollan sntomas caractersticos en un corto tiempo. Los sntomas inducidos en la planta indicadora revelan la presencia del patgeno y permiten identificarlo.
Agrobiotecnologa
Aplicaciones del cultivo de tejidos
Mtodos serolgicos
Se basan en la alta especificidad de la reaccin antgeno-anticuerpo, por la cual un anticuerpo reconoce y se combina slo con la porcin de antgeno que le dio origen.
- Pruebas inmunoenzimticas
(DAS-ELISA) - Floculacin de ltex sensibilizado (partculas de ltex recubiertas por anticuerpos especficos, se observa agregacin de partculas con formacin de precipitado) - Microprecipitacin (gotas de antisuero y antgeno, se observa formacin de precipitado)
Agrobiotecnologa
Aplicaciones del cultivo de tejidos
Microscopa electrnica
Observacin de partculas virales en extractos vegetales (dip method) Inmunoelectromicroscopa Cortes ultrafinos de tejidos vegetales (observacin directa del patgeno o de anomalas citolgicas o efectos histopatolgicos como secuela de la presencia del patgeno)
Inclusiones virales detectadas con el microscopio ptico
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Aplicaciones del cultivo de tejidos Inclusin cristalina del virus del mosaico de tabaco (I) en clulas epidrmicas de Nicotiana tabacum Clula de tricoma de Vicia faba con inclusin amorfa (I)
Conservacin de germoplasma
Agrobiotecnologa
Aplicaciones del cultivo de tejidos
Conservacin de germoplasma
Las tcnicas de cultivo in vitro de tejidos vegetales costituyen parte esencial de una estrategia general para la conservacin e intercambio de recursos fitogenticos.
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Aplicaciones del cultivo de tejidos
Gentillieza W. Roca
Agrobiotecnologa
Aplicaciones del cultivo de tejidos
www.cgiar.org
La conservacin de germoplasma mediante el cultivo de tejidos se basa en la limitacin del crecimiento del material vegetal.
Implementacin:
- Medios de cultivo de composicin subptima - Baja intensidad lumnica (<500 lux) - Temperaturas inferiores a las adecuadas para el activo metabolismo de las clulas y tejidos vegetales bajo cultivo (15-20 C)
Agrobiotecnologa
Aplicaciones del cultivo de tejidos
Los bancos de semilla permiten la conservacin de especies vegetales que se propagan sexualmente
Resultan de utilidad en el caso plantas cuyas semillas se mantienen viables durante un largo perodo de almacenamiento.
El material debe mantenerse bajo condiciones controladas en una cmara de mantenimiento:
- Bajas temperaturas - Bajo contenido de humedad
Este mtodo no puede aplicarse a la conservacin de plantas cuyas semillas presentan longevidad reducida, especies autoincompatibles o especies de propagacin vegetativa obligada
Agrobiotecnologa
Aplicaciones del cultivo de tejidos
Crioconservacin de germoplasma
Consiste en el mantenimiento de material vegetal a temperaturas ultrabajas (-196 C), por inmersin en nitrgeno lquido Diferentes explantos (pices de yemas, meristemas, anteras, embriones inmaduros) as como callos y suspensiones celulares pueden ser crioconservados a -196 C.
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Aplicaciones del cultivo de tejidos
www.science.siu.edu
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Aplicaciones del cultivo de tejidos
Recultivo
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Aplicaciones del cultivo de tejidos
Mejoramiento vegetal. Estudios de gentica cuantitativa. Estudios de diferenciacin celular y alternancia de generaciones.
Agrobiotecnologa
Aplicaciones del cultivo de tejidos
Ttradas de microsporas
Sacos polnicos (con granos de polen)
Consiste en el cultivo de anteras inmaduras en medios sintticos que promueven la divisin celular y la formacin de embriones o callos. Los embriones, transferidos a un medio de regeneracin, darn lugar a plantas haploides.
anteras
Agrobiotecnologa
Aplicaciones del cultivo de tejidos
- Genotipo de las plantas donantes - Fisiologa de las plantas donantes - Caracterizacin citolgica y bioqumica de etapas muy tempranas del desarrollo de los granos de polen - Pretratamiento de las anteras con altas o bajas temperaturas o con choque osmtico - Medios de cultivo con alto contenido en osmticos para la induccin de callos y menores concentraciones de sacarosa para la regeneracin de plantas
Agrobiotecnologa
Aplicaciones del cultivo de tejidos
El cultivo de anteras ofrece numerosas ventajas para el mejoramiento de plantas de inters comercial
Agrobiotecnologa
Aplicaciones del cultivo de tejidos
- Las microsporas o clulas haploides pueden usarse para la induccin de mutantes y para la seleccin de caracteres esporofticos.
Rescate de embriones (mediante polinizacin y fertilizacin in vitro) Induccin de la embriognesis somtica a partir de nucelos de diferentes especies vegetales.
es
Agrobiotecnologa
Aplicaciones del cultivo de tejidos
Estudio de requerimientos nutricionales de embriones en desarrollo. Rescate de embriones hbridos derivados de cruzamientos interespecficos e intergenricos. Producin de monoploides. Superacin de la latencia de las semillas.
Embrin cigtico
Agrobiotecnologa
Aplicaciones del cultivo de tejidos
Semillas sintticas
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Aplicaciones del cultivo de tejidos
Semillas sintticas
Embriones somticos de Pinus sp
Agrobiotecnologa
Aplicaciones del cultivo de tejidos
Las semillas artificiales poseen una cubierta de proteccin, contienen sustancias de reserva y portan un embrin en su interior.
Agrobiotecnologa
Aplicaciones del cultivo de tejidos
Agrobiotecnologa
Aplicaciones del cultivo de tejidos
Cultivo de protoplastos
Agrobiotecnologa
Aplicaciones del cultivo de tejidos
Agrobiotecnologa
Aplicaciones del cultivo de tejidos
Esquema general de la manipulacin gentica de protoplastos in vitro para la realizacin de tcnicas de mutagnesis, fusin o transformacin.
Agrobiotecnologa
Aplicaciones del cultivo de tejidos
Mtodo mecnico
- Bajo rendimiento - Procedimiento tedioso - Aplicabilidad limitada Choque osmtico para producir plasmlisis celular y ruptura de la pared. Los protoplastos se liberan de las clulas rotas mediante el restablecimiento de su nivel osmtico.
Mtodo enzimtico
Consiste en la incubacin de las clulas en una mezcla de enzimas que degradan la pared celular: celulasas, hemicelulasas y pectinasas. Las preparaciones comerciales de dichas enzimas contienen adems proteasas, nucleasas y lipasas.
Variacin somaclonal
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Aplicaciones del cultivo de tejidos
La variacin somaclonal puede explicar la variacin fenotpica de las plantas regeneradas in vitro
Entre otras causas: Modificaciones genticas heredables por las progenies de las plantas obtenidas mediante cultivo in vitro Prevalencia del cariotipo especfico de plantas y tejidos quimricos o mosaicos Cambios en el cariotipo, debidos a una respuesta diferencial a los procedimientos de cultivo (composicin del medio, etc.)
Agrobiotecnologa
Aplicaciones del cultivo de tejidos
Potencial para el mejoramiento vegetal cuando se trata de verdaderas modificaciones del material gentico (variabilidad)
Agrobiotecnologa
Aplicaciones del cultivo de tejidos
Referencias
1.
Altman, A. and Loberant, B. Micropropagation: clonal plant propagation in vitro. En: Agricultural Biotechnology. Arie Altman Ed. Chapter 2: 19 40 Marcel Dekker, New York, U.S.A., 1998. Cassells, A. S. In vitro production of pathogen-free plants. En: Agricultural Biotechnology. Arie Altman Ed. Chapter 4: 57 82. Marcel Dekker, New York, U.S.A., 1998. Doods, J. H. and Roberts, L. W. Experiments in Plant Tissue Culture. Cambridge University Press. Cambridge, U.S.A. 1992. Herrera Estrella, A. and Chet, I. Biocontrol of bacteria and phytopathogenic fungi. En: Agricultural Biotechnology. Arie Altman Ed. Chapter 11: 263 282. Marcel Dekker, New York, U.S.A., 1998. Litz, R. E. Cultivo de embriones y vulos. En: Cultivo de tejidos en la agricultura. Fundamentos y aplicaciones. CIAT. Centro Internacional de Agricultura Tropical. Cali, Colombia. Cap. 12: 295 312, 1991. Roca, W. M., Nez, V. M. & Mornan, K. Cultivo de anteras y mejoramiento de plantas. En: Cultivo de tejidos en la agricultura. Fundamentos y aplicaciones. CIAT. Centro Internacional de Agricultura Tropical. Cali, Colombia. Cap. 11: 271 294, 1991. Sasson, A. Biotechnology and Natural Products. Prospects for Commercial Productio, ACTS, African Centre for Technology Studies. Nairobi, Kenya. 1992. Roca, W. M., Nez, V. M. & Mornan, K. Cultivo de anteras y mejoramiento de plantas. En: Cultivo de tejidos en la agricultura. Fundamentos y aplicaciones. CIAT. Centro Internacional de Agricultura Tropical. Cali, Colombia. Cap. 11: 271 294, 1991. Scragg, A. H. Large scale plant tissue culture. En: Agricultural Biotechnology. Arie Altman Ed. Chapter 9: 225 249. Marcel Dekker, New York, U.S.A., 1998.
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