1.- Identificacin y Aislamiento de microorganismos nativos, precursores de la Tan Acil Hidrolasa (TAH).

En el Campo: Los frutos maduros de tara, recolectados por los agricultores de la zona, sern embalados en papel toalla, de primer uso, y colocados dentro de una bolsa plstica para su traslado al laboratorio. La recoleccin de los frutos en el campo debe realizarse con cuidado, evitando cualquier dao y el contacto con el suelo. En el laboratorio 1. Los frutos, trados del campo, son colocados en el interior de una cmara hmeda. 2. Los tperes de plstico son desinfectados con alcohol al 96%, se aade agua destilada estril hasta un nivel por debajo de las rejillas de metal que se colocan dentro de los tperes y en las cuales se colocan los frutos de tara. 3. Los tperes, cerrados y correctamente rotulados, son incubadora 25C aproximadamente. 4. Luego de 5 a 7 das de incubacin se revisan las muestras y se observa el crecimiento de micelio sobre la superficie de las vainas. 5. Mediante la ayuda de un asa de siembra estril, se coge una porcin de micelio y se siembra en Agar Czapeck mezclado con polvo de vainas de tara, como medio de cultivo. Todo se incuba a 25 C, en un periodo de 3 a 5 das. 6. Los aislamientos son identificados usando clave taxonmica de Barnet y los aislamientos seleccionados son conservados, a 4 C, en tubos conteniendo APD en pico de flauta. 2. Preparacin de la harina de vainas de tara Luego de recolectar los frutos de la tara, se proceder a su almacenamiento en bodegas expuestas al aire; pero evitando el contacto directo con el suelo y exposicin a las lluvias. Para impedir la formacin de mohos y la fermentacin, los agricultores colocan los frutos en un patio para su secado al sol. Luego, se realiza la ruptura de las vainas con el uso de un palo y se procede a separar las semillas y fibras grandes de forma manual. Las vainas semi trituradas son molidas manualmente con el fin de reducir el tamao, hasta obtener partculas de 1 mm de dimetro. Las partculas de vainas de tara son nuevamente molidas y tamizadas con la ayuda de un molino manual para granos y un tamiz de 106 um. 3. Seleccin de los hongos con mayor produccin de TANASA Los hongos que fueron aislados, se siembran en una mezcla lquida conteniendo Czapeck con harina de vainas de tara y se les somete a agitacin constante de 150rpm

durante 10 das. Al trmino de la incubacin, la biomasa de los hongos es retirada mediante proceso de filtracin, cuantificando el cido glico en el extracto final. Esto se realiza utilizando el mtodo Folin Ciolcateuy realizando la lectura en el espectrofotmetro UV- visible, calibrado a 750 nm, previa determinacin de la concentracin mediante la elaboracin de la curva de calibracin. Los hongos que favorecen la mayor produccin de cido glico, derivado de los taninos presentes en la harina de las vainas de tara sern utilizados en las etapas posteriores del trabajo.

4. Identificacin y Estandarizacin de los parmetros fsicos y qumicos, de obtencin de la enzima Tanasa a nivel de laboratorio. Alrededor de 10 das y agitacin constate a 150rpm, los microorganismos seleccionados son cultivados en medio lquido, conteniendo Czapeck y harina de vainas de tara. Luego, mediante filtracin, se separa la biomasa del hongo presente en el extracto final que, adems, contiene la enzima y el cido glico. La enzima presente en el extracto, es purificada utilizando columnas cromatogrficas, a la que se le determinar sus propiedades fsicas y qumicas; como el pH, la temperatura, los nutrientes y la aireacin ideal que mejore su actividad; con lo que, posteriormente, sern estandarizados estos parmetros usando un diseo factorial. As mismo, se construir la curva de crecimiento de los hongos aislados y se identificar la fase de mayor produccin de la enzima. 5. Estandarizacin de las caractersticas de la biomasa, nutrientes, pH, temperatura, humedad y aireacin, necesarios para la produccin de cido glico. Los resultados obtenidos durante la identificacin y Estandarizacin de los parmetros fsicos y qumicos, a nivel de laboratorio, sern extrapolados para la produccin de cido glico a nivel de reactor y aplicacin industrial.

IV. N

Presupuesto Materiales Cantidad 10 10 10 5 Precio unit 15.2 13.2 10.97 24.5 Total 152.0 132.0 109.7 122.5

3 Matraz erlenmeyer de vidrio graduado 50 ml boca angosta Matraz erlenmeyer de vidrio graduado 250 ml boca 4 angosta Matraz erlenmeyer de vidrio graduado 500 ml boca 5 angosta Matraz erlenmeyer de vidrio graduado 1000 ml boca 6 angosta

7 Placas petri de vidrio de 15 mm x 100 mm Potenciometro de mesa, autocalibracin, RES 0.01/0.1 8 Electrodo sure 15 Vaso de precipitacin de vidrio 1 L 16 Vaso de precipitacin de vidrio 100 ml 17 Vaso de precipitacin de vidrio 250 ml 18 Desecadores de Humedad de vidrio 19 Tapers de plstico con tapa 20 Czapeck 500 gr 21 Agar Agar 500 gr 22 Algodn hidrfilo rollo x 500 gr 23 Alcohol etilico 70 C x 1L 24 Guantes descartables Talla Medium (Caja x 50 pares) 25 Alcohol etlico 96 C x 1L Papel toalla blanco de 22 cm x 20 cm x 60 hojas (Paquete x 26 3 rollos) 27 Papel Kraft 50 g x 75 cm x 120 cm (x millar) 28 Folin Phenol Ciolcateu 29 Carbonato de sodio ACS x 500 gr 30 D-Glucosa Frasco x 500 gr 32 Papel filtro Whatman N 40 (x100 unidades) Espectofotmetro de luz uv + cubetas Agitador orbital Incubadora con rango de temperatura de 20 a 50 C Camara de flujo laminar
Sub total

20 1 10 10 10 1 20 2 2 10 10 5 15 20 10 1 1 1 2 1

4.0 3572.0 48.0 36.8 32.5 150.0 18.0 215.0 612.0 14.5 4.1 11.4 7.9 1.5 0.2
170.2

80.0 3572.0 480.0 368.0 325.0 150.0 360.0 430.0 1224.0 145.0 41.0 57.0 118.5 30.0 2.0
170.2

145.0 95.6 153.0

145.0 95.6 305.9

TOTAL

15295.44 127795.44