Hctor Rocha L.

DNA

DNA 1 1) ACIDOS NUCLEICOS 656 658 661

2) LAS BASES NITROGENADAS

3) SINTESIS DE LAS BASES NITROGENADAS a) Sntesis de las Purinas 661 b) Biosntesis de las Pirimidinas 664

4) DIFERENCIAS ENTRE LA SINTESIS DE PURINAS Y PIRIMIDINAS 667 5) NUCLETIDOS 667

6) REGULACIN DE LA SNTESIS DE LAS BASES NITROGENADAS 7) VIAS DE RESCATE DE LAS PURINAS Y PIRIMIDINAS 8) DEGRADACION DE LAS BASES NITROGENADAS 675

676

9) ALGUNOS TRASTORNOS EN EL METABOLISMO DE LAS PURINAS Y PIRIMIDINAS 679 10) DNA 684

a) Estructura primaria 684 b) Estructura secundaria 684 c) Estructura terciaria 685 d) DNA tipo B 686 e) DNA tipo-A 686 f) DNA tipo-Z 686 11) DNA CRUCIFORME 688

12) DNA PRESENTE EN MITOCONDRIAS, CLOROPLASTOS Y DNA VIRAL 688 13) PROPIEDADES DEL DNA a) En solucin 691 b) Temperatura 691 c) Hibridizacin 691 d) Absorcin de luz 692 e) Reparacin 692 f) Daos que puede experimentar g) Mutaciones 694 h) Daos por luz UV 696 691

693

653

Hctor Rocha L. DNA

DNA 2 14) REPLICACION DEL DNA a) iniciacin 701 b) elongacin 702 c) terminacin 703 15) RNA 704 706 706 698

16) PRINCIPALES DIFERENCIAS ENTRE RNA Y DNA EN EUCARIOTES 17) TRANSCRIPCION DEL DNA EN PROCARIONTES Y EUCARIONTES 18) PROCESAMIENTO DEL TRANSCRITO PRIMARIO O RNAhn 19) RNAr 20) RNAt 717 718 721 722 714

21) LOS RIBOSOMAS

22) SINTESIS DE PROTEINAS

23) PROCESAMIENTO DE LAS PROTEINAS RECIEN SINTETIZADAS 24) ALGUNAS CARACTERISTICAS DEL GENOMA HUMANO 25) DESARROLLOS POSTERIORES 732 728

726

654

Hctor Rocha L. DNA

1) ACIDOS NUCLEICOS. En los captulos precedentes se describi el metabolismo de los carbohidratos, los lpidos y los aminocidos. Corresponde ahor, el estudio de los Acidos Nucleicos tanto DNA como

655

Hctor Rocha L. DNA

RNA, para completar as el concepto que involucra la dinmica de las macromolculas biolgicas. En este caso especfico nos referirmos a la capacidad para guardar, mantener y pasar la informacin, adaptndola al medio externo por medio de su descendencia. El Acido Desoxirribonucleico o Deoxiribonucleico (ADN: castellano, DNA: ingls), se encuentra protegido en el ncleo de la clula eucarionte, por una estrecha interaccin con ciertas protenas ricas en Lys y Arg (bsicas) denominadas histonas. Mientras que en los organelos, como la mitocondria de la clula animal y el cloroplasto de la clula vegetal, se le encuentra desnudo, es decir, sin histonas. En esta misma, forma se le encuentra en procariontes, que no poseen ncleo y donde el DNA exciste en la forma de un cromosoma circular. Por otro lado, es tambin posible encontrarlo al interior de las bacterias en la forma de uno o varios DNAs circulares llamados plasmidos o plasmidios. Estos ltimos pueden reproducirse de forma independiente al cromosoma principal. Porotro lado, las partculas virales tienen su cido nucleico como DNA o RNA, el cual se encuentra protegido por una envoltura o cpside. El DNA es donde radica la herencia, ya que todas las protenas se encuentran codificadas en l. Esto significa que una tira lineal de DNA, no solo guarda la informacin de la estructura primaria de las protenas, sino que tambin se encuentran implcitas sus interacciones espaciales. El DNA en s, esta formado por una doble hebra de polideoxiribonucleotidos. A su vez cada hebra est formada por la unin entre los Deoxiribonucletidos mediante enlaces fosfodiester. La interaccin que mantiene juntas ambas hebras depende de los enlaces hidrgeno, entre las bases nitrogenadas pertenecientes a los Deoxiribonucletidos de cada hebra. A su vez las bases de cada una de las hebras, se apilan unas sobre ejerciendo interaccin hidrofbica entre ellas. El DNA, posee distintas estructuras espaciales o estructuras promedio, que pueden variar de un tipo al otro dependiendo del grado de hidratacin y la identidad de las bases alternadas en ambas hebras. De esta manera su grado de torsin puede ser levgiro o dextrgiro, con distintos anchos y sus formas se denominan tipo A, B, C, D, T y Z. Los procesos en que se encuentran involucrados los cidos nucleicos en la clula son bastante variados e incluyen la Replicacin misma de la molcula de DNA, la Transcripcin de su mensaje a otra hebra, esta vez formada de polirribonucletidos o RNA y la Traduccin de este mensaje lineal a una secuencia aminoacdica que adquirir una estructura tridimensional en una protena. Otro de los cidos nucleicos es el RNA, que es capaz de presentar las ms variadas funciones estando constituido tan solo una hebra de Poliribonucletidos. Esta hebra se puede plegar y aparear consigo misma, alcanzando una determinada estructura espacial con varios bucles, sin llegar nunca a la forma helicoidal como el DNA, debido a la presencia del grupo OH en la posicin 2 de la Ribosa. Una de las principales funciones del RNA, es hacer de molcula intermediaria (RNAm) entre la informacin contenida en el DNA y el punto de ensamblaje de las protenas, donde la informacin se traduce en las cadenas polipetdicas de secuencia especfica. Entre sus otras funciones, se encuentra la transferencia de aminocidos a los puntos de ensamblaje proteico en los poliribosomas (RNAt) y, adems su capacidad de actuar como un heteropolmero estructural en el ribosoma mismo (RNAr). Aqu interviene en el reconocimiento y la fijacin del RNA mensajero al Ribosoma. Nuevas funciones del RNA han sido descritas ltimamente y entre ellas se encuentra la actividad enzimtica del RNA mismo, representada por las Ribozimas o enzimas polimerizantes de nucletidos formadas por secciones de RNA no codificante, denominadas Intrones y que pertenecen al transcrito primario o RNA Heteronuclear (RNAhn) conocido como RNA naciente o recin transcrito del gen en los Eucariontes.

656

Hctor Rocha L. DNA

Entre otras funciones del RNA, se le atribuye la propiedad de actuar como catalizador de la formacin del enlace peptdico durante la sntesis de protenas en el Ribosoma. Una de sus sus facultades es el control de la expresin de los genes en Eucariontes, la que estara mediada a su vez por genes que solo se expresan como RNA y no protenas. Estas secuencias seran capaces de aparearse con el UNAM, para evitar su lectura por los ribosomas. Otro de estos mecanismos mediados por el RNA, ocurrira mediante el apareamiento o hibridizacin con la hebra con sentido del DNA, para as impedir su lectura por la RNA polimerasa y la expresin de determinados genes. Volver inicio al

2) LAS BASES NITROGENADAS. As como los aminocidos son los ladrillos o heteromonmeros que forman una protena, los nucletidos son los heteromonmeros que estructuran a un polinucletido de DNA o RNA. La secuencia y orden de las bases nitrogenada entregan la identidad a las secuencias de los

657

Hctor Rocha L. DNA

cidos nucleicos. La sntesis de las bases nitrogenadas ocurre "de novo", lo que significa a partir de cero, ya que se emplean los aminocidos como precursores, Fig. 1-14.
PRECURSORES E IDENTIDAD DE LAS BASES NITROGENADAS PURINAS Asp CO 2

6
ADENINA NH 2 6 C 5 N C C 4 7 N GUANINA O C HN C C N N CH
10

7
1

5
CH8

2 HC N 3

10

N H 9

C HN 2

N - Formil - F H 4

Gly

N - Formill - F H 4

N H

2 4
PIRIMIDINAS Gln Gln

1
Carbamil - P CITOSINA NH 2 C 4 CH5 CH 6 N 1

2
Asp

URACILO O C N O C N CH CH O N C

TIMINA O C C CH N CH 3

3 N 2 O C

Fig. 1 - 14. Los aminocidos son los precursores de las Purinas y Pirimidinas. Las Purinas se construyen sobre el anillo de Ribosa activado como Fosfo-Ribosil-Pirofosfato (PRPP). En primer lugar se adiciona el grupo del Amino (1) de la Gln que entra al PRPP, seguido del esqueleto de la Gly (2) y el grupo Formilo (3) aportado por el c. Flico (FH4). A continuacin, entra otro grupo Amino aportado por una nueva Gln (4), acompaado por el cierre del anillo con ATP (5). Luego se contina con la incorporacin de un CO2 (6), ms un grupo Amino aportado por el Asp (7) y finalmente otro Formilo (8), aportado por el c. Flico, ms el cierre del segundo anillo y formacin del Ac. Inosnico ( Inosina -Ribosa - Fosfato). Por otro lado, las Pirimidinas se forman a partir del Carbamil-P citoplasmtico (1) con el aminocido Asp (2), formando el Carbamil Aspartato, que se cierra para formar el anillo por medio de una deshidratacin y posterior oxidacin con NAD, entregando el Ac. Ortico. A este ltimo se le agrega Ribosa en la forma de PRPP, para dar finalmente el c. Orotidlico (OMP) precursor de Uracilo, Citosina y Timina.

En cuanto a las bases nitrogenadas aportadas por la dieta, estas no se utilizan ya que pueden haber sufrido alguna modificacin previa y seguro aumentar el riesgo de producir mutaciones al ser incorporadas al DNA o al RNA. Por otro lado, algunas de estas bases son transformadas por las bacterias intestinales en ac. rico y Amonio que puede ser absorbido y luego excretado en los productos de deshecho. ESQUEMA GENERAL DE LA SNTESIS Y SALVATAJE DE LOS NUCLETIDOS DE PURINA Y PIRIMIDINA

658

Hctor Rocha L. DNA

SNTESIS DE LAS PURINAS Gln PRP Gly N5,N10 Metenil-FH4

VIA DE SALVATAJ E Gln

-

Hipoxantina

Guanina

PRPP

HCO3

Asp

HGPRT PP

N10 Formil-FH4 C- P Asp PRPP Ortico OMP

-

HCO3
UMP AMP Fosforilacin ADP

IMP
Asp Gln

GMP

CDP

CTP Gln

UTP

UDP

GDP

SNTESIS DE LAS PIRIMIDINAS NDPs

Complejo Ribonucletido Difosfato Reductasa

Metilacin del Uracilo por N5,N10 Metilen-FH4 P dTMP

Timidilato Sintasa

NTPs

RNA

dUMP

dNDP Fosforilacin dTDP dTTP dATP DNA dGD dCDP dGTP dCTP

ATP

ADP

dADP

Otra de las vas que aporta bases nitrogenadas corresponde al rescate de bases, que ocurre a partir del DNA o RNA endgeno que ha sido metablicamente degradado. En este caso las Purinas como bases libres pueden ser unidas a la Ribosa activada, como Fosfo-RibosilPirofosfato (FRPP) para formar el correspondiente nucletido y las Pirimidinas son rescatadas a nivel de los Nuclesidos los cuales con ATP se vuelven a fosforilar, como se observar en detalle ms adelante. El costo energtico de la sntesis de novo de las Purinas y Pirimidinas

659

Hctor Rocha L. DNA

es alto, por lo tanto el reciclaje es menos costoso y a su vez tiene un efecto regulador sobre la va de sntesis inhibindola. Las Purinas forman como producto de excrecin c. rico que es parcialmente soluble y 2/3 del que se produce diariamente es excretado por el rin y solo 1/3 es excretado por el intestino. En contraste las Pirimidinas no tienen un solo producto de excrecin definido, sino que varios siendo todos ellos solubles como la -Alanina y el cido -Aminoisobutrico, junto a Amonio y CO2. CMO SE RELACIONA LA VITAMINA B12 CON EL CIDO FLICO? La vitamina B12 se necesita para que el Metil-THF pase su grupo metilo a la Cobalamina para as formar Metil-Cobalamina. Sin B12 se acumula todo el cido flico bajo la forma de Metil-THF, mientras que los niveles de THFdisminuyen. De esta manera no existir THF libre para ser destinado a formar N5, N10 Metenil THF y N10- Formil-THF, que intervienen en la sntesis de las Purinas y el otro compuesto N5, N10 Metilen-THF, empleado durante la sntesis de Timina, lo que a su vez impide la sntesis de los cidos Nucleicos. Esta carencia de disponibilidad se traduce en una incapacidad para dividirse de parte del ncleo de los eritroblastos, ya que no disponen de una reserva adecuada de Purinas y Timina para formar Deoxiribonucletidos y permitir la replicacin del DNA. La consecuencia de esta falta provoca la enfermedad denominada Anemia Perniciosa. Esta es del tipo megaloblstica (eritrocitos de gran tamao, ya que no se dividen sus precursores). Por otro lado la falta de Metil Cobalamina, no permite la formacin de Metionina a partir de Homocistena en el metabolismo de los aminocidos. POR QU LAS PIRIMIDINAS NO TIENEN VIA DE SALVATAJE? En las Purinas el salvataje se produce a nivel de las bases nitrogenadas Hipoxantina y Guanina, mientras que en las Pirimidinas este proceso no es tan importante y ocurre a nivel de los Nuclesidos. Esto se debe a que las Purinas forman productos de degradacin parcialmente solubles, que al acumularse cristalizan y producen dao (c. rico), mientras que las Pirimidinas forman compuestos de degradacin totalmente solubles. PORQU EL DNA TIENE TIMINA Y EL RNA PURINA? a) Una de las razones se debe a que la base Uracilo del RNA no es lo suficientemente especfica en su apareamiento, mientras que la misma base metilada como Timina s lo s y aparea solo con Adenina. De esta manera se gana en estabilidad y se evita la formacin de bucles en un DNA mal apareado, preservando la fidelidad en la replicacin. b) Por otro lado el DNA, es en general metilado para preservar su integridad ya que lo hace de esta manera irreconocible a ciertes Nucleasas que puen ser aporatdas mediante partculas virales o bacterias c) La adicin de un grupo metilo hace al DNA que sea ms hidrofbico y menos expuesto a cambios en el solvente. En especial el grupo metilo de la Timina es repelido por el agua hacia una cierta posicin escondida en la hendidura mayor. De

660

Hctor Rocha L. DNA

esta manera la Timina se encuentra menos expuesta a la interaccin con otras bases, al ser su base precursora Uracilo un tanto promiscua en su apareamiento en el RNA. Volver inicio al

3) SINTESIS DE LAS BASES NITROGENADAS. a) Sntesis de las Purinas . El Fosfo-Ribosil-Pirofosfato (FRPP) es una Ribosa activada con ATP, con un Fosfato en la posicin del carbono 5, mientras que en el carbono 1 se halla el Pirofosfato, (Fig. 2 - 14). En este ltimo carbono activado (posicin 1), se recibe al grupo Amino, donado por la Glutamina con salida del Pirofosfato, denominndose ahora como 5-FOSFO-RIBOSIL-1-AMINA (PRA). A continuacin se procede la adicin del aminocido Glicina, activado previamente con ATP en la forma de un acilfosfato, el cual se une al grupo anterior 1-Amino. Una vez que sale el fosfato activador de la Glicina, se forma la GLICINAMIDA RIBONUCLETIDO (GAR). En la etapa siguiente el grupo amino de la Glicina es formilado por el N10- Formil-FH4, para formar la -N-FORMILGLICINA RIBONUCLETIDO (FGAR). A continuacin la Glutamina con ATP, dona su Nitrgeno en la posicin , al carbonilo de la Glicina ya incorporada, para as formar la -N-FORMILGLICINAMIDINA RIBONUCLETIDO (FGAM). Posteriormente se cierra el anillo con la energa del ATP, formando el 5'-AMINOIMIDAZOL RIBONUCLETIDO (AIR). De esta manera queda formado el primer anillo de la Purina. A continuacin se carboxila sin Biotina y con -HCO3, para dar origen al 4-CARBOXI- 5AMINO-IMIDAZOL RIBONUCLEOTIDO (CAIR). Luego, el Aspartato con la ayuda de ATP dona su grupo amino para formar el N-SUCCINO-5-AMINOIMIDAZOL-4-CARBOXAMIDA RIBONUCLEOTIDO (SAICAR), el que posteriormente se descompone liberando c. Fumrico, para quedar en la forma de 5-AMINOIMIDAZOL-4-CARBOXAMIDA RIBONUCLETIDO (AICAR). Posteriormente, este ltimo intermediario, recibe otro carbono por la N10-Formil-FH4, para formar un nuevo compuesto, el N-FORMILAMINO-IMIDAZOL-4-CARBOXAMIDA RIBONUCLETIDO (FAICAR). Luego, se cierra el anillo con salida de agua, para quedar sintetizado el precursor llamado c Inosnico, INOSINATO o IMP. Una vez sintetizado el doble anillo de la Inosina sobre la Ribosa-Fosfato o IMP (c. Inosnico), la va biosinttica se bifurca para dar origen al Adenilato (AMP) y Guanilato (GMP), (Fig. 3 - 14). En el caso del AMP, el Aspartato deja su Amonio en la posicin 6 del doble anillo saliendo nuevamente como Fumarato y en el caso del GMP, se produce la oxidacin del IMP con NAD en el carbono 2, para quedar como Xantilato o XANTINA MONO FOSFATO (XMP). Este ltimo, al recibir Amonio aportado por la Glutamina, se convierte en Guanilato o GUANINA MONOFOSFATO o GMP (Fig. 3 - 14). Finalmente por medio de la accin de las Fosfoquinasas los nucletidos monofosfato GMP y AMP, pueden pasar a formar los respectivos Nucletidos Trifosfato GTP y ATP.

661

Hctor Rocha L. DNA

Nombre de cada una de las enzimas y productos que participan en la sntesis de las Purinas de la figura 2-14: NMERO 1 2 3 ENZIMA FOSFORIBOSIL PIROFOSFATO AMIDOTRANSFERASA GAR SINTASA GAR TRANSFORMILASA COMPUESTO FORMADO 5-FOSFO-RIBOSIL-1-AMINA ( PAR) GLICINAMIDA RIBONUCLETIDO (GAR) -N-FORMILGLICINA RIBONUCLETIDO (FGAR) -N-FORMILGLICINAMIDINA RIBONUCLETIDO (FGAM) 5'-AMINOIMIDAZOL RIBONUCLETIDO (AIR) 4- CARBOXI-5-AMINOIMIDAZOL RIBONUCLETIDO (CAIR) N-SUCCINO-5-AMINOIMIDAZOL4-CARBOXAMIDA RIBONUCLETIDO (SAICAR) 5-AMINOIMIDAZOL-4CARBOXAMIDA RIBONUCLETIDO (AICAR) N- FORMIL AMINO IMIDAZOL-4CARBOXAMIDA RIBONUCLETIDO (FAICAR) AC. INOSNICO (I M P)

FGAR AMIDOTRANSFERASA

FGAM CICLASA

AIR-CARBOXILASA

SAICAR-SINTASA

SAICAR-LIASA

AICAR -TRANSFORMILASA

10

I M P Sintasa

662

Hctor Rocha L. DNA

2H 2

P R P P OPOCH2

H
H
O

1
O

2H 3O P O C H 2

H H H O

1
H

N H2 H H O H ATP + G ly

2H 3O P O C H 2

N
H H O H

C O

H H H O ADP + Pi

C H 2

N H 3 2

H N H C O C N H R ib o s a - P
F o r m il - G lic in a m id a R ib o n u c le t id o (F G A R )

C H O

O P O PO H

OH OH OH G ln

H O G lu + PPi

PRPP s in ta s a

N , N - M e te n il- F H 4

10

F H 4

R ib o s a - 5 - P + ATP

5 - P - R ib o s il -1 A m in a (P R A )

G lic in a m id a R ib o n u c le t id o (G A R )

G ln ADP + Pi C O 2

ATP ATP

H O O C C H H C 2 H O O C
N -S u c c in o 5 -A m in o im id a z o l 4 -C a r b o x a m id a R ib o n u c le t id o (S A IC A R )

O C N H H N 2 C C N

ADP + Pi

A sp + ATP

+ G lu

4
H N C H O N H R ib o s a - P C

ADP + Pi

H O O C C H C N C H N H C N C H N H C C H N 2

R ib o s a - P

H N 2

H N

R ib o s a - P

R ib o s a - P
5 -A m in o im id a z o l R ib o n u c le t id o (A IR )

8
F u m ar at o

4 -C a r b o x ila to 5 A m in o im id a z o l R ib o n u c le t id o (C A IR )

O C H N 2
5 -A m in o im id a z o l 4 -C a r b o x a m id a R ib o n u c le t id o (A IC A R )

10

N -F o rm il-F H 4

F H 4

O C
H O 2

O C HN HC

F o r m ilg lic in a m id in a R ib o n u c le t id o (F G A M R )

C C

N C H N

H N 2

R ib o s a -

N -F o r m ila m in o -Im id a z o l 4 -C a r b o x a m id a P R ib o n u c le t id o (F A IC A R )

HN 2 O C H

C C N H

N C H N

C C

N C H N

10

R ib o s a - P

N H

R ib o s a - P

c . In o s n ic o o I M P

Fig. 2 - 14. Sntesis de las Purinas a partir de PRPP (Pirofosfato va en el carbono 1 de la Ribosa y en el carbono 5 el Fosfato), ATP y los aminocidos precursores.

663

Hctor Rocha L. DNA

HO 2 + NA D O C HN HC N

+ H + NA DH

O C HN C O N C N

Gl n + ATP

Gl u + A MP + P P HN

O C C N CH

CH C N

C N XM P HN C N 2 A m inasa

Ribosa - P IM P Deshidro genasa Ac. Xantlico C N CH C N

Ribosa - P GMP

I MP o Ribosa - P A c. Inosnico A s p + GT P GDP + P i HOOC CH CH COOH 2 C HN HC N C N CH C N Fum arato Ribosa - P A c. A denilosuccnico AMP NH A denilo 2 Succinato C Liasa HN C N CH HC N C N Ribosa - P

A denilo Succinato Sintasa

Fig 3 - 14. Paso del IMP a AMP con Amonio del c. Asprtico y paso del IMP a GMP por oxidacin y posterior adicin del Amonio perteneciente a la Glutamina con ATP.

b) Sntesis de las Pirimidinas (Fig. 4 - 14). En la biosntesis de las PIRIMIDINAS, se sintetiza primero el anillo y despus se lo une a la Ribosa activada. El Carbamil - Fosfato es uno de los precursores del anillo de las Pirimidinas y se forma en el citoplasma, sin relacin con la molcula producida por la mitocondria en el resto del organismo, con excepcin del Hgado, donde la Carbamil-P Sintasa perteneciente al Ciclo de la Urea, puede aportar algo del Carbamil-P para la sntesis de las Pirimidinas cuando este es exportado al Citosol. El otro precursor es el c. ASPARTICO, (Fig. 4 -14). La primera reaccin de la va, es la unin del CARBAMIL-FOSFATO y c. ASPARTICO para dar origen al c. CARBAMIL-ASPARTICO. Esta molcula posteriormente se deshidrata, cerrndose el anillo y pasa a formar el c. L-DIHIDRO-OROTICO, que se oxida con FAD para convertirse en c. OROTICO. Este ltimo recibe el anillo de la Ribosa activada, como 5-Fosforibosil-1-Pirofosfato, para formar la Orotidina-5-Fosfato o c. OROTIDILICO (OMP) con salida del Pirofosfato y posterior hidrlisis. El OMP por descarboxilacin dar

664

Hctor Rocha L. DNA

origen al URIDILATO, tambin llamado URIDINA MONO FOSFATO o UMP. Una vez formado, se le adicionan dos fosfatos en dos reacciones sucesivas con ATP para dar el UTP o URIDINA TRIFOSFATO. Esta molcula al recibir un amino de la Glutamina activada con ATP, forma finalmente la CITIDINA-5-TRIFOSFATO (Fig. 4 - 14). Como se puede observar esta va de sntesis es lineal sin mayores bifurcaciones como ocurre con las Purinas.

Nombre de las enzimas y productos involucradas en la sntesis de las Pirimidinas (Fig. 4 14): NMEROS ENZIMAS 1 CARBAMIL- FOSFATO SINTASA II ACTI 2 ASPARTATO VIDADES TRANSCARBAMILASA 3
ENZIM-

DIHIDROROTASA
TICAS EN UN SOLO COMPLEJO

PRODUCTOS CARBAMIL-P (CP) CARBAMIL- ASPARTATO (CA) DIHIDROOROTATATO (DHO)

4 5

Dihidrorotato deshidrogenasa Orotato Fosforibosil Transferasa

Orotidilato Descarboxilasa

7 8 9

UMP Quinasa Nuclesido Difosfoquinasa CTP sintasa

OROTATO OROTIDINA MONO FOSFATO (OMP) URIDINA MONO FOSFATO (UMP) URIDINA DIFOSFATO (UDP) URIDINA TRIFOSFATO (UTP) CITIDINA TRIFOSFATO (CTP)

(O)

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al

665

Hctor Rocha L. DNA

Carbamil - P
O H N C O PO3H2 2 1
-

O Ac. A s p a r t i c o HO C CH C HN 2 H 2 COOH Pi O HO HN 2 C

O C

Ac. N Carbamil Asprtico

HO 2 CH C H 3 COOH O FAD FAD HN C

Ac. Dihidro-ortico
O C C H2 C H N H COOH

N H

HCO3 + Gln + ATP (U D P)

HN C O N O C ADP CH CH 7 O

(U M P)
ATP HN C

O C CH CH N
2H3OP

(O M P)
CO 2 6 O O C H2 O H HO OH HN C

O C CH C N HN 5 COOH O C N H PP i 2 FADH 2 PRPP O C

CH C COOH

ATP ADP

Ribosa - O P2 O6 H3 8 O C CH CH N

Ribosa OPO3H2

Uridina - 5' - Di - P
Gln + ATP 9

Uridina -5' - P
NH

Orotidina - 5' P o c. Orotidlico

Ac. Ortico

(U T P)
HN C O

Glu + A D P + Pi H N C O

(C T P) C

2 CH CH

N Ribosa - O P3 O9 H4

Ribosa - O P3 O9 H4

Uridina - 5' - Tri - P

Citidina - 5' - Tri - P

Fig. 4 - 14. Biosntesis de las Pirimidinas a partir de Carbamil-P y Aspartato. Las enzimas reguladoras se encuentran en un rectngulo oscurecido.

666

Hctor Rocha L. DNA

4) DIFERENCIAS ENTRE LA SINTESIS DE PURINAS Y PIRIMIDINAS.

PURINAS Representadas por Adenina y Guanina, tanto en el DNA como en el RNA. Su nico anillo se sintetiza inmediatamente sobre la Ribosa activada como 5-Fosfo-Ribosil-1-Pirofosfato. El cido Flico se emplea para adicionar carbono como Metenilo y Formilo

PIRIMIDINAS

Representadas por Timina, Citosina y Uracilo El DNA tiene TIMINA y CITOSINA. El RNA tiene URACILO y CITOSINA. Ambos anillos se sintetizan primero y despus se unen a la Ribosa activada como 5-Fosfo-Ribosil-1-Pirofosfato Una vez formado el anillo del URACILO, el c. Flico se emplea para adicionar el grupo Metilo al nucletido dUMP que se transforma en dTMP Sus precursores son el c. Asprtico, la En su sntesis solo se emplea Glicina, dos Glutaminas, CO2 y dos c. Glutmico y Carbamil Fosfato grupos Formilos A partir de la IMP se bifurcan en la va para El c. Orotidina-5- Fosfato (OMP) es la sntesis de AMP y GMP precursor directo de UMP y CMP

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al

5) NUCLEOTIDOS Los Nuclesidos estn formados por una base nitrogenada ms el azcar, mientras que los Nucletidos tienen la base nitrogenada, el azcar y uno o ms fosfatos en la posicin 5. Tanto el producto final de la sntesis de las Purinas como de las Pirimidinas es el nucletido Monofosfato. En la figura 5 - 14, se pueden observar las bases nitrogenadas Adenina y Guanina junto a sus nuclesidos y nucletidos, los que se encuentran dispuestos en la forma SIN. Esto significa que el C-5' del azcar tiene un Fosfato al mismo lado que la posicin en que se encuentra el doble anillo de la base nitrogenada (Figs. 5 - 14 y 6 - 14). Cuando se encuentran en la forma opuesta se denominan ANTI. El azcar de los Nuclesidos puede ser Ribosa o (Desoxi) Deoxiribosa y los fosfatos en el Nucletido pueden estar en nmero de 1 a 3. Con 3 fosfatos es cuando la molcula contiene la mayor energa. Los fosfatos se ordenan de adentro hacia fuera, es decir desde el C-5' del azcar hacia su extremo y se denominan Fosfatos (C-5'-O-PO3H2), (C-5'-O-PO2-O-PO3 H2) y (C-5'-O-PO2-O-PO2-O-PO3H2), luego el ms externo es l .

667

Hctor Rocha L. DNA

NH C

NH 2 C C N CH N HC N HOH C 2 C

2 C C N CH N
HO

NH C N

2 C C N CH N

NH C

2 C C N CH

6
N H2 C

7
N CH N H

HC HOH C 2

1N 2H C
N

5C 4C 3
ADENINA

N O H H

O P O O

HC N
H C 2

N
O HO P O

HC N
H C 2

4
H

1
H H

O H H H HO H

O H H H HO OH

H H HO

O H H H

3 2
HO OH

6 - Aminopurina

Adenosina

Deoxiadenosina

Ac. Adenlico

Ac. Deoxiadenlico

O O C HN C HN 2 N GUANINA H HO C C HN N CH N C HN 2 HOH C 2 H N O H H OH H C N C C N CH HN 2 HOH C 2 HN C

O C C C N N CH N
HO

O C HN C C N O H H HO OH H H N CH C HN 2
O H C 2

O C HN C C N N CH C HN 2
O H C 2

O P O

N
HO

O P O

O H H H HO H

O H H H HO H

2 - Amino - 6 - ceto purina

Guanosina

Deoxiguanosina

Ac. Guanlico

Ac. Deoxiguanlico

Fig 5 - 14. Bases Pricas junto a sus Nucletidos y Deoxiribonucletidos

668

Hctor Rocha L. DNA

N H N H

2 C H C H

N H C N C O N

2 C H C H O

N H C N

2 C H

N H C N

2 C H C H

4 3
O N C

2 C C H C H N N

5 6
H O H 2 C O H H H O H
O

C N

H O P O O H 2 C

C O N

C H O H O P O O

H 2 C

C O N

1 C IT O S IN A

H O H 2

C O H H H H O H

O H H H O H H O H

O H H H O H H H

H O H

2 - C e to - 4 A m in o P ir im id in a
O C

C itid in a
O C

D e o x ic itid in a
O C

A c . C itid lic o

C M
H N
C O N C H C H O

P
O C

A c .D e o x ic itid lic o d C M P
O C C H C H N H O O P O O H C 2

HN
C N

C H C H O

HN
C N

C H C H

O H O P O O H 2 C O

HN
C

HN
C N

C H C H

H O H 2

C O H H H O H H O H

H O H 2

C O H H H H O H

O H H H O H H O H

O H H H H O H

U R A C IL O

2 , 4 - D ic e to p ir im id in a
O C

U r id in a

S e u d o u r id in a
O C

A c . U r id lic o U M P
C H 3 O H O P O O H 2 C

A c . S e u d o u r id lic o O d U M P
C

H N
C C H C O N H O

C C H

C H

H N
C O N

C C H

C H

H N
C O N

H O H 2

C O H H H H O H

O H H H O H H H

T IM IN A
H

2 , 4 - D ic e to - 5 M e t il P ir im id in a

d -T im id in a o D e o x itim id in a

A c.

T im id lic o
d T M P

Fig. 6 - 14. Bases Pirimidnicas con sus respectivos Nuclesidos y Nucletidos.

669

Hctor Rocha L. DNA

En la Figura 6 - 14, se pueden observar los Nucletidos y Nuclesidos de las bases Citosina, Uracilo y Timina. Es importante destacar que los nucletidos de la Timina son solo del tipo Deoxi.

670

Hctor Rocha L. DNA

Los Nucletidos, fuera de constituir los cidos nucleicos son empleados en otras actividades y entre ellas tenemos: a) la activacin de sustratos, como es el caso de la UDP-Glucosa y el CDPDiacilglicerol o la CDP-Colina. b) como parte de los cofactores vitamnicos en las coenzimas NAD, FAD, la Deoxiadenosilcobalamina (B12) y la Coenzima A. c) Cmo segundos mensajeros en las cascadas de amplificacin AMPc y GMPc. Los Ribonucletidos en la forma nucletido difosfato (NDP), son los precursores de los deoxiribonucletidos (dNDP), que son necesarios en la forma de dATP, dGTP, dCTP y dTTP para la sntesis del DNA. As tenemos que la enzima RIBONUCLEOTIDO REDUCTASA de la figura 7 - 14 se encuentra activada en las clulas mitticas y cataliza la Deoxigenacin de la D-Ribosa a D-Deoxiribosa, por medio de la reduccin directa del OH a H, sin cambios en la configuracin del azcar.
Complejo de la Ribonucletido Difosfato Reductasa donde ocurre la reduccin del 2OH de la Ribosa a 2H en la Deoxiribosa. Solo los Nuclesidos Difosfato son los sustratos del Complejo.

ADP CDP GDP UDP

NADPH+ H
+

FAD

2 Fe + 2

T
Tioredoxina

S S

Ribonucletido Reductasa
E SH SH S E S

NADP

Tiorredoxina Reductasa
F A D H2 Fe + 3

SH SH

d ADP d CDP d GDP d UDP

Fig 7 - 14. La actividad denominada Tiorredoxina Reductasa es parte del Complejo y acta sobre los grupos 2'- Hidroxilos de los Ribonuclesidos Difosfatos.

. El sistema enzimtico de la figura 7 - 14, pertenece al E. Coli, siendo similar en sus caractersticas principales al de los Eucariontes. Este sistema cuenta con un dador de protones como el NADPH + H, un transportador como FAD, hierro no Hemnico como transportador de electrones y la protena Tiorredoxina de PM. 12kD. Esta protena contiene un par de Cys formando un puente disulfuro entre sus estados reducido y oxidado. El Complejo de la Ribonucletido Reductasa, toma los hidrgenos reversiblemente de ambas Cistenas de la Tiorredoxina y con sus propios grupos Tioles o SH procede a la reduccin de la Ribosa A continuacin la enzima Timidilato Sintasa (Fig. 8 - 14), tiene por funcin catalizar la reaccin en que el Deoxiuridilato (dUMP) pasa por metilacin a Deoxitimidilato (dTMP). Se emplea en este caso la coenzima que contiene c. Flico (THF) como transportador de carbono, en la forma de N5, N10- Metilen -Tetrahidrofolato. Esta coenzima despus de entregar el Metilo, queda como c. Dihidroflico (DHF). Para llegar nuevamente a este ltimo compuesto funcional se lleva a cabo una reduccin con la enzima Dihidrofolato Reductasa y NADPH + H. En la reaccin de carga del metilo, como metileno al c. THF, es tambin necesaria la Vitamina B12 o Cobalamina en la forma de Metil-Cobalamina. De esta manera, se puede

671

Hctor Rocha L. DNA

inhibir la sntesis de DNA en Quimioterapia (tratamiento para Leucemia) por la inhabilidad de contar con el dTMP necesario para formar dTTP. Para ello se emplean los compuestos qumicos conocidos como Aminopterina, Metopterina y Trimetoprima (Fig. 8 - 14). Su capacidad, se debe a que actan como inhibidores competitivos de la enzima Dihidrofolato Reductasa (DHFR), ya que su estructura es anloga al c. Flico.
a)
NADPH + H FH2 (DHF) DIHIDROFOLATO

dTMP

DIHIDROFOLATO REDUCTASA NADP F H 4 (THF) TETRAHIDROFOLATO

TIMIDILATO SINTASA dUMP

5-FLUORURACILO Y 5-FLUORDEOXIURUDINA SON INHBIDORES

AMINOPTERINA, METOPTERINA Y TRIMETOPRIMA SON INHIBIDORES DE LA DIHIDROFOLATO REDUCTASA

N ,N

10

- METILEN - F H 4

b)

dUMP

TIMIDILATO SINTASA

dTMP

N5 , N10 - METILEN - F H 4

DFH

NADPH + H
DIHIDROFOLATO REDUCTASA

GLICINA
Serina Hidroxi Metil Transferasa o Serina Trans Hidroxi Metilasa

B12
TFH

SERINA

NADP

Fig 8 - 14. a) Accin de la enzima Timidilato Sintasa y Dihidrofolato Reductasa. b) Ciclo de carga del grupo Metilo desde la Serina en el c. Flico.

Tambin inhiben la sntesis del IMP, precursor de ATP y GTP en aquellas reacciones que requieren de c. Flico (Figs. 2 - 14 y 4 - 14) en la sntesis de las Purinas. Ver el Captulo 6 de las Vitaminas. Por otro lado, se puede tambin evitar la sntesis de dTMP mediante la inhibicin de la enzima Timidilato Sintasa (Fig. 8-14) con el empleo de sustratos suicidas (5Fluoruracilo y la 5-Fluordeoxiurudina o 5-FdUMP), ya que se unen irreversiblemente al sitio activo.

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al

672

Hctor Rocha L. DNA

6) REGULACIN DE LA SNTESIS DE LAS BASES NITROGERNADAS. En la Figura 9 - 14, se observa la sntesis general de los Nucletidos destinados al RNA y DNA. La enzima Tiorredoxina Reductasa, esta a cargo de la formacin de los Deoxiribonucletidos, mientras que la Timidilato Sintasa se encuentra encargada de la transferencia de metilo al dUMP para formar dTMP, adems la enzima CTP - Sintasa se encuentra catalizando el paso entre UTP y CTP. Finalmente la Desaminasa cataliza el paso desde dCMP a dUMP.

ESQUEMA DE REGULACIN EN LAS PURINAS Y PIRIMIDINAS

R IB O S A - 5 - P
R IB O S A - 5 - P P IR O F O S F O Q U IN A S A
-

HCO3 + Gln + ATP

CARBAMIL-P SINTASA II

PRPP
UTP
G L U T A M IN A - P R P P - A M ID O T R A N S F E R A S A

CP
C-Asp

ASPARTATO TRANSCARBAMILASA DIHIDRO OROTASA

5 - P - R IB O S IL A M IN A
A D E N IL O S U C C IN A T O S IN T A S A

CTP

IM P

DI-HIDROOROTATO

A D E N IL O S U C C IN A T O

XMP

OROTATO PRPP OMP

DIHIDRO OROTASA DESHIDROGENASA

AMP

GMP

ADP

GDP

UMP

ATP

GTP

UDP

UTP

CTP

Fig 9a 14. Regulacin de las Purinas y Pirimidinas

Fig 9b 14. regulacin de la Pirimidinas

La regulacin de las Purinas (fig. 9a 14), es en gran parte a nivel celular, pero la disponibilidad de PRPP se encuentra controlada por inhibicin de ADP y GDP en la primera enzima de la va metablica. Cuando sube el nivel de estos nucletidos disminuye la actividad de la Ribosa-P Pirofosfoquinasa o PRPP Sintasa. Adems, la segunda enzima de la va Amido Fosfo Ribosil Transferasa (Glutamina PRPP Amidotransferasa), es inhibida por ATP, ADP, AMP y GTP, GDP y GMP. Esta misma enzima es activada por la presencia de PRPP. Por otro lado, el paso donde se produce la bifurcacin de IMP a GMP y AMP, es tambin regulado en forma cruzada. El aumento de ATP estimula la sntesis de GMP y el aumento de GTP estimula la sntesis de AMP.

673

Hctor Rocha L. DNA

La regulacin de la sntesis de las Pirimidinas (fig. 9b 14) es distinta en bacterias y animales. En animales la enzima es multifuncional o bien es un complejo de multiples actividades enzimticas que presenta actividad de Carbamil-P Sintasa (CPS II) en su primera reaccin, que ocurre en el citoplasma a diferencia de la Carbamil Fosfato Sintasa I del Ciclo de la Urea en la mitocondria. La CPS II del citoplasma, es inhibida por UTP, CTP, UDP y dUTP a la vez que es activada por ATP. Otras de las actividades de este mismo complejo son la Aspartato Transcarbamilasa y la Dihidrorotasa. (Fig. 9b - 14). En general la actividad de CPS II es inhibida por UDP y dUTP y , mientras que el ATP y el PRPP la estimulan. Otra enzima de la va biosinttica es la Dihidroorotato Deshidrogenasa, que es estimulada por ATP y PRPP. Por otro lado, la enzima OMP Descarboxilasa u Orotidilato Descarboxilasa (fig. 4 - 14), es inhibida competitivamente por UMP y CMP . Finalmente, la enzima CTP sintasa es inhibida por CTP y activada por GTP. En la figura 10 14 , se puede observar el panorama general de la sntesis de los Nucletidos de Purina y Pirimidina.

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674

Hctor Rocha L. DNA

C O 2 + G ln + A T P

E s q u e m a G e n e r a l d e la S n te s is d e N u c le tid o s y A c id o s N u c l ic o s . C a r b a m il-P S in ta s a II
C O M P LE JO R IB O N U C L E T ID O D i-P -R E D U C T A S A T IM ID IL A T O S IN T A S A

C P S II
UDP U TP dUTP C TP

A s p a r t a to

T r a n s c a rb a m ila s a CTP + ATP

C a r b a m il - P A c . U r e id o S u c c n ic o C T P A c . O r t ic o

d U M P d U D P

d T M P
D E S A M IN A S A

d T T P

U D P U M P
C T P S IN T A S A

+
A s p

d C M P

U D P

U T P

C T P

C D P

d C D P

d CT P

AM P G MP ADP GDP ATP G TP

C O M PLEJO R IB O N U C L E T ID O D i-P -R E D U C T A S A

R N A DN NA A D
P R P P (G lu ta m il) A m id o T r a n s fe r a s a
A T P G T P

P R P P

R -5 - P + ATP

S IN T A S A AM P GMP

AM P G M P ADP GDP ATP G TP

AM P GM P ADP GDP ATP G TP

G M P I M P

G D P

d G D P
C O M PLEJO R IB O N U C L E T ID O D i-P -R E D U C T A S A

d G T P

P R P P

+ G ln

5 - P - R IB O S IL A M IN A

A M P

A D P

d A D P
C O M P LE JO R IB O N U C L E T ID O D i-P -R E D U C T A S A

d A T P

T IO R R E D O X IN A R E D U C T AS A

Fig. 10 - 14. Resumen general de la sntesis de los Nucletidos.

675

Hctor Rocha L. DNA

7) VIAS DE RESCATE PARA LAS PURINAS Y PIRIMIDINAS. Debido a que se estn continuamente formando y destruyendo clulas, lo que implica sntesis y degradacin de DNA y RNA, es necesario un suministro adecuado o pool de bases nitrogenadas tanto de Purinas como de Pirimidinas. En aquellas clulas cuya destruccin esta programada se produce un primer ataque por las Endonucleasas, que cortan los cidos nuclicos en el interior de la cadena, precisamente en los enlaces fosfodiester produciendo Oligonucletidos de distintos largos. Estos son posteriormente atacados por las Fosfodiesterasas, que hidrolizan individualmente las uniones fosfodiester entregando como producto a los 5o 3 Mononucletidos, los que son posteriormente hidrolizados por las 5- Nucleotidasas o 3- Nucletidasas, que eliminan su fsforo para convertirse en Nuclesidos. Sobre estos ltimos, actan las Nuclesido Fosforilasas (fig.10-4), para dejar finalmente a la base nitrogenada sola y una Ribosa-1-P. Esta ltima reaccin, es del tipo reversible y las bases individuales pueden ser tambin recicladas para formar nuevamente un Nuclosido, que bajo la accin de una enzima denominada Nuclesido Quinasa (fig. 11-14) y ATP pueden dar origen a un Nucletido que puede ser integrado a los cidos nucleicos. Las enzimas ADENOSINA FOSFORIBOSIL TRANSFERASA (APRT) e HIPOXANTINAGUANINA FOSFORIBOSILTRANSFERASA (HGPRT) en la figura 11 - 14, son las principales enzimas dedicadas a volver a unir las bases pricas de deshecho a los respectivos azcares. De esta manera se evita que las bases de los nucletidos degradados sean descartadas.

( A P R T ) A d e n o s i n a F o s f o R ib o s il T r a s f e r a s a y ( H G P R T ) H i p o x a n t i n a , G u a n i n a F o s f o r i b o s il T ra n s fe ra s a s
A d e n in a G u a n in a H ip o x a n t i n a + + + P R P P P R P P P R P P A M P G M P I M P + + + P Pi P Pi P Pi

N u c le s id o
N u c l e s id o + + P i A T P

F o s fo r ila s a
B ase N it r o g e n a d a + A M P R ib o s a - 1 - P + A D P

A d e n o s in a ( A d e n in a - R ib o s a )

N u c le s id o
T im i d i n a + ( T im i n a - D e o x i r i b o s a ) U r id i n a + ( U r a c i lo - R ib o s a ) C it id i n a + ( C it o s i n a - R ib o s a ) A T P A TP

Q u in a s a
dT M P UMP + + A D P ADP

ATP

CMP

ADP

Fig 11 - 14. La mayora de las vas de salvataje en los animales no incluyen a las Pirimidinas. La Nuclesido Fosforilasa rompe el enlace Glicosdico entre el Carbono 1 de la Ribosa y la Base Nitrogenada, dejando la base sola y la Ribosa fosforilada en el mismo Carbono 1.

676

Hctor Rocha L. DNA

Por otro lado, en el hombre las Pirimidinas no son recicladas de manera significativa, como ocurre con el salvataje a nivel primario de las Purinas por HGPRT y APRT, adems las Pirimidinas forman compuestos de degradacin solubles sin generar problemas clnicos, como sucede con el c. rico de las Purinas. En todo caso, en las Pirimidinas es importante el salvataje de las Timinas (Fig. 11-14) por la Timina Fosforilasa (Timina + Deoxiribosa-1-P-------Timidina + Pi) y la Timidina Quinasa (Timidina + ATP------dTMP + ADP) que preparan a la clula para entrar en divisin. Volver al inicio

8) DEGRADACION DE LAS BASES NITROGENADAS. Como se vio anteriormente los Nucletidos de las Purinas (Fig. 12 - 14), se degradan primero por accin de una 5'-Nucleotidasa que remueve el fosfato tanto del AMP como del GMP, para luego eliminar en la Adenosina el grupo Amino por una Adenosina Deaminasa dejando a la Inosina, esta posteriormente pierde la Ribosa con una Nucleosidasa dejando Hipoxantina. Esta ltima por medio de la doble actividad enzimtica representada por la Xantina Oxidasa y Xantina Deshidrogenasa, genera Xantina como intermediario para dar finalmente c. rico. La Guanosina (Guanina-Ribosa), (Fig. 12 - 14) pierde a la Ribosa por la Nucleosidasa y la base restante Guanina, por accin de una Deaminasa, se convierte en el compuesto de
O N H Adenosina 2 C N N C CH C C N N HOHC 2 H HO O H C HN HC N HOHC 2 H HO O H H C C

Degradacin de las Purinas

Inosna
N CH N HN O C C C N

Hipoxantina
N CH N H

Adenosina H Deaminasa H
OH

NcleoHC sidasa

NAD

H2O, O2
OH

Xantina Deshidrogenasa
O C

Xantina Oxidasa
2H+, O2HN O C

NADH + H
C C N CH N H HN O C

O C C C N H H N C N H O

O Guanosina C N HN 2 C N HOHC 2 H HO O H H H OH HN 2 C C N CH N

N H

Xantina
O C N C N C C

Ac. Urico

Ncleosidasa

Guanina

Deaminasa
N CH N H

Fig 12 - 14. En la figura 15 14, se observa el paso de Hipoxantina a Xantina y desde esta ltimal c. rico. Este paso es catalizado por dos actividades enzimticas: Xantina Oxidasa, que emplea Agua y Oxgeno para formar Superxido ( O2- ) y Xantina Deshidrogenasa, que emplea NAD como coenzima. Los pjaros eliminan gran cantidad de c. rico, mientras que los primates lo hacen en menor cantidad, eliminando principalmente Urea.

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Hctor Rocha L. DNA

convergencia Xantina. Esta ltima, se oxidada por accin de la Xantina Oxidasa para formar c. rico. En el caso de las Pirimidinas, la Citosina (Fig. 13 - 14), se deamina pasando a formar el Uracilo mediante una reduccin del doble enlace del anillo, produciendo el Dihidrouracilo por medio de la enzima Dihidropirimidina Deshidrogenasa. Este compuesto se descompone luego en c. -Ureido Propinico mediante la accin de la
(1) Dihidropirimi dina Deshidro genasa
NH C N C O N H Citosina NADPH + H CH 3 CH CH N H Timina C C O 2 NH 3 HN C N H Uracilo NADP

Catabolismo de las Pirimidinas

NADPH + H NADP

O C C C O HN C

O C

(2) Dihidropiri midinasa

HO 2 CH 2 CH 2 O HN 2 C

Ureidopro pionasa
COOH HO 2 CH 2 CH N H 2 + CO + NH 2 4 + H N CH C H C O O H 2 2 2

N H Dihidrouracilo

Ac. Ac.-Ureidopropinico

-Alanina Ureidoisopro pionasa

O C HN C O

O C CH 3 HO 2 COOH HN 2 C CH

HN C

CH CH

CH 3 HO 2

2 (1) O N O N Dihidropi H H rimidina Ac. -Ureido isobutrico Ac. Deshidro Dihidrotimina genasa (2) Dihidropiri midinasa

C H2

+ CO + NH 2 4 + HN CH C H C O O H 2 2 CH 3

Ac. -Amino Isobutrico

Fig. 13 - 14. El Amonio de las pirimidinas se excreta como UREA, mientras que los esqueletos hidrocarbonados pueden degradarse en el CTC. En (1) y (2) se observan los mismos pasos.

Dihidropirimidinasa para dar finalmente - Alanina, CO2 y NH4 por accin de la Ureido Propionasa. La - Alanina puede ir a la sntesis de CoASH o bien despus de algunas transformaciones se puede convertir en Acetil-SCoA para entrar al CTC. Por otro lado, la Timina (Fig. 13 - 14) al no contar con un grupo Amino, se degrada por reduccin con NADPH (igual que la Citosina) a Dihidrotimina y posteriormente se transforma + en c. -Ureidoisobutrico. Este ltimo se descompone en CO2, NH4 y c. Aminoisobutrico. Este ltimo se puede transformar despus de varios pasos en SuccinilSCoA y entrar al CTC. En el caso de las aves, primates, reptiles e insectos estos producen c. URICO, mientras que otros vertebrados forman ALANTOINA (Fig. 14 - 14).

678

Hctor Rocha L. DNA

Los peces telesteos eliminan Alantoato y los anfibios junto a los peces cartilaginosos eliminan solo UREA. Finalmente, los invertebrados marinos llevan a cabo toda la va degradativa y ms completa y eliminan solo CO2 y NH+4 directamente al medio.

OH C N HO C N C C N

AC. URICO EN PRIMATES PAJAROS, REPTILES E INSECTOS

C N H OH 1/2 O

+ HO 2 H N C C H N H O HO 2 NH 2 C N H O C OH NH 2 O C C H O H N 2 COOH H CHO O HN 2 C N H2 HO 2 CO 2 + NH 4

CO

ALANTOINA EN ALGUNOS VERTEBRADOS

O

2 O C

NH 2 C N H

ALANTOATO EN PECES CON ESQUELETO

UREA EN ANFIBIOS Y PECES CARTILAGINOSOS AMONIO EN INVERTEBRADOS MARINOS

Fig. 14 - 14. Distintas especies excretan diferentes productos nitrogenados.

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679

Hctor Rocha L. DNA

9) ALGUNOS PIRIMIDINAS.

TRASTORNOS

DEL

METABOLISMO

DE

LAS

PURUNAS

I ) En el caso del metabolismo de los Nucletidos de las Purinas algunas enzimas involucradas pueden fallar provocando los siguientes problemas:

Cuando falla la enzima enzima Xantina Oxidasa (XO) o la Xantina Deshidrogenasa (XDH) tenemos: a) Gota Falla la Se produce por la acumulacin e insolubilidad del c. rico o Hiperuricemia (acumulacin de c. rico en la sangre) por sobre 7 mg/dl. Las manifestaciones clnicas aparecen por la precipitacin de cristales de Urato de sodio en el lquido sinovial de las articulaciones especialmente dedo gordo del pi (Podagra), esto produce inflamacin y artritis de la articulacin. Surge en general por exceso de Purinas o una deficiencia parcial de la HGPRT. Se trata con Alopurinol, el cual es un ismero de la Hipoxantina y a la vez inhibidor competitivo de la Xantina Oxidasa.

Hipoxantina

Alopurinol

Por otro lado la Gota juvenil o nefropata hiperuricmica, ocurre tanto en hombres como mujeres y es de naturaleza fatal. El defecto bioqumico se desconoce hasta la fecha. b) Falla de Xantina Deshidrogenasa (XDH) que provoca la Xantiuria Hereditaria La enzima XDH presente en el Hgado y la Mucosa intestinal cataliza la degradacin de Hipoxantina a Xantina y de esta ltima a c. rico, emplea NAD como coenzima. La enzima requiere de cofactores como Molibdeno (Mo), FAD y Hierro (Fe). La enzima tiene una baja actividad o es inexistente en Homocigotos con deficiencia de XDH. En estos casos se acumula Xantina, ya que Hipoxantina es empleada en la va de salvataje. La deficiencia en la absorcin de Molibdeno tambin se traduce en una acumulacin de Xantina. Todos estos problemas se manifiestan con transtornos renales agudos a la edad de 8 aos. c) Deficiencia de Adenina Fosforibosil Transferasa (APRT) Se encuentra en todo el organismo principalmente en el ncleo. Tiene dos diferencias Tipo I en caucsicos y Tipo II en Japoneses con una Km 10X superior a la primera. Se acumula como 8-Hidroxi adenina y 2,8-Dihidroxiadenina que es muy insoluble produciendo falla renal en infantes. Esta enfermedad tiene un amplio espectro y puede ir desde clculos a temprana edad hasta pasar inadvertida sin afectar la calidad de vida de la persona.

680

Hctor Rocha L. DNA

d) Deficiencia de Hipoxantina Guanina Fosforibosil Transferasa (HPGPRT) La falla en la enzima HGPRT de la figura 9-14 o la falta de su expresin, provoca en los nios el sndrome de Lesh-Nyhan. Esta enfermedad se caracteriza por altos niveles de c. rico en la sangre y una descontrolada sntesis de novo (cerca de 20 veces) en la va de las purinas. Estos transtornos son acompaados por artritis, gota una alta agresividad a la edad de dos aos, acompaada con episodios de automutilacin debido a la ingestin de su propia lengua y dedos. En esta enfermedad se encuentra deteriorado el sistema nervioso, ya que el rescate de Purinas es en gran medida empleado por el cerebro durante su desarrollo. Esto ltimo explicara en parte el comportamiento aberrante de los pacientes. e) Superactividad de Fosforibosil Pirofosfato Sintasa (PRPS) Pasa Pirofosfato desde ATP hasta Ribosa-5-Fosfato y se encuentra ligado al cromosoma X con Gota severa y clculos en los riones en adolescencia o antes de la edad adulta.. La enzima es reguladora y se encuentra sometida al efecto de diferentes nucletidos como productos finales de las distintas vas que se derivan ms adelante. f) Deficiencia de Purina Nuclesido Fosforilasa (PNP). Causa una inmunodeficiencia por afectar la reproduccin de los Linfocitos T y B. g) Deficiencia de Adenosina Deaminasa (ADA). Es causada por la falla en la enzima Adenosina Deaminasa que convierte Adenosina en Inosina, ver figura 11-14. Cuando falta la enzima, el sustrato Deoxiadenosina se acumula y se fosforila para formar dATP en grandes cantidades. Como en los Linfocitos son altas las enzimas de salvataje incluyendo a la Nuclesido Kinasas, ver figura 10-14, las altas concentraciones de dATP inhiben a la Ribonucletido Reductasa (fig. 6-14), evitando que otros dNTP sean formados. El efecto de la falta de dNTPs, conduce a la incapacidad de divisin de las clulas precursoras y destruccin de los Linfocitos T y B de los cuales depende la respuesta inmune. Esta enfermedad es fatal en la infancia. h) Deficiencia de Mioadenilato Deaminasa (MAD) Cataliza el paso de Deaminacin de AMP a IMP, son 4 isoenzimas con mxima actividad en msculo esqueltico. Su falla produce calambres musculares y mialgia el exceso de Amonio producido neutraliza la produccin de cido Lctico. Se incrementa la Gliclisis. i) Deficiencia de Adenilo Succinato (ADS). j) La enfermedad de Von Gierke en el metabolismo de la Glucosa (falla Glucosa-6Pasa), produce un exceso de Glucosa-6-P, la cual se dirige a la Va de las Pentosas y finalmente a la formacin de un exceso de Ribosa-5-P y consecuentemente a un posterior exceso de PRPP (Ribosa activada), lo que lleva a su vez a tener un exceso de Purinas, con las dificultades que esto trae consigo, como es el caso de una Hiperuricemia.

681

Hctor Rocha L. DNA

II) En el caso del metabolismo de los Nucletidos de Pirimidina pueden fallar algunas enzimas provocando los siguientes desrdenes:

a) Aciduria Ortica hereditaria: Se produce cuando falla el complejo (UMP sintasa) que mantiene a las actividades enzimticas conocidas como la enzima (4), Orotato Fosforibosil Transferasa (OFRT) y la enzima (5) Orotidilato Descarboxilasa en la figura 4 14 y 15-14. Esta enfermedad es responsable de inhibicin del crecimiento junto a una anemia severa. Esto se debe a que se forman eritrocitos hipocrmicos junto a una medula megaloblstica (no hay bases para que se replique el DNA). Leucopenia es tambin comn. Se trata con Uridina y con Citidina, que conducen a un aumento en la formacin de UMP por las Nuclesido Kinasas. A su vez el UMP inhibe a la Carbamil-Fosfato Sintasa del citoplasma atenuando la produccin del c. Ortico, precursor de las Pirimidinas. b) Deficiencia de la enzima (1) Dihidropirimidina Deshidrogenasa (DHPD) en la figura 13 14 y 15 - 14. Se caracteriza por una excrecin aumentada de Uracilo y Timina en la orina. Ocurre tanto en adultos como nios acompaados por desordenes y malformaciones neurolgicas respectivamente. Estos problemas se deben al defecto en la primera de las tres enzimas que degradan las Purinas, DHPD, que normalmente acta catalizando el paso limitante y emplea a la coenzima NADPH como fuente de protones para reducir el anillo de la Pirimidina. Esta enzima tambin limita la efectividad del compuesto anticancergeno 5-Fluoruracilo al destruirlo. c) Deficiencia de (2) Dihidropirimidinasa. Ver figuras 13 14 y 15-14. Enzima que cataliza la abertura del anillo de Pirimidina, para formar c. -Ureido Propinico y c. -Ureido Isobutrico, tanto en la va de degradacin de la Citosina como de la Timina respectivamente. El aminocido -Alanina es un producto final de estas vas y se le considera como neurotransmisor putativo (puede ser y puede no ser) y su falta provocara transtornos nerviosos en infantes con 6 a 8 semanas de edad. d) Deficiencia Pirimidina-5- Nucleotidasa (PMNA).Ver figura 15-14. Cataliza la hidrlisis de los Nucletidos de Pirimidina por medio de dos actividades isoenzimticas: Uridina Monofosfato Hidrolasa (UMPH1) 1 y (UMPH2) 2, la 1 hidroliza UMP a Uridina y CMP ms dCMP a Citidina y la 2 hidroliza dUMP a Uridina y dTMP a Timidina. La mayor parte de la actividad se encuentra en la UMPH1. Cuando esta falla en homozigotos se observa anemia hemoltica acompaada de esplenomegalia y colelitiasis (formacin de clculos biliares en coldoco). Altos niveles de Bilirrubina son tambin comunes.

e) Deficiencia de CDP-Colina Fosfotransferasa

682

Hctor Rocha L. DNA

Se produce una acumulacin de CDP-Colina al fallar el paso de CDP-Colina + Diacilglicerol para dar Fosfatidilcolina (Lecitina) y CMP. Esta acumulacin ocurre en eritrocitos y produce hemlisis crnica acompaada de ictericia y esplenomegalia.
RNA ATP ADP ADS AMP APRT AMPS MAD ADENOSINA ADA INOSINA HGPRT GUANOSINA HGPRT ADENINA METILTIO ADENOSINA POLIAMINAS PNP HIPOXANTINA S-ADENOSIL HOMOCISTEINA XDH XANTINA XDH PNP IMP XMP GMP dATP AMPc DNA R - 5- P PRPS PRPP ADS ITP dGDP DNA RNA GMPc GTP

GDP

8-HIDROXI ADENINA XDH 2,8 HIDROXI ADENINA

XDH

GUANINA

S-ADENOSIL METIONINA

AC.URICO

Fig 15 14. Vas de catabolismo, sntesis y salvataje de las purinas en el hombre

ENZIMAS DE LA FIGURA 15-14: XDH: XANTINA DESHIDROGENASA APRT: ADENINA FOSFORIBOSIL TRANSFERASA HGPRT: HIPOXANTINA GUANINA FOSFORIBOSIL TRANSFERASA PRPS : FOSFORIBOSIL PIROFOSFATO SINTASA PNP: PURINE NUCLEOTIDO FOSFORILASA ADA: ADENOSINA DEAMINASA ADS: ADENILO SUCCINASA MAD: MIOADENILATO DEAMINASA

683

Hctor Rocha L. DNA

CICLO NH4+ GLUTAMINA DE LA Carbamil-P UREA Sintasa 1 y 2 CARBAMIL-P + ASPARTATO DNA CDP- DIACILGLICEROL RNA dCMP AC. OROTICO OFRT OMP dCMP CMP PMNA ODC PMNA PMNA URIDINA CITIDINA URACILO CITOSINA DHPD DIHIDROURACILO DHPA -UREIDOPROPINICO DHPD DIHIDROTIMIDINA DHPA -UREIDOISOBUTRICO TIMINA TIMIDINA UMP dUMP dTMP CDP- DIACILGLICEROL RNA UTP dUTP DNA

dCDP

CDP

UDP

dUDP

dTDP

-AMINOISOBUTRICO -ALANINA Fig 16 14. Vas de sntesis, catabolismo y salvataje de las Pirimidinas en el hombre.

ENZIMAS DE LA FIGURA 16-14:

OFRT ODC DHPD DHPA PMNA

inicio

: OROTATO FOSFORIBOSIL TRANSFERASA : OROTIDILATO DESCARBOXILASA : DIHIDROPIRIMIDINA DESHIDROGENASA : DIHIDROPIRIMIDINASA : PIRIMIDINA-5-NUCLEOTIDASA

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10) DNA

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Hctor Rocha L. DNA

La doble hebra duplohelicoidal (Fig. 17 - 14), puede tener varias grados de organizacin al igual que una protena. Por lo tanto se describen en ella las siguientes estructuras:
a) La estructura primaria, depende del orden y secuencia de las bases nitrogenadas que se encuentran unidas al carbono 1' de las Deoxiribosas, tanto por el Nitrgeno ubicado en la posicin 9 de las Purinas como por el Nitrgeno ubicado en la posicin 1 de las Pirimidinas. La disposicin del Deoxiribonucletido es del tipo SIN, es decir la deoxirribosa y la base nitrogenada se encuentran hacia el mismo lado, mientras que el arreglo duplohelicoidal de la doble hebra se forma debido a que la Deoxiribosa no opone impedimento estrico al acomodarse la doble hebra con una torsin hacia la derecha por la falta de su 2'- OH. En cada una de las hebras los Deoxiribonicletidos se encuentran unidos entre s por los enlaces FOSFODIESTER, llamados as por ser los enlaces entre el carbono 5'- OH que porta el fosfato cido Alfa con el carbono 3'- OH del Deoxiribonucletido siguiente. b) La estructura secundaria, consiste en la interaccin mediada por enlace Hidrgeno entre las bases nitrogenadas de cada una de las hebras que se encuentran dirigidas hacia el interior de la hlice. Dos enlaces hidrgeno para la interaccin A-T y tres enlaces hidrgeno para la interaccin G-C. Entre las bases apareadas existe una pequea desviacin del plano horizontal que las hace ver como las aspas de una hlice. Adems cada una de la hebras esta dispuesta en sentido antiparalelo de 5'a 3', mientras que las bases de cada hebra se encuentran apiladas hacia el interior unas sobre otras y se relacionan por medio de la interaccin hidrofbica. c) La estructura terciaria depende de lav interaccin con las Histonas. Estas son cerca de 5 protenas que poseen cargas (+) debido a la presencia de Lisinas y Argininas en su

5'
EXTREMO

3' 5'
HO
N N

H N

CH OH

CH

N 2 N

3'

EXTREMO

H O

H
ENLACE

O O P O
N

CH

FOSFO

O H N H O
N

ENLACE

P O

FOSFO DIESTER

DIESTER

H
N

N N N

CH

H O CH
2

3'

EXTREMO

3'

HO

OH

5'

EXTREMO

5'

Fig. 17 - 14.Representacin de la estructura bsica del DNA.

685

Hctor Rocha L. DNA

secuencia. Estas protenas se organizan en los complejos (H2A-H2B)2, (H3)2 y (H4)2 formando un octmero (Fig. 18 - 14), que posee ciertas hendiduras especficas que interaccionan con las cargas negativas de los fosfatos expuestos en los surcos del DNA. La molcula de cido nucleico se encuentra en este caso superenrrollado y procede a dar dos vueltas en el complejo del carrete de Histonas, mientras que su entrada y salida se encuentran protegidas por la Histona H1.
HISTONAS
Interaccionan electrostticamente con el DNA

HA
2 Oct'amero : (H ) 3 (H ) 4

HB
2

2 2

H1 Histona protectora del carrete : H1

H1

H1

H 4

Histona que interaca con protenas activadoras y silenciadoras de los genes

Fig 18 - 14. Empaquetamiento de las Histonas para formar el Nucleosoma.

El complejo DNA-Histona es denominado Nucleosoma y su formacin se encuentra regulada por la interaccin del amino terminal de la histona H4 con los factores proteicos activadoras o silenciadoras que modulan la expresin de los genes. La histona H4 mediara la estabilidad del Nucleosoma, ya que al entrar en contacto con un factor activador , se producira la descomposicin del Nucleosoma para dejar al DNA desnudo, con su promotor expuesto listo para su transcripcin. En caso contrario al interactuar el Nt de la Histona H4 con una protena silenciadora se formara esta vez el nucleosoma ocultando al promotor. Al continuar con la organizacin estructural del DNA, encontramos que la agrupacin de nucleosomas es denominada polinucleosomas. Estos a su vez forman estructuras compactas denominadas solenoides los que son parte de las hebras o la cromatina del cromosoma mismo.

d) DNA tipo B

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Hctor Rocha L. DNA

La doble hebra de DNA desnudo puede tener distintas formas y entre ellas encontramos al DNA B o clsico de Watson y Creek. Este se caracteriza por tener la torsin duplohelicoidal hacia la derecha y mostrar profundas hendiduras mayores y menores en sus costados debido a que el carbono C 2 de la Deoxiribosa se encuentra en la forma ENDO. Esto significa que al comparar la deoxiribosa con un sobre, uno de sus vrtices se encuentra levantado, es decir por arriba del plano del resto de los otros vrtices o carbonos del anillo.

e) DNA tipo A

Entre las otras formas tenemos al DNA tipo-A con torsin hacia la derecha, pero que se forma cuando la humedad baja del 75% y es ms ancho y corto por vuelta debido al plegamiento que sufre en este caso la Deoxiribosa. El azcar aqu es del tipos C 3' ENDO. Este plegamiento hace que los pares de bases que se encuentran apareados en el centro se inclinen respecto al eje central, mientras que la disposicin entre las Deoxirribosas y las bases nitrogenadas ser del tipo ANTI u opuesta. Estos arreglos hacen desaparecer la hendidura menor, tpica del DNA B y desfavorece la unin de las molculas de agua a los fosfatos.

f) DNA tipo Z

Este otro tipo de DNA se encuentra en las secuencias alternadas de C y G, las que se acomodan con una torsin hacia la izquierda donde los fosfatos presentan un ordenamiento de ZIG-ZAG junto a una hendidura lateral profunda. En el DNA Z las bases nitrogenadas son capaces de girar 180o y pasar de la forma Syn a la Anti. Esto significa que la estructura cambia desde la forma en que la D-Ribosa y la Base Nitrogenada se encuentran a un mismo lado, a la forma en que la D-Ribosa y la Base Nitrogenada se encuentran opuestas una a la otra. A pesar de que este tipo de estructura no es termodinmicamente favorable, suele ocurrir por la metilacin de las citosinas en el carbono 5. Finalmente se puede agregar que las tres formas de DNA descritas aqu, ms otras que se vern a continuacin son estructuras promediadas. Esto significa que el pozo de energa que define la estabilidad de cada una de sus formas estructurales no es lo suficientemente profundo y permite variaciones dinmicas a lo largo de las estructuras propuestas. El hecho de definirlas como estructuras fijas sera como tomarles una foto con un "flash" en determinada etapa de su movimiento y encontrarlas solo en la estructura ms probable dadas las condiciones del momento. A continuacin en la Tabla 1 - 14, se pueden observar las caractersticas de los distintos tipos de hlices:

TABLA 1 14

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Hctor Rocha L. DNA

A Forma Incidencia

Ms ancha DNA natural y sinttico

Intermedia DNA natural y sinttico 34nm

Ms elongada DNA alternado de purina y pirimidina 38nm

Elevacin por par de 23nm bases Dimetro Hlice Sentido Enlace Glicosdico

255nm Derecho "anti"

237nm Derecho "anti"

184nm Izquierdo "anti" para C,T y "sin" para G 12

Pares de bases por vuelta Altura por vuelta

11

10.4

246nm

322nm 1o

456nm 9o

Inclinacin desde el 19o eje normal Hendidura Mayor

Estrecha y muy Profunda Muy ancha y superficial

Ancha y Profunda

Sin surco plana

Hendidura Menor

Estrecha y Profunda

Muy estrecha y profunda

En la figura 19, 20 - 14, aparecen representadas las tres formas del DNA. Existen an otras dos formas ms del DNA. Estas son el: DNA C con 9,3 pb/vuelta a la derecha y 33nm de elevacin por cada par de bases, frecuente en modelos dshidratados de DNA natural y sinttico. El DNA D con 8pb/vuelta a la derecha mayormente encontrado en el DNA sinttico de secuencia ATATAT y con 30 nm de elevacin por cada par de bases. Otra forma extra corresponde al DNA T presente solo en bacterifagos. Cmo se di a entender anteriormente las distintas formas del DNA estaran ligadas al reconocimiento especfico que ocurrira por protenas activadoras y silenciadoras de los genes, junto al reconocimiento de ciertos tipos de DNA por receptores hormonales que actuaran controlando la expresin al reconocer, no solo secuencias especficas, sino que tambin diferentes formas y tipos en que se acomoda la doble hlice. Por otro lado las distintas formas del DNA dependeran de las secuencias que se encuentran presentes en el y de su capacidad para adaptarse a los cambios inducidos por el medio, donde son de importancia el grado de hidratacin, la salinidad del medio, el pH y la presencia de otros factores involucrados en la expresin de los genes. Por ejemplo un espcimen

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Hctor Rocha L. DNA

adaptado a alta temperatura tendra un mayor nivel de secuencias GC para mantener la estabilidad de la doble hebra y favorecer con ello una de las formas promedio que puede tomar el DNA. Volver inicio
11) DNA CRUCIFORME

al

Ocurre cuando aparece una secuencia repetitiva de tipo recproca, en que para una secuencia dada de bases le sigue otra complementaria de orden inverso lo que se denomina palndrome. La estructura cruciforme se representa aqu por un trbol de dos hojas u horquillas: C T G A T T 5' AGCCTGA 3' TCGGACT A A T C G A T A A TCGGCCT 3' AGCCGGA 5' T T A T A

Esta forma con simetra bicatenaria en el DNA tambin puede servir de reconocimiento para algunas protenas que controlan la expresin de los genes. Hbridos DNA-RNA. Estas formas hbridas seran similares al DNA tipo A con 11 a 12 pares de bases por vuelta. Sin embargo segn la secuencia de bases que se apareen pueden llegar incluso a ser polimrficas. Estos hbridos estaran involucrado en el control de la expresin de los genes. Volver inicio
12) DNA PRESENTE EN MITOCONDRIA, CLOROPLASTOS y DNA VIRAL.

al

El DNA mitocondrial humano tiene solo 16,569 kB y es cerca del 1% del DNA nuclear. Codifica para cerca de trece genes estructurales sin intrones y 22 molculas de RNA en total que son del tipo de transferencia y ribosomal. Entre las protenas que codifica estn algunas subunidades de la Citocromo Oxidasa del Complejo IV de la Cadena Respiratoria, el Citocromo b del Complejo III y algunas subunidades de la ATP Sintasa incluyendo el canal de los protones en la parte Fo. El DNA mitocondrial se encuentra en su mayor parte desnudo sin histonas y es similar en todos los vertebrados con un peso de 15 a 20 kD, sin embargo difiere con el DNA de los no vertebrados representado por las plantas, cuyo DNA mitocondrial tiene de 218.000 a 2.400.000 nucletidos de extensin. Esto no significa un mayor nmero de

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genes codificadores, sino que pueden ser incluso los mismos genes que se hallan en el DNA mitocondrial de los vertebrados, pero en este caso acompaado de grandes trozos de DNA no codificante entre ellos. Los genes mitocondriales son de herencia exclusiva materna y se han empleado en la actualidad para trazar los orgenes de las distintas razas. Cada persona hombre o mujer porta el DNA mitocondrial de su madre.

Fig 19 - 14. Modelos de algunas de las conformaciones del DNA representadas por la unin de los tomos de fsforo, mientras que los segmentos horizontales indican la posicin de los pares de bases.

De esta forma en la mitocondria se encuentran codificadas solo un pequeo nmero de protenas que ejerce una funcin esencial, mientras que la mayora de las otras proviene de los cromosomas nucleares. Las protenas de origen nuclear se transportan a la mitocondria por medio de un complejo sistema de seales que se encuentra en la secuencia misma, para de esta manera integrarse con las protenas de origen mitocondrial una vez cortada la seal que les premiti entrar a la mitocondria. El Cloroplasto tambin cuenta con un DNA ms pequeo que el del ncleo y con su propio sistema de transcripcin y traduccin. Al igual que la mitocondria, no fabrica todas las protenas que necesita, por lo tanto se importan del citoplasma las subunidades proteicas o las enzimas que necesita y cuyos genes forman parte del genoma de la clula. Los virus tienen su material gentico en el interior de una envoltura o cpside y no son capaces de expresar esta informacin por lo que deben infectar bacterias para usurpar la maquinaria de la Traduccin y Transcripcin. Algunos permanecen largo tiempo integrados al genoma nuclear y se expresan posteriormente, mientras que otros codifican para elementos de control de la expresin en los genes normales que se han vuelto silentes en los Eucariontes durante la ontogenia.

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Hctor Rocha L. DNA

ig. 20 - 14. Distintos largos entre DNA A, el ms corto, B y Z el ms extendido respectivamente.

El virus de la gripe tiene 8 cadenas de RNA de 800 a 5000 nucletidos. El virus de la hepatitis B con tiene una doble hebra de DNA de solo unos pocos miles de pares de bases. Los virus RNA se pueden expresar inmediatamente pasando la informacin a una protena empleando su RNA como RNAm. Mientras que otros generan otra cadena de RNA complementario que ser el verdadero RNA mensajero. En el caso de los RETROVIRUS, estos generan un DNA a partir de su RNA por la accin de la Transcriptasa Inversa codificada en su propio gen. Este DNA se integra al genoma de la clula husped donde puede estar silente, es decir se comporta como integrante del DNA o bien se puede expresar causando enfermedades como tumores en animales o el SIDA en los humanos. Los Retrovirus son an capaces de arrancar elementos de control de los genes de una clula husped y en una posterior infeccin controlar la expresin de un gen que ha sido silenciado durante los eventos normales correspondientes al desarrollo y diferenciacin celular. Este mecanismo de accin ocurre con los proto-oncogenes, los que codifican para algunas Protenas Quinasas que controlan la actividad de ciertas vas metablicas de las clulas y que estn a su vez relacionadas con los efectos causados por algunas hormonas. De esta manera tejidos que no responden a una hormona despus de diferenciados, lo empiezan a hacer nuevamente con posterioridad a la infeccin con un retrovirus que porta un oncogen. Por este mecanismo reaparece la multiplicacin celular e indiferenciacin lo que se denomina usualmente como cncer. Afortunadamente esta ltima forma de infeccin viral ocurre principalmente en animales y no ha sido del todo comprobada en los humanos. Volver inicio al

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Hctor Rocha L. DNA

13) PROPIEDADES DEL DNA. a) En solucin:

El DNA forma soluciones viscosas en agua segn el grado de denaturacin que presente. A mayor denaturacin presentar mayor viscosidad. La viscosidad disminuye cuando se fragmenta el DNA.
b) Temperatura:

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Hctor Rocha L. DNA

La temperatura produce la "fundicin" o separacin de ambas hebras. La Temperatura de fusin 50 o Tf50, es la constante que indica la Temperatura a la que el 50% del DNA duplohelicoidal se ha separado en sus hebras individuales (Fig. 20a - 12). La Tf50 variar con la composicin de las bases, as a mayor % de GC se tendr un mayor Tf50 y a mayor % de AT una menor Tf50 .

c) Hibridacin del DNA.

Las hebras individuales o separadas del DNA duplohelicoidal pueden unirse nuevamente entre s o con otras hebras homlogas al bajar gradualmente la temperatura (Fig. 20a - 14). La reasociacin del DNA se estudia por la ecuacin de la figura 20b-14, que relaciona de manera inversamente proporcional la fraccin f de DNA monofibrilar con su concentracin inicial y el tiempo de asociacin. En la figura 20c - 14, se observa en forma numerada del 1 al 4 la cintica de reasociacin de secuencias cada vez ms heterogneas. La curva 1 corresponde al DNA repetitivo o con un alto % de GC alternadas, mientras que la curva 4 corresponde al DNA heterogneo. Las curvas 2 y 3 corresponden a DNA entremezclado de repetitivo y heterogneo. Este efecto permite estudiar casos de secuencias repetitivas, donde ambas hebras pueden unirse en forma desfasada y no necesitan alinearse de manera estrictamente opuesta o bien el caso de secuencias heterogneas donde ambas hebras deben aparear en solo una posicin como ocurre entre una llave y una cerradura.
A)
D N A fragmentado me Desnaturalizacin Trmica T o C Reasociacin al bajar la Temperatura k

B]

: fraccin de molculas de una sola hebra

C)

f
+

1 = 1 + k C ot

1,0 0,5

f = fracci'on de mol'eculas monofibrilares k

k =

Cte. de Velocidad de reaccin

10

-- 4

10

Co t

C o = Concentracin del DNA t = tiempo

Fig 20a - 14. Separacin y reasociacin de hebras del DNA. Fig 20b - 14. Cintica de reasociacin de las hebras del DNA Fig 20c - 14. Reasociacin del DNA.

Por el anlisis anterior se puede estudiar el grado de parecido entre un gen y sus similares dentro de una misma especie y tambin entre dos especies distintas. Mientras mejor aparee el DNA monocatenario de una especie con la hebra de la otra especie, ambas estarn

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Hctor Rocha L. DNA

mayormente relacionados entre s. De esta forma se ha demostrado que el Chimpanc pigmeo difiere del hombre en solo un 1% de sus secuencias y que el Orangutn difiere en un 4,5%, siendo el ms distinto. El DNA repetitivo que se encuentra cerca de los centrmeros del cromosoma es de tamao pequeo e hibridiza mucho ms rpidamente que aqul de largo tamao y heterogneo. Este DNA se emplea en la actualidad en pruebas de paternidad al estudiar la fragmentacin de sus trozos por medio de enzimas restrictivas (solo cortan el DNA doble hebra en un centro de simetra bicatenaria) y electroforesis entre los posibles familiares y no familiares del vstago.

d) Absorcin de luz:

Las bases nitrogenadas absorben luz UV a 260 nm (Fig. 21 - 14) y el grado de absorcin aumenta cuando una doble hebra en solucin, se descompone exhibiendo sus bases nitrogenadas a la luz incidente. Este efecto se conoce como Hipercrmico. En el caso contrario cuando se baja la temperatura de un DNA que se encuentra separado, se produce el efecto Hipocrmico, ya que ambas hebras se aparean nuevamente y ocultan sus bases disminuyendo la absorcin de la luz UV.

e) Reparacin del DNA.

El DNA puede sufrir ya sea lesiones de origen exgeno por el medio ambiente que lo rodea y tambin del tipo endgeno. Este ltimo ocurre cuando el apareo entre las bases no es correcto, es decir las DNA pol I y III introducen un error en el apareo de las bases con un promedio de 1 en un total de 104 bases. Sin embargo se ha descubierto que casi todas las DNA polimerasas de origen bacteriano tienen una actividad correctora por la que reparan las secciones mal apareadas del DNA. Este tema se abordar ms adelante.

A bs.

E fe c to H ip e r c r m ic o E fe c to H ip o c r m ic o

220

260

280

( nm )

Fig 21 - 14. El DNA de una sola hebra absorbe mayor cantidad de luz UV que el DNA duplohelicoidal por tener sus bases descubiertas.

f) Daos que puede experimentar el DNA.

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La doble hebra no es inmutable y puede experimentar una serie de modificaciones fsicoqumicas que en caso de no ser reparadas acarrean una modificacin en el control o la expresin de los genes. En la Tabla 2-12, se pueden observar algunas de las lesiones a que se encuentra expuesto el DNA.
TABLA 2 - 14 Lesin del DNA Perdida de una base CAUSA Remocin por medio cido o temperatura. 2x104 purinas/clula da en eucarionte a 37oC. Radiacin ionizante GAMA, agentes alquilantes, diol epxidos derivados del cigarrillo. Deaminaciones espontaneas: C-->U, A->Hipoxantina Agentes qumicos que se intercalan, Ej.:Acridina Radiacin U.V. Radiacin ionizante, tipo o rayos X

Base alterada

Base incorrecta Delecin/Insercin Dmeros de Timina Ruptura de las Hebras

g) Mutaciones en el DNA.

Las mutaciones (Figs. 22-14 y 23-14) que cambian el marco de lectura para la sntesis de una protena pueden ser por delecin o la insercin de una base en la secuencia de la hebra. Otro tipo de mutaciones solo afectan a un solo triplete y se traducen en un solo aminocido cambiado en la protena y su mecanismo es por transicin, en que una Purina se cambia por otra Purina o transversin en que se cambia una Purina por una Pirimidina o viceversa.

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Hctor Rocha L. DNA

TIPOS DE MUTACIONES .
A) AUG UUU UCU UAU CGG AAG GAA GUU GAA CCU UAA
CODON DE INICIO CODONES DE

: AUG

Met - Phe- Ser - Tyr - Arg - Lys - Glu - Val - Glu - Pro U

: UAA UAG UGA

TERMINO

INSERCION
B) AUG UUU UCU UAU CGG AAG GAA GUU GAA CCU UAA AUG UUU UCU UAU CGG AAU GGA AGU UGA

Met - Phe- Ser - Tyr - Arg - Asn - Gli - Ser

A

DELECION
C) AUG UUU UCU UAU CGG AAG GAA GUU GAA CCU UAA AUG UUU UCU UAU CGG AGG AAG UUG AAC CUU

Met - Phe- Ser - Tyr - Arg - Arg - Lys - Leu - Asn - Leu - ETC - ETC

Fig. 22 - 14. a) Secuencia normal de un gen. b) Se produce la insercin de Uracilo en el triplete AAG que pasa a AAU-G. c) El triplete AAG pierde Adenosina y pasa a ser AG-G.

A continuacin se explica detalladamente cada una de estas mutaciones y se puede empezar analizando las que ocurre cuando se introduce una base como Citosina* en el lado 3' de la hebra cebadora. La Citosina no aparea con la Adenina de la hebra Templada: 3' A G C T G C A C T A G 5' Hebra Madre 5' T C G A C G C*- - - - - 3' Hebra Hija En este ejemplo la base mal apareada puede ser removida junto con otras vecinas por la capacidad exonuclesica 3'--> 5'de la DNA pol I o la DNA pol III de E. Coli y el sitio puede ser repavimentado con la base correcta. Esta capacidad es tambin denominada EDITORA en las DNA pol bacterianas y animales. Otro ejemplo de mutacin ocurre cuando una molcula plana como el Benzopireno (alquitrn de cigarrillo) o las Aminas cclicas (carne a las brazas) se intercalan en el DNA separando las bases. En estos casos se produce una mutacin por cambio del marco de lectura. Esto significa que una protena puede ser normal en su secuencia aminoacdica hasta el punto de la mutacin y desde este lugar se salta en la lectura una o dos bases por la presencia de la molcula fornea que se encuentra intercalada en la secuencia. De esta manera la protena es totalmente distinta desde el triplete de la mutacin en adelante y en este caso la secuencia anormal puede en algunos casos detenerse prematuramente cuando se forme el codn que no codifica para ningn aminocido (debido al desfasamiento de la lectura) o continuar an ms all de su terminacin normal, hasta que se forme alguno de los codones de terminacin por similar razn a la anterior.

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Hctor Rocha L. DNA

Igual cosa ocurre si se intercala una base extra en una de las hebras como se observa en la figura 19 - 14, donde la secuencia desde el lugar de la mutacin en adelante es distinta a la original. Mutaciones por Delecin ocurren cuando se pierde una base por Depurinacin espontanea, la que puede ser llevada a cabo por la Temperatura o la acidez del medio. En este caso se pierde el marco de lectura, ya que la base que falta para la lectura de un triplete se toma del siguiente alterando la protena desde aqu en adelante en su secuencia (Fig. 19 - 14). En el caso de mutaciones por Transversin, es decir el cambio de una Purina por una Pirimidina o de Transicin con el cambio de una Purina por otra Purina o de una Pirimidina por otra Pirimidina, ocurre que se altera en la secuencia de la protena solo el aminocido correspondiente al triplete afectado (Fig. 20 - 14). Si ocurre que este aminocido tiene entre cuatro a seis tripletes para su codificacin, este tipo de mutacin puede ser silente. Esto significa que la mutacin ocurre en el DNA, pero no se manifiesta en la Protena, ya que el nuevo triplete producido an codifica para el mismo aminocido. De acuerdo a este postulado la primera y segunda base de un triplete afectan ms la identidad de un aminocido que la tercera base. Esta ltima no es importante ya que el cdigo gentico es degenerado o ambiguo. Lo que significa que distintas combinaciones pueden an codificar para el mismo aminocido. La expresin de la mutacin siempre depender de los mecanismos correctores de la clula y en el caso de que esta sobrepase la correccin, depender del sitio y el nivel donde se produzca. Si es en los elementos de control de la expresin de un gen, el resultado ser catastrfico, pero si ocurre en las zonas no codificadoras es probable que no ocurra ningn efecto, excepto cuando ocurre en las zonas repetitivas como se observar posteriormente.

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h) Dao por luz UV.

La luz Ultravioleta por tener la longitud de onda de mayor energa del espectro induce daos en el DNA especialmente en aquellos lugares donde un par de bases nitrogenadas como la Timina se encuentran vecinas en la misma hebra, (Fig. 23 - 14). As tenemos que en una clula de la dermis en un da de playa, dos timinas vecinas pueden dar origen a un aducto formado por un Ciclo Butilo entre los dos anillos de Timina. Esta unin produce una pequea joroba en el DNA que si persiste en la replicacin del DNA, las dos Timinas no tendrn representacin como dos Adeninas en la hebra hija y en el caso de sintetizarse una protena se producir un salto en la lectura de las Timinas lo que se traducir en una mutacin por delecin. En los humanos existe la enfermedad denominada Xeroderma Pigmentosa, en que la piel se mancha fcilmente bajo la exposicin de la luz solar. Esta enfermedad presenta una alta susceptibilidad al desarrollo de carcinomas y melanomas, donde se sospecha la existencia de varios genes involucrados en la reparacin del DNA y que pueden encontrarse defectuosos por esta razn. En este caso las enfermedades son clnicamente similares, pero molecularmente pueden tener distintos orgenes. En bacterias el fenmeno es mucho mejor comprendido y ha sido descrito en detalle (Fig. 2414).
TIPOS DE MUTACIONES .
A) AUG UUU UCU UAU CGG AAG GAA GUU GAA CCU UAA
CODON DE INICIO CODONES : U A A DE UAG UGA : AUG

Met - Phe - Ser - Tyr - Arg - Lys - Glu - Val - Glu - Pro G

TERMINO

TRANSICION
B ) AUG AUG UUU UCU UAU CGG AAG GAA GUU GAA CCU UAA UUU UCU UAU CGG GAG GAA GUU GAA CCU UAA

Met - Phe - Ser - Tyr - Arg - Glu - Glu - Val - Glu - Pro C

TRANSVERSION
C ) AUG AUG Met UUU UCU UAU CGG AAG GAA GUU GAA CCU UAA UUU UCU UAU CGG CAG GAA GUU GAA CCU UAA Phe - Ser - Tyr - Arg - Gln - Glu - Val - Glu - Pro

Fig. 23 - 14. a) Secuencia normal de un gen. b) Mutacin por Transicin donde Adenina es reemplazada por Guanina. c) Transversin donde Citosina es reemplazada por Citosina.

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Las protenas UvrA y UvrB participan en la reparacin unindose a la joroba del aducto y lo desenrollan con la energa del ATP. Luego una tercera protena, UvrC se une a las otras dos e induce cortes de 12 nucletidos, los que se desenrollan por la accin de la helicasa II. Este hueco es posteriormente relleno por la DNA pol I y a continuacin la enzima DNA ligasa completa la reparacin cerrando los extremos libres.

Reparacin de ADN daado por luz U V.

por sistem a de reparacin Uvr ABC. Luz UV .

se separan cerca de 12 bases de la hebra daada .

D N A pol I cierra la brecha .

Accin de la LIGASA.

P
ATP ADP P

P P OH

T T

T T

T T
OH

T T
OH

Uvr A

Uvr B

Uvr C
Corta la seccin de 12 nucleotidos y con Helicasa II se remueve el fragmento

Ambas protenas desenrrollan la seccin de ADN con joroba . Requieren de ATP .

Fig 24 - 14. La reparacin de los dmeros de Timina en E. Coli se emplea de modelo para el estudio de la reparacin del DNA en humanos.

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14) REPLICACION DEL DNA.

Durante la replicacin del DNA descrita en procariontes intervienen una serie de protenas que se catalogan en la Tabla 3 - 14. Estas protenas son de varios tipos y entre ellas encontramos a las protenas estabilizadoras, las enzimas replicadoras y aquellas protenas que evitan la formacin de nudos al desenrollar el DNA.

TABLA 3 - 14
PROTEINAS NECESARIAS PARA INICIAR LA REPLICACION DEL DNA.

Protena Protena DNA A

PM kD 50

Protena DNA B o 300 Helicasa Protena DNA C 29 HU Primasa o protena G SSB RNA polimerasa DNA topoisomerasa II o Girasa 19 60 75,6 454 400

N de subunidades Funcin 1 Abre la doble hebra en lugares especficos en el origen 6 Desenrolla DNA 1 2 1 4 6 4 Requerida para la unin del DNA B en el origen Protena similar a la Histona. Se necesita para el inicio. Sintetiza RNA cebadores Se une a una sola hebra del DNA Facilita la actividad de la DNA A Reduce la tensin generada por el por el desenrrollamiento del DNA.

En la Tabla 4 - 14, se aprecian las caractersticas de las distintas DNA polimerasas descritas hasta la fecha en E. Coli.

La DNA pol I es la que se encuentra en mayor proporcin, sin embargo es lenta para la replicacin del DNA en bacterias, pero tiene actividad exonuclesica 5' ---> 3', hidrolizando y rellenando sectores del DNA que no aparean.

La DNA pol II acta para reparar sectores especficos del DNA y la DNA pol III es la enzima principal involucrada en la replicacin del DNA bacteriano (Fig. 22 - 14). La DNA pol III es multimrica con ms de diez subunidades que poseen distintas actividades polimerizadoras y editoras.

TABLA 4 - 14.

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COMPARACION ENTRE DNA POLIMERASAS DE E. COLI.

Gen Estructural Subunidades PM kD 3'-->5'Exonucleasa Editora 5'-->3'Exonucleasa Vel. Polimerizacin.(nct/sg ) NCT agregados antes de la disociacin

I polA 1 103 Si Si 16-20

II PolB >4 88

III polC > 10 900

No 7

250-1000

3-200

> 10000

> 500000

En la Tabla 5-12, se caracterizan las subunidades que constituyen la DNA polimerasa III:

TABLA 5 - 14 SUBUNIDADES DE LA ENZIMA DNA pol III EN E. COLI.

Subunidad Alfa Epsilon Deta Tau Gama Delta Delta' Xi Ps Beta PM kD 13,2 27,0 10,0 71,0 52,0 35,0 33,0 15,0 12,0 37,0 Gen polc(dna E) dnaQ (MutD) hho lE DnaX DnaX HolA HolB HolC Hold DnaN Funcin Polimerizacin 3'--> 5'Exonucleasa Editora

ATPasa requerida para ptima actividad

El lugar desde el que se inicia la replicacin se denomina oriC y se encuentra en un sitio especfico del cromosoma gigante en la bacteria E. Coli. Este sitio esta caracterizado por tener un sector con cuatro secuencias repetitivas de 9 pares de bases (4 de 9) y otro sector

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con tres secuencias de 13 pares de bases repetitivas (3 de 13), dando un total de 245 pares

D N A Polimerasa I I I Holoenzima de E . Coli.

Fig 25 - 14. Estructura general de la DNA pol III.

de bases (Fig. 23 - 14).

3 secuencias de 1 3 pares de bases en tandem GATCTNTTNTTTT

4 secuencias de 9 pares de bases TTATCCACA

Fig. 26 - 14. Secuencias repetitivas en Ori C.

En la prctica se suele dividir el proceso de replicacin en tres etapas: Iniciacin, Elongacin y Terminacin. Volver al inicio

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a) INICIACION:
Esta etapa parte con la unin de cerca de 20 a 30 molculas de protena bajo la accin del ATP al sitio Ori C con 4 sectores repetidos de 9 pb con la secuencia TTATCCACA (Fig. 27 14). Este sitio debe poseer DNA circular superen rollado negativamente como exigencia. Luego bajo la presencia de la protena HU similar a la histona, se forma un "loop" u horquilla con el DNA que se desaparea en la secuencia GATCTNTTNTTTT abrindose. Posteriormente se unen a este sitio la protena DNA B ayudada por la protena DNA C. La protena DNA B acta como helicasa en presencia de ATP y desenrolla el DNA oriC en forma bidireccional creando una burbuja de replicacin con dos horquillas de replicacin en cada extremo con la ayuda de las protenas DNA B y C.

Ori C Secuencias repetitivas Cromosoma de E. Coli DNA Circular Protenas dna A requerida para la iniciacin O r i C 9 - mers Protenas dna B Ambas protenas dna C son requeridas en el 30 oC primosoma 9 - mers 13 mers

DNA Super Enrrollado

13 mers

Fig 27 - 14. Etapa de Iniciacin. El trmino "mers" se refiere a las secuencias repetitivas.

En este momento es posible la unin de la protena SSB (Protenas estabilizadoras) para estabilizar el DNA abierto junto a la DNA Girasa (DNA topoisomerasa II). La Girasa corta la hebra para desenrollar y aliviar la tensin producida por la Helicasa y la une posteriormente con la energa del ATP.

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b) ELONGACION:
En esta etapa se sintetizan la hebra lder o continua de 5'--->3' y la hebra discontinua o retrasada que debiera ir de 3'--->5, sin embargo existe aqu un problema ya que la DNA polimerasa III y I avanzan en la direccin 5'--->3' solamente (Fig. 25a-12). La hebra lder o continua se sintetiza con la ayuda de la enzima PRIMASA del complejo PRIMOSOMA. Esta es una RNA pol que produce una hebra de 10 a 60 ribonucletidos de RNA cebador en el sitio de origen. Este RNA cebador o "primer", aporta su lado 3'OH para la unin del 5' Alfa Fosfato del primer Deoxiribonucletido del DNA que se esterifica a este lugar por medio de la enzima DNA polimerasa III (Fig. 25b - 14). Esta enzima solo avanza replicando en direccin 5'--->3' de acuerdo con el avance simultneo de la burbuja de replicacin en la misma direccin 5'--->3'. En la hebra discontinua o retrasada se presenta el problema de la falta de bidireccionalidad de la DNA pol III (Fig. 25c - 14). Por lo tanto un conjunto agrupado de protenas en el complejo denominado PRIMOSOMA( 7 protenas distintas) subsana este problema. En este caso se forman varios RNA cebadores o "primers" de 10 a 60 ribonucletidos por accin de la Primasa del PRIMOSOMA en direccin opuesta al avance de la burbuja de replicacin. Posteriormente a los cebadores de RNA se les unen trozos de DNA en su lado 3'libre por accin de la DNA polimerasa III, formando el fragmento mixto RNA-DNA conocido como fragmento de Okasaki (Fig. 25d - 14). RNA DNA Fragmento 5'---------->3'-P- 5'------------>3' de OKASAKI. unin fosfodister

Fig. 28 - 14. Horquilla con bucle permitira la sntesis de la hebra Retardada en el mismo sentido de la hebra Lder coincidiendo con el movimiento de la Helicasa. Las horquillas permiten el avance del replisoma en ambos sentidos.

Cuando se han completado varios de los fragmentos de Okasaki en ambas direcciones de la burbuja, la DNA polimerasa I del PRIMOSOMA hidroliza los RNA cebadores y simultneamente los reemplaza por DNA (Fig. 25d - 14). La brecha entre los distintos trozos es luego cerrada por una LIGASA del PRIMOSOMA, que forma los enlaces entre el final 3'OH de un deoxirribonucletido y el inicio 5' Fosfato del otro, formando de esta manera el enlace fosfodister y dndole continuidad a la hebra recin sintetizada (Fig. 25e - 14 y 25f - 14). Ocurre el caso de que la hebra retardada puede ser tambin sintetizada en la direccin del avance de la horquilla cuando se produce un "loop" o bucle alrededor de la DNA polimerasa

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III (Fig. 26 - 14). De esta manera ambas hebras de DNA con sus respectivas DNA pol III, la lder (continua) y la retardada (discontinua), se encontrarn avanzando en la misma direccin de la horquilla (Fig. 26 - 14) a medida que el bucle se traslada en la misma direccin en que se mueven las Topoisomerasas. Volver al inicio

c) TERMINACION
Ambas horquillas de replicacin se encuentran en el otro extremo del cromosoma circular del E. Coli, donde intervienen las Topoisomerasas Tipo II. Estas enzimas son necesarias para la separacin de los dos pares de hebras madre-hija. Las protenas Ter especifica la terminacin evitando que las Helicasas desenrollen ms DNA impidiendo el avance de la horquilla. Algunos detalles de la replicacin an se desconocen, sin embargo es conocido que pueden aparecer varias burbujas de replicacin simultneas cuando la bacteria cuenta con un buen aporte de nutrientes. La replicacin en Eucariontes es de 50 nucletidos por segundo lo que es solo un dcimo de la rapidez con que ocurre en los Procariontes, pero empieza en sectores denominados sitios de replicacin autnomos y existen varios de estos sitios por cromosoma y a la vez varias burbujas de replicacin autnomas. En Eucariontes las DNA polimerasas son tres, ALFA (), DELTA () y EPSILON (). La replica la hebra retardada y la la hebra lder, mientras que la tiene actividad reparadora, adems acta en conjunto a otras protenas estabilizando y facilitando el ensamblaje de los sistemas replicadores.

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O
O P O

H
O N

H
2 N

5'

CH

N 2 O O O OH O N N 2 O O O O P O CH 2 O OH O N N N

P O CH

H
2

O O P O CH

OH O N

N N 2 O N N

H
2

3'
Fig. 29 - 14. Hebra de RNA.

OH

OH

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15) RNA
El RNA est formado por solo una hebra de Poliribonucletidos al igual que una de las hebras de DNA y se dirige desde el extremo 5'Fosfato al 3'OH. Los Ribonucletidos se encuentran unidos por enlaces fosfodister y poseen las siguientes bases nitrogenadas: Adenina, Guanina, Citosina y Uracilo (Fig. 27 - 14). La molcula tiene en su Ribosa un grupo 3' OH para el enlace fosfodister y un grupo 2'OH que la hace susceptible a la hidrlisis alcalina. La molcula de RNA puede aparear consigo misma, pero no forma hlices duplohelicoidales similares al DNA debido al impedimento estrico de la Ribosa con 2'OH que impide la torsin adecuada. El RNA es una molcula que posee variadas funciones y entre sus diversas molculas se puede contar al RNAm que lleva la informacin desde el DNA a la protena, al RNA ribosomal que interacciona con las protenas del Ribosoma (RNAr) e interviene en el reconocimiento y fijacin del RNAm a los ribosomas. Otras de estas molculas se conocen como RNA de transferencia (RNAt) que lleva aminocidos al sitio de ensamble en el Ribosoma, tambin se pueden citar al RNA cebador, para la DNA pol III en la formacin de los fragmentos de Okasaki y an se le puede encontrar como una enzima (Ribozima) en los Intrones de los

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transcritos primarios (RNA recin transcrito que lleva al RNAm) que son capaces de cortar y empalmar Exones de forma autocataltica. La secuencia aminoacdica de una protena esta determinada por la secuencia de los tripletes en el DNA. Cada triplete esta formado a su vez por tres bases y codifica para un aminocido de la protena. La informacin total para la secuencia aminoacdica de cada protena reside en el Cdigo Gentico (Fig. 28 14). Esta informacin es transportada por el RNAm y leda por la maquinaria que da origen a la protena. En el Cdigo Gentico cada aminocido de los 20 conocidos, est codificado por uno o ms tripletes de tres bases. En general existen 64 tripletes para codificar los 20 aminocidos. Dos aminocidos estn codificados por solo un codn, como es el caso de la Metionina por AUG y Triptfano por UGG, mientras que Leu y Arg tienen seis codones para cada uno de ellos, adems existen

Phe Phe Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ile Ile Ile Met Val Val Val Val

Ser Ser Ser Ser Pro Pro Pro Pro Thr Thr Thr Thr Ala Ala Ala Ala

Tyr Tyr No codifica No codifica His His Gln Gln Asn Asn Lys Lys Asp Asp Glu Glu

Cys Cys No codifica Trp Arg Arg Arg Arg Ser Ser Arg Arg Gly Gly Gly Gly

U C A G U C A G U C A G U C A G

Fig. 30 - 14. Cdigo Gentico.

tres codones que no codifican para aminocidos e indican el final de una protena y son UAA, UAG y UGA. Todas las protenas empiezan con el aminocido Metionina (AUG) en Eucariontes, mientras que en bacterias empiezan con Formil-Metionina. El cdigo gentico es universal entre comillas, ya que en ciertos organismos y las Mitocondrias es un tanto diferente lo que indica que an se encuentra evolucionando. Su origen segn las nuevas teoras puede provenir a partir de materiales encontrados en cometas orgnicos, sistemas marinos hidrotermales o bien de un mundo primordial regido por el RNA como origen de genes y protenas.

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16) PRINCIPALES DIFERENCIAS ENTRE RNA Y DNA EN EUCARIONTES RNA a) Posee una Ribosa con 2'OH que no le permite formar una hlice similar al DNA cuando aparea consigo mismo DNA a) La Deoxiribosa tiene un 2' H que le permite formar la doble hlice

b) Posee en su secuencia Uracilo en vez de Timina c) Se hidroliza con NaOH

b) En vez de Uracilo posee Timina

c) Estable a la hidrlisis alcalina

d) En su estructura reside la informacin o d) Solo almacena informacin la actividad cataltica.

e) Interacciona con las protenas formando las Ribonucleoprotenas y Ribosomas

e) Interacciona con protenas en los Nucleosomas y los complejos activadores y silenciadores f) Se forma por Replicacin todo el DNA como DNA--> DNA

f) Se forma por de transcripcin selectiva de los genes de la forma DNA --> RNA o pasa informacin de la forma RNA --> DNA en los retrovirus g) Existen los siguientes tipos: RNAm (mensajero), RNAr (ribosomal), RNAt (transferencia), Ribozimas.

g) Existen varios tipos como: DNA gnico y DNA basura que comprende a su vez al DNA repetitivo DNA satlite DNA minisatlite, etc.

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17) TRANSCRIPCION DEL DNA EN PROCARIONTES Y EUCARIONTES.

La transcripcin del DNA es el paso de la informacin desde una de las hebras del DNA al RNA mensajero, tanto en Procariontes como en Eucariontes. En Eucariontes se lleva a cabo este proceso mediante la accin de tres RNA polimerasas y el comienzo ocurre antes del sitio real de codificacin. La nueva hebra de RNA crece en la direccin 5'--> 3' y proviene de la hebra 3'<-- 5', mientras que la hebra 5'-- 3' del DNA es totalmente idntica al RNA naciente excepto que en vez de Timina tiene Uracilo. El RNAhn es de gran peso molecular cuando est recin transcrito y tiene tanto exones como intrones. Los Exones son los elementos que darn origen a la protena y cada uno de ellos aportar una caracterstica especial a esta. Los intrones no sern expresados como protenas y ellos mismos procedern a catalizar en algunos casos el corte y empalme de los exones durante la etapa de procesamiento. En el extremo 5' se adicionar la estructura CAPUCHON (CAP) formada por una Guanina metilada que aporta un P, ms dos fosfatos del primer nucletido adicionado como Gmppp. La funcin del CAP parece ser el aumento de la afinidad por los ribosomas.

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En el extremo 3' se encuentra la secuencia AAUAAA, la cual es poliadenilada para aumentar la estabilidad del RNAm procesado a las Ribonucleasas. Esta cola de poli A disminuye cuando envejece el RNAm. Una vez que el RNA ha madurado o ha sido procesado con estos tres cambios CAP, Poli A y corte y empalme de exones, el RNAm aparece en el citoplasma, ya que los cambios mencionados anteriormente ocurrieron en el ncleo. A continuacin se detallan las principales diferencias en la transcripcin de Procariontes y Eucariontes:

Procariontes
La RNApol tiene dos subunidades Alfa similares y dos Beta distintas: (Alfa)2 Beta-Beta' de 500kD en total. Existe una RNA polimerasa con un factor de inicio Sigma y otro de terminacin Rho. La RNA pol reconoce secuencias especficas de inicio junto al factor SIGMA en el PROMOTOR

Eucariontes
Las RNA pol tienen de 10 a 15 polipptidos y un origen comn con las de E.Coli. Existen tres tipos distintos de RNA polimerasas especializadas. RNApol I transcribe RNAr 45S ubicada en el nuclolo RNApol II transcribe RNAm y RNA procesador. RNApol III transcribe RNAt ubicada fuera del nuclolo y RNAs de histonas.

Hay distintos factores SIGMA para cada serie de El control de la transcripcin depende de genes u operones que se transcriben elementos CIS, los cuales son segmentos de DNA policistronicamente con secuencias especficas para intensificar o inhibir la transcripcin mediante los elementos TRANS o Protenas tanto Activadoras como las Represoras (silenciadoras) que se unen a los elementos CIS La holoenzima (RNApol+Sigma,) desenrolla la Existen factores de iniciacin, elongacin y de predoble hebra. iniciacin poco conocidos (Figs. 29a - 12, 29b - 12 y 31 - 12). El PROMOTOR tiene la secuencia especfica de El PROMOTOR contiene las secuencias de consenso de TTGACA y TATAAT a -35 y -10 pb consenso CCAAT, GC y TATA a -110, -40 y -25 corriente arriba de la regin del inicio del RNAm. pb respectivamente, en la direccin corriente -35 pb -10 pb +1 arriba de la regin codificadora: TTGACA---------TATAAT--/- . -110 -40 -25 +1 -CCAAT--/--GC-/-TATA--/--A estas secuencias se unen la protena TATA y los factores basales que permiten la unin de la RNA pol II Entre los Factores basales de Transcripcin (Fig. 30-12) tenemos al TFIID (100kD) o protena TATA que se une a la misma caja TATA corriente arriba de la regin codificadora. TF = Transcription Factor El factor TFIIB se une luego a la RNApol II y ambos se unen al DNA, donde hidrolizan ATP para abrir la doble hebra. Inmediatamente empieza la transcripcin con adicin de TFIIE y nucletidos. Esta transcripcin es de baja intensidad.

Los cambios que existen en la secuencia de los Por esta razn se requiere de los "enhancers" o

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TF I I B
Transcripcin

R N A pol

Transcripcin

T F IID
Sitio de inicio de la transcripcion + 1

E l D N A se TF I I E TF I I S abre en l de N C T sitio iniciacin A TP A D P

5'
TF I I B T F II D

R N A pol I I
C aja T A T A _ 30 pb

R N A

T F II D

C O M PLEJO
Fig. 31 - 14. El inicio de la transcripcin depende de la unin primaria de los Factores Basales que facilitan la entrada a la RNApol. TF IID se une a TATA y el factor TF II B se une a la RNA pol II. El factor TF II B acta como ATPasa en el Complejo. El DNA se funde abrindose para iniciar la Transcripcin con los factores restantes TF II E y TF II S ms los NCTs o Nucletidos.

promotores afectan la afinidad con que la RNA pol intensificadores o exacerbadores de la eficiencia se une y los transcribe de unin de la RNA pol II. Los intensificadores se unen a la regin GC y actan favoreciendo la formacin de loops o repliegues del DNA que facilitan la entrada de la RNA pol II (Figs. 31-12 y 32-12). En procariontes los genes poseen protenas En Eucariontes tambin existen secuencias inductoras y represoras que se unen a regiones silenciadoras a las cuales se unen protenas adjuntas al promotor o en el operador mismo que represoras que inhiben la expresin del gen. se encuentra dentro del promotor. Ambas se activan por seales, moleculares (Fig. 30 - 12). Dentro de los promotores hay pequeas secuencias de 6 a 20 pb denominadas motivos donde se unen las protenas reguladoras Los motivos son tambin las regiones intensificadoras y silenciadoras

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B son Secuencias Reguladoras, m ientras que X , Y y Z son Genes Inducibles

Sitio de unin de la Protena activadora

OPERADOR donde se une la protena Represora

Genes Inducibles Policistrnicos

PROMOTOR: Sitio de unin del a RNA pol y donde se encuentran las secuencias - 35 pb TTTACA y - 10 pb TATG TT Fig 32 - 14. Control de los genes inducibles en bacteria.

PO S IC IO N D E LAS S E C U EN C IAS A C TIV A D O R A S , IN TE N S IFIC AD O R AS O EN H A N C E R S .

INICIO TERM INO

a)

R egin corriente arriba del G en

R egin corriente abajo del gen G E N

- 200

C C A A T G G G C G

- 40

+ 1

TA TA

R egin C odificadora

b)

TA TA

Regin Codificadora

EXON
IN TR O N Activador de 0,1 a 10 kB ubicado antes de la regin codificadora INICIO

EXON

Regin activadora en el Intron TERM INO

Activador a 10 kB del trm ino

Fig. 33 - 14. a) Secuencias de consenso desde -200 pb hasta la regin codificadora. b) Las secuencias activadoras pueden encontrarse corriente arriba, en el Intrn o corriente abajo del gen.

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Hctor Rocha L. DNA

La transcripcin es policistrnica, es decir consta Los puntos anteriores se resumen en el modelo de varias cadenas polipeptdicas con mltiples desnudo de la transcripcin del DNA. En este las secuencias activadoras y silenciadoras se unen a seales de inicio y trmino los factores del mismo nombre para facilitar la disposicin de los factores basales y la eficiencia de la RNApol (Figs. 34 - 14)

Factores basales

R N A polimerasa

Secuencia activadora ubicada curso arriba

Promotor proximal

Regin codificadora

Caja T A T A Lugar iniciador de la transcripcin Protenas Activadoras

R N A polimerasa R N A mensajero

R N A mensajero

Fig. 34 - 14. Activacin gnica. Modelo del DNA desnudo donde las secuencias intensificadoras junto a sus factores activadores ms la presencia de los factores basales pliegan al DNA y ayudan a la entrada de la RNApol.

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EXPRESION NO MODULADA O BASAL

E F B RNA pol H

REGION CODIFICADORA

CAJA TATA

PROTEINA DE UNION FACTORES BASALES

Fig 35 -14. Expresin basal de baja intensidad

IR eg io ne s Inte nsifica dora s

R egio ne s S ilec iado ra s

P rotena s A ctivado ra s

P rotena R epre so ra s C O A C TIV A D O R A S

H E RN A pol
R egin C odific ad ora

C aja T A T A
P rotena de uni n a la caja TA TA Factore s ba sa le s

Fig. 36 - 14. Los factores intensificadores y silenciadores se unen a sus respectivas secuencias para interaccionar con los factores basales modulando la eficiencia de la Transcripcin por la RNApol.

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Hctor Rocha L. DNA

El modelo de la transcripcin del DNA con histonas en Eucariontes atribuye a las histonas un papel encubridor de la caja TATA y para que se unan a ella los factores basales, las protenas activadoras corriente arriba deben interaccionar con el Nt de la histona H4 (Fig. 34-12); que forma parte del nucleosoma ms cercano. A continuacin el nucleosoma se desarma dejando la caja TATA libre para la unin de los factores basales apareciendo un bajo nivel de transcripcin. En seguida el DNA se repliega por accin de las protenas activadoras que interaccionan con los factores basales o coactivadores para tener un nivel mximo de transcripcin La transcripcin policistrnica es: AUG-//-UAA--AUG-//-UAA--AUG-//-UAA El gen es continuo en procariontes La transcripcin es monocistrnica es: AUG --//--UAA. El gen en Eucariontes es discontinuo con EXONES codificadores e INTRONES no codificadores.

Transcripcin y Traduccin son simultneas en El RNAhn contiene al RNAm procariontes

La terminacin puede ocurrir con el factor Rho o sin l. Se forma en el RNA transcrito una horquilla autocomplementaria cerca del final donde se debilita el apareamiento RNA-DNA entre poli Us del RNA con poli As del DNA y se facilita el apareamiento RNA-RNA transcrito formando una horquilla poli G-C y poli C-G.

El RNAhn sufre procesamiento para pasar a RNAm. El RNAhn esta intercalado por INTRONES que no se traducen y EXONES que si se traducen. El extremo 3 lleva un poli A (200-250 ncl)) integrado en el ncleo Post-transcripcionalmente al RNAhn que despus madura a RNAm

Existe una secuencia denominada SHINE- Otra modificacin en el extremo 5' es la adicin de DELGARNO previa al AUG del RNAm en el extremo CAP (m7G) que es el 7-metilguanilato en unin 5'--5 5'que aparea con el RNAr 16S del RNAm. Est tambin presente en el RNAhn. El RNAhn debe sufrir corte y empalme de exones. Existen 4 formas de corte y empalme, 2 son catalizadas por el Intrn y dos por enzimas proteicas RNAsn 1,2,4,5,6 y las ribonucleasas. El RNAm solo tiene extrones, una 5'-CAP y una. 3'poli A, con lo que sale del ncleo.

Podemos decir finalmente que en Eucariontes cuando un gen se activa, debe unirse un grupo de protenas a la regin promotora proximal donde se encuentra la caja TATA, posteriormente se unen otras protenas y forman el complejo de preiniciacin. Luego se coloca la RNApol en el promotor proximal. Otras protenas se unen curso arriba del DNA y son activadoras lo cual desencadena la produccin mxima de mensajero y son los enhancers o activadores o exacerbadoras o intensificadores como se observa en el esquema: Los intensificadores (Enhancers), son secuencias especficas del DNA o elementos cis donde se unen elementos trans como un complejo receptor-hormona, aumentando la actividad de

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los promotores cercanos tanto para RNASpol I como II. No son en si mismos promotores, pero estimulan la Transcripcin. Se encuentran de 5' a 3' o de 3' a 5, en cualquiera direccin y su efecto mismo pareciera ser un cambio en la conformacin de la doble hebra para aumentar la afinidad por la RNA pol.

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COLA DE H 4 NH2 FACTORES BASALES SECUENCIA ACTIVADORA O INTENSIFICADORA CORRIENTE ARRIBA

al

PROTEINAS ACTIVADORAS

R N A polimerasa

CAJA T A T A

REGION CODIFICADORA

H2A-H2B R N A polimerasa

RESTOS DEL NUCLEOSOMA R N A mensajero

R N A mensajero

Fig 37 - 14. a) Los factores activadores interaccionan con el Nt de la Histona H4. b) El Nucleosoma se descompone y se unen los factores basales a la secuencia TATA. c) Entrada de la RNApol facilitada.

18) PROCESAMIENTO DEL TRANSCRITO PRIMARIO.

715

Hctor Rocha L. DNA

Existen cuatro formas de cortar y empalmar los exones:

I) La primera de ellas ocurre en el Intrn autocataltico (Fig. 38 - 14), con la adicin de un GMP. El grupo 3' OH del GMP acta como nuclefilo sobre el Fosfato de la unin 5'- 3' cortano la unin exn-intrn al extremo 5, para que de esta manera la Guanosina se una al intrn.

U Exon1 5' G 2' OH OH 3' 5' U Exon1 OH 3' OH pO OH 3' P

A OH P 5' GpU Exon2

(GMP)

pO

G 2' OH P

A 2' OH P 3' 5' P

G OH 3' P

U OH P Exon2

3' 5'

El empalme se produce por el ataque del grupo 3' OH del Exn a la unin ester situada al extremo del Intrn
U Exon1 OH 3' P U OH P Exon2

Fig 38 - 14. Corte y empalme Autocataltico de Exones.

Ahora el extremo 3' libre que resta del exn ataca el otro extremo del intrn, para romper nuevamente la otra unin 5'- 3', quedando de esta manera unidos el lado 3' del exn A con el lado 5' del exn B.

II) La segunda forma de corte y empalme (Fig. 39 - 14) es tambin autocataltica y en este caso el intrn mismo aporta el grupo 2' OH de una Adenosina en el centro del intrn y que acta como nuclefilo atacando la unin 5'- 3' cortando la unin exn-intrn al extremo 5'. La Adenosina a su vez queda unida al extremo del intrn formando un circulo o lazo, mientras

716

Hctor Rocha L. DNA

INTRON
C P OH P 2' A U2' G2' OH OH P 5' C OH P U OH 2' A
P

A P OH OH

U P A P OH

5'

Exon 1

Exon 2

3'

U G P

5'

Exon 1

OH 3' 5'

Exon 2

3'

OH

C OH P A U OH U
5'

A P 2'
P

OH

5'

Exon 1

3'

Exon 2

3'
P

3'

OH

Exones empalmados

Intron Circularizado

Fig 39 - 14. Otro mecanismo de corte y empalme de Exones autocataltico.

que en el otro extremo de la unin 5'-3' se produce ahora el ataque en la unin intrn-exn restante por el lado 3' OH del extremo 5' en el exn que acta como nuclefilo, as se
A
Exon 1
Sitio deCorte 5'
AGGUAAGU

Sitio deCorte 3' U ACU A CA AG

5'

3'

Exon 2

U1

U2
3'
R a m a 2' O H

A
U2

B
3'
5'

U1
5' p p p 5' 7 CA mUm UA C GG U C C A m G 5' A G GU A A G U

5' 3'
AG

A U G A U GU U A CU A CA

Exon 1

Exon 2

U1 U5 U4 U4 U6 U6 U4 U6 U5

C
U 2 U 4 Exon 1 U5 U6

Exon 2
U4
5'

U2

U5

U6
UACUA CA

AG

E
Exon 1

3'
U

A A GA

Lazo con e n l a c e 2' , 5' fosfodiester

Exon 2

Fig 40 - 14. Pequeos RNA participan en el corte y empalme de los exones.

empalma al otro exn.

717

Hctor Rocha L. DNA

III) Otra forma de procesar RNAs transcritos primarios es mediante los RNAsn (small nuclear) (Fig. 40 - 14). Cinco de ellos U1, U2, U4 ,U5, y U6 estn asociados a protenas y reconocen sectores de la unin exn-intrn donde cortan y empalman. Las protenas con que se asocian son de 6 a 10 en nmero y algunas son comunes a todos ellos y otras son especficas.
IV) Esta ltima forma de corte y empalme es mediada por la accin de endonucleasas y ligasas que actan en los extremos exn-intrn (Fig. 41 - 14).

5'

EXON!

INTRON

EXON2

3'

Endonucleasa

INTRON
OH

3'

2' 5' EXON! 5'

P P HO

2' 3' ATP Kinasa

EXON2 5'

3'
P P OH

2' EXON2
OH OH

ADP 3' Ligasa 2'

5'

EXON! 3'

5"A 2'
P P

ATP PP 3' EXON2

P

5'

EXON! 3' Fosfatasa

P

O H 2' EXON2

3'

RNAt MADURO

2' EXON! 3' 5'

5'

OH P

OH

2' 3'

EXON2 5'

Fig. 41 - 14. La presencia de enzimas proteicas permite el corte y empalme de este tipo de Exones.

Volver inicio

al

718

Hctor Rocha L. DNA

19) RNA r
El RNA ribosomal en Eucariontes proviene de precursores o transcritos primarios (RNA recin traducido sin haber sido procesado) de gran tamao que se encuentran representados en tandem en el genoma en un nmero cerca de 450 veces en el genoma y que se encuentran presentes en el nucleolo. Su transcripcin se lleva acabo mediante la RNA pol I. Los transcritos primarios o preribosomales son procesados paulatinamente mediante cortes y metilaciones, hasta formar las molculas que definitivamente participan en el ensamble de los ribosomas. En Procariontes el precursor es un RNA 30 S que luego de cortes y metilaciones da origen a los RNA 5s,16S y 23S (Fig. 42 - 14).
Procesamiento de pre RNA r en bacteria.

16 S

4S

23 S

5S

Metilacin

Ruptura

Nucleasa

Nucleasa

16 S

RNAr

4S

RNAt

23 S

RNAr

5S

RNAr

Fig. 42 - 14. La maduracin de un precursor 30S de RNAr en bacteria consiste en la eliminacin de secuencias intermedias y metilacin

En E.Coli hay 7 genes que producen el mismo precursor 30S, pero con distinta secuencia en los espacios entre los cuales se encuentran los precursores. Tambin ocurre que entre las secciones 16 S y 23 S de RNAr, hay secuencias para distintos RNAt en cada uno de los 7. En Eucariontes (Fig. 43 - 14), el precursor de los RNAr o RNA preribosomal es de 45 S y sufre procesamiento en el nucleolo para formar la familia de los RNA ribosomales 5.8 S, 18 S y 28 S.

719

Hctor Rocha L. DNA

P rocesamiento de R N A preribosomal en EUKARIONTES

18S

5.8S

28S

Metilacin

Corte

18S

5.8S

28S

RNAr

RNAr

RNAr

Fig 41 - 14. Formacin de los RNAr en Eucariontes.

El RNAr 5S es formado por otro transcrito distinto, que tambin se encuentra con un precursor representado en el DNA en tandem. Aqu los espaciadores son mayores que en el gen del RNAr 5S. Volver al inicio

20) RNAt
No existe interaccin directa entre los tripletes del Codn del RNAm y los aminocidos, por lo tanto se requiere de una molcula adaptadora denominada RNAt que lee la informacin del RNAm y la traduce en los aminocidos que formarn parte de la secuencia de la futura protena. Los RNAt se encuentran representados por unas 40 a 50 molculas en Eucariontes y por unas 32 en Procariontes. Tienen pesos moleculares que van de 24 a 31kD y con un nmero de 73 a 93 nucletidos donde algunos aminocidos tienen ms de un RNAt. Entre las caractersticas de los RNAt o adaptadores, est la presencia de 7 a 15 bases no comunes en su estructura. El extremo 5' esta fosforilado y puede ser pG, mientras que el extremo 3'OH donde se transporta el aminocido es CCA en todos ellos. Los RNAt tienen cuatro brazos (fig 44-14) y se denominan: 1)brazo Ribotimina-Seudouracilo-Citosina 2)brazo Dihidrouracilo 3)brazo anticodn que aparea con el codn del RNAm y 4)el brazo 3' CCA donde se une el aminocido.

720

Hctor Rocha L. DNA

5'pGUUAUCAGUUAAUUGA A UU 3 ' O H C G U A C G U G C G C G C U A C C G C G C C G G G G C GU U UG C U A A CC GA U C G U AGG C G A U G A G A UU C G A U A U G C A U A C A U A G G C U A

3'OH

Transcrito primario

5' p

Corte

A A U U

U C A C

3'OH G A G G 5' p C G U A C G C U A C G G C C C C G C G U G G G G CG U U C U U GA C G A U A C C G C C G U G C A U A G G C G A G C C C C G C G G A U A G G C G G UU U G U G C C G U U A A C CGA U C A U G A U U AGG C G A G G C U A G A UU A U C G A A U C A A U U A G G C G C A U U A A C

C U C U

A G A

Empalme

A A U 3'OH A C C A G A U

C A C

G U A 3'OH

U A

Procesamiento de RNA t en bacteria y eukarionte.

U A

RNAt

maduro
m

C U C G U G C G G C U C C G C G C C G G C G G T m GU U D GA A C CG mC G D AGG C G A UDU A G A mG C G A U A U G C A U A C A U

5'

Adicin de CCA
mA
G C C

Modificacin de Bases

C U C G U G C G C U G C A G C C C C G C G U G G G CG U UG C U A A U A CC G C G U A GGC G A U G A G A UU C G A U A U G C A U A C U A G U A

5'

A C C A G A

Fig 45 -14. Corte, empalme y modificacin de bases en la formacin de los RNAt.

Los RNAt provienen de precursores de 120 a 150 nucletidos que son transcritos por la RNApol III. A estos transcritos primarios se les acortan los extremos 5' y 3' y se modifican sus bases (Fig. 45 - 14). La enzima aminoacil RNAt sintasa que carga los aminocidos al RNAt, debe reconocer entre los aminocidos y entre los distintos RNAt disponibles. Esto parece que se consigue mediante las bases especiales que se encuentran en los brazos de los RNAt y la conformacin estructural de cada RNAt, de esta manera la enzima sabe cul es el aminocido que le corresponde (Fig. 45 - 14). La verdadera forma de L del RNAt (Fig. 46 - 14), se determin por cristalografa de RAYOS X, en esta estructura existen algunas interacciones entre las bases que no son estrictamente GC y A-U. Las bases se encuentran en algunos casos metiladas y con una secuencia comn a todos ellos cerca del centro de la secuencia UUCG. Un solo anticodn del RNAt puede reconocer ms de un codn siempre que este corresponda al mismo aminocido a causa del "alabeo o bamboleo", como se ver ms adelante. Sucede que la

721

Hctor Rocha L. DNA

Posiciones de identificacin por las Aminoacil'RNAt Sintasas.

posiciones iguales en todos los RNAt

5'

3'

Brazo de unin al aminocido.

posicines de reconocimiento para una o ms RNAt sintasas. Brazo D H U

Brazo T

Brazo extra

Anticodon

Fig. 45 - 14. Sitios especficos en la estructura de los RNAt.

tercera base del codn no se une estrictamente (como bases de Watson y Creek) a la primera base del anticodn. Lo que ocurre en realidad es una unin aproximada, ms dbil que permite mantener la velocidad de sntesis de la protena sin abandonar la especificidad.

Asa

con el ANTICODON

Asa DHU Extremo de unin del Aminocido A C C

Asa T C

3'

5'
Fig 46 - 14. Los RNAt tienen forma de L en su estado natural.

De esta manera Adenina, Uracilo y Citosina en la posicin 3 del Codn del RNAm pueden aparear con Inosina en la posicin 1 del anticodn del RNAt.,mientras que Adenina y Guanina en similar posicin del Codn aparean con Uracilo del Anticodn y Citosina y Guanina del

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Hctor Rocha L. DNA

Codn aparearn con Guanina del Anticodn. Por otro lado Guanina del Anticodn puede aparear normalmente con Citosona del Anticodn y Uracilo con Adenina del Anticodn. Volver inicio al

21) LOS RIBOSOMAS.

Los ribosomas son complejos ribonucleoproteicos formados por distintas molculas de RNAr y protenas(Fig. 47 - 14). Entre ambos forman el andamiaje para la unin del RNAt cargado con su aminocido y el RNAm con la secuencia de la protena a sintetizar. En el Ribosoma el aminocido abandona al RNAt y se ensambla con su vecino de uno en uno siguiendo las instrucciones de orden y secuencia escritas en el RNAm. Si estas reacciones se llevaran a cabo en solucin de forma escalar la sntesis de protenas sera muy lenta y desordenada. En Procariontes (Fig. 47 - 14), 31 protenas ms los RNAr 23S y 5S forman la subunidad 50S de los ribosomas, mientras que la subunidad 30S esta formada por 21 protenas ms el RNAr 16S. En Eucariontes (Fig. 47 - 14), 50 protenas ms los RNAr de 5S, 28S y 5,8S forman la subunidad de 60S, mientras que la de 40S esta formada por 33 protenas ms el RNAr de 18S.

Eukarionte

RNAr 18 S RNAr 5,8 S

33 Protenas

Subunidad 40 S

Ribosoma RNAr 28 S Prokarionte 50 Protenas Subunidad 60 S 80 S

RNAr 16 S

21 Protenas

Subunidad 30 S

Ribosoma RNAr 23 S RNAr 5 S 31 Protenas Subunidad 50 S 70 S

Fig 47 - 14. Composicin de los Ribosomas en Eucarionte y Procarionte.

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723

Hctor Rocha L. DNA

22) SINTESIS DE PROTEINAS.

1 ETAPA . La primera etapa requiere de los 20 aminocidos, 20 o ms Aminoacil-RNAt sintetasas y 20 o ms RNAt con ATP y Mg+2 . Las enzimas del citosol Aminoacil-RNAt-Sintasas son especficas para cada aminocido y su RNAt. AA + ATP ---------------> Aminoacilo-AMP + PPi PPi ---------------> 2Pi El aminoacilo-AMP permanece unido a la enzima hasta que entra el RNAt adecuado, producindose la aminoacilacin del RNAt. Aminoacilo + RNAt -------------->Aminoacilo-RNAt --------------------------------------------------AA + RNAt + ATP ------> aminoacilo-RNAt + PPi PPi-------> 2 Pi -29 kJ/mol De esta manera se activa el aminocido y se une a un adaptador para la sntesis de protenas. En aquellos aminocidos relacionados estructuralmente la enzima Aminoacil RNAt Sintasa tiene dos sitios activos uno para la formacin del compuesto intermediario AminoacilAMP, antes de unirlo al RNAt y el otro que compueba la efectividad de la unin del aminoacilo que corresponda al RNAt adecuado, ya que al menos existe una enzima por cada RNAt. En Procariontes (Fig 48 14), se empieza con FORMIL Metionina y en Eucariontes con solo Metionina, pero con dos RNAt uno para la Met del principio y el otro para la Met del interior de la protena. En la etapa de iniciacin se congregan el RNAt con Formil- Metionina, la subunidad 30S de los ribosomas con el RNAr de 16S , el RNAm, tres factores de iniciacin, GTP, la subunidad 50S y Mg+2. A la subunidad 30 S se une el factor de iniciacin IF-3, en seguida se une el RNAm dejando al codn AUG en un lugar preciso de la 30 S. La posicin adecuada del AUG en el 30S para que quede en el sitio P, se alcanza debido a la secuencia SHINE-DELGARNO, del RNAm que se encuentra corriente arriba de 8 a 13 pb del AUG y que aparea con el 16S RNAr:

16 S RNAr 3' OH G-----------//--5' A A U C UCCUCCA 5' A U U C C U A G G A G G U U U G A C C U [ A U G ] C G A G C 3' SECUENCIA SHINE-DELGARNO en el RNAm

724

Hctor Rocha L. DNA

El sito P (Fig. 48 14), est formado tanto por la subunidad 30S como la 50S. Ahora tenemos unido el IF-3, la subunidad 30S y el RNAm a los cuales se une el Factor de Iniciacin 2 o FI-2 que esta unido a GTP y el Formil-Metionina-RNAtfMet con el anticodn 5' UAC 3' Enseguida se produce la combinacin de este complejo con la subunidad 50S, se hidroliza el GTP unido a IF-2 y se sueltan los factores de iniciacin. El sitio P queda ocupado por el primer formil Met-RNAt.

Formacin del complejo de Iniciacin.

FI-3

5'

AUG

3'

30S

FI-3

P
U A C

A 3'
FI-2 GTP GTP fMet fMet U A C FI-2

5'

AUG

FI-3

FI-1

P 5' A AU UG G
U A C

A 3'

50S

FI-1

FI-2

GDP + P
fMet

Fig 48 - 14. Formacin del Complejo de Iniciacin.

2 ETAPA . La siguiente etapa (Fig. 49 - 14), requiere del complejo de iniciacin ms tres protenas o Factores de Elongacion (FE), como son los FE-Tu, FE-Ts y FE-G en conjunto con el siguiente RNAt cargado y GTP. El sitio A del complejo de iniciacin esta desocupado y tiene una vacante para la unin del segundo AA-RNAt, el cual entra unido a al factor Tu que se halla previamente unido al GTP. Una vez el AA-RNAt situado en el sitio A y con la interaccin codn-anticodn completada, se hidroliza el GTP saliendo el Tu unido al GDP. El GDP ahora, se libera por la accin del factor de elongacin Ts quedando unidos Tu-Ts. Luego entra otra molcula de GTP sacando a Ts y dejando GTP para la entrada del tercer AA-RNAt. Cuando ambos sitios P y A estn ocupados con sus respectivos RNAt cargados con los aminocidos la actividad enzimtica de Peptidil Transferasa se manifiesta, catalizando el ataque nucleoflico del Amino del segundo aminocido sobre el Carbonilo que se encuentra en la unin ster con el 3' OH de la Ribosa del RNAt del primero. Para formar enseguida un

725

Hctor Rocha L. DNA

enlace peptdico en que el primer aminocido aporta el carboxilo y el segundo el grupo amino. Es una reaccin en la cual se pierde una molcula de agua y es catalizada, no por una protena sino que por una RIBOZIMA (Peptidil Transferasa) formada por el RNAr 23S, de la subunidad mayor del ribosoma en Procariontes. Cuando se ha formado el enlace peptdico el ribosoma debe translocar un sitio para la unin del tercer AA-RNAt al sitio Aminoacilo. Esto se logra por la accin de la Protena G y la hidrlisis de una molcula de GTP. De esta manera el sitio P queda con el segundo RNAt unido al dipptido ( el aminocido que trajo el primer RNAt ubicado en el lado amino terminal del dipptido ms el segundo unido al lado 3' del segundo RNAt), mientras que el primer RNAt abandona el lugar para ser empleado nuevamente. El polipptido crece a medida que se repite la operacin mediante la formacin de sucesivos enlaces peptdicos. La enzima que cataliza este proceso se denomina Ribosomasa o Peptidil Transferasa y une el polipptido al lado amino de los sucesivos aminocidos que son transportados al sitio Aminoacilo por sus respectivos RNAt. Como la sntesis de las protenas debe ser un proceso rpido, la interaccin entre el
Etapa de la Elongacin .
P 5' A AU UG G
U A C U U U

A AAA
CCC

P 3' 5' A AU UG G
U AC

A AAA
U U U

CCC

3'

Tu
O O C O O C R C H NH 2 R C NH

GTP

Tu

GTP

Ts
O O C

GTP Tu

R C H

Ts
GDP

GTP

N
O C

R C H

Tu GDP

GDP+P

Ts

NH 2

P 5' P 5' A AU UG G
U A C

A AU U UG G G A

A AA A AA A AA
U U U

CCC 3'

CCC

A AAA
U U U U A C

GGG
CCC

3'

Tu

GTP

O O C R C H O O C R C H NH 2 O O C R C H NH 2 O O C H R C H NH

N
O C

R C H

NH 2

Fig 49 - 14. Formacin del enlace peptdico, translocacin y liberacin del RNAt vaco.

Anticodn del RNAt cargado con el aminocido y el Codn del RNAm debe ser de corta duracin. Esta necesidad no sera posible si la interaccin fuera normal, por ejemplo el Codn CCC apereara con el Anticodn GGG y tendra 9 enlaces hidrgenos, en cambio la interaccin del Codn AUA con el Anticodn UAU tendra solo 6 enlaces hidrgeno. Esta diferencia en la capacidad de interaccin retrasara la sntesis de las protenas en algunos

726

Hctor Rocha L. DNA

puntos ms que otros y se necesitaran 61 RNA distintos de transferencia. Para remediar esta situacin ocurre que la verdadera interaccin Codn-Anticodn no es tan estricta, de esta manera el Anticodn del RNAt puede reconocer a ms de un Codn del RNAm siempre que correspondan al mismo aminocido. Ms an, un Anticodn reconoce a varios Codnes debido a que el apareo entre la bases no es estricto entre el primer nucletido del Anticodn y el tercero del Codn, (Fig. 49 - 14). 3a ETAPA. Finalmente cuando aparecen los codones UAA, UAG y UGA,(Fig. 50-14) los que son reconocidos por los factores de terminacin FT1 que reconoce a UAG y UAA mientras que FT2 reconoce a UGA y UAA. Al unirse los FT al codn la actividad de Peptidil Transferasa transfiere la cola de la protena al agua en vez de a otro AA-RNAt, cosa imposible porque estos tres codones no codifican para ningn aminocido.

Etapa de Terminacin.
UAA

UGA
P 5' 5' A

FL

30S
P A

CCU GGA

U G AA AA

3'

5'

5'

CCU GGA

U G AA AA

3'
GGA

FL FL H O
C C N O C H H

O O R C C N O C H H

Ct
O R

50S

5'

CCU

UAG

3'

t
N

Fig 50 - 14. Terminacin y descomposicin del Complejo.

En bacterias la Transcripcin y la Traduccin son simultaneas, adems los RNAm son de corta vida media lo que permite una economa al cambiar su metabolismo rpidamente de un substrato a otro junto con las enzimas necesarias. Por lo tanto este sistema favorece una rpida adaptacin a las condiciones del medio en que se encuentren los Procariontes. Volver al inicio

727

Hctor Rocha L. DNA

23) PROCESAMIENTO DE LAS PROTEINAS RECIEN SINTETIZADAS.

No todas las protenas tienen Metionina o Formil Metionina como primer aminocido al ser analizada su composicin y secuencia. Esto significa la existencia de una etapa de procesamiento o que las protenas sufren algunas modificaciones antes de ser completamente funcionales. Entre estas modificaciones post-traduccin se encuentran: a) Modificaciones del Amino terminal y Carboxilo terminal. b) Perdida de las secuencias sealizadoras o "pptido seal". Aquellas secuencias que dirigen el destino final de las protenas, una vez en su lugar ya no son necesarias (Figs. 51,52 - 14 ).

Pre Pro Protenas

Nt Ct

Secuencia Funcional Pre

Pro Pre - Secuencia : Generalmente se emplea para indicar el lugar donde el pptido funcional ser Pro - Secuencia : Su salida se relaciona con la adquisicin de la estructura funcional por la pro Secuencia Funcional : Es la prote'ina con la conformaci'on 'optima para llevar a cabo su funci

Fig 51 - 14. Protenas con secuencias intermedias que sealizan su destino y el momento de entrar en funcin.

c) Modificaciones a los aminocidos. Los aminocidos como Ser, Thr y Tyr pueden ser fosforilados como ocurre en la Casena, otros como el Glu Carboxilados. Algunos otros pueden sufrir deaminaciones como ocurre en el paso de Gln a Glu o de Asn a Asp. Otros aminocidos pueden ser Hidroxilados, como Pro a OH-Pro o Lys a OH-Lys, Tyr a 3,4 Dihidroxifenilalanina, etc. d) Unin a carbohidratos o Glicosilacin. En aquellas glicoprotenas de lubricacin como las Mucoprotenas, los carbohidratos se unen a los aminocidos como Asn, Ser y Thr. e) Adicin de grupos prostticos no aminoacdicos. Algunas protenas como Hemoglobina, Citocromo C, Mioglobina reciben grupos HEME o grupos prostticos. f) Procesamiento proteoltico en los Zimgenos.

728

Hctor Rocha L. DNA

g) Formacin de puentes -S-S- durante el procesamiento proteoltico como en la insulina. h) Isoprenilacin. La protena Ras sufre la unin al farnesil pirofosfato, quedando con una cola hidrofbica con la que se pega a las bicapas aportndole su carcter transformante. (Para mayor informacin ver Captulo de Protenas).
Seal de la Secuencia

Caperuza m pppG 5'

GUA

Partcula Reconocedora de la Seal

UAA

A A A ( A ) A A3 ' n Poli A

Receptor del Ribosoma

Receptor de la Peptidasa Partcula Reconocedora

RETICULO ENDOPLASMICO

de la Seal

Protena Terminada

Fig 52 - 14. Asociacin entre poliribosomas y Retculo Endoplsmico Liso, por medio de un receptor especfico y la partcula reconocedora de la seal en el polipptido.

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729

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ALGUNAS CARACTERISTICAS DEL GENOMA HUMANO.

El contenido total del DNA en el humano es el genoma y consiste en 3109 pb (pb= pares de bases). Se le encuentra representado por 23 cromosomas individuales aportados por cada padre, es decir 22 autosomas ms el cromosoma X o Y segn sea el sexo de los progenitores (X: mujer, Y: hombre), de esta manera una persona tendr 46 cromosomas ms el par XX (mujer) o XY(hombre). Los cromosomas difieren fsicamente cuando son teidos y observados al microscopio (Kariotipo), presentando diferentes bandeos y tamaos. Es decir, solo los cambios groseros en su estructura pueden ser detectados, como lo son la prdida de una copia, las rupturas y translocaciones. As tenemos, que una tercera copia del cromosoma 21 se asocia al sndrome de Down o trisoma del cromosoma 21. Sin embargo, los cambio sutiles de unas cuantas a tan solo una base no pueden ser detectados como ocurre con la Fibrosis cstica o la Anemia Falsiforme. Por esta razn, con el fin de predecir, prevenir y encontrar una cura a estas enfermedades parti el Proyecto Genoma Humano en 1990. Se pensaba que los humanos cuentaban con 80.000 o 100.000 genes, sin embargo investigaciones recientes han mostrado que no son ms de 30.000 comparados a los 6000 u 8000 genes, que se encuentran presentes en los procariontes.. Los genes humanos en este nmero son capaces de controlar todas las etapas de la existencia de la clula, como ser embriognesis, desarrollo, crecimiento, reproduccin, etc. Algunos especmenes, como el Salmn son tetraploides con cuatro copias de un gen, mientras que otras especies, como lo es un tipo particular de ciervo es haploide con al menos una copia de cada gen. Sin embargo la cantidad total de DNA en este animal es similar a la encontrada en los ciervos diploides. Otro hecho sorprendente es lo que ocurre al comparar la cantidad de DNA presente entre las ranas, algunos peces y el hombre. Los anfibios poseen una mayor cantidad de DNA y se podra pensar que se encuentran en una etapa superior de la evolucin al asumir que cuentan con una mayor cantidad de genes expresados. Sin embargo no ocurre as, ya que una gran parte de su DNA es "intil" o no codificante y se encuentra formado por secuencias de relleno que no son precisamente genes. Los 30.000 genes humanos estaran codificados por cerca del 3% de su DNA total, mientras que el resto (97%) pasara a ser DNA "basura" o DNA "intil", sin embargo poco a poco se han desarrollado las tcnicas y medios para estudiar este ltimo tipo de DNA y hasta la fecha se ha visto que es responsable de algunas importantes funciones. Gran parte del DNA "basura" o "intil" esta formado por secuencias repetitivas que son caractersticas de cada persona y algunas de ellas se encuentran localizados en lugares tales como los centrmeros o punto de unin de los cromosomas al huso durante la divisin celular y en los telmeros o extremos del cromosoma. As tenemos que la familia "Alu" de secuencias repetidas tiene 300 o 500 pb y cuenta con cerca de 500.000 copias, algo as como el 4% del genoma humano. En esta familia de secuencias repetidas se piensa que estaran los centros en que se forman las burbujas durante la replicacin del DNA. Existen algunas hiptesis que le atribuye a este DNA repetitivo, la cualidad de no ser ms que un parsito de los genes tiles al observar que una parte del DNA humano y de los vertebrados superiores no codifica y que la otra parte es de secuencias repetidas. Este hecho

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permite deducir que los genes tiles se encuentran dispersos en un mar de DNA no codificante.
A pesar de lo anterior, un reciente enfoque atribuye a los cromosomas con sus distintas secuencias la cualidad de ser "Organelos Informacionales", que presentan un sofisticado sistema de mantenimiento de su estructura y control de la expresin de los genes. Este sistema estara radicado en el % de DNA considerado como "intil" o DNA " basura". Esta hiptesis se basa en observaciones que han demostrado la existencia de al menos 5 secuencias regulatorias por gen, donde algunas de ellas se encuentran enterradas entre las secuencias denominadas intiles e incluso dentro de las secuencias de tipo repetitiva. Las mutaciones en el DNA minisatlite, formado por secuencias altamente repetitivas se han visto asociadas a algunos tipos de cncer mamario, colorectal, vejiga y an leucemia aguda. Otras secciones del DNA repetitivo que se encuentran en los centros y extremos del cromosoma, parecen ser centro de unin para protenas que protegen los extremos del cromosoma para que este no se "deshilache" en aquellos puntos o bien cumplen con el papel de reparar las posibles lesiones que ocurran en este lugar. Este DNA es parte del "DNA intil" y se denomina DNA satlite, aunque sus secuencias son de mayor tamao que las presentes en el DNA minisatlite. Otra funcin que posiblemente se pueda atribuir al "DNA basura", es que codificara para ciertas secuencias de RNAs que no se traduciran en protena y que actuaran en la modulacin de la expresin de los genes. Su mecanismo de inhibicin sera mediante la unin de este RNA regulatorio a una de las hebras del DNA en el gen mismo o al RNA producido por este. Ms an, este RNA regulatorio podra ser tambin parte de los Intrones que se encuentran durante el procesamiento del RNA heteronuclear en Eucariontes. En general el "DNA basura" constituido por el 97% del DNA en humanos consta de las siguientes secuencias:

INTRONES : Secuencias que no codifican protenas y que se encuentran entre los genes en Eucariontes separando las distintas regiones que si codifican (Exones) en los distintos dominios que forman una protena.
Por otro lado, el genoma Eucarionte presenta islas de secuencias cortas que se repiten una y otra vez en arreglos cortos y largos, los que se denominan DNA repetido en tandem (TR DNA) o bien DNA Satlite:

SATELITES: Secuencias cortas que se repiten de 100 a 1000 veces en el centro o extremo de los genes. Se dice que de la estabilidad estructural de estas regiones depende la sobrevivencia del cromosoma.
Otros tipos de estas mismas secuencias, an ms cortas son los mini y microsatlites que se pueden denominar como Secuencias Repetidas de Nmero Variable o VNTR (Variable Number Tandem Repeats) MINISATELITES: Secuencias similares a la satlite, pero ms cortas y que se encuentran en cualquiera parte del cromosoma. Algunos defectos en su secuencia estn asociados con cncer.

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MICROSATELITES: Secuencias repetitivas an ms cortas que los minisatlites. Sus defectos estn tambin asociados con cncer.
Las repeticiones de una secuencia son altamente variables en distintos individuos e incluso el nmero de repeticiones en un locus especial es distinto en los cromosomas paterno y materno para este mismo locus que posee un individuo, es decir es heterozigoto Una tcnica altamente especfica para identificar la individualidad y que se emplea en anlisis fornsico consiste en distinguir el nmero de repeticiones de una secuencia dada perteneciente al DNA de cada sospechoso dejado en la escena de un crimen, ya sean pelos, piel, sangre o semen.

Sondas

La figura muestra los sitios de corte del DNA por una endonucleasa de restriccin (enzima Hinf1 extrada de Haemophylus Influenzae, estirpe 1 y que es capaz de reconocer una misma secuencia especfica las veces que se encuentre presente en la doble hebra de DNA procediendo a cortarla). Esta enzima reconoce el mismo sitio de corte, en dos segmentos de DNA que difieren en el largo de las repeticiones, es decir c/u de ellos posee lo que se llama un Nmero Variable de Repeticiones en Tandem o Variable Number Tandem Repeats con 8 y 3 repeticiones respectivamente. Los fragmentos una vez separadas sus hebras podrn hibridizar con la sonda o hebra de DNA marcada, que identifica la zona repetitiva en cada uno de los casos. Ambas zonas repetitivas pueden separadas por su tamao mediante Electroforsis. Otro alcance de esta tcnica es la variabilidad entre los sitios de restriccin o corte (Variable Restriction Site) por las Endonucleasas de Restriccin en zonas no codificantes del DNA. Este proceso es particularmente comn y puede ser empleado en el reconocimiento de individuos. La aparicin o desaparicin de un sitio de corte por una Endonucleasa de Restriccin, puede ocurrir cundo tan sola una de las bases sufre una mutacin. Por ejemplo un cambio de AGATCC por GGATCC, introduce un nuevo sitio de corte para la enzima Hinf en un segmento de DNA y este hecho permite distinguir un individuo de otro. Este tipo de polimorfismo se traduce en variabilidad en el largo de los segmentos de DNA producto de una digestin con una endonucleasa determinada y pasan a llamarse Polimorfismos en el Largo de los Fragmentos de Restriccin o RFLPs por Restriction Fragment Length Polymorphisms.

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En la figura, se observa que el fragmento superior tiene solo dos sitios de corte y el inferior tres sitios, por lo tanto despus de ser separados por tamao, la sonda ser capaz de identificar cada uno de ellos. En el siguiente Captulo se explicar con ms detalle cada una de estas tcnicas.

REGIONES NO TRADUCIDAS EN EL EXTREMO 3'(3'UTR): Las secuencias finales al extremo 3'de regiones codificadoras de protenas en el gen, son seguidas de DNA que es transcrito en RNA, pero que no es traducido en protena. Estas secuencias contienen regiones que regulan la actividad del gen mismo. RNA HETERONUCLEAR (RNA hn): Solo el 25% del transcrito primario o RNAhn corresponde a los Exones e Intrones que darn origen al RNAm. El 75% restante no se sabe que papel desempea. RETROTRANSPOSONES: Desarrollos posteriores respecto a los Transposones ha demostrado la presencia elementos conocidos por las siglas LINE y SINE o elementos intercalados largos y cortos respecitvamente. Se caracterizan por ser secuencias del DNA que pasan por RNA antes de volver a incertarse en distintos lugares del DNA. ELEMENTOS INTERCALADOS CORTOS O "Short interspersed elements" (SINEs): son de 100 a 400 pbs y comprenden a los genes que dan origen a RNA small nuclear o RNAsn, RNAs de transferencia o RNAt y RNA ribosomal especialmente RNAr 5S. Todos ellos son originalmente transcritos por RNA pol III. Los ms comunes son la secuencia Alu (300pbs) con 106 secuencias (11%). Dependen de la maquinaria de LINE para copiarse y pegarse en el genoma.Son copias de secuencias repetitivas que se encuentran repartidas a lo largo del genoma humano sin orden alguno. La secuencia ALu nombrada anteriormente pertenece a esta familia. Se sabe que estas secuencias pueden "saltar" a distintas partes del genoma (Transposones) e insertarse en un gen. Son causantes de enfermedad como la neurofibromatosis-1 presente en el caso del "hombre elefante". ELEMENTOS INTERCALADOS LARGOS (LINEs): Corresponden a un 18% del total del genoma. Son similares a los anteriores, pero ms largos como de 7000pb. Son causantes de enfermedad ya que por el mismo mecanismo anterior producen la discontinuidad del gen donde caen. Los LINEs constituyen unos (850.00 en genoma humano. El mecanismo por el cual los LINE, especialmente la familia L1 (LINE-1) ejercen su funcionan consiste en la transcripocin del DNA L1desde unos cientos de pares de bases hasta 90000pbs. Cera de 50 (6500 pbs) de ellos son funcionales, es decir se transcriben y se traducen. Codifican 3 protenas Endonucleasa , Transcriptasa Inversa. La regin con secuencia LINE L1-DNA se transcribe en RNA L1 por la RNA pol II. El RNA L1 se asocia a ribosomas y fabrica unas protenas: Transcriptasa Inversa y Endonucleasa. Posteriormente las Protenas y RNA se asocian y vuelven al ncleo donde la actividad de Endonucleasa corta al DNA en una secuencia blanco en un Intron y la Transcriptasa Inversa retrotranscribe el RNA L1I en DNA L1, e introduce el DNA aumentando al distancia entre los exones. Por lo tanto, similares personas pueden tener los mismos exones con distinta separacin Se sospecha que su presencia regula la eficinecia de la transcripcin en los mismos genes, pero de distintas personas.Se supone que este mecanismo pudo dar origen a los Pseudogenes sin promotores o intrones.

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TRANSPOSONES: Actun provocando dao a la expresin de un gen cualquiera sea el lugar donde se incertan, exones, intrones , intensificadores y promotores. Solo hacen ms copias de si mismos. Su funcin en Humanos no se sabe. Los Transposones se encuentran muy bien caracterizados en las plantas.

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25) DESARROLLOS POSTERIORES

Al continuar con la descripcin del genoma humano podemos decir que los genes se pueden agrupar en diferentes tipos, entre ellos tenemos las familias o grupos de genes que son muy similares en la secuencia de sus exones o de los pptidos que codifican, indicando con ello que han evolucionado desde un nico gen ancestral que se ha duplicado y diversificado. Algunos de los cromosomas humanos se encuentran llevando la mayora de la informacin (cromosoma 19: 23 genes/ 10 6 pb), mientras que otros son pobres en genes (cromosoma 5: 5 genes/ 106 pb) y tienen una mayor proporcin de DNA de relleno.

Entre los genes se pueden distinguir dos grandes tipos, aquellos inducibles o que se expresan bajo determinadas condiciones metablicas y los constitutivos, que se clasifican como de mantencin o "housekeeping". Estos ltimos son activos en todas las clulas cumpliendo funciones comunes. Entre estos ltimos se pueden clasificar las enzimas corrientes del metabolismo y entre los primeros algunas enzimas marcapasos. Dentro de las familias de genes es posible encontrar a los pseudogenes o genes inactivos como se los nombr anteriormente y que debido a una mutacin en los elementos que controlan su expresin permanecen silenciosos en la actualidad. Entre los genes de las cadenas de la Hemoglobina, el gen Delta permanece silente mientras que los Alfa y Beta se expresan. A su vez ambos parecen ser el producto de un crossing over desigual ocurrido entre sus genes. Otros genes se caracterizan por encontrarse anidados o "nested", tambin se les denomina solapados. Estos genes se encuentran dentro de otros genes en la misma hebra o en la hebra opuesta y no se expresan usualmente. En general los genes de los organismos superiores o Eucariontes, son discontinuos y presentan los llamados Extrones o partes codificantes y los Intrones o partes no codificantes, pero que tambin se transcriben aunque son posteriormente eliminadas al madurar el transcrito primario o RNAhn (RNA heteronuclear) en el RNA mensajero. En bacterias o Procariontes los genes son del tipo continuo, sin Intrones. Los Intrones van desde las 0,1kB (1kB = 1000 bases) hasta 1 kB o ms y pueden existir dos como en el caso de las cadenas Alfa y Beta de la Hemoglobina hasta 7 en la Ovoalbumina. Algunos de estos Intrones como ha visto tienen actividad enzimtica propia y pueden catalizar sus propias reacciones de corte y empalme del transcrito primario para formar el RNAm.

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Los Extrones parecen codificar para zonas o dominios especficos en las protenas que les confieren una determinada caracterstica. Su existencia se justifica parcialmente al pensar que las protenas de Eucarionte han evolucionado intercambiando exones para obtener nuevas capacidades adaptativas antes de esperar a la aparicin de mutaciones puntuales que puedan ocurrir o no en cada una de ellas con el mismo fin. La familia del gen Beta de la Hemoglobina se encuentra dispuesta en varias copias que se emplean durante las distintas etapas del desarrollo u ontogenia como son, la etapa embrionaria fetal, la infancia primaria y el estado adulto. Presentando un total de 5 genes homlogos a lo largo de 80 kB. Se encuentran dentro de esta familia los llamados Pseudo genes 1 y 2, los cuales presentan una secuencia algo divergente a la original y no determinan a una protena ya que son inoperantes. Por lo tanto dentro de las 80kB en que se encuentran dispersa la familia Beta, solo 3kB pertenecen a los genes operantes de las globinas, o sea un 4% del total. Igual cosa sucede con otros genes como los de la Ovoalbmina o los genes de los Antgenos de Histocompatibilidad del ratn, con espacios no codificadores de 5 a 15 kB entre cada gen y con un promedio en total de un 10% de DNA no codificador. Parece ser evidente que la existencia de familias de genes dedicados a un fin entrega un mayor poder de adaptabilidad a la especie. Cada copia de una enzima correspondiente a una determinada familia de genes tendr caractersticas especiales de actividad bajo una determinada condicin, como lo es el pH, temperatura, fuerza inica, etc. Esto demuestra que la duplicacin de un gen original y su divergencia puede ser un poderoso motor evolutivo al variar este nuevo gen presentando caractersticas de funcionamiento y adaptabilidad distintas al gen original.

Por ltimo se puede concluir que los genes Eucariontes presentan una determinada dinmica interna, la que ocurre en un ambiente de secuencias no codificadoras rica en repeticiones y que pueden actuar como la causa o la seal de numerosas variaciones genticas junto con el control de la expresin de los genes. Es posible comparar esta disposicin a una solucin acuosa, en que los genes seran el soluto y las secuencias repetitivas el solvente. Cualquier cambio de uno de los componentes afecta al otro en el estado dinmico en que ambos se encuentran interrelacionados.

El proyecto Genoma Humano pretende arrojar luz sobre las distintas posibilidades que se han analizado en el prrafo anterior, contribuyendo al diagnstico, prediccin y susceptibilidad a las enfermedades. En la actualidad se han identificado cerca de 30.000 genes de los supuestos 100.000 genes que se haban propuesto. En la actualidad se ha encontrado que, entre la mosca Drosophyla de la fruta (13.500 genes), el gusano C. elegans (19.000 genes) y humanos, existe una gran similaridad en la informacin contenida en sus genes (genes homlogos) y se ha propuesto que cada uno de ellos actuara como las unidades de aquel juego denominado LEGO, donde se pueden construir variadas formas desde un automovil a un edificio con las mismas piezas. Gran parte del DNA codificante pertenece a los factores de Transcripcin que regulan la expresin de los genes como ocurre en el Ciclo Celular y muchos de los genes cofificantes producen ms de una protena por medio del corte y empalme alternativo (alternative

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splicing) incluyendo protenas intensificadoras (Enhancers) de la trascripcin basal. Esto nos entrega un nmero superior de protenas que los mismos 30.000 genes descubiertos (Protemica). A la vez existen genes pequeos desde un exon a cerca de 80 exones cubrinedo una buena cantidad de bases de varios millones.La protena promedio tiene 450 aminocidos y 4 exones a lo ms. Aprendiendo ms del material gentico y su entorno, se desarrollar una nueva y mejor tecnologa, tanto en la secuenciacin como en la computacin asociada a ella, para as analizar y relacionar los datos obtenidos junto con revisar los aspectos ticos, legales y sociales que este nuevo procedimiento implique. Volver al inicio

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