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Laboratorio de Principios de Qumica Orgnica Grupo 6

Cromatografa en capa fina.

Becerra Pedraza Mnica. Crdenas Torres Laura. Departamento de Qumica, Universidad Nacional de Colombia. Bogot-Colombia.

Resumen En sta prctica de laboratorio se llev a cabo la cromatografa de capa fina, mediante el uso de diferentes eluyentes con el fin de separar una muestra problema, indicando el solvente ms apropiado para la separacin de la misma. Palabras claves: Eluyente, fase estacionaria, fase mvil. 1. Introduccin La principal utilidad de la cromatografa en capa fina consiste en seguir el curso de reacciones qumicas y biolgicas, realizar anlisis cualitativo de pequeas cantidades de muestra y determinar las condiciones para la cromatografa en columna a presin atmosfrica y a alta presin. Son de uso distintos tipos de placas cromatogrficas, existen aquellas que traen consigo indicadores de fluorescencia que permiten una mejor visualizacin de las manchas arrastradas por la fase mvil por medio de la ayuda de la luz ultravioleta. Existen tambin aquellas de resolucin de silicagel de un tamao de partcula especial que permite realizar separaciones delicadas sembrando poca cantidad de muestra y cuyo desarrollo sea de slo 3 o 4 cm y existen tambin placas de fase reversa o invertida donde la fase mvil es ms polar que la fase estacionaria. (Alicia & Arturo, 1998) En la cromatografa de capa fina un solido, sorbente o soporte de la fase estacionaria, se extiende en forma de capa sobre una placa de vidrio o polietileno, de forma que la fase mvil fluya a travs de ella. Dependiendo de las propiedades que el solido en cuestin presente, la separacin cromatografica ser consecuencia de sucesos de particin, intercambio inico, exclusin o absorcin. El suceso de inters trabajado ser el de absorcin, donde el sorbente empelado retiene algunos de los constituyentes de la fase mvil al desplazarse por el mismo, las fuerzas intermoleculares involucradas son en su mayora de Van Der Waals. Cuando se trata de fijar la eficacia y la resolucin de la cromatografa en capa fina, se suele hablar como en cualquier otro tipo, del equilibrio de distribucin de las fases con respecto al soluto, regido por la constante o relacin de distribucin:

Sin embargo cuando se estudian las relaciones de espacio en este tipo de cromatografas debe tenerse en cuenta que la muestra analizada nunca abandona el sistema correspondiente, por lo cual estas relaciones son una funcin del desplazamiento. En capa fina se define el RF (factor de retraso), cuya definicin hace

referencia a una relacin entre la velocidad de desplazamiento del soluto y la velocidad de desplazamiento de la fase mvil.

A un tiempo dado, la expresin anterior se transforma en:

Dicho factor es el que caracteriza el comportamiento de un soluto en un sistema cromatografico de capa fina, y se vera afectado por las condiciones experimentales, como temperatura, fase mvil y estacionaria, entre otros.(Valcarcel Cases, 1988)

2. Procedimientos experimentales En la prctica de laboratorio llevada a cabo, se trabajo en base a una fase estacionaria (silicagel) y tres fases mviles (Tolueno, Metanoly ter de Petrleo) en cmaras cromatogrficas independientes. Inicialmente se llevaron las tres cmaras cromatogrficas y las placas de vidrio a un horno que se mantuvo en una temperatura de alrededor 87 - 93C con el fin de eliminar toda la humedad que podra encontrarse presente en cada uno de ellos y con esto asegurar una cromatografa de tipo adsorcin resorcin mediante la activacin de las placas de slicagel. En ste proceso es inevitable eliminar toda la humedad existente en las placas puesto que como es conocido, se pueden formar sales hidratas y para eliminar dicha humedad acumulada en stos sitios se hace necesario llegar hasta el punto de ebullicin de dichas sales y de ste modo liberar stas ltimas molculas de agua. En cada cmara se dispusieron dos placas las cuales estaban conformadas por: la primera de ellas constaba de una aplicacin de la muestra problema y una aplicacin de dos patrones diferentes (las tres manchas se ubicaron equidistantes entre s y a una distancia de 1cm de la base de la placa como lo indica la Figura 2). Los patrones que se trabajaron fueron: Amarillo de Sudn, m-nitroanilina, rojo de metilo y sudan amarillo.

Organizar los solventes en orden de polaridad

Determinar las distancias desde el punto de siembra hasta el puntofinal

Determinar frente del solvente

Elegir tres de ellos, (asignados)

Retirar la placa de la cmara, cuando el solvente este aproximadamente a 1,0cm del borde superior de la placa

Escoger la mejor combinacin de solventes para realizar una nueva separacin

Llenar tres cmaras con 1,0 cm del solvente correspondiente

Permitir el ascenso del solvente

Sembrar tres placas con los tres patrones correspondientes y la muestra

Introducir una placa en cada cmara

Figura 1. Diagrama de flujo del procedimiento experimental

3. Clculos y Resultados

Figura 2. Fotografa de los resultados obtenidos en las seis lminas cromatogrficas, todas las distancias estn en

centmetros. M= Muestra, P1:Rojo de metilo, P2:Sudan III, P3: m-nitroanilina, P4: Sudan Amarillo.

Tabla 1. Distancia recorrida por cada solvente (todas las distancias estn en centmetros), datos ilustrados en la Figura 2.

Solvente Patrn

ter de petrleo Tolueno Metanol 0 0 0 0.1 0.1 5 0 2.2 1.5 2.5 2.5 7 4.7 5 0 5 5.5 5.7

Rojo de Metilo Sudan III m- nitroanilina Sudan Amarillo Muestra Frente Solvente

Tabla 2. Medida de la velociddad para cada patrn con cada uno de los eluyentes.

Rf Rojo de metilo Sudan III mnitroanilina Sudan Amarillo

ter 0 0 0 0.02

Tolueno Metanol 0 0.44 0.214 0.357 0.854 0.909 0 0.877

Tabla 3. Medidas de velocidad expresadas como Rst.

Rst Rojo de metilo Sudan III mnitroanilina Sudan Amarillo

ter 0 0 0 1 4

Tolueno Metanol 0 1,14 1,66 1 1,17 1,1 0 1,1

Muestra de clculo

Para el patrn 2 (Sudn III) con tolueno como eluyente se tiene:

4. Anlisis de resultados La cromatografa en capa fina es un mtodo muy efectivo para la determinacin de los componentes que tiene una sustancia desconocida; la efectividad de este procedimiento depende directamente de la polaridad o apolaridad de la muestra y del eluyente que se utiliza, ya que esta operacin se basa nicamente en las fuerzas intermoleculares existentes entre dichas sustancias. Durante la prctica se utilizaron tres eluyentes, cada uno con caractersticas diferentes, por lo tanto es importante analizar el efecto de cada uno de ellos: En una primera cmara la cual contena ter de petrleo como eluyente presento desplazamiento tanto para la muestra como para el patrn 4. Lo cual indica que el ter de petrleo presenta una polaridad menor respecto a los patrones y la muestra al punto de no permitir el desplazamiento. La segunda cmara, la cual contena tolueno como eluyente, presento desplazamiento tanto de la muestra, como de los patrones 2,3 y 4. En la figura 2 se observa que el desplazamiento esta aproximadamente a la mitad de la placa, lo cual representa que la muestra y los patrones tienen una polaridad menor con el tolueno en comparacin con el desplazamiento en la placa con etr de petrleo. En la Figura 2 se observa que el patrn 2 se desplazo a una distancia de 2.2cm desde su aplicacin, a esta misma altura se observa una mancha ntida roja de la muestra. El patrn 3 recorri una distancia de 1.5cm, la muestra presenta una coloracin amarilla a esta altura, por lo cual se puede concluir que estos dos patrones estn presentes en la muestra. El patrn 4 tuvo un desplazamiento de 2.5cm con una coloracin naranja, pero al comparar con el desplazamiento de la muestra a esta misma distancia se puede notar que a esta altura se encuentra la mancha roja correspondiente a la identificacin del patrn 2 por eso se concluye que los patrones 1 y 4 no se encuentran presentes en la muestra.

En la ltima cmara, la cual contena metanol como eluyente, se observ un mayor desplazamiento tanto de la muestra como de los patrones, esto evidencia una mayor polaridad del metanol siendo este ms afn respecto a la muestra y los patrones. Siendo as esta diferencia mucho menor en comparacin con el tolueno, lo que permite que haya un gran desplazamiento a travs de la placa. Para este ensayo el patrn 1 tuvo un desplazamiento de 4.7cm, el patrn 2 un desplazamiento de 5cm al igual que para el patrn 4. A partir de la figura 2 se concluye que para este eluyente se encuentran presentes en la muestra los patrones 2 y 4. Las valores calculados de velocidad para las placas con el eluyente tolueno son mucho menores que los valores para las placas con metanol como eluyente, lo cual ratifica el anlisis presentado con anterioridad, en el cual se explica la influencia de la polaridad en cada uno de los ensayos. A menor Rf la sustancia queda ms retenida en la fase estacionaria y a mayor Rf la sustancia no esta fuertemente unida con la fase estacionaria y es arrastrada por la fase mvil. Para obtener un mejor resultado teniendo en cuenta la consideracin que Rf debe encontrarse entre 0,2 y 0,8 se puede realizar una mezcla de eluyentes entre tolueno y metanol en una relacin (1:1).

A partir de lo obtenido en las tres cmaras se evidenci que en la muestra se encontraban presentes tres patrones (P2,P3 y P4), lo cual no es consecuente con la informacin suministrada en el laboratorio ya que la muestra problema deba contener slo dos patrones. Esto puede deberse a que la muestra se encontraba contaminada.

5. Conclusiones Los patrones Sudn III y m-nitroanilina se encuentran presentes en la muestra. La efectividad de la cromatografa en capa fina depende de la polaridad o apolaridad, tanto del eluyente que se utiliza, como de las muestras a analizar, ya que si el eluyente y los analitos son altamente polares, el eluyente al desplazarse en forma vertical arrastrara con l a los analitos y los dispondra a una misma distancia del punto de aplicacin, con lo cual no se obtendra ningn resultado; si por el contrario el eluyente es apolar, y los analitos son polares, o viceversa, se atraeran mutuamente y los analitos no se desplazaran, teniendo en cuenta lo anterior, para realizar una buena cromatografa se debe equilibrar la polaridad del eluyente.

6. Cuestionario Qu ocurre si al introducir la placa cromatogrfica, el nivel del eluyente alcanza el sitio de aplicacin de la mancha?

Si el eluyente alcanza el sitio de aplicacin de la mancha, los componentes se disuelve, impidindose de esta forma la separacin, ya que no se presentara capilaridad y por consiguiente, no se llevara a cabo el arrastre. Cul es el efecto de la polaridad en la cromatografa?

La polaridad en la cromatografa es muy importante, ya que de esta propiedad depende la velocidad de migracin de las sustancias, por la relacin entre la fase mvil y estas. Debido a esto, es necesario el 6

establecimiento de series eluotrpicas que se encargan de clasificar los solventes teniendo en cuenta su polaridad, del menos al ms polar. Los compuesto polares tienen afinidad con solventes polares, y los no polares con solventes no polares; del mismo modo aquellas sustancias que son menos afines a la fase mvil y presentan afinidad por la fase estacionaria se quedarn en el camino. Cules son las consecuencias de una columna mal empacada?

La volatilidad es un parmetro de un gran nmero de sustancias analizadas por medio de procedimiento cromatogrficos. Si la sustancias bajo anlisis tiene una alta volatilidad, se dificultara la adsorcin en la fase mvil y por ende su ascenso por la placa. Adicionalmente, se podra presentar un ensanchamiento en la banda y por consiguiente baja resolucin en la mancha, haciendo necesaria la determinacin del nmero de platos tericos de la placa y quizs aumentar dicho nmero. Cules son las diferencias entre cromatografa de gases y lquidos?

La diferencia radica en que en la cromatografa de gases la fase mvil no interacciona con las molculas del analito, utiliza disolventes polares y la nica funcin de este mtodo es el transporte del analito por la columna, mientras que en la cromatografa de lquidos, la fase mvil es necesaria, participando en esta un solvente lquido que puede ser una sustancia pura o una mezcla de diferentes solventes caracterizando la velocidad de elucin y la resolucin de cada mancha para su anlisis posterior. Profundizacin sobre fluorescencia para sustancias incoloras.

Los indicadores para la luz ultravioleta permiten localizar algunos de los compuestos separados, evitando de sta manera las reacciones de coloracin que los altera qumicamente. Por lo anterior, existen placas que traen impregnadas un indicador de fluorescencia para facilitar la identificacin de las muestras, de otro modo se hara necesario pasar la placa a una etapa de revelado que sustancialmente se hace bajo la influencia de la luz ultravioleta, para ello se puede utilizar una fase estacionaria que contenga un indicador de fluorescencia (F254 o F366) En los indicadores enunciados, el subndice representa su longitud de onda de excitacin. Tambin podra accederse a la introduccin de la placa en vapores de yodo o el roco de launa solucin de Agua cido Sulfrico. El indicador que se adiciona a los sorbentes para que produzca una intensa fluorescencia cuando se exciten con luz U.V. de onda corta (234nm) es generalmente el silicato de zinc activado con magnesio, en una proporcin del 2%. Los compuestos presentes en la placa que absorben esa longitud de onda contrastarn en forma de manchas oscuras sobre un fondo verde. De manera anloga, el indicador que permite el revelado con luz U.V. de longitud de onda larga (366nm) es generalmente fluorescena sdica que emite una fluorescencia azul sobre la cual resaltarn las manchas oscuras, correspondientes a los compuestos que absorben a esa longitud de onda. Tambin, pueden detectarse sustancias que no absorben a esas longitudes de onda porque se disminuye la fluorescencia en el sitio correspondiente, por ejemplo lpidos y esteroides saturados.(Torres de Young, 1994) Parmetros de la Cromatografa lquida de alta eficiencia.

La cromatografa de alta eficiencia se fundamenta en impulsar mecnicamente el eluyente con ayuda de una bomba y de ste modo el proces suceder con una mayor velocidad a la presentada convencionalmente ya que en esencia, como el eluyente no asciende por capilaridad o no desciende por gravedad ste proceso se agiliza. [2]

ste tipo de cromatografa se lleva a cabo especialmente bajo las siguientes consideraciones: Alta sensibilidad, adaptacin a determinaciones cuantitativas, separacin de especies no voltiles, separacin de especies termolbiles. De igual manera, este tipo de cromatografa est basada en el descubrimiento de que las separaciones cromatogrficas mejoran mucho si la fase estacionaria est formada por partculas esfricas de tamao uniforme y muy pequeas. El tamao reducido de la partcula asegura tener una gran rea superficial para adsorber mejor y una forma esfrica permite un empacamiento estrecho y uniforme. En la prctica se suelen utilizar micro esferas recubiertas de slice, de 10 a 25 de dimetro, preparadas especialmente. Slo 15 g de estas micro esferas ocuparan una superficie igual a la de un campo de ftbol americano. Se requieren bombas de alta presin para hacer pasar el disolvente a travs de una columna de cromatografa de alto rendimiento y se usan detectores electrnicos para monitorear la aparicin de material eludo de la columna.(McCabe, 1991)

7. Bibliografa Alicia, B. P., & Arturo, A. V. (1998). MTODOS EXPERIMENTALES DE LABORATORIO EN QUMICA ORGNICA. Washington: Eva V. Chesneau. McCabe, W. L. (1991). Operaciones bsicas en ingeniera qumica. Madrid: Mc Graw Hill. Torres de Young, S. (1994). Introduccin a la cromatografa. Valcarcel Cases, M. (1988). TECNICAS ANALITICAS DE SEPARACION. Barcelona : Reverte S.A.