Desarrollo embrionario y reconocimiento materno de la preez

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Los factores que comprometen el desarrollo embrionario involucran procesos como la proliferacin celular, el desarrollo y mantenimiento del cuerpo lteo, las funciones del oviducto y del tero, la implantacin y vascularizacin del embrin, entre otros.
Nstor Tovo L.1; Arturo Duica A.2; Henry Grajales L.3 * nitoviol@unal.edu.co

Es determinante la interaccin entre varios factores en el proceso de desarrollo y de implantacin embrionaria en la hembra

bovina. Desde el estadio de ovocito, se observa en el lquido oviductal sustancias como piruvato, bicarbonato, aminocidos libres, oxgeno, CO2, carbohidratos, lpidos, esteroides y factores de crecimiento, que son aportadas entre otros por la mucosa del oviducto que en interaccin con otras producidas por el mismo ovocito participan en su mantenimiento. Llevada a cabo la fertilizacin, se observa que las secreciones hormonales especficas interactan con determinados factores para desencadenar el desarrollo del embrin. Especialmente se destaca la Progesterona (P4), hormona secretada por el Cuerpo Lteo (CL) el cual tiene una duracin activa y prolongada, rasgo caracterstico de la preez en los mamferos. La P4 acta en el tero estimulando y manteniendo las funciones necesarias para el desarrollo embrionario temprano, esto con la finalidad de llevar a cabo la implantacin, placentacin y desarrollo fetal. De acuerdo a esto se ha afirmado que el control endocrino para la sntesis de protenas uterinas durante el desarrollo embrionario temprano est influenciada principalmente por la accin de la P4, la cual es la responsable de los cambios cualitativos y cuantitativos en el medio ambiente uterino, controlando la sntesis y secrecin de por lo menos 10 protenas. Segn esto se asume que deficiencias de P4 podran causar que el endometrio llegue a ser deficiente en cuanto a la nutricin histotrpica, fuente disponible para el crecimiento, mantenimiento y supervivencia del conceptus (embrin con todas sus membranas asociadas). Estas deficiencias de origen endocrino estaran contribuyendo a aumentar los niveles basales de mortalidad embrionaria (ME), niveles que probablemente se deban a una seleccin natural ineludible, la cual busca con este mecanismo la eliminacin de genotipos poco competentes. Desarrollo embrionario Los factores que comprometen el desarrollo embrionario y el subsiguiente crecimiento fetal son complejos ya que involucra procesos como la proliferacin celular, el desarrollo y mantenimiento del Cuerpo lteo (CL), las funciones del oviducto y del tero, la implantacin y vascularizacin del embrin entre otros. Durante los primeros estadios de divisin celular desde una clula hasta el blastocisto temprano alrededor del da 7 - 8, el embrin se encuentra encerrado en la llamada zona pelcida, donde sus requerimiento para mantenimiento se basan en el piruvato y oxalacetato. En estas primeras etapas antes de la fertilizacin, se ha evidenciado la presencia de factores de crecimiento (FC) como el transformador alfa (TGF-), el transformador beta (TGF-) y el derivado de plaquetas (PDGF), lo cual sugiere que estn involucrados en el proceso de desarrollo temprano del ovocito. Entre el tercer y cuarto da posterior a la fertilizacin (fase de 8 a 16 clulas), el embrin migra del oviducto hacia el cuerno uterino en donde la glucosa es utilizada como sustrato energtico. El FC similar a la insulina tipo 1 (IGF-I) podra estar involucrado en este proceso de descenso embrionario, ya que el ARNm que codifica para IGF-I ha sido encontrado en el oviducto bovino durante esta fase de migracin. A los 5 o 6 das de vida embrionaria (fase de 16 a 32 clulas), se lleva a cabo el proceso de compactacin celular, formndose contactos que desarrollan uniones firmes entre las clulas. En esta etapa el embrin comienza a funcionar como un organismo llamado Mrula, el cual es relativamente independiente del ambiente uterino y su supervivencia parece depender de su programacin gentica. Durante este estadio se expresan las anormalidades cromosmicas procedentes del padre, lo que podra desencadenar en mortalidad embrionaria (ME).

El desarrollo de uniones intracelulares estrechas en el estadio de Mrula durante la compactacin, es seguido de la acumulacin de lquido formando una cavidad central que recibe el nombre de blastocele, la cual tambin acumula lquido proveniente del metabolismo mitocondrial. La localizacin de la bomba sodiopotasio (Na+/K+) activa en la membrana basal del trofoblactodermo para transporte inico activo, esto establece un gradiente que induce movimiento de lquido hacia adentro del blastocele, provocando expansin que hace que las clulas de la Mrula compactada se ubiquen hacia la zona externa o interna de las vesculas llenas de lquido, con lo cual se forma una capa celular externa que recibe el nombre de trofoblasto y una masa celular interna llamada embrioblasto, originndose de esta manera el estadio de Blastocisto; el cual alrededor de los 8 das de vida posee aproximadamente 120 clulas asociadas con la masa celular interna (embrioblasto) (25%) y el trofoblasto (75%). Aproximadamente al 9 o 10 da de vida (fase de 160 clulas) el blastocisto eclosiona de la zona pelcida por combinacin de acciones fsicas y enzimticas de la vescula en expansin. Esta liberacin podra involucrar sntesis de prostaglandinas por parte del embrin ya que la P4 estara evitando la expansin y liberacin del blastocisto. Las enzimas plasmina y tripsina activan al blastocisto lo cual causa reblandecimiento de su zona matriz permitiendo la expansin y ruptura a lo largo del plano ecuatorial para la salida de la masa celular. Inmediatamente, se establece el primer contacto del embrin y el epitelio uterino materno, lo cual desencadena un intercambio de nutrientes y prepara el ambiente para un estado de preimplantacin embrionaria. Tras la liberacin el embrin comienza a cubrir fsicamente parte del endometrio para poder comenzar a regular la produccin de PGF2 uterina la cual cumple funciones de lutelisis.

El estado de preimplantacin embrionaria in vivo, estara regulado por factores de crecimiento de origen materno y embriona rio, como el TGF-, TGF-1, PDGF-, IGF-I, IGF-II, TGF-2, TGF-3, CSF-1, Interleucina 3 (IL-3) e IL-6; adems citoquinas como el factor inhibidor de la leucemia (LIF). La regulacin de la receptividad del tero a la implantacin del blastocisto, podra estar ejercida por una glucoprotena transmembranosa denominada Musina 1 (Muc1), la cual es expresada en la superficie de gran parte de epitelio del tracto reproductivo. Esta glucoprotena es abundante en la fase no receptiva y se reduce notablemente o puede estar ausente para el momento de la implantacin, con lo cual se abre paso a la cascada de adhesin del trofoblasto embrionario, accin regulada por las

integrinas en el lumen del epitelio endometrial, donde se involucran protenas como la LGALS15, SPP1 y la fibronectina oncofetal en el caso de ovinos. Como la sntesis epiteliar de Muc1 est regulada por la P4, la perdida de receptores nucleares para esta hormona en el epitelio uterino (da 8 10) reducira la produccin de Muc1 y se abrira un estado receptivo para la adhesin del embrin. Para el da 10 se reduce la produccin de la P4, lo que conlleva igualmente a la reduccin de la concentracin de Muc-1. Esta reduccin permite la interaccin y contacto entre factores adhesivos como las integrinas y sus receptores, acercando el embrin a la superficie uterina y formando un tipo de placentacin epiteliocorial.

Varios investigadores han reportado la expresin de integrinas en rumiantes, las cuales son secretadas por las glndulas endometriales y detectadas a lo largo de la superficie del lumen uterino hacia los das 19 a 21 de preez (periodo temprano de adhesin con puntos visibles entre carnculas y cotiledones). Se sugiere que la v3 es una de las ms verstiles integrinas capaz de vincular protenas como la fibronectina, fibronectina oncofetal, vitronectina, tenascina, galactina - 15 y osteopontin de la cual se reporta que el epitelio glandular de ovejas preadas expresa su mRNA. Tambin se ha observado que la expresin endometrial de esta protena es regulada por la P4 y no por el IFN-. En vacas se reporta especficamente la expresin de sub unidades de integrinas 1, 3, 6 y v3. Otra molcula vinculada a la adhesin embrionaria, es la molcula 1 de adhesin celular 1 (GLYCAM -1), la cual es secretada por el endometrio y ha sido detectada en vacas preadas, encontrado sus mximas concentraciones hacia el da 15 y 17 de gestacin. Se ha sugerido que el trofoblasto comienza a adherirse firmemente al lumen del epitelio endometrial hacia el da 16, observndose durante esta adhesin del embrin bovino y ovino el desarrollo de microvellosidades, las cuales son proyectadas hacia el interior de la luz de las glndulas uterinas. Estas vellosidades proporcionan un anclaje transitorio y una estructura absorbente para el embrin mientras sigue completndose la implantacin. Posteriormente estas microvellosidades se reducen en longitud lo que conlleva a un contacto ms cercano entre estas y el epitelio uterino, el cual termina comprimindose hacia la superficie trofoblstica interbloqueandose con las proyecciones citoplsmicas en la superficie del trofoblasto hasta que sus microvellosidades vuelven a desarrollarse, de esta forma generando una adhesin compleja. Igualmente se sugiere que solamente las clulas mononucleadas del trofoblasto embrionario son las que se adhieren al lumen del epitelio endometrial. En cuanto que las clulas binucleadas del trofoblasto podran estar participando de alguna forma en la formacin del sincitio maternofetal, escencial para la implantacin exitosa y posterior crecimiento placentomal; en donde se forman paquetes de clulas trinucleadas. Igualmente las clulas binucleadas podran estar involucradas de alguna manera en la sntesis y secrecin de protenas (lactogeno placentario) y hormonas esteroideas (P4) entre otras. Se ha planteado por algunos autores que los mecanismos que intervienen en el desarrollo embrionario, implantacin y desarrollo

placentario son an complejos, lo que hace que se desconozca el papel de muchas de las molculas presentes en el proceso de la gestacin. Las protenas asociadas a la gestacin (PAGs) son, junto con molculas conocidas como el lactgeno placentario y el IFN, producto de las clulas trofoblsticas (mononucleadas y binucleadas) del embrin y tejido placentario de mamferos ungulad os.

Varios estudios han revelado la expresin de ARNm en la placenta de rumiantes la existencia de multitud de genes de PAG. La elevada homologa que caracteriza estas molculas dificulta la purificacin y aislamiento de formas simples, por lo que slo se ha conseguido analizar la secuencia de un nmero muy reducido de PAGs.

Hacia el da 42 pos fertilizacin termina el perodo embrionario al completarse el periodo de diferenciacin, evidencindose el feto en el cual la mayora de los tejidos, sistemas y rganos se encuentran ya formados.

Reconocimiento materno de la preez

El reconocimiento materno de la preez (RMP) se define como el periodo crtico en el cual el conceptus (embrin con todas sus membranas asociadas) da seales de su presencia a la madre. Este reconocimiento requiere que el conceptus se transforme de esfrico hacia una forma elongada para generar una mayor superficie de contacto con el epitelio uterino, con la finalidad de desencadenar la produccin del factor antiluteoltico denominado Interfern Tau (IFN-); produccin regida entre otros por el estado de desarrollo embrionario. Este interfern es producido en las clulas mononucleares del trofoblasto embrionario entre los das 10 y 25, con produccin mxima alrededor de los das 14 y 19 de gestacin, tiempo en el cual el embrin se encuentra en estado de

precontacto.

La sntesis y secrecin de IFN- se relaciona con la presencia en el fluido luminal uterino del FC IGF- I y IGF-II. La presencia de un solo FC no afectara la presencia de interfern, sin embargo ambos factores podran aumentar significativamente su secrecin, lo que podra indicar un papel importante para los FC similares a la insulina en el RMP. El IFN- comienza a establecer efecto antiluteoltico es a nivel de la regin intercaruncular, en donde las clulas responden ms a concentraciones de Oxitocina (OT). La expresin gnica de IFN- se ha detectado en la regin de contacto de la implantacin celular, entre las clulas mononucleadas del trofoblasto embrionario y las clulas epitelio del lumen endometrial.

De acuerdo a la clasificacin de la Sociedad Internacional de Interferones, estos son glucoprotenas sintetizadas durante la respuesta inmunitaria as como bajo influencia de mltiples estmulos antignicos o mitgenos; igualmente poseen propiedades antivricas y antiproliferativas.

El IFN- se clasifica como una protena cida con peso molecular de 19 kDa y cuenta con 172 aminocidos. Es el primer interfern clasificado en la familia tipo I cuyas propiedades no solamente son antivricas y es expresado por una familia de genes que est restringida a especies de rumiantes como vacas, ovejas y cabras.

Durante la fase ltea la P4 tiene una doble funcin en la regulacin de la expresin de receptores para la OT en el tero, induciendo la presencia de altos niveles de receptores para P4 en el endometrio (modulacin en alta), con lo cual se inhibe la expresin de los receptores para estrgenos (RE) y para oxitocina (ROT), fenmeno que se conoce como el "bloqueo de la P4". No obstante, la misma P4 comienza a ejercer gradualmente una regulacin para la disminucin de la expresin de sus propios receptores (modulacin baja) en el epitelio luminal, perdiendo as su habilidad para suprimir la expresin endometrial de los RE y ROT, por lo cual en el caso de existir preez el embrin debe extender el "bloqueo de la P4", previniendo as la produccin pulstil de PGF2 mediante la se crecin de IFN- (factor luteotrpico). Este efecto antiluteoltico del IFN-, resulta en el mantenimiento estructural y funcional del CL, por lo tanto se asegura la secrecin de P4 que es esencial para mantener un ambiente uterino que soporte los acontecimientos crticos para el desarrollo exitoso del conceptus.

Seal luteotrpica

La formacin del CL activa la sntesis y secrecin de P4 por parte de esta glndula endocrina transitoria, con ello se incrementan sus receptores en el tero hacia los primeros das del diestro (regulacin en alta), lo que desencadena el bloqueo de la expresin del gen para RE, as mismo se previene que los estrgenos incrementen la expresin de genes para ROT.

Hacia el final de la mitad de la fase luteal del CE los receptores de P4 en el tero comienzan a disminuir (regulacin en baja), desencadenando un incremento en la expresin de RE y ROT, con lo cual se desencadenan los factores necesarios para causar luteolisis, evidencindose un nuevo ciclo estral en el caso de no existir preez.

El IFN- producido por las clulas mononucleares del trofoblasto embrionario, acta de forma parcrina ligndose a sus receptores en las clulas endometriales, lo que desencadena el bloqueo de la expresin de ARNm que codifica para la expresin del gen de receptores alfa de E2 (RE) y la expresin del gen para ROT, impidiendo de esta forma el desencadenamiento del mecanismo endometrial luteoltico. Sin embargo el interfern no inhibe la produccin basal de la PGF2.

Algunos autores sugieren que al ligarse el IFN- a su receptor de membrana, induce la va de transcripcin citoplasmtica (StA RT), protena que fosforilada forma un complejo que migra al ncleo, all se une a la regin reguladora de los genes inductores del interfern que podran estar bloqueando uno o ms pasos de la va de sntesis de la prostaglandina. Igualmente se ha propuesto que el IFN- tambin ejerce un efecto antiluteoltico incrementando los niveles de cido linolico, el cual inhibe por competencia de co x 2 al cido araquidnico, con lo cual la sntesis de PGF2 se ve afectada.

En el mecanismo antiluteoltico se sugiere que participan adems del IFN- la prostaglandina E2 la cual ejercera proteccin del CL, el factor activador de las plaquetas (FAP), este ltimo posiblemente en sinergismo con el interfern y quizs otras protenas de origen trofoblstico entre otros.

Bsicamente el RMP est regulado por la capacidad del endometrio en responder a las seales generadas por el embrin, lo que desencadena el bloqueo en la produccin de PGF2. Este bloqueo depende bsicamente de la elongacin del conceptus el cual debe cubrir una adecuada cantidad de puntos de cuerno uterino para comenzar a generar la sntesis de IFN-. Teniendo en cuenta lo anterior se ha evidenciado que el conceptus bovino vara de tamao que va de 15 a 250 mm. para el da 17, con lo cual se resalta la importancia del desarrollo embrionario que es regulado en gran parte por interacciones guiadas por la P4.

Seal luteoltica

La vaca ovula espontneamente, lo cual es dependiente del ciclo estral que es repetitivo de acuerdo a su duracin hasta el establecimiento de la preez. Por tal razn se podra decir que el ciclo estral es dependiente de la accin del endometrio (epitelio luminal y glandular superficial), si se tiene en cuenta que este es la fuente del factor antiluteal (PGF2) cuan do la vaca no se encuentra preada o cuando no se reconoce su preez.

Durante el diestro temprano, la sntesis de P4 producida por el CL recin formado comienza a disponer el tero para el establecimiento de la preez, pero igualmente activa mecanismos determinantes para la produccin endometrial del factor luteoltico.

Hacia los das 10 y 15 del ciclo estral, cuando comienza a disminuir el nmero de receptores de P4 en el tero (modulacin baja), comienzan a aumentar los RE endometriales los cuales inducen la expresin de ROT. Los E2 provienen de los folculos en crecimiento y estimulan el aumento de sus receptores alfa. La OT proviene de las clulas luteales grandes; igualmente es producida en el hipotlamo y almacenada en la neurohipfisis.

La alta concentracin de OX igualmente comienza a provocar la prdida de sensibilidad del endometrio, por lo cual luego de un lapso de tiempo se deja de secretar PGF2. El intervalo entre pulsos de PGF2 est determinado por la prdida de la sensibili dad del endometrio a la OX, y por el tiempo en que tarda en recuperarla. As, el mecanismo de retroalimentacin positiva se interrumpe y vuelve a establecerse hasta que pasan 6 horas, tiempo suficiente para que el endometrio recupere la sensibilidad a la OX; por tal motivo los pulsos de PGF2 se presentan con un intervalo de 6 a 8 horas.

En la clula endometrial la unin de la OT con su receptor estimula el clivaje de cido araquidnico a partir de la fosfolipasa C

(PLC), la cual activa la fosfolipasa A2 (PLA2) (localizadas en la membrana plasmtica). Intervienen para este fin mensajeros como el inositol trifosfato (IP3) y el diacylglicerol (DAG) (sistema de segundo mensajero fosfatidil inositol diacilglicerol protena kinasa C). El IP3 estimula la liberacin de Ca ++ de las reservas intracelulares. El DAG activa la protena Kinasa C (PKC) la cual estimula a la PLA2 en presencia de Ca ++ para que posteriormente se induzca la liberacin de cido araquidnico de los depsitos fosfolipidicos en el epitelio endometrial (la P4 en etapas tempranas de CE induce incremento en las reservas de fosfolpidos).

La transformacin del cido araquidnico en PGF2, es regulada por la isoforma ciclooxigenaxa 2 (COX 2) de la prostaglandina sintetasa, enzima identificada en el epitelio luminal de vacas preadas, la cual limita la sntesis de las prostaglandinas. La actividad de esta enzima se incrementa durante el diestro temprano por accin de la P4 la cual es inducida por el estradiol, factores de crecimiento e interleuquinas. La concentracin de COX 2 se reduce cuando el IFN- comienza a ser secretado por parte de las clulas del trofoblasto embrionario.

La ciclooxigenasa (Prostaglandina G/H sintetasa) cataliza el paso limitante en la biosntesis de prostaglandinas, que es la conversin del cido araquidnico a prostaglandina H2 (PGH2), la cual es convertida rpidamente a PGF2 gracias a la prostaglandina F sintetasa entre otras.

Al final de cada ciclo estral hacia el da 16 - 17 el CL sufre lutelisis (inhibicin de la esteroidognesis - induccin de la apoptosis) por la accin de la PGF2, la cual es producida en el epitelio endometrial y en menor proporcin por el CL, esta es vertida a la vena uterina, de donde por difusin pasa a la arteria ovrica y por contracorriente alca nza al CL (esto permite a la PGF2 viajar a la arteria ovrica sin entrar a la circulacin pulmonar, en donde podra ser enzimticamente inactivada en los pulmones), en donde se une a receptores ubicados en las clulas luteales. All por eventos intracelulares se presenta la muerte de las clulas por apoptosis mediante el desencadenamiento de cascadas de sealizacin que involucran hormonas como la prolactina; citoquinas como el Factor de Necrosis Tumoral alpha (TNF), el Interfern gamma (IFN) y el Fas ligando (FasL); especies reactivas de oxgeno (ROS), endotelina-1(E1) y la protena HSP70 de choque trmico, entre otros.

La endotelina -1 se ha identificado como posible mediadora de los efectos de la PGF2 en el flujo sanguneo luteal. La PGF2 estimula a las clulas endoteliales del CL a producir endotelina 1 in vitro e in vivo. Esta endotelina posee actividad vasoconstrictora e inhibe la actividad esteroidognica de las clulas luteales.

El proceso apoptotico parece estar mediado por el ARNm para FAS y FalsL, a travs de la activacin de la caspasa-3. El receptor de FasL es un dimero protico con un solo segmento transmembranal que en su porcin intracitoplasmtica tiene un dominio de unin de muerte celular, al cual se une la protena FADD, que a la vez tiene un dominio efector de muerte, que es el sitio de unin de la procaspasa 8 para formar el complejo sealizador para la induccin de muerte. Las procaspasas 8 reclutadas, se clivan para activarse en caspasa 8.

La luteolisis ha sido planteada en dos pasos: Luteolisis funcional, que consiste en la prdida de la capacidad de sintetizar P4, y luteolisis estructural, que es la involucin del CL acompaada de la prdida en la integridad de sus clulas.

Se sugiere que para que se produzca lutelisis, el CL debe ser expuesto aproximadamente de 5 a 8 pulsos de PGF2 con intervalos de 6 a 8 horas. Esta pulsatilidad ocurre en respuesta a la unin de la OT con su receptor en las clulas del endometrio uterino. Igualmente se plantea que el CL debe alcanzar cierto grado de madurez caracterizado por una amplia vascularizacin y por la produccin de P4 que lleva a niveles por encima de 1 ng/ml., esto ocurre aproximadamente hacia el da 5 del ciclo estral.

Comentario final

La interrelacin activa y adecuada de varios factores son los que determinan el establecimiento y desarrollo embrionario, con lo cual se constituyen mecanismos bioqumicos que desencadenan una seal antiluteoltica basada en el reconocimiento materno de la preez (RMP); cualquier falla en los factores determinantes desencadena en la muerte del embrin. Con respecto a lo anterior se debe tener en cuenta que las hembras pertenecientes a un sistema de produccin, casi siempre maximizan su potencial reproductivo, lo que se traduce en preeces cuando son receptivas (celo, estro o calor), al macho, pero indudablemente un gran porcentaje de los casos en que la hembra repite celo a los 20 22 das (momento esperado), se asume que esta no quedo preada, siendo esto aparente ya que la perdida embrionaria pudo haberse presentado antes del periodo RMP, motivo por el cual la hembra repiti celo en la fecha prevista; si la prdida embrionaria sucede posterior al RMP, el ciclo estral se afecta (ciclo estral largo), lo cual es tomado sin irrelevancia al interior de las empresas ganaderas.

1, 2, 3 Grupo de Investigacin en Biologa de la Adaptacin de los Animales al Trpico, Facultad de Medicina Veterinaria y de Zootecnia, Universidad Nacional de Colombia sede Bogot. 1, 2 Zootecnista, MSc., Mdico Veterinario, MSc. Investigadores vinculados Departamento de Ciencias para la Produccin Animal, Facultad de Medicina Veterinaria y de Zootecnia, Universidad Nacional de Colombia sede Bogot. 3Zootecnista, MSc., PhD. Profesor Asociado DCPA, FMVZ, UNAL sede Bogot.