Los nutrientes que requieren los microorganismos son: H2O, Carbohidratos, Fosforo, Azufre, Calcio, Cobre, etc.

Tambien es necesario brindarlelas condiciones ambientales adeacudas de luz, temperatura, humedad,oxigenacin. Las bacterias crecen a 37C con un pH de 6.5 - 7.5. Los hongos de 27C con un pH de 4.5 6.0 MEDIOS DE CULTIVO Por su consistencia se clasifican por su consistencia, funcin y composicin. Los de CONSISTENCIA: Lquidos: Tambin llamados caldos de cultivo, no contienen agar y se pueden prepara en un matraz Erlenmeyer. Semislidos: Contienen 0.5% de agar y se preparan en matraces pequeos. Slidos: Contienen de 1.5% a 2.0% y se preparan en cajas de Petri o en tubos de ensaye. Por FUNCIN: Selectivos: Diferenciales: Enriquecimiento: Y de COMPOSICIN: Definido: Complejo: Mnimo:

Existen medios cuya composicin permite el crecimiento de: 1. un gran nmero de especies (agar nutritivo, caldo ordinario, agar de Sabouraud), (impidiendo el desarrollo de otros), son los

2. determinados microorganismos denominados medios selectivos. 3.

Otros en cambio, se desarrollan para el estudio de determinadas pruebas fisiolgicas o test

bioqumicos (utilizacin de citratos, acidificacin a partir de azcares, etc.).

Los medios de cultivo poseen una serie de componentes: 1. Indispensables: Entre los primeros se incluye el agua, nutrientes orgnicos (hidratos de carbono, aminocidos, vitaminas, etc) y nutrientes inorgnicos (P, Fe, N, Mg, S, etc) 2. Alternativos: sustancias isosmotizantes (NaCl), agente solidificante (agar-agar), tampones, indicador de pH, etc.

Durante las prcticas se van a manejar medios de cultivo de composicin muy variada y de tres tipos diferentes en cuanto a consistencia: medios slidos, semislidos y lquidos. Este ltimo aspecto es importante a la hora de la preparacin de los mismos. Aunque los medios artificiales o sintticos se pueden preparar a partir de sus componentes individuales, se pueden adquirir comercialmente como medios deshidratados a los que solamente hay que aadir la cantidad de agua necesaria. El fabricante indica la composicin, la caducidad, y la cantidad que debe pesarse por cada litro a preparar e incluso como debe esterilizarse. 1. Disolver los componentes del medio en agua destilada. En muchos casos se parte de un preparado comercial con todos los componentes deshidratados. Siguiendo las instrucciones del fabricante o del profesor, aadir la cantidad de agua adecuada para conseguir la concentracin deseada de los mismos. Si el medio contiene un agente solidificante (agar-agar) hay que calentar el preparado hasta la ebullicin del mismo agitando de vez en cuando, para asegurar una completa disolucin del agar (medios slidos y semislidos); para medios lquidos no es necesario calentar, nicamente se agita la mezcla hasta la completa disolucin de la misma.

2. Esterilizar la disolucin.- Una vez disuelto el medio se debe esterilizar para evitar el crecimiento de contaminantes. Dependiendo de la forma en que vaya a utilizarse el medio, el procedimiento ser diferente: a) Medios slidos en placa.- Tapar el matraz con tapn de algodn y cubrir con papel de aluminio. 0 Llevar a esterilizar alautoclave (121 C) durante 15-20 minutos. Una vez estril repartir en placas de Petri estriles y dejar en reposo para que solidifique.

b) Medios lquidos.- Una vez disueltos los componentes repartir en tubos a razn de unos 2-4 ml por tubo, tapar con tapn de aluminio y llevar a esterilizar en autoclave.

Temperatura
Influencia de la temperatura en el crecimiento microbiano.
Uno de los factores que influyen en el desarrollo de microorganismos son la temperatura, de la cual podemos definir la mxima, ptima y mnima El crecimiento de organismos se ve influenciado por varios factores, entre los que se consideran de realce son la temperatura y la aireacin. En la temperatura, los microorganismos crecen en un margen de temperaturas que se ve delimitado por la temperatura mxima de crecimiento a partir de la cual ya no puede vivir y llegan hasta morir. Y la temperatura mnima en la cual si es de bajo de esta ya no crecen pero no llegan a morir, y la temperatura ptima de crecimiento en la cual su crecimiento se ve favorecido ampliamente por este factor.

Los microorganismos lo podemos clasificar en: Hipertermfilos: De temperatura ptima por encima de los 80C. Muchos de ellos son arqueas. Termfilos: De temperatura ptima entre 45-70C. Suelen ser microorganismos de vida libre Mesfilos: De temperatura ptima entre los 25-45C. Incluye microorganismos patgenos y comensales del hombre y animales de sangre caliente y algunos de vida libre. Psictrofos: La temperatura ptima de este grupo est debajo de los 25 30C. Psicrfilos: La temperatura ptima de desarrollo es entre los 12 15C.

Los mtodos que se emplean para obtener una temperatura constante para el cultivo in vitro de los microorganismos son: 1. La estufa de cultivo.- En ella pueden haber oscilaciones de 1 a 3C. 2. El bao termostatizado.- Permite un mantenimiento ms estable de la temperatura. En l las oscilaciones suelen ser inferiores a 1C. Objetivos Observar la influencia de la temperatura sobre el desarrollo de los microorganismos. Realizacin prctica Se siembran tres placas de agar nutritivo con el cultivo mixto mediante la tcnica de agotamiento de asa o de las estras escocesas. Se llevan a incubar a temperatura ambiente (25C aproximadamente), 4C, 37C y 60C durante 24 horas. Tras la incubacin se observa que las placas que estuvieron a 4 y 60C no presentan crecimiento alguno, mientras que las dos placas incubadas una a temperatura ambiente y otra a 37C, ambas presentan crecimiento aunque este es mayor en la que se incub a 37C. Por lo que la conclusin es que los microorganismos presentes en el cultivo son mesfilos, ya que crecen ptimamente a 37C, mientras que la temperatura ambiente, de entre 22-25C, se encuentra dentro de su rango de crecimiento ya que han crecido pero menos.

24 horas a temperatura ambiente

24 horas a 37C

24 horas a 4C

24 horas a 60C

Para comprobar el efecto de la temperatura mnima (4C) y la temperatura mxima (60C) se llevan a incubar estas dos placas ahora a 37C durante 24 horas. Tras este periodo de incubacin se observa que los microorganismos previamente sometidos a 4C crecen normalmente mientras que en la placa que haba sido incubada previamente a 60C o no crece nada, o pueden aparecer unas pocas colonias lo que indica que alguna especie presente en el cultivo mixto es productora de esporas, estructuras que son resistentes a factores ambientales adversos como las altas temperaturas.

Placa de 4C incubada 24 h a 37C

Placa de 60C incubada 24 h a 37C

Asepsia y esterilizacin

El material y los medios de cultivo donde vamos a crecer a los microorganismos deben de ser utilizados en co aspticas para evitar su contaminacin con los microorganismos presentes en el medio ambiente.

El mechero Bunsen no slo permite crear una zona asptica de trabajo, tambin nos permite esterilizar diverso ins como el asa de siembra o el asa de vidrio, mediante la aplicacin directa de calor.

Esterilizacin del asa de siembra. El asa de siembra o asa bacteriolgica es probablemente la herramienta ms usada por el microbilogo. Consiste en un filamento con un lazo en uno de sus extremos. El otro extremo est unido a un mango. El filamento suele ser de una aleacin metlica que se calienta muy rpidamente. Esta herramienta tan simple nos permite tomar un inculo de un cultivo bacteriano y transferirlo a otro recipiente con medio de cultivo, o a un portaobjetos para su observacin microscpica. El asa de siembra debe de esterilizarse a la llama antes de usarla y despus de haber sido usada. Debe de esterilizarse antes para evitar la contaminacin de los microorganismos en estudio con otros microorganismos que estuvieran presentes en el filamento metlico. Debe de esterilizarse despus de su uso para evitar que los microorganismos que hemos tomado contaminen el laboratorio o sean incluso un riesgo biosanitario. Para esterilizar el asa de siembra ponerla lo ms vertical posible y acercar el filamento a la llama del mechero Bunsen. Cuando todo el filamento se haya puesto al rojo vivo se habr conseguido la esterilizacin. En ese momento retirarla y dejar enfriar antes de tomar la muestra, para evitar que el calor destruya a los microorganismos. Esterilizacin del asa de vidrio por flameado con alcohol El asa de vidrio es utilizada para la extensin de un inculo por toda la superficie de una placa de agar. El vidrio no puede ser esterilizado mediante la aplicacin de calor directo en el mechero Bunsen pues podra fundirse o quebrarse. Para su esterilizacin, el asa debe de ser introducida en un bote conteniendo alcohol 96. Despus, escurrirla sacarla y flamearla a la llama del mechero Bunsen. Cuando el alcohol sea consumido el fuego se apagar por si solo. Esperar un poco para enfriar y proceder a usarla. La esterilizacin por flameado del alcohol es usada tambin con otros materiales e instrumentos como pinzas, portaobjetos y cubre objetos, etc. Precaucin: Se recomienda tener mucho cuidado con el bote de alcohol. Conviene trabajar con el bote alejado de la llama del mechero. En caso de que el alcohol se prenda, mantener la calma. El fuego del alcohol se apaga fcilmente si tapamos el bote y dejamos que no haya oxgeno.

Ebullicin

La ebullicin no es un procedimiento de esterilizacin. Con este procedimiento fsico tan slo alcanz temperaturas de 100C, insuficientes para eliminar formas de resistencia como las endosporas. Peroe s procedimiento nos puede permitir la eliminacin de formas vegetativas, sobre todo de patgenos, reduc significativamente la carga microbiana.

Para la realizacin de esta prctica se parte de un tubo con un cultivo mixto que debe de contener al me especie bacteriana del gnero Bacillus.

Inoculamos 100 microlitros del cultivo mixto en una placa de agar nutritivo. Este ser nuestro control con comparar.

El tubo debe de cogerse con las pinzas de madera, encendemos el mechero Bunsen y le aplicamos la l

Debemos estar vigilantes para evitar que el lquido rebose debido a la ebullicin, o que el tapn salga despedido por los gases emitidos.

El tubo debe de ebullir al menos tres veces. Posteriormente lo dejamos enfriar e inoculamos un volumen microlitros en otra placa de agar nutritivo.

Tras incubar a 37C durante 24 horas las dos placas, observaremos que la placa con el inculo que no llevado a ebullicin muestra una gran cantidad y diversidad de colonias. Si la concentracin microbiana alta incluso puede observarse un cesped bacteriano. En cambio, la placa con el inculo que ha sido llev ebullicin slo debe de mostrar unas cuantas colonias y todas ellas muy similares.

Autoclave
En el laboratorio de Microbiologa es imprescindible trabajar con material y soluciones estriles con objeto de que los resultados que se obtengan correspondan al microorganismo o microorganismos que estn presentes en la muestra en estudio y no a contaminantes que procedentes del medio o los materiales, puedan desarrollarse y falsear las pruebas. Para ello antes de comenzar el trabajo prctico se esterilizar, junto con los medios de cultivo, el material que posteriormente va a ser utilizado. Se entiende por esterilizacin los procedimientos por los cuales se eliminan todas las formas vivas de microorganismos, sean patgenos o no, que se hallen en un material. Esta esterilizacin suele efectuarse con calor hmedo en unos aparatos denominados autoclave

Qu es el autoclave? El autoclave es un instrumento habitual en los laboratorios de Microbiologa. Es un sistema cerrado donde se forma vapor de agua que se somete a una presin elevada, una atmsfera, lo que hace que el agua alcance una temperatura de 121C causando la desnaturalizacin de enzimas lo que conlleva a la muerte de los microorganismos y la destruccin de las esporas. Habitualmente, se esteriliza a 121C durante 20 minutos. El funcionamiento del autoclave El proceso completo de esterilizacin en un autoclave se compone de diferentes fases: 1. Fase de purgado: A medida que la resistencia calienta el agua del fondo del caldern, se va produciendo vapor que desplaza el aire, hacindolo salir por la vlvula de purgado que est abierta. Esta fase termina cuando se alcanza la temperatura de esterilizacin. 2. Fase de esterilizacin: Una vez cerrada la vlvula de purgado y alcanzada la temperatura de esterilizacin previamente seleccionada se inicia el proceso de esterilizacin.

3. Fase de descarga: Terminado el proceso de esterilizacin, deja de funcionar la resistencia calefactora, con lo que deja de producirse vapor y la presin y temperatura del caldern empieza a bajar poco a poco.

Algunas consideraciones para una correcta esterilizacin del material 1. Para que la esterilizacin de medios de cultivo sea eficaz, la temperatura y el tiempo seleccionados deben alcanzarse en todo el lquido. 2. Los recipientes con cierre hermtico deben ser introducidos en el autoclave sin cerrar totalmente el tapn, para facilitar la entrada del vapor durante el proceso. Al vaciar el autoclave despus de la esterilizacin procederemos a cerrar totalmente estos recipientes. 3. Los recipientes vacos precisan de un tiempo de esterilizacin mayor que los recipientes con lquido en su interior.