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PRCTICA No. 6 CROMATOGRAFA

Objetivo: Separar e identificar los componentes de una mezcla problema mediante la tcnica de cromatografa en placa fina. La cromatografa es un mtodo analtico empleado ampliamente en la separacin, identificacin y determinacin de los componentes qumicos en mezclas comple as. !ing"n otro mtodo de separacin es tan poderoso y con tantas aplicaciones.

#escripcin general de la cromatografa

$s difcil definir con rigor el trmino cromatografa, porque el concepto se %a aplicado a una gran &ariedad de sistemas y tcnicas. Sin embargo, todos estos mtodos tienen en com"n el empleo de una fase estacionaria y una fase m&il. Los componentes de una mezcla son lle&ados a tra&s de la fase estacionaria por el reflu o de una fase m&il gaseosa o lquida. Las separaciones est'n basadas en las diferencias en la &elocidad de migracin entre los componentes de la muestra.

(lasificacin de los mtodos cromatogr'ficos

Los mtodos cromatogr'ficos son de dos tipos. $n la cromatografa en columna la fase estacionaria se mantiene dentro de un tubo angosto y la fase m&il es forzada a pasar a tra&s del tubo ba o presin por gra&edad. $n la cromatografa planar, la fase estacionaria est' sostenida por una placa plana o en los poros de un papel. $n este caso, la fase m&il se mue&e a tra&s de la fase estacionaria por accin capilar o ba o la influencia de la gra&edad. $n este captulo se %ar' referencia a la cromatografa en columna. Los mtodos cromatogr'ficos se clasifican en tres categoras basadas en la naturaleza de la fase m&il. Los tres tipos de fases incluyen lquidos, gases y fluidos
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superficiales. +ay cinco tipos de cromatografa lquida y tres tipos de cromatografa gaseosa que difieren en la naturaleza de la fase estacionaria y los tipos de equilibrio dentro de las fases.

(romatografa de elucin
#os componentes a y b se resuel&en en una columna por cromatografa de elucin. La elucin comprende el la&ado de un soluto a tra&s de una columna por agregado de disol&ente fresco. ,na sola porcin de la muestra disuelta en la fase m&il es introducida por la parte superior de la columna, en donde los componentes a y b se distribuyen por s mismos entre las dos fases. La introduccin de una fase m&il fuerza a la posicin disuelta de la muestra %acia aba o de la columna, donde ocurre despus una particin entre la fase m&il y porciones frescas de la fase estacionaria. La particin entre el disol&ente fresco y la fase estacionaria tiene lugar simult'neamente en el sitio original de la muestra. Adiciones posteriores de disol&ente acarrean las molculas de soluto %acia aba o en la columna en una serie continua de transferencias entre las dos fases. (omo el mo&imiento del soluto puede ocurrir slo en la fase m&il, la &elocidad promedio a la cual un soluto migra depende de la fraccin del tiempo que se gasta en esa fase. $sta fraccin es peque-a para los solutos que son retenidos enrgicamente por la fase estacionaria y grande donde la retencin en la fase m&il es de mayor afinidad. Idealmente, las diferencias que resultan en las &elocidades son causa de que se separen en bandas o zonas los componentes de una mezcla a lo largo de la longitud de la columna. $l aislamiento de las especies separadas se logra pasando una cantidad suficiente de fase m&il a tra&s de la columna para %acer que las bandas indi&iduales salgan %acia el e.tremo, donde se pueden recolectar.

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(romatogramas
Si un detector que responda a la concentracin de soluto se coloca en el e.tremo de la columna y su se-al se lle&a a una gr'fica como una funcin del tiempo se obtiene una serie de picos simtricos. $sta gr'fica, llamada cromatograma, es "til tanto para an'lisis cualitati&o como cuantitati&o. Las posiciones de los picos sobre el e e de los tiempos se pueden emplear para identificar los componentes de la muestra0 las 'reas ba o los picos proporcionan una medida cuantitati&a de la cantidad de cada especie.

Los efectos de

las velocidades

elativas de !i" aci#$ % el

e$sa$c&a!ie$to de la ba$da e$ la esol'ci#$

$n la figura 1 se muestran los perfiles de concentracin para las bandas que contienen solutos a y b en la columna de la figura 2 en el tiempo t1 y en un tiempo posterior t3. #ebido a que b es retenido con m's fuerza por la fase estacionaria que a, b se retrasa durante la migracin. Se &e claramente, que la distancia entre las dos se incrementa a medida que se mue&en %acia aba o en la columna. Sin embargo, al mismo tiempo tiene lugar el ensanc%amiento en ambas bandas, lo cual disminuye la eficiencia de la columna como un dispositi&o de separacin. 3ientras que el ensanc%amiento de las bandas es ine&itable, se pueden encontrar condiciones donde esto ocurra m's lentamente que la separacin de las bandas. As como se muestra en la fig. 1, es posible una separacin limpia de las especies considerando que la columna sea suficientemente larga. #i&ersas &ariables qumicas y fsicas incluyen en las &elocidades de separacin de las bandas y su ensanc%amiento. (omo consecuencia, se pueden obtener con mayor facilidad separaciones me oradas mediante el control de las &ariables que 24 aumentan la &elocidad de separacin de bandas, o 14 disminuyan la &elocidad de ensanc%amiento de bandas. $stas alternati&as se muestran en la fig. *.

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Las &ariables que influyen en las &elocidades relati&as a las cuales los solutos migran a tra&s de la fase estacionaria se describen en la siguiente seccin. (on esta e.plicacin se regresa a los factores que uegan un papel en el ensanc%amiento de las zonas. PROC()IMI(NTO 5ara la separacin de amino'cidos como la glicina, 'cido asp'rtico, 'cido glut'mico, tiro.ina0 se puede utilizar como eluente6 n7butanol 7 acido actico glacial 8 agua 9:6261 ;626;4. 5ara la separacin de pigmentos naturales como la clorofila, .antofilia y carotenos, se utiliza el ter etlico. 5ara carbo%idratos como glucosa y fructuosa se emplea acetato de etilo 8 'cido actico glacial 8 agua 9<61614. 5ara separar una mezcla de indicadores 9ro o fenol, azul de bromofenol, ro o congo, azul de bromotimol, naran a de metilo4 se puede separar utilizando6 n7butanol 8 etanol 8 amoniaco 1! 9*62624.
Reactivo Reactivo Sol&entes Sol&entes

Colector Colector
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C o!ato" af*a de "ases

Objetivo: (onocer el mane o del cromatgrafo de gases y separar e identificar los componentes de una mezcla, utilizando la tcnica de cromatografa de gases La cromatografa es la separacin fsica de dos o m's compuestos, basada en la diferente distribucin de dos fases, una de las cuales es estacionaria y la otra m&il. $n el caso de la cromatografa de gases en el fluido es un gas. La cromatografa tu&o sus inicios en 2;)> con la separacin de anilinas por ?. ?. @unge. $n este proceso de separacin de &arios colorantes, @unge tom como base la afinidad color7papel y la diferencia de peso molecular. $sta tcnica, ampliamente utilizada en nuestros das, se conoce como cromatografa en papel. $n 2<>:, AsBett present la utilizacin de columnas de gas empacadas con un absorbente adecuado para separar los pigmentos &egetales. A este proceso se le llama cromatografa de tintas. $n esta tcnica tambin se emple un lquido m&il para remo&er los compuestos adsorbidos en el material de empaque. Los compuestos adsorbidos se eluyeron en la corriente del lquido m&il y pudieron colectarse al final de la columna. Aunque la separacin fue m's bien directa, el problema es m's comple o para la mayora de los sistemas de deteccin y para la cuantificacin de los compuestos eluidos. $n 2</2 3artn y Singe surgieron la posibilidad de utilizar un gas en la fase m&il del cromatgrafo, pero esto se qued slo en teora y nunca se puso en pr'ctica. #entro del desarrollo de la cromatografa de gases, el primer instrumento fue descrito por 3artn y Cames en 2<)1. $mpleaba una bureta autom'tica para detectar y determinar 'cidos y bases, el primer cromatgrafo de gases, satisfizo slo estos dos grupos funcionales. $l &erdadero potencial no se pudo alcanzar %asta la publicacin
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de Aay, del primer cromatograma, en 2<)/. $l detector empleado fue de conducti&idad trmica, que a"n se sigue usando. ?ue %asta 2<)) cuando los primeros instrumentos comerciales aparecieron en el mercado. $n el cromatgrafo se utiliza un gas acarreador 9la fase m&il4 que ba o presin mue&e una muestra de &apor del puerto de inyeccin, a tra&s de una fase estacionaria 9la columna4 donde se efect"a la separacin. Luego pasa al detector donde se con&ierte en una se-al elctrica la cual puede medirse con un graficador. A la gr'fica se le conoce como cromatograma. $l tiempo de retencin absoluto se mide desde el punto de inyeccin a la punta del pico, en cm, pulgadas, o minutos, y constituye un inicio cualitati&o de cada compuesto ba o las mismas condiciones de an'lisis. Los gases acarreadores m's comunes son6 +elio, +idrgeno, !itrgeno y Argn. La consideracin m's importante para seleccionar un gas acarreador es el tipo de detector que se &a a utilizar. 5or e emplo, un detector de captura de electrones que funcione como un sistema pulsante requiere una mezcla de argn y metano. ,n detector de conducti&idad trmica traba a me or con %elio o %idrgeno. 5ara un detector de conducti&idad generalmente no con&iene el nitrgeno ya que reduce muc%o la sensibilidad del mismo. La columna es la parte m's importante del cromatgrafo de gases y consta de tres elementos6 24 ,n recipiente, que es un tubo de metal o &idrio. 14 ,n soporte slido *4 ,na fase estacionaria

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$l tubo no interfiere en la separacin cromatogr'fica, e.cepto cuando una muestra puede reaccionar con l. Los materiales que m's se usan son6 cobre, acero ino.idable y &idrio, el cual se utiliza cuando el metal no satisface las condiciones del an'lisis. $l soporte slido pro&ee una gran 'rea inerte para detener la fase lquida. $s la tierra diatomeas calcinada y seleccionada por un tamiz de metal est'ndar para obtener partculas uniformemente peque-as. La fase estacionaria debe ser la "nica parte acti&a de la columna, la separacin se efect"a entre el gas acarreador y este material. $ste proceso puede &erse como una serie de particiones donde la muestra pasa a la solucin 9o es absorbida4 en la fase estacionaria y subsecuentemente re7e&aporada. La afinidad de la muestra con la fase estacionaria determina el tiempo que los compuestos indi&iduales de la muestra permanecen en la columna. Los compuestos con menos afinidad emergen primero y los de mayor afinidad emergen al "ltimo. +ay una amplia &ariedad de materiales que se pueden usar como fases estacionarias y se clasifican en naturaleza como polares y no polares. ,nos e emplos tpicos son los detergentes, el %ule de silicones, polisteres y &arios aceites y ceras, cuando se establece una seleccin de los materiales es muy importante considerar la temperatura m'.ima que se puede usar en la fase estacionaria, as como la afinidad de la muestra con este material. La longitud de la columna puede &ariar de una pulgada a *>> pies, pero las que m's se usan son de * a 21 pies de largo. La columna puede ser recta, en espiral o en forma de D,E dependiendo del dise-o del instrumento. Los compuestos deben detectarse cuando se separan de la muestra y emergen de la columna al detector. $l detector de conducti&idad trmica emplea una resistencia 9filamentos o termisor4 que se calienta por medio de electricidad. $l gas acarreador disipa el calor del elemento en grado constante, pero cuando la muestra pasa a tra&s
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del detector la proporcin se altera y la temperatura de la resistencia cambia, lo cual tambin causa un cambio en la resistencia del elemento detector y este cambio se transmite a un graficador apareciendo como un pico. $l detector de ionizacin de flama emplea una flama de %idrgeno para la combustin de la muestra y produce iones. ,n potencial #( 9corriente continua4 aplicado entre el colector y las trampas de D etE, genera una corriente que despus se con&ierte en &olta e, se amplifica y aparece en el graficador como un pico. PROC()IMI(NTO

Fperacin del cromatgrafo de gases Garian **)>

2.7 Abrir el tanque de gas acarreador 9nitrgeno4. La presin del tanque est' regulada para ser igual a ;> lbHin1. 1.7 $ncender el regulador de &olta e para que suministre a la lnea 21> GA(. *.7 (olocar el interruptor del cromatgrafo en la posicin de encendido. /.7 La pantalla del (I Garian **)> puede mostrar una leyenda que indica D5oBer ?ailHJarm Start FcurredE o D(%ecKing SystemE oprimiendo la tecla @eset, usted puede ya tener acceso a modificar comandos. Ieneralmente el mtodo a utilizar ya est' incluido en el equipo por personas especializadas, razn por la cual no se modificar' ning"n par'metro. $n caso de ser necesario otro mtodo, con la tecla DActi&eE, como su nombre lo indica, acti&ar el mtodo requerido, tecleando tambin D3et%od LE. ).7 $s necesario esperar para darle al equipo la oportunidad de estabilizarse. $n el panel de control este momento se identifica cuando se enciende la luz de D@$A#ME.

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:.7 3ientras el cromatgrafo se estabiliza, se procede a iniciar el programa SAA@ (+@F3AAFI@A5+M, e ecutable en BindoBs <). =.7 (olocamos el indicador del DmouseE sobre el comando DSMSA$3 (F!A@FLHA,AF3AAIF!E y esperamos a que el indicador de la configuracin del mdulo, &isible en la pantalla, cambie de gris a ro o. (olocamos el DmouseE en DInstrumentE y seleccionamos Garian **)> e inmediatamente aparecer' la pantalla sobre la cual se recibir' la se-al desde el cromatgrafo. $n el instante que la &entana marque @$A#M, el equipo estar' listo para utilizarse. ?F@3A #$ I!M$(AA@ $l cromatgrafo cuenta con un dispositi&o para arrancar autom'ticamente el SoftBare actuando de la siguiente manera6 a4 Aomar 2 ml de muestra con una eringa microltica para lquidos. b4 Introducir completamente la agu a al inyector sin empu ar el mbolo de la eringa y sin empu ar la placa de acero ino.idable que circunda el inyector. c4 $mpu ar el mbolo %asta &aciar el capital. d4 $mpu ar el cuerpo de la eringa de manera que la placa de acero se mue&a %acia aba o y arranque el programa de integracin.

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)IAGRAMA )( FL+,O

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:)

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