Metodologa y tcnicas para el estudio de enfermedades musculares

Dolores Moreno Len. Tcnico Superior Anatoma Patolgica y Citologa INP (Instituto Neuropatologa) IDIBELL HUB (Hospital Universitari de Bellvitge). LHospitalet de Llobregat. CIBERNED

BIOPSIA MUSCULAR Anatoma del msculo esqueltico

Introduccin

Msculo esqueltico

Fascculo

Fibra muscular
(varios mm a varios cm)

BIOPSIA MUSCULAR Anatoma del msculo esqueltico

Motoneurona Tipo I
Miofibrillas

Introduccin

Fibras tipo I y tipo II, y contraccin muscular Tipo I rojas +++ lenta, +++ mitocondrias +++ actividad oxidativa +++ mioglobina +++ gotas lipdicas +++ rpida, +++ glucgeno +++ miofibrillas

Fibra muscular Tipo I Motoneurona Tipo II

Miofibrillas

Tipo IIb blancas

IIa intermedias ++ rpidas IIIc regenerativas

Fibra muscular Tipo II

BIOPSIA MUSCULAR
Esquema fibra muscular
Complejo Sarcoglicanos 2 1 Laminina 2 1 Complejo Distroglicano Caveolina

Introduccin

B T B T T B
Lamina A/C

Distrofina Emerina

Miofibrillas

Actina asociada al esqueleto

Miosina Titina

Mitocondrias B-cristalina Miotilina Teletonina Desmina lpidos

sarcmero

Banda Z -actina

Actina Troponina Tropomiosina Nebulina Sarcoplasma

Sarcolema

Ncleo

Glucgeno

BIOPSIA MUSCULAR
2 1 Laminina 2 Complejo Sarcoglicanos 1 Complejo Distroglicano

Introduccin
Protenas membrana: Patrn distrfico

Caveolina

B T B T T B
Lamina A/C

Distrofina Emerina

Miofibrillas

Actina asociada al esqueleto

Miosina Titina

Mitocondrias B-cristalina Miotilina Teletonina Desmina lpidos

sarcmero

Banda Z -actina

Actina Troponina Tropomiosina Nebulina Sarcoplasma

Sarcolema

Ncleo

Glucgeno

BIOPSIA MUSCULAR
2 1 Laminina 2 Complejo Sarcoglicanos 1 Complejo Distroglicano Caveolina

Introduccin

B T B T T B
Lamina A/C

Distrofina Emerina

Miofibrillas

Actina asociada al esqueleto

Miosina Titina

Mitocondrias B-cristalina Miotilina Teletonina Desmina lpidos Protenas de sostn: patrn MFM Glucgeno
MFM= miopatia miofibrilar

Banda Z -actina
sarcmero

Actina Troponina Tropomiosina Nebulina Sarcoplasma

Sarcolema

Ncleo

BIOPSIA MUSCULAR
2 1 Laminina 2 Complejo Sarcoglicanos 1 Complejo Distroglicano Caveolina

Introduccin

B T B T T B
Lamina A/C

Distrofina Emerina

Miofibrillas

Actina asociada al esqueleto

Miosina Titina

Mitocondrias B-cristalina Miotilina Teletonina Fallo en el metabolismo de la fibra: enfermedades metablicas Desmina lpidos
sarcmero

Banda Z -actina

Actina Troponina Tropomiosina Nebulina Sarcoplasma

Sarcolema

Ncleo

Glucgeno

BIOPSIA MUSCULAR
2 1 Laminina 2 Complejo Sarcoglicanos 1 Complejo Distroglicano Infiltrados Inflamatorios: miositis

Introduccin

Caveolina

B T B T T B

Distrofina Lamina A/C Miofibrillas Actina asociada al esqueleto Miosina Titina Emerina

Mitocondrias B-cristalina Miotilina Teletonina Desmina lpidos

sarcmero

Banda Z -actina

Actina Troponina Tropomiosina Nebulina Sarcoplasma

Sarcolema

Ncleo

Glucgeno

BIOPSIA MUSCULAR Las enfermedades neuromusculares

Introduccin

- La mayora son de carcter gentico y generalmente hereditarias - Son enfermedades crnicas y progresivas - Afectan a la musculatura y al sistema nervioso perifrico - Su aparicin puede producirse en el nacimiento o en otras etapas de la vida - Las caractersticas ms importantes son la prdida progresiva de fuerza muscular, y la degeneracin de los msculos y de los nervios perifricos

BIOPSIA MUSCULAR Enfermedades neuromusculares

Motoneurona Perifrica (Asta anterior de la mdula espinal) Nervio perifrico (fibra nerviosa) Unin Neuromuscular

Introduccin

Fibra Muscular

DISTROFIAS MUSCULARES CONGNITAS DISTROFIAS MUSCULARES GLUCOGENOSIS MITOCONDRIALES MIOPATAS LIPDICAS MIOSITIS MFM (Miopatia Miofibrilar) MIOPATAS CONGNITAS MIOPATAS DISTALES METABLICAS

Hereditarias:
.-Amiotrfias espinales

Neuropatas sensitivo-motora

Hereditarias:
.-Enfermedad Charcot-Marie-Tooth .-Leucodistrfias

Adquiridas:
.-Virales: poliomielitis .-Degenerativas: Esclerosis lateral amiotrfica(ELA)

Enfermedades de la unin neuromuscular

MIOTONAS CONGNITAS PARLISIS PERIDICA DISTROFIAS MIOTNICAS

Hereditarias:
Sndromes miastnicos Congnitos

Adquiridas:
.-Inflamatorias: S. Guillain Barr, polineuropata desmielinizante crnica inflamatoria (PCDI) .-Infecciosas .-Txicas .-Metablicas (e.j. diabetes)

Adquiridas:
Miastenia gravis

BIOPSIA MUSCULAR
Distrofias musculares I
Distrofia muscular de Duchenne
recesiva ligada a X, Xp21,2(distrofina)

Introduccin
Distrofias musculares II
Distrofia muscular de Emery-Dreifuss
recesiva ligada a X, Xq28 (emerina)

Miopatas metablicas
Miopatas mitocondriales
transmisin materna, autosmica dominante, autosmica recesiva ligada a X, espordica

Distrofia muscular de Becker

recesiva ligada a X, Xp21,2(distrofina)

Miopata de Bethlem
autosmica dominante, 21q22,3 (sub-unidades a1 y a2 del colgeno VI) 2q37

Distrofinopatas menores
recesivas ligadas a X, Xp21,2(distrofina)

Lipidosis musculares: Miopatas con dficit de carnitina

autosmica recesiva

Distrofia muscular congnita con dficit de merosina

autosmica recesiva, 6q22 23 (merosina)

Distrofia muscular con dficit de adhalina o de alfasarcoglicano (LGMD 2D)

autosmica recesiva, 17q12-q21 (adhalina o alfasarcoglicano)

Miopatas con dficit de carnitina palmitiltransferasa de tipo II (CTP II)

autosmica recesiva, 1p32 (carnitina palmitiltransferasa)

Distrofia muscular congnita de tipo Fukuyama

autosmica recesiva, 9q31 q32 (dficit parcial de 43 DAG y de merosina)

Distrofia muscular con dficit en betasarcoglicano (LGMD 2E) Distrofia muscular con dficit en gammasarcoglicano (LGMD 2C)

Lipidosis con dficit en acil CoA deshidrogenasa

autosmica recesiva, 12q22-qter (acil CoA deshidrogenasa)

autosmica recesiva, 4q12 (betasarcoglicano)

Sndrome de Walker-Warburg
autosmica recesiva

autosmica recesiva, 13q12 (gammasarcoglicano)

Sndrome MEB (Msculo-Ojo-Cerebro o enfermedad de Santavuori)

autosmic recesivo

Glucogenosis musculares: Enfermedad de McArdle Enfermedad de Tauri

autosmica recesiva, 11q13 (fosforilasa muscular) autosmica recesiva, 12q13.3 (fosfofructoquinasa)

Distrofia muscular con dficit en deltasarcoglicano (LGMD 2F)

autosmica recesiva, 5q33 (deltasarcoglicano)

Distrofia muscular oculofarngea

autosmica dominante, 14q11.2q13

Enfermedad de Pompe
autosmica recesiva, 17q225 (maltasa cida)

Distrofia muscular de cinturas tipo Erb (LGMD 2A)

autosmica recesiva, 15q15 (calpaina 3)

Enfermedades musculares inflamatorias

Polimiositis adquiridas Dermatomiositis adquiridas Miositis por cuerpos de inclusin (IBM o inclusion body myositis)
espordica

Miopatias Miofibrilares (MFM)

Desmina
autosmica dominante 2q35

Distrofias musculares de cinturas (LGMD 1A)

autosmica dominante, 5q22-q34

Miotilina
autosmica, dominante 5q31

(LGMD 2B)
autosmica recesiva, 2p13-p16

FLNC,
autosmica dominante, 7q32.0

Distrofia muscular facioescapulo-humeral (Miopata de Landouzy-Djrine)

autosmica dominante, 4q35

Zasp
autosmica dominante 10q22.3-23.2

Alfa-B-cristalina
autosmica dominante, 11q21-23

BIOPSIA MUSCULAR Recepcin de la biopsia muscular

Historia clnica. Pruebas complementarias

Recepcin

Biopsia muscular

M.E.

Congelacin/OCT

Reserva s/m

Banco Tejidos Banco ADN

Estudio ultraestructural

Cortes criostato

Extraccin de protenas

Extraccin ADN

Estudio EHQ/HQ/IHQ

western blotting

PCR

DIAGNSTICO

Consejo Gentico

BIOPSIA MUSCULAR Recepcin de la biopsia muscular

Recepcin

- Comprobacin de datos del paciente y nmero de registro - Separacin de diferentes fragmentos para sus diferentes estudios: - OCT - Reserva sin montar para western blotting y/o ADN - PFA 4% (paraformaldehdo) - m.e. (microscopa electrnica) - Congelacin de la biopsia muscular al corte transversal en isopentano enfriado en nitrgeno lquido y posterior montaje en OCT - Conservar la muestra a -80C - Cortes de criostato entre 6 y 8 m. Montaje en portas pretratados

BIOPSIA MUSCULAR Recepcin de la biopsia muscular

Recepcin

Fibras sin orientar

Seleccionar los diferentes fragmentos

Orientar las fibras en la misma direccin

Mantener el nmero asignado durante todo el proceso de congelacin

Comprobarcin de los datos y nmero de laboratorio

BIOPSIA MUSCULAR Congelacin de la biopsia muscular

Congelacin
N2

Metilbutano

Congelacin durante 10 en metilbutano frio Inclusin en OCT con la orientacin transversal al corte

Bloque de OCT Reserva sin montar Diferentes pasos de la congelacin de la muestra

BIOPSIA MUSCULAR Tcnicas histolgicas y EHQ de rutina en la biopsia muscular:

-H-E (hematoxilina-eosina) -T. Gomori (Tricrmico de Gomori) -PAS, PAS+D (cido periodico de Schiff, ms diastasa) -NADH (nicotin-adenina deshidrogenasa) -ATPasas (ATPasas miosnicas) -COX (citocromo oxidasa) -SDH (succinato deshidrogenasa) -Fosforilasa -Fosfofructocinasa -oil red/sudn negro

Tinciones

BIOPSIA MUSCULAR Hematoxilina-eosina

(Tincin topogrfica de rutina)

Tinciones

Hematoxilina de Harris: Colorante natural (haematoxylon campechianum): - oxidacin - mordiente (alumbre) Vacuolas festoneadas - progresiva/regresiva - diferenciacin/viraje

Eosina: Colorante artificial derivado del xanteno -regresiva -diferenciacin

Diferentes tamaos de fibras Msculo normal

Valoracin: Forma y tamao de las fibras, necrosis, atrofias, hipertrofias, inclusiones citoplasmticas, infiltrados inflamatorios.

BIOPSIA MUSCULAR Tricrmico de Gomori (TG)

(Tcnica estructural)
Bastones Nemalnicos

Tinciones

Tincin nuclear con Hx de Harris/Weigert Mezcla de colorantes citoplasmticos: - Cromotopo 2R - Fast green - cido fosfostngstico
Msculo normal Inclusiones citoplasmticas

Ragged-red

Bastones Nemalnicos

Vacuolas rimmed

Valoracin: Las mitocondrias, las fibras ragged-red (rojo-rasgadas), las vacuolas rimmed (festoneadas), los cuerpos nemalnicos, la mielina y los nervios se tien de rojo. Resto del citoplasma de color verde oscuro; los ncleos de color lila/negro.

BIOPSIA MUSCULAR Oil red O/ sudn negro

(Tincin de lpidos)

Tinciones
Oil Red Con contraste nuclear

- Colorante Oil Red O o Sudan negro a saturacin en solucin alcohlica. - Capacidad de tincin por comodidad del colorante. - Contraste nuclear con H. de Harris
Sudan Black

Valoracin: Las vacuolas lipdicas y los lpidos neutros se tien de rojo o de negro dependiendo del colorante (Oil Red O o sudn negro)

BIOPSIA MUSCULAR PAS

Tinciones

y PAS + diastasa (Tcnica histoqumica)

Oxidacin de los grupos hidroxilo del glucgeno con cido peridico CH2 OH O H OH O H OH CH2 OH O OH H O OH H O OH H
C

CH2 OH

O O C

CH2 OH O O C O

CH2 OH

O H

HO C H

HO C H

Valoracin: Ncleos lilas y depsitos de glucgeno fucsia. PAS+diastasa: diferencia glucgeno vs mucinas: el glucogeno se va

BIOPSIA MUSCULAR

Tinciones

Tcnicas EHQ (ATPasas miosnicas, NADH, COX, SDH, fosforilasa, fosfofructocinasa) Tcnicas que ponen de manifiesto si existe la actividad del enzima en estudio

Solucin tamponada pH Sustrato Capturdor de color

E= Enzima S= sustrato P= Producto MO= Microscpio ptico EHQ= enzimohistoqumica

Capturador de color

Producto Visible al

MO

BIOPSIA MUSCULAR Tcnicas EHQ: ATPasa miosnica

- Sustrato: Adenosina-trifosfato - Acetato sdico/cido actico; veronal/cloruro clcico - Incubacin a 3 pH diferentes - El capturador de color es cloruro de cobalto y sulfuro de amonio ATP=ADP+P P+ClCo=Co3(PO4)2 pH 4.63 pH4.35

Tinciones

Co3(PO4)2+(NH4)2S =CoS Tipo I rojas, lentas, +++ mitocondrias+++actividad oxidativa pH 9.4 Tipo II blancas, rpidas, +++ glucgeno Valoracin: pH 4.35 fibras tipo I, IIc pH 4.63 fibras tipo I, IIb, IIc pH 9.4 fibras tipo II

BIOPSIA MUSCULAR Tcnicas EHQ: NADH

(NAD Diaforasa)
Citoplasma Membrana Externa Espacio intermembrana

Tinciones

Cit C

- Sustrato: Nicotinamida-adenina-dinucletido - Capturador de color: NBT (cromgeno)

Membrana interna

C-I

C-II

C-III

C-IV

NADH+

- Solucin tampn: Tris - pH 7.4 NADH=NAD+H H + NBT = NBT

-

Normal

Succinato NAD Fumarato Fosforilacin Oxidativa Transporte de Electrones

O2

H2O2

Refuerzo subsarcolmico

Normal

Targets: fibras en diana

Lesin tipo core

Central core

Valoracin: Actividad mitocondrial lila. Complejo I de la respiracin mitocondrial. Diferenciacin de tipos de fibras.

BIOPSIA MUSCULAR Tcnicas EHQ: COX

(citocromo oxidasa)
Citoplasma Membrana Externa Espacio intermembrana

Tinciones

Cit C

- Sustrato: Citocromo C + catalasa - Capturador de color: DAB (cromgeno reducido) - Solucin tampn: tampn fosfato - pH 7.4

Membrana interna

C-I

C-II

C-III

C-IV

NADH+

Normal COXFosforilacin Oxidativa

Transporte de Electrones

Succinato NAD Fumarato

O2

H2O2

COX

Valoracin: Actividad mitocondrial marrn pardo. complejo IV de la respiracin mitocondrial diferenciacin de tipos de fibras

Actividad COX -

BIOPSIA MUSCULAR Tcnicas EHQ: SDH

(succinato deshidrogenasa)
Citoplasma Membrana Externa Espacio intermembrana

Tinciones

Cit C

- Sustrato: Succinato sdico

Membrana interna

- Capturador de color: NBT (nitroblue tetrazolium) - Solucin tampn: tampn fosfato - pH 7.4 SucNa = sucNa+H H + NBT = NBT
Normal

C-I

C-II

C-III

C-IV

NADH+

Normal

Succinato NAD Fumarato

Normal

O2

H2O2

Fosforilacin Oxidativa Transporte de Electrones

Normal

Valoracin: Actividad mitocondrial lila Complejo II de la Respiracin mitocondrial Diferenciacin de tipos de fibras
Refuerzo SDH Fibras ragged-blue

BIOPSIA MUSCULAR Tcnicas EHQ: fosforilasa

NADPH

Tinciones
Glucgeno
ATP AMP

Glucogenolisis

- Sustrato: AMP, glucgeno, glucosa 1-fosfato - Capturador de color: Lugol - Solucin tampn: tampn acetato sdico/ cido actico - pH 5.6 La fosforilasa, activada por el AMP, acta sobre la glucosa 1-fosfato en presencia de glucgeno formando un polisacrido. El polisacrido formado reacciona con el lugol Valoracin: Actividad fosforilasa lila Diferenciacin de tipos de fibras

NADPH

Ruta de las pentosas

Ribulosa-5-fosfato

Glucosa-6-fosfato Glucolisis Fructosa-6-fosfato

Ribosa-5-fosfato

ATP

Fructosa-1,6-bifosfato
2-NADH 2-ATP 2-ATP

Ac. Pivrico

BIOPSIA MUSCULAR Tcnicas EHQ: fosfofructocinasa

NADPH NADPH

Tinciones
Glucgeno Glucogenolisis Glucosa-6-fosfato Glucolisis Fructosa-6-fosfato
Ribosa-5-fosfato ATP ATP AMP

- Sustrato:Arsenato sdico ATP B-nicotinamida adenina dinucletico (B-NAD) - Capturador de color: NBT - 2 Soluciones incubacin: fructosa 1,6 difosfato pH 8.6 fructosa 6 fosfato sulfato de magnesio pH 7

Ruta de las pentosas

Ribulosa-5-fosfato

Fructosa-1,6-bifosfato
2-NADH 2-ATP 2-ATP Ac. Pivrico

Fosk 6

Fosk 1-6

Valoracin: Actividad fosfofructocinasa lila Diferenciacin tipos de fibras

BIOPSIA MUSCULAR

Resultados

Tcnicas histolgicas y EHQ de rutina en la biopsia muscular: utilidad en las diferentes patologas
1 Denervacin
-H-E (Hematoxilina-eosina) -T. Gomori (Tricrmico de Gomori) -PAS, PAS + D -NADH -ATPasas -COX (citocromo oxidasa) -SDH (succinato deshidrogenasa) -fosforilasa -fosfofructoquinasa -oil red/sudn negro

2 Glucogenosis 3 Mitocondrial

4 Miopatas lipdicas

5 Patrn inflamatorio: Miopatas inflamatorias 7 Patrn distrfico

MFM= miopatia miofibrilar

6 Patrn MFM

BIOPSIA MUSCULAR 1. Denervacin

H-E Gomori

Resultados

ATPasa 4.35 msculo normal

NADH: targets (fibras en diana)

ATPasa 4.35: agrupacin por tipos

BIOPSIA MUSCULAR 2. Glucogenosis IV: McArdle

H-E
Fosforilasa Negativa Control Fosforilasa

Resultados
m.e.: Depsito de glucgeno subsarcolmico

Vacuolas subsarcolmicas
Glucgeno
NADPH NADPH ATP AMP

PAS Depsito de glucgeno subsarcolmico

NADH

Glucogenolisis

Ruta de las pentosas

Ribulosa-5-fosfato

Glucosa-6-fosfato Glucolisis Fructosa-6-fosfato

Ribosa-5-fosfato

ATP

Fructosa-1,6-bifosfato
2-NADH 2-ATP 2-ATP

Vacuolas subsarcolmicas

Ac. Pivrico

BIOPSIA MUSCULAR 3. Miopata mitocondrial

H-E TG/ Ragged Red
Citoplasma Membrana Externa Espacio intermembrana Membrana interna

Resultados

Cit C

C-I

C-II

C-III

C-IV

NADH+

Normal

Succinato NAD Fumarato Fosforilacin Oxidativa Transporte de Electrones

O2

H2O2

Refuerzo SDH m.e.: megamitocondrias con inclusiones

Actividad COX-

Refuerzo NADH

BIOPSIA MUSCULAR 4. Miopatas lipdicas

H&E NADH

Resultados

m.e.

Sudan black

Oil Red O

BIOPSIA MUSCULAR Tcnicas histolgicas y EHQ de rutina en la biopsia muscular

Resultados

-H-E (Hematoxilina-eosina) -T. Gomori (Tricrmico de Gomori) -PAS, PAS + D -NADH -ATPasas (Atpasa miosnicas) -COX (citocromo oxidasa) -SDH (succinato deshidrogenasa) -fosforilasa -fosfofructoquinasa -oil red/sudan Black

Tcnicas de IEHQ

5 Patrn Distrfico Patrn MFM

Patrn inflamatorio Miopatas inflamatorias

7
MFM= miopatia miofibrilar DM= Dermatomiositis IBM= Inclusin Body Miositis

BIOPSIA MUSCULAR Tcnicas IEHQ en la biopsia muscular: Tcnica Strep-ABC

- Fijacin con acetona-metanol - Bloqueo de la peroxidasa endgena -Bloqueos de las uniones inespecficas con suero normal - Incubacin en primario especifico - Incubacin en secundario biotinilado - Incubacin Strep-ABC - Revelado con diaminobencidina: DAB
Anti-human made in mouse anti-mouse made in goat biotilinado

IEHQ

H2O2 +DAB-= DAB+=COLOR

IEHQ= inmunoenzimohistoqumica

BIOPSIA MUSCULAR Tcnicas inmunofluorescencia

desmina miotilina

IF

- Fijacin con acetona-metanol - Bloqueos de las uniones inespecficas con suero bovino fetal 10% - Incubacin en anticuerpo primario especifico - Incubacin en secundario marcado con fluorocromo
anti-ratn hecho en cabra conjugado con fluorocromo

anti-humano hecho en ratn

IF= inmunofluorescencia

BIOPSIA MUSCULAR Tcnicas IF confocal

-Fijacin con acetonametanol - Bloqueos de las uniones inespecficas con SBF10% - Incubacin con 2 primarios especficos - Incubacin con 2 secundarios marcado con fluorocromos de diferentes longitudes de ondas de emisin - Anlisis con microscopio confocal
desmina miotilina

IF Confocal
merge

anti-rabbit made in goat conjugado con fluorocromo Y Anti-human made in rabbit

anti-mouse made in goat conjugado con fluorocromo X Anti-human made in mouse

BIOPSIA MUSCULAR

IEHQ Resultado

Marcadores Distrofias: Dys 1, Dys 2, Dys 3 utrofina: DRP1, DRP2 -sarcoglicano -sarcoglicano -sarcoglicano -sarcoglicano -distroglicano emerina merosina (laminina alfa-2) laminina 1 disferlina caveolina

Western-Blot

Marcadores MFM: miotilina desmina ubiquitina B-cristalina filamina C Dys1 gelsolina 5 6 Patrn MFM

Diagnstico

Marcadores linfocitarios: CD4, CD8, MHC clase I Patrn inflamatorio: miopatas inflamatorias

Patrn distrfico

MFM= miopatia miofibrilar DM= Dermatomiositis IBM= Inclusin Body Miositis

BIOPSIA MUSCULAR 5. Miopatas Inflamatorias: dermatomiositis, polimiositis

Dermatomiositis Dermatomiositis

IEHQ Resultado

Polimiositis

Polimiositis: atrofia perifascicular Polimiositis MHC clase I

Control -

DM= Dermatomiositis IBM_ Inclusin Body Miositis

BIOPSIA MUSCULAR 6. Miopata miofibrilar (MFM)

H-E Gomori

IEHQ Resultado

desmina

B-cristalina

miotilina

ubiquitina

m.e. desminopata

C-filamina

miotilina

BF-10

BIOPSIA MUSCULAR 7. Patrn distrfico

H-E COX

IEHQ Resultado

Gomori

NADH

ATPasa 4.35

PAS

BIOPSIA MUSCULAR 7. Patrn distrfico

Dys1
DMB Control

IEHQ Resultado

Dys1

Dys2

Dys2
Distrofinas

Dys3

Dys3

DMB= Distrofia Muscular de Becker

BIOPSIA MUSCULAR 7. Patrn distrfico

DMB Control DMB

IEHQ Resultado

Control

DMB= Distrofia Muscular de Becker

Sarcoglicanos

BIOPSIA MUSCULAR

IEHQ Resultado

Marcadores Distrofias: Dys 1, Dys 2, Dys 3 utrofina: DRP1, DRP2 -sarcoglicano -sarcoglicano -sarcoglicano -sarcoglicano -distroglicano emerina merosina (laminina alfa-2) laminina beta 1 disferlina caveolina 6

western-blotting

Marcadores MFM: Miotilina Desmina ubiquitina Alfa-Bcristalina Filamina C Dys1 Gelsolina 5 Patrn MFM

Diagnstico

Marcadores linfocitarios: CD4, CD8, MHC clase I Patrn inflamatorio Miopatas inflamatorias:
DM, IBM, Polimiositis

Patrn distrfico

BIOPSIA MUSCULAR Tcnica de western blotting

1.-Extraccin de protenas (desnaturalizacin-estructura primaria) 2.-SDS-PAGE % acrilamida + Marcador con p.m. conocidos + electroforesis 3.-Blotting + IEHQ 4.- Revelado en un film 4

Western-Blot

quimioluminiscencia

PM= pesos moleculares SDS-PAGE=sodium dodecil sulfate polyacrilamide gel

BIOPSIA MUSCULAR Tcnica de WB en la biopsia muscular

Western-Blot

Mini-protean III. Electroforesis SDS-PAGE

Geles teidos con coomassie

BIOPSIA MUSCULAR Tcnica de western blotting

Western-Blot

Semy-dry Ponceau, tincin inespecfica de protenas en las membranas despus de la transferencia

BIOPSIA MUSCULAR Tcnica de western blotting en la biopsia muscular

Western-Blot

Cmaras de incubacin para los anticuerpos

Revelado en cmara oscura con luz de seguridad

BIOPSIA MUSCULAR Tcnica de western blotting

Western-Blot

Diferentes exposiciones en dos films

BIOPSIA MUSCULAR Tcnica de western blotting: Distrofia de Becker

Fig.1 400 kDa 1 Fig.2 Coomassie 2 3 4 5 6 7 8 Dys1 Dys2 Dys3

Western-Blot: resultado

50 kDa 35 kDa

9 10 11 12 13 14

200 kDa

Fig. 1 Extractos de protenas de un msculo sano control (carril 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13) y el probando (carril 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14) donde se observa una disminucin en la inmunotincin de todas las protenas y un ligero cambio de peso molecular en la Dys 1( patrn tpico de la distrofia de Becker) Fig. 2 Control de carga teido con coomassie
8 Control 6 Probando

0 Dys 1 Dys2 Dys3 Alfa Bet a Delt a Gamma

BIOPSIA MUSCULAR Tcnica de western blotting

teletonina
1 2 3 1 19 kDa

Western-Blot: resultado

disferlina

3 210 kDa

Miosina Coomassie control probando control

Miosina Coomassie control probando control

Carril 1 y 3: control de msculo sano. Carril 2: probando. Se aprecia la ausencia de teletonina en una distrofia muscular autosmica recesiva tipo 2G causada por mutacin en el gen de la teletonina, y de disferlina en una disferlinopata