El cerebro, la comunicacin

intercelular y los pptidos

Jean-Louis Charli y Patricia Joseph-Bravo
Desde la antigedad se ha propuesto al cerebro
del ser humano como el sitio de las sensaciones
y la inteligencia. Uno de los flsofos que apoy
esta idea fue Hipcrates en el siglo V a.C. Sin
embargo, una tradicin ms antigua considera-
ba al corazn como el centro del intelecto. As
por ejemplo Aristteles en el siglo IV a.C. slo
le otorgaba al cerebro la capacidad de enfriar
los fuidos que bombea el corazn. El abando-
no de esta conviccin fue paulatino, y estuvo
asociado a los descubrimientos sobre la estruc-
tura y funcin del cerebro. Actualmente sabe-
mos que el cerebro, integrando una variedad de
seales que se originan tanto del medio interno
como del externo y ayudado por el resto del
organismo, nos permite responder a estmulos
sensoriales (provenientes de nuestros sentidos),
controlar nuestros movimientos, aprender y re-
cordar, generar emociones, coordinar las funcio-
nes endocrinas y las autnomas, entre muchas
otras capacidades.
nuestro cerebro es parte de lo que se llama
el sistema nervioso, uno de los sistemas encar-
gados de coordinar las actividades de los ani-
males. El sistema nervioso de los animales su-
fri cambios dramticos durante la evolucin.
A partir de sistemas nerviosos en forma de red
se generaron sistemas en los cuales las clulas
que los constituyen se agrupan. En los verte-
brados ocurre una diferenciacin estructural
que protege al cerebro, el cerebelo y la mdu-
la espinal (que en conjunto forman el sistema
nervioso central -SnC) en una cavidad cra-
neana unida a la columna vertebral. El SnC se
comunica con los rganos perifricos a travs
de nervios que salen del cerebro y de la mdu-
la espinal, nervios que contribuyen al sistema
nervioso perifrico (SnP).
Galeno, en el siglo II, inici el estudio ana-
tmico del sistema nervioso al reconocer al
cerebro y al cerebelo y mostrar la existencia de
cavidades (ventrculos) que atraviesan el cere-
bro llenas de un fuido (lquido cerebro espinal).
Sugiri, basndose en una asociacin entre for-
ma (aspecto y dureza) y funcin, que el cerebro
es responsable de las sensaciones y el cerebelo
del movimiento; la circulacin del fuido en las
cavidades y los nervios permitira registrar las
sensaciones e iniciar los movimientos. Por mu-
cho tiempo, y por la falta de tcnicas de anlisis
de la sustancia cerebral, la atencin se man-
tuvo centrada en esta teora. Uno de los pro-
ponentes ulteriores fue Descartes, quien en el
siglo XVII, junto con otros lleg a sugerir que el
cerebro de los animales funcionaba como una
mquina. Para el fnal del siglo XVIII se tena

5
3
Biotecnologia V14 CS3.indd 53 11/14/07 4:59:57 PM
54
|
una buena descripcin anatmica del sistema
nervioso, pero hasta el siglo XIX se iniciaron los
estudios cientfcos (basados en observacin
y experimentacin) sobre su funcionamiento.
Algunos de estos estudios sugeran que las
grandes funciones del sistema nervioso tienen
localizaciones particulares. As, Broca correla-
cionaba la perdida del habla en un paciente con
una lesin, que detectaba, despus de la muer-
te del paciente, en una regin particular del l-
bulo frontal izquierdo de la corteza cerebral.
Las neuronas y la neurotransmisin
En el siglo XIX se demostr que el cerebro est
formado de clulas, tal como otros tejidos. Las
propiedades especiales del sistema nervioso
se deben en gran parte a las caractersticas de
uno de los tipos de clulas especializadas que
lo componen, las neuronas, y a su patrn de
organizacin. Golgi y Ramn y Cajal estudiaron
la estructura de las neuronas del cerebro de
mamferos y aves aprovechando en particular
una tcnica de tincin del SnC desarrollada por
Golgi, que permite observar con el microscopio
ptico en su totalidad una pequea fraccin
de las neuronas teidas al azar. Las neuronas
tienen una regin central o soma, de la cual se
desprenden unas extensiones que se ramifcan,
llamadas dendritas, y otra extensin nica, a ve-
ces muy larga, llamada axn, de donde pueden
surgir varias ramifcaciones que terminan en un
ensanchamiento que se llama terminal nervio-
sa. Asociados en paralelo, los axones forman los
nervios. En contraposicin con Golgi, Ramn y
Cajal propuso que las neuronas son elementos
fnitos e individualizados asociados de manera
seriada a travs de contactos clula-clula. Hoy
en da reconocemos que nuestro cerebro est
constituido por cien billones de neuronas, agru-
padas en ncleos y redes que comunican entre
s distintas reas. Ramn y Cajal demostr que
las neuronas estn organizadas de manera muy
variable, de acuerdo a la regin estudiada.
El mismo Ramn y Cajal, basndose en la
estructura de las neuronas, gener una hipte-
sis crtica para el estudio cientfco de nuestro
cerebro, idea que fue confrmada ms adelan-
te: las neuronas transmiten informacin de
manera unidireccional, del compartimiento
dendrtico hacia la terminal nerviosa. Se puede,
por lo tanto, predecir la direccin de la informa-
cin nerviosa a travs de circuitos neuronales.
Cul es la naturaleza de la informacin que
transmiten las neuronas de las dendritas a las
terminales nerviosas? El descubrimiento de la
contraccin muscular en respuesta a una es-
timulacin elctrica del nervio por Galvani a
fnales del siglo XVIII, llev al abandono de la
teora de los fuidos y a la idea de que el siste-
ma nervioso funciona como una red de cables
elctricos que conducen rpidamente un est-
mulo entre zonas lejanas.
El anlisis experimental de las propiedades
de los axones tuvo que esperar hasta mediados
del siglo XX, cuando Hodgkin y Huxley demos-
traron, en la membrana plasmtica del axn
gigante de calamar, la existencia de conduc-
tancias especfcas para los iones na
+
y K
+
, cuyo
cambio provoca una despolarizacin transitoria
de la membrana plasmtica llamada un poten-
cial de accin. Propusieron que las conductan-
cias se deben a la existencia en la membrana
plasmtica de puertas controladas por el vol-
taje transmembranal, puertas que llamamos
canales inicos y que fueron identifcadas vein-
te aos ms tarde. En respuesta a la suma de
informaciones recabadas en el rbol dendrtico,
estos canales permiten generar en la zona ini-
cial del axn un potencial de accin que se pro-
paga muy rpidamente (alrededor de 10 metros
por segundo) a todo lo largo del axn. El patrn
de disparo de los potenciales de accin, variable
de clula a clula y en una misma clula, es un
cdigo que contiene informacin que es deco-
difcada por las clulas blanco.
La prueba de la existencia de los contac-
tos neurona-neurona propuestos por Ramn
y Cajal, que Sherrington llam sinapsis, tuvo
que esperar hasta la invencin del microsco-
pio electrnico, a mediados del siglo XX. Sin
embargo, los estudios de Loewi, Katz y Eccles
en la primera parte del siglo XX demostraron
que, al nivel sinptico, las neuronas se comuni-
El cerebro, la comunicacin intercelular y los pptidos
Biotecnologia V14 CS3.indd 54 11/14/07 4:59:57 PM
|
55
can entre s (o con otras clulas blanco, como
las clulas musculares) mediante la liberacin
en el espacio intercelular (espacio sinptico) de
sustancias que inciden sobre la clula conti-
gua, causando en sta cambios que permiten
la transmisin del mensaje. Se demostr que
buena parte de la comunicacin intercelular
en el sistema nervioso es de naturaleza qu-
mica y se lleva a cabo por molculas que se
llamaron neurotransmisores. El primer neuro-
transmisor, la acetilcolina, sintetizada a partir
de la colina y del grupo acetil, se identifc a
raz de los estudios de Loewi en los 1920. Aos
despus, se defnieron como neurotransmiso-
res a aminocidos como el acido glutmico y
la glicina, o a derivados de aminocidos, como
la serotonina proveniente del triptofano, las
catecolaminas (dopamina, noradrenalina o no-
repinefrina, adrenalina o epinefrina) derivadas
de la tirosina, y el GABA (cido gama amino
butrico), producto del metabolismo del acido
glutmico. Estos neurotransmisores son ahora
llamados neurotransmisores clsicos.
En la segunda mitad del siglo XX, la utili-
zacin de tcnicas de microscopa electrnica,
fraccionamiento subcelular, cultivo celular y
marcaje metablico, permiti un acercamien-
to a la biologa de las neuronas. En el soma, el
ncleo, los ribosomas, el retculo endoplsmi-
co y el aparato de Golgi permiten la sntesis de
las protenas, algunas de las cuales son trans-
portadas a lo largo del axn, empaquetadas
en vesculas sinpticas. Los neurotransmisores
clsicos se sintetizan en la terminal nerviosa
donde las enzimas responsables de su sntesis
han viajado desde el soma. En la terminal ner-
viosa, los neurotransmisores son concentrados
en las vesculas sinpticas por protenas llama-
das transportadores vesiculares.
Qu induce la liberacin de estos neuro-
transmisores al espacio sinptico? ste es un
proceso regulado y controlado por la llegada de
un potencial de accin a la terminal nerviosa, lo
que facilita la entrada de calcio a la misma; este
in causa cambios conformacionales en prote-
nas intracelulares que provocan el acercamiento
y la fusin de las vesculas sinpticas a la mem-
brana plasmtica, permitiendo la liberacin de
su contenido al espacio sinptico.
Cada uno de los neurotransmisores cuen-
ta con receptores especfcos localizados en
la membrana plasmtica de dendritas, soma
o incluso, de la terminal nerviosa. Existen dos
grandes tipos de receptores: los ionotrpicos y
los metabotrpicos. La unin del neurotransmi-
sor a receptores ionotrpicos (canales inicos)
provoca cambios conformacionales que se tra-
ducen muy rpidamente en un cambio de la
permeabilidad del canal inico, desencadenan-
do alteraciones del potencial de membrana.
Dependiendo del tipo de neurotransmisor y del
receptor al que se acople, y del potencial de la
membrana, el fujo de iones causa una despola-
rizacin (interaccin del acido glutmico con el
receptor de tipo AMPA) o una hiperpolarizacin
(interaccin del GABA con su receptor de tipo
A) de la membrana de la clula receptora. Estos
cambios transitorios del potencial de membra-
na se pueden transmitir de manera pasiva a lo
largo de las dendritas, sumarse y determinan
si se puede iniciar un potencial de accin en el
axn. Los cambios que despolarizan la mem-
brana facilitan el disparo de potenciales de ac-
cin, por lo que se llaman estimuladores; al con-
trario, los neurotransmisores que inducen una
hiperpolarizacin son llamados inhibitorios,
porque difcultan el disparo de los potenciales
de accin.
Cuando el neurotransmisor se une a un re-
ceptor metabotrpico, el cambio conformacio-
nal activa una protena intracelular (protena G)
unida al receptor, desencadenando reacciones
intracelulares que transducen el mensaje a tra-
vs de segundos mensajeros que controlan la
actividad de protenas intracelulares y que pue-
den tambin llevar a alteraciones del potencial
de membrana, si bien de manera ms lenta
que en el caso de los receptores ionotrpicos.
Un mismo neurotransmisor puede presentar
distintos tipos de receptores, tanto ionotrpi-
cos como metabotrpicos.
El neurotransmisor liberado al espacio sinp-
tico genera una seal transitoria. Esto debido,
por un lado, a la desensibilizacin del receptor
El cerebro, la comunicacin intercelular y los pptidos
Biotecnologia V14 CS3.indd 55 11/14/07 4:59:58 PM
56
|
por el mismo neurotransmisor mediante even-
tos rpidos de fosfo-defosforilacin que cam-
bian su conformacin apagando su actividad
y, por otro lado, a mecanismos de inactivacin
del neurotransmisor que, en general, se llevan
a cabo por protenas (transportadores plasm-
ticos) presentes en las membranas sinpticas
que remueven al neurotransmisor del espacio
sinptico. La acetilcolina es inactivada por un
proceso diferente, siendo degradada por una
enzima extracelular (la colinesterasa). La rpida
inactivacin por los transportadores o enzimas
evita la desensibilizacin de los receptores por
el exceso de ligando.
Por medio de tcnicas histoqumicas se
han identifcado los somas donde se producen
las enzimas responsables de la sntesis de los
transmisores, las terminales nerviosas donde
se localizan, as como las clulas que expresan
sus receptores y transportadores. Cada neuro-
na puede recibir muchos contactos sinpticos
de distintas clulas provenientes de diversas re-
giones del sistema nervioso y a su vez incidir en
muchas otras clulas a travs de los contactos
sinpticos que establecen las terminales ner-
viosas de cada rama del axn. En general, cada
neurona sintetiza un neurotransmisor clsico y
existe una asociacin estable entre la localiza-
cin de una neurona y el tipo de neurotransmi-
sor que sintetiza. Las neuronas glutamatrgicas
y GABArgicas (que sintetizan acido glutmico
y GABA) se encuentran distribuidas en todas las
regiones del cerebro, constituyendo los princi-
pales estimuladores e inhibidores de la activi-
dad neuronal. Su funcin es crtica para la vida.
Por ejemplo, la transmisin glutamatrgica
contribuye a la plasticidad detectada en varios
paradigmas de aprendizaje. Las neuronas que
utilizan neurotransmisores como la acetilco-
lina y las monoaminas se localizan de manera
ms discreta, pero inervan mltiples regiones,
regulando numerosas neuronas postsinpticas
a la vez. Por ejemplo, las neuronas dopaminr-
gicas, cuyos somas se localizan en la sustancia
nigra de cada hemisferio, proyectan hacia el
estriado en donde facilitan la iniciacin de los
movimientos voluntarios. Estas neuronas de-
generan en las personas que sufren mal de Par-
kinson, una enfermedad en la cual se difculta
el inicio de los movimientos voluntarios, y la
terapia tradicional es la toma de un precursor
de la dopamina para incrementar su sntesis en
las neuronas que persisten.
Estas redes neuronales, su actividad elctri-
ca y sus sistemas de neurotransmisin, son el
soporte fsico sobre el cual se establecen fun-
ciones tan dispares como la percepcin, la ge-
neracin de emociones y el control motor. Uno
de los retos fundamentales de la neurobiologa
es entender cmo las propiedades de sistemas
de neuronas permiten la elaboracin de fun-
ciones complejas. Tcnicas modernas permiten
vislumbrar que mltiples zonas cerebrales se
activan en nuestro cerebro al momento de rea-
lizar una tarea especfca, pero esta cartografa
no explica por el momento los comportamien-
tos. Sin embargo, se sospecha que el patrn
espacio-temporal de la actividad elctrica de
grandes conjuntos de neuronas puede codif-
car la percepcin de un estmulo. Por otro lado,
las redes neuronales son plsticas; o sea, hasta
en la vida adulta la existencia, estructura y las
propiedades de las sinapsis (su efcacia) varan
de acuerdo a la actividad previa. La plasticidad
de estas redes parece implicada en los proce-
sos de aprendizaje, un rea de investigacin
muy intensa actualmente. Adems, muchas de
las actividades que efecta el cerebro son in-
conscientes, pero algunas llegan al nivel cons-
ciente. Entender cmo se genera la consciencia
de nuestras acciones o emociones es un reto
todava ms difcil.
Uno de los aspectos de la qumica cerebral
que pudiera correlacionarse con la complejidad
de los procesos nerviosos es que la comunica-
cin intercelular en el cerebro es mucho ms rica
que la adscrita a los neurotransmisores clsicos.
Los pptidos y la comunicacin
nerviosa
Posterior a la identifcacin de los neurotrans-
misores clsicos se empezaron a reconocer
otras molculas capaces de afectar la actividad
El cerebro, la comunicacin intercelular y los pptidos
Biotecnologia V14 CS3.indd 56 11/14/07 4:59:58 PM
|
57
cerebral. Su naturaleza qumica es muy variada:
algunas reconocidas antes como hormonas pe-
rifricas (esteroides), protenas, un gran nmero
de pptidos, derivados lipdicos como los que
actan sobre los receptores del principio activo
de la marihuana (endocanabinoides), nucleti-
dos (ATP), y hasta gases, como el xido nitroso
(nO) y el monxido de carbono (CO).
Los pptidos constituyen una gran familia
de molculas que participan en la comunica-
cin celular en todos los reinos de la vida. Su
biosntesis, liberacin, accin e inactivacin
tienen algunas diferencias clave cuando se
comparan a los neurotransmisores clsicos.
En las neuronas, los pptidos son sintetizados
en el retculo endoplsmico rugoso, en forma
de protenas de alto peso molecular que son
procesadas en la va de secrecin regulada por
la accin secuencial de varias enzimas, siendo
un evento inicial la actividad de las convertasas,
enzimas que hidrolizan la cadena peptdica de
manera controlada al nivel de pares de ami-
nocidos bsicos. Enseguida una carboxipep-
tidasa remueve generalmente los aminocidos
bsicos del pptido en formacin. Se pueden
formar as varios pptidos, a partir de un solo
precursor, con actividades biolgicas distintas,
como es el caso de la pro-opiomelanocortina
que es procesada a corticotropina y lipotro-
pina, y stos a su vez a otros pptidos activos
como la -melanotropina y la -endorfna. Las
protenas precursoras de los pptidos y las en-
zimas procesadoras son empaquetadas, a par-
tir del trans-Golgi, en vesculas de propiedades
distintas a las de las vesculas sinpticas, los
grnulos de secrecin. El procesamiento del pre-
cursor ocurre primordialmente dentro de los
grnulos de secrecin, que se acumulan en la
terminal nerviosa. Estos grnulos se fusionan
con la membrana plasmtica en respuesta a la
llegada de trenes de potenciales de accin o en
respuesta a neurotransmisores cuyos recepto-
res estn cercanos a la terminal nerviosa. Los
pptidos liberados al espacio sinptico actan
sobre receptores, a veces localizados lejos del
sitio de liberacin, que son casi siempre de tipo
metabotrpico. Por lo tanto, los pptidos no
afectan rpidamente al potencial de membra-
na (lo pueden hacer en forma ms lenta), pero
modulan la actividad de los neurotransmisores
clsicos, por lo que se les ha clasifcado en la
categora general de neuromoduladores. Su in-
activacin opera principalmente por la accin
de ectopeptidasas, de manera anloga a la in-
activacin de la acetilcolina.
Los neuropptidos y los neurotransmisores
clsicos normalmente estn co-localizados en
una misma terminal nerviosa pero en entida-
des subcelulares distintas (grnulos en vez de
vesculas). Se pueden co-secretar, si bien las
propiedades de los trenes de potenciales de
accin que liberan unos u otros son distintas.
As, las neuronas liberan generalmente un cc-
tel de neurotransmisores. Este proceso de co-
secrecin lleva a una modulacin de la accin
de los neurotransmisores clsicos por los ppti-
dos, que pueden ampliar o modifcar su accin
de mltiples maneras.
El reconocimiento de los pptidos como una
gran familia de molculas mensajeras empieza
en la dcada de los 70 del siglo XX con el descu-
brimiento de los pptidos hipotalmicos. El hi-
potlamo es una regin del cerebro que integra
seales de diversas fuentes hacia un fnal co-
mn: las neuronas hipotalmicas que regulan
la funcin endocrina al controlar a su director,
la pituitaria anterior. Dos grupos encabezados
por Guillemin y Schally, trabajando por 10 aos
con extractos de medio milln de hipotlamos
bovinos y mltiples mtodos cromatogrf-
cos, dilucidaron una estructura poco conven-
cional, el piroglu-his-pro-nH
2
, un pptido con
ambas terminales bloqueadas responsable de
provocar la liberacin de una hormona de la
pituitaria anterior, la tirotropina, por lo que se
denomin hormona liberadora de tirotropina
(TRH). Siguieron otras estructuras de pptidos,
incluyendo la de la hormona liberadora de go-
nadotropinas y la de la hormona inhibidora de
la hormona de crecimiento (somatostatina).
En poco tiempo fue descubierta la sustan-
cia P y su papel en la transmisin del dolor, as
como los pptidos endgenos que reconocen el
receptor de la morfna, las encefalinas. La lista
El cerebro, la comunicacin intercelular y los pptidos
Biotecnologia V14 CS3.indd 57 11/14/07 4:59:58 PM
58
|
de pptidos activos en el SnC se ha incremen-
tado considerablemente (existe por lo menos
una centena), ya que pptidos caracterizados
en el sistema gastrointestinal, y muchos otros,
se expresan tambin en el cerebro. Las funcio-
nes que desempean los pptidos estn an en
va de exploracin pero son muy numerosas, y
dependen estrechamente del tipo de neurona
que los secretan.
Bioqumica de un fenotipo
peptidrgico en el sistema nervioso
central
La efciencia de la transmisin sinptica a tra-
vs de pptidos depende de su tasa de secre-
cin, de los mecanismos de transduccin al ni-
vel del receptor y de la velocidad de eliminacin
del pptido. nuestro laboratorio trabaja desde
hace varios aos para comprender cmo se re-
gula la cantidad del pptido activo que llega a
la clula blanco, tomando como modelo expe-
rimental uno de los primeros pptidos caracte-
rizados, el TRH. nuestro estudio se ha enfocado
principalmente a dos niveles: la sntesis y la in-
activacin del pptido.
Hemos llevado a cabo la mayora de estos
estudios en el contexto del sistema neuroendo-
crino del roedor, por el conocimiento existente
del papel fsiolgico del TRH en la regulacin
del eje hipotlamo-pituitaria-glndula tiroidea.
El TRH sintetizado en el ncleo paraventricular
del hipotlamo es liberado, en respuesta a un
estmulo, de la eminencia media del hipotla-
mo a la circulacin portal que irriga la pituitaria
anterior; ah incrementa la sntesis y liberacin
de la tirotropina a la circulacin general, cau-
sando en la tiroides un incremento de las secre-
ciones de las hormonas tiroideas, responsables
de controlar el metabolismo energtico en casi
todas las clulas del organismo. La secrecin de
TRH es regulada por varias categoras de infor-
macin, como la temperatura ambiental, que
al caer induce su secrecin de manera refeja.
Como en el caso de otros ejes neuroendocri-
nos, las concentraciones circulantes de las hor-
monas liberadas por el ltimo rgano blanco se
mantienen en un rango normal, ya que al au-
mentar las concentraciones de hormonas tiroi-
deas, ejercen un efecto retroalimentador nega-
tivo sobre el hipotlamo, inhibiendo la sntesis y
liberacin de TRH, y sobre la pituitaria anterior,
inhibiendo la sntesis y liberacin de tirotropi-
na as como la expresin del receptor de TRH.
Adems, el TRH puede secretarse en respuesta
a la succin del pezn y estimular la secrecin
de la prolactina, una hormona de la pituitaria
anterior con mltiples funciones incluyendo la
produccin de leche durante la lactancia.
Como para otros pptidos, el TRH proviene
de la transcripcin de un gen nico. La traduc-
cin del cido ribonucleico mensajero (ARnm)
lleva a la generacin de un precursor de alto
peso molecular, cuyo procesamiento en la va
de secrecin regulada permite la generacin
de varias copias del TRH y de pptidos inter-
medios, y su acumulacin en grnulos de se-
crecin en las terminales nerviosas (figura 1).
En el laboratorio hemos identifcado dos de las
convertasas que estn presentes en las neuro-
nas de TRH del nPV, y que contribuyen al pro-
cesamiento del precursor.
1
En el hipotlamo,
este proceso biosinttico complejo se estable-
ce paulatinamente durante el desarrollo de los
mamferos, un poco despus de la aparicin
de las neuronas que van a sintetizar el TRH. La
expresin de TRH inicia en etapas tardas del
desarrollo pre-natal; en el hipotlamo de rata
se detecta el ARnm del precursor a partir del
da embrionario 14, si bien el pptido procesa-
do aparece das ms tarde, posiblemente debi-
do al tiempo requerido para la maduracin del
aparato secretor. Hemos mostrado que la ex-
presin de TRH es baja hasta los primeros das
postnatales, incrementndose luego hasta al-
canzar un pico a los 20 das.
2

1
Snchez, E. et al., en Brain Res. 761, pp. 77-86, 1997.
2
Covarrubias, L. et al., en Biochem. Biophys. Res. Comun. 151, pp. 615-622, 1988.
El cerebro, la comunicacin intercelular y los pptidos
Biotecnologia V14 CS3.indd 58 11/14/07 4:59:58 PM
|
59
Figura 1.
Biosntesis del TRH en el sistema nervioso central. En la
parte derecha se muestra un esquema de una neurona
TRHrgica del ncleo paraventricular del hipotlamo (en
verde) con algunas terminales nerviosas (en azul) hacien-
do contacto sinptico sobre ella.
Arriba a la izquierda, parte del promotor del gen de TRH
con la identifcacin de algunos elementos de respuesta
a factores transcripcionales. bajo a la izquierda, el pro-
cesamiento del precursor del TRH en la va de secrecin
regulada.
El cerebro, la comunicacin intercelular y los pptidos
prcccsancnLc nca
vcscuarzacn LransCcg
LranspcrLc axcna
y prcccsancnLc na
granucs dc sccrccn
rcLcuc cndcpasncc
rugcsc
prcprc TkH
^kNn
CkL
rcgn prcxna dc prcncLcr dc gcn dc TkH
Ncurcna TkHcrgca
raL 255
prcpcpLdc
TkH
C C
C O C
H
C
N
H
C
C
H
C
CH
2
O O
CO

N
H
N C
H
C
NH
2
CH
2
NH
2
COOH
CH
2
C
H
C
N N
H
H
2
H
2
H
2
CC THkL T^T^
+l
2lu lul 59 29
CkL/^l
Biotecnologia V14 CS3.indd 59 11/14/07 4:59:58 PM
60
|
Uno de los esfuerzos del laboratorio se ha
dirigido a identifcar los eventos que son res-
ponsables del proceso de induccin de la sn-
tesis del TRH. El comportamiento observado
in vivo se pudo reproducir en cultivos de neu-
ronas hipotalmicas fetales, que mostraron
un incremento gradual en la expresin de TRH
hasta llegar a una meseta,
3
validando estos
cultivos como un modelo til para el estudio
del desarrollo en condiciones controladas. En
la bsqueda de factores extracelulares que in-
fuyeran en la diferenciacin de las neuronas
TRHrgicas, hemos evidenciado, por un lado,
el papel de protenas de la matriz extracelular
cuyo efecto parece focalizado a la induccin
traduccional
4
y, por el otro, la importancia de
factores trfcos, que regulan los niveles del
ARnm de TRH. El factor neurotrfco derivado
de neuronas (BDnF) incrementa los niveles del
ARnm de TRH en clulas hipotalmicas, nica-
mente en el subconjunto de neuronas TRHrgi-
cas que expresan el receptor del BDnF.
5
Estas
son neuronas del ncleo paraventricular, por
lo que sugerimos que en este ncleo el BDnF
contribuye al establecimiento del fenotipo TR-
Hrgico, incrementando la sntesis del ARnm y
la acumulacin de pptido.
6
Con el objetivo de identifcar otros factores
implicados en el desarrollo del fenotipo TRHr-
gico, decidimos aislar las neuronas TRHrgicas
fetales y comparar su transcriptoma (conjunto
de los ARn expresados en la clula) con el de
las clulas hipotalmicas en general. Con esta
estrategia esperbamos identifcar factores de
transcripcin sobre-expresados en neuronas
TRHrgicas durante el inicio de su vida post-
mittica que podran ser reguladores de la ex-
presin de TRH. Debido a que las neuronas que
expresan al pptido representan un porcentaje
mnimo de las clulas hipotalmicas, para en-
riquecerlas tuvimos que transfectar las clulas
hipotalmicas embrionarias con un vector de
expresin de la protena verde fuorescente bajo
el control de una parte del promotor de TRH.
Esto gener, de manera especfca, una seal
fuorescente en las neuronas TRHrgicas, lo que
nos permiti enriquecerlas con la ayuda de un
separador de clulas activado por fuorescen-
cia.
7
Se purifc el ARn total a partir de las clu-
las enriquecidas y se utiliz en un micro-arreglo
de ADn para identifcar los ARn cuya expresin
era mayor en esta poblacin que en la de las c-
lulas no fuorescentes. As identifcamos varios
factores de transcripcin cuya expresin es
elevada en neuronas TRHrgicas fetales; uno
de ellos es el factor 4 similar a Krppel (KLF4),
un factor cuya expresin no haba sido descrita
en el SnC. Hemos podido demostrar que KLF4
se expresa durante el desarrollo hipotalmico,
que se une in vitro a secuencias del promotor
de TRH y que su sobre-expresin en neuronas
hipotalmicas fetales incrementa la transcrip-
cin del TRH.
8
Estos datos identifcan uno de
los factores de transcripcin involucrados en la
induccin de la expresin de TRH; el KLF4 sera
uno de los primeros factores transcripcionales
identifcados con un efecto especfco sobre la
induccin de un fenotipo peptidrgico. Actual-
mente estamos analizando su papel in vivo, as
como el de otros factores identifcados duran-
te el anlisis del transcriptoma.
En una seccin anterior se mencion que
un evento importante en la transmisin sinp-
tica es la inactivacin de los neurotransmisores
liberados al medio extracelular. Al fnal de los
aos 70 del siglo XX se inici la bsqueda de los
mecanismos responsables de la inactivacin
de los pptidos. Muchas evidencias mostraron
que el mecanismo principal de inactivacin
de neurotransmisores clsicos, la captura por
3
Prez-Martnez, L., J. L. Charli y P. Joseph-Bravo, en Dev. Brain Res. 130, pp. 73-81, 2001.
4
niquet, J. et al., en Dev. Brain Res. 120, pp. 49-56, 2000.
5
Guerra-Crespo, M. et al., en Eur. J. Neurosci. 14, pp. 483-494, 2001.
6
Ubieta R. et al., en Brain Res., 11-74, pp. 28-38, 2007.
7
Guerra-Crespo, M., J. L. Charli y L. Prez-Martnez, en Ciencia 56, pp. 67-76, oct-dic 2005.
8
Prez-Monter, C. et al., en Annual Meeting of the Society for Neuroscience, 2006.
El cerebro, la comunicacin intercelular y los pptidos
Biotecnologia V14 CS3.indd 60 11/14/07 4:59:59 PM
|
61
transportadores plasmticos, no operaba en el
caso de los pptidos. Para el TRH, mostramos
que si bien se observa una internalizacin del
pptido del medio extracelular al citosol en re-
banadas de cerebro, la muy baja velocidad del
fenmeno sugiere que no es un mecanismo
efcaz de remocin.
9

Identifcamos en membranas de cerebro
una actividad que degrada al TRH; esta activi-
dad se encuentra concentrada en sinaptosomas
(estructura formada por la terminal nerviosa
que se sella posterior a la homogenizacin del
tejido nervioso en soluciones iso-osmticas, a
la que queda pegada parte de la membrana
post-sinptica).
10
Posteriormente caracteriza-
mos a la actividad como una metalo-enzima,
con actividad de piroglutamil peptidasa, o sea
que hidroliza el enlace peptdico piroglu-his del
TRH.
11, 12
Fue nombrada piroglutamil peptidasa
II (PPII) para distinguirla de la piroglutamil pep-
tidasa I, cuyas propiedades son muy distintas
y que no degrada al TRH in vivo.
13
Mostramos
que la actividad de la PPII est principalmente
localizada en el SnC y en menor grado en la
pituitaria anterior. La distribucin de la activi-
dad de la PPII en SnC es heterognea;
14
la de
su ARnm coincide generalmente con la de los
ARnm de los dos receptores identifcados para
TRH. En el cerebro se encuentra nicamente en
neuronas, posiblemente en el compartimiento
post-sinptico.
15, 16
La PPII es una ectoenzima, es decir que su
sitio activo est presente en la interfase mem-
brana plasmtica-medio extracelular,
17
por lo
que tiene una topologa ideal para hidrolizar
al TRH una vez liberado. La regin extracelular
de la PPII tiene varios dominios, incluyendo un
dominio cataltico y un dominio C-terminal. He-
mos mostrado que en el cerebro el empalme
alternativo del ARnm de la PPII genera un ARn
que tiene el potencial de traducir una forma
truncada, carente del dominio C-terminal. Esta
PPII truncada no tiene actividad enzimtica,
pero funciona como dominante negativa.
18

Estamos analizando las consecuencias fsiol-
gicas de su expresin en el SnC, debido a que
pudiera ser un nuevo mecanismo de regulacin
de la actividad de ectoenzimas.
A diferencia de otras peptidasas, la PPII es
muy especfca porque degrada slo al TRH o
pptidos muy similares, cuya existencia en el
cerebro es an controversial. Mediante com-
paraciones estructurales con enzimas de la fa-
milia de peptidasas a la que pertenece la PPII
(las aminopeptidasas de la familia M1) y mu-
tagnesis dirigida, hemos identifcado algunos
de los posibles lugares de reconocimiento del
sustrato en el sitio activo; estos datos explican
en parte lo que hace a la PPII una enzima tan
especfca.
19
Actualmente intentamos obtener
ms informacin sobre los determinantes es-
tructurales de su actividad.
Todos estos datos sugieren que el meca-
nismo responsable de la inactivacin del TRH
liberado al medio extracelular en el SnC en la
pituitaria es la actividad de la PPII (figura 2).
20

Ahora bien, existen ajustes de la actividad de
la PPII que pueden afectar la transmisin TRH-
rgica? Utilizando modelos in vivo e in vitro, he-
mos demostrado que el metabolismo del TRH
es regulable a distintos niveles. Estmulos para
la secrecin del pptido tambin lo son para
9
Charli, J. L. et al., en J. Neurochem. 42, pp. 981-986, 1984.
10
Joseph-Bravo, P. et al, en Brain Res. 166, pp. 321-329, 1979.
11
Garat, B. et al., en Neuropeptides 6, pp. 27-40, 1985.
12
Torres, H. et al., en Neurochem. Intern. 9, pp. 103-110, 1986.
13
Charli, J. L. et al., en Neuropeptides 9, pp. 373-378, 1987.
14
Vargas, M. et al., en Neurosci. Lett. 79, pp. 311-314, 1987.
15
Cruz, C. et al., en J. Neurochem. 56, pp. 1594-1601, 1991.
16
Joseph-Bravo, P. et al., en Neurosci. Lett. 178, pp. 243-246, 1994.
17
Charli, J. L. et al., en Neurochem. Intern. 13, pp. 237-242, 1988.
18
Chvez-Gutirrez, L. et al., en J. Neurochem. 92, pp. 807-817, 2005.
19
Chvez-Gutirrez, L. et al., en J. Biol. Chem. 281, pp. 18581-18590, 2006.
20
Charli, J. L. et al., en Neurobiology 6, pp. 45-57, 1998.
El cerebro, la comunicacin intercelular y los pptidos
Biotecnologia V14 CS3.indd 61 11/14/07 4:59:59 PM
62
|
TkH
prcguLan pcpLdasa
ncnhrana pcsLsnapLca
Lcrnna ncrvcsa
rcccpLcrcs dc TkH
piro-CIu-His-ProNH
2
piro-CIu+His-ProNH
2
granuc dc sccrccn
Figura 2.
Esquema de una sinapsis TRHrgica con la terminal ner-
viosa repleta de grnulos de secrecin que contienen el
pptido (en azul), la membrana post-sinptica (en rosa) y
el espacio sinptico donde el TRH difunde una vez libera-
do, interacciona con sus receptores y es inactivado por la
piroglutamil peptidasa II.
El cerebro, la comunicacin intercelular y los pptidos
Biotecnologia V14 CS3.indd 62 11/14/07 5:00:04 PM
|
63
su biosntesis. La degradacin del TRH est a
su vez sujeta a un estricto control, en particu-
lar en la pituitaria anterior. Demostramos que
en esta glndula las hormonas tiroideas incre-
mentan la actividad de la PPII,
21
adems de que
el TRH y otros efectores importantes en la re-
gulacin endocrina regulan la expresin y acti-
vidad de la PPII en la pituitaria anterior, debido
a la activacin de los receptores de membrana
de estos factores y de vas de transduccin es-
pecfcas.
22, 23, 24, 25
Aparte de su papel neuroendocrino, al TRH
se le han descubierto mltiples efectos en el
SnC, donde parece tener un papel de regulador
homeosttico. Debido a que la mayor actividad
de la PPII se localiza en el SnC, nos pregunta-
mos si es tambin regulable en el cerebro, en
particular en condiciones en las que son activa-
das las neuronas TRHrgicas. Recurrimos a un
modelo de epilepsia experimental que consiste
en la diaria estimulacin elctrica sub-umbral
de la amgdala, lo que produce un aumento
progresivo en la excitabilidad neuronal que, a
su vez, provoca cambios qumicos y morfolgi-
cos en zonas epileptognicas (amgdala, hipo-
campo y corteza), incluyendo un aumento en la
sntesis y liberacin de TRH. Encontramos que,
concomitante con la activacin de las neuro-
nas TRHrgicas, la expresin y actividad de la
PPII es modulada en forma similar a la de los
receptores de TRH y slo en las regiones epilep-
tognicas.
26, 27
Para estudiar la especifcidad del
fenmeno utilizamos un paradigma de inhibi-
cin neuronal que se logra produciendo nar-
cosis con alcohol. Observamos que durante la
21
Ponce, G. et al., en Neuroendocrinology 48, pp. 211-213, 1988.
22
Vargas, M. A., P. Joseph-Bravo y J.L. Charli, en Neuroendocrinology 60, pp. 323-330, 1994.
23
Vargas, M. A. et al., en J. Neuroendoc. 10, pp. 199-206, 1998.
24
Bourdais, J. et al., en Neuropeptides 34, pp. 83-88, 2000.
25
Vargas M. A. et al., en J. Neuroendocrinol. 14, pp. 184-193, 2002.
26
De Gortari, P. et al., en Brain Res. 679, pp. 144-150, 1995.
27
De Gortari, P. et al., en Neurochem. Intern. 38, pp. 31-42, 2006.
28
De Gortari, P. et al., en Neurochem. Intern. 46, pp. 347-356, 2005.
29
Pascual, I. et al., en Int. J. Biochem. Cell Biol. 36, pp. 138-152, 2004.
30
Charli, J. L. et al., en Molecular Endocrinology, P. Joseph-Bravo (ed.), 2006.
31
Charli, J. L. et al., en Neuropeptides 14, pp. 191-196, 1989.
induccin de la narcosis, la expresin del TRH y
de la PPII son moduladas en las regiones blanco
de la droga: corteza, hipocampo y ncleo ac-
cumbens.
28
Por lo tanto, el patrn de regulacin
de la PPII en el cerebro tiene una distribucin
que depende del paradigma experimental, lo
que sugiere que la actividad enzimtica est
controlada por vas neuronales especfcas.
Estos hallazgos demuestran que la PPII es
regulable en condiciones que modulan la ac-
tividad de las neuronas TRHrgicas, probable-
mente en las clulas blanco del TRH, tal como
ocurre en el caso de los receptores a TRH. Es-
tamos buscando las evidencias experimentales
que comprueban que estos ajustes son crticos
para la transmisin peptidrgica. Para esto
necesitamos herramientas que nos permitan
manipular especfcamente a la PPII. Hemos
identifcado inhibidores de la actividad enzi-
mtica; en particular uno muy especifco ais-
lado a partir de un gusano muy abundante en
las costas de Cuba.
29
Con estas herramientas
hemos mostrado que en la pituitaria anterior
la disminucin parcial de la actividad de la PPII
es sufciente para alterar los niveles de prola-
ctina secretada en respuesta al TRH
30
y que,
en rebanadas de cerebro, la inhibicin de su
actividad incrementa la recuperacin de TRH
in vitro.
31
Actualmente estudiamos, en el circui-
to hipocampal in vitro, cmo la PPII modula el
efecto del TRH sobre la transmisin GABArgi-
ca. Esta lnea de investigacin debera permitir
determinar el signifcado de los ajustes de los
mecanismos de inactivacin de pptidos en
la fsiologa nerviosa, un tema que no ha sido
El cerebro, la comunicacin intercelular y los pptidos
Biotecnologia V14 CS3.indd 63 11/14/07 5:00:05 PM
64
|
estudiado. nuestra hiptesis es que el ajuste
de los procesos de inactivacin es uno de los
mecanismos plsticos que en el cerebro con-
tribuyen a la modulacin de las propiedades
sinpticas.
El conocimiento del mecanismo de inac-
tivacin de los pptidos no slo es de inters
en ciencia bsica, sino que permite eventual-
mente el desarrollo de frmacos capaces de
inhibirlo. Tomar como blanco farmacolgico a
los mecanismos de inactivacin de neurotrans-
misores tiene ventajas cuando se compara con
el uso de agentes que activan los receptores,
porque en teora se afecta a la transmisin de
manera proporcional a la actividad natural de
cada va. Los inhibidores de los mecanismos
de inactivacin de neurotransmisores se utili-
zan actualmente para el tratamiento de varias
enfermedades del SnC. El prozac, por ejemplo,
utilizado para tratar la depresin, es una dro-
ga que inhibe especfcamente al transporta-
dor plasmtico de serotonina, permitindole
permanecer activo ms tiempo en el espacio
sinptico. Tambin se usan inhibidores de pep-
tidasas para el tratamiento de la hipertensin
arterial, y es probable que algn da tambin se
utilicen para tratar desrdenes del SnC.
Agradecimientos
La obtencin de resultados novedosos, y las hi-
ptesis que de ellos se generan, han sido posi-
bles gracias a la entusiasta participacin de in-
vestigadores, tcnicos y estudiantes asociados
al grupo, as como de investigadores de otros
grupos del IBT. El laboratorio no podra funcio-
nar sin el apoyo cotidiano de Manuel Villa, Ele-
na Martel y Miguel ngel Olvera, as como el de
las unidades de bioterio, biblioteca y cmputo,
y por supuesto la administracin del IBT. La in-
vestigacin del grupo ha sido apoyada en parte
por fondos del Conacyt y de la DGAPA-UnAM.
Bibliografa
Neuroscience: exploring the brain, M.F. Bear, B.W. Connors
y M.A. Paradiso (eds.), 2a. edicin, Baltimore, Lippincott
Williams & Wilkins, 2001.
Rose, S., The future of the brain. The promise and perils of
tomorrow's neuroscience, Oxford University Press, 2005.
El cerebro, la comunicacin intercelular y los pptidos
Biotecnologia V14 CS3.indd 64 11/14/07 5:00:05 PM