TRABAJO ESPECIAL PRODUCCION DE BIOPLASTICOS EMPLEANDO BACTERIAS

CONTENIDO INTRODUCCIN PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA JUSTIFICACIN

OBJETIVO GENERAL ESPECFICOS

MARCO REFERENCIAL DISEO METODOLGICO CONCLUSIONES

BIBLIOGRAFA

INTRODUCCION

El planeta tierra, o bien sus pobladores parece que se estn volviendo muy sensible a la necesidad de proteger nuestro medio ambiente, de esto se ah generado la habilidad de crear productos de recursos sostenibles y que sirvan totalmente de abono al trmino de su vida til, es una proposicin emocionante y atractiva. En nuestro trabajo presentamos la palabra plstico que se refiere a ciertos tipos de materiales sintticos obtenidos a partir de derivados del petrleo. Al incorporarse el plstico a la vida cotidiana, una parte considerable comenz a acumularse en el ambiente, precisamente por la resistencia de los plsticos a la degradacin por microorganismos (biodegradacin).

La degradacin de los plsticos sintticos es muy lenta, tanto que llegan a permanecer en el medio hasta 500 aos. Adems, en buena medida la degradacin de estos plsticos simplemente genera partculas ms pequeas que, a pesar de ya no ser evidentes, se acumulan en los ecosistemas. Por este motivo se ha buscado generar plsticos degradables de tal forma que puedan producirse plsticos que presenten las mismas propiedades pero que tengan un periodo de degradacin ms corto. En busca de la solucin se ha generado un sistema de reciclaje de los mismos, que ha consistido bsicamente en recogerlos selectivamente, limpiarlos, seleccionarlos por tipo de material y fundirlos de nuevo para usarlos como materia prima adicional, alternativa o sustituta, para el moldeado de otros productos, evitando as la intrusin en el medio de sustancias contaminantes difciles de controlar, sin embargo, no ha sido suficiente. En los ltimos aos, el concepto de plstico ha ido evolucionando hacia aquellos materiales cuyo origen es distinto del petrleo y que puedan convertirse en compuestos de caractersticas similares. Estos materiales tienen un origen en materias orgnicas, en principio renovables, de ah el concepto de Bioplstico (BPL), que adems, pueda biodegradarse por la accin de los microorganismos, a corto plazo. Se ha trabajado en esta investigacin los tipos de bacterias que ayudan en la biodegracin o para la produccin del Bioplstico, destacamos a los polihidroxialcanoatos (PHA) son polmeros naturales producidos por bacterias. Son biodegradables, tienen propiedades fsicas semejantes a las de los plsticos derivados del petrleo y son producidos a partir de recursos renovables.

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

El mayor porcentaje de este material se convierte directamente en basura al usarse y ser desechado Los plsticos: Su produccin es de aprox. 260 millones de ton/ao. En su elaboracin se consumen anualmente cerca de 270 millones de toneladas de petrleo y gas. Poseen tiempo de uso corto, por lo cual representan del 35-55% de los residuos no biodegradables que van a los rellenos sanitarios. No son degradados fcilmente por medio de procesos naturales y tardan en descomponerse hasta 300 aos. El 11% de nuestra basura son desechos plsticos, y esto aumenta un 1% desde 1960.

Hay ms de 18.000 piezas de bolsas plsticas que flotan en cada kilmetro cuadrado de los ocanos del mundo. Emisin de gases generada en su prctica es altamente contaminante. Incineradores saturados (La capacidad es insuficiente.) Depsitos sanitarios saturados Crecimiento en la demanda del sector agropecuario El reciclaje nunca alcanzar a manejar todos los desperdicios de plstico que se producen.

JUSTIFICACIN

En el estudio de este problema es de suma importancia ya que contribuye en primer lugar al desarrollo de la ciencia y en segundo lugar a la creacin de procesos sostenibles con los cuales el grado de contaminacin en la produccin disminuira considerablemente. Nuestra investigacin se basa en la creacin de un material que es totalmente favorable para el medio ambiente y que sea de utilizacin e innovacin a nivel industrial. El material que se va a crear busca ser el remplazo del plstico convencional el cual tiene una descomposicin lenta, mientras que este ser remplazado con un material que tenga biodegradacin ms rpida y haga un menor dao al medio ambiente. Para su desarrollo se han encontrado varias investigaciones con la intervencin de microorganismos, logrando un producto plstico natural. Ahora bien se puede destacar que se busca de una u otra manera estar en armona con el ambiente, cubriendo necesidades cotidianas y mejorando la economa del pas, ya que esto puede generar una gran cantidad de empleo.

OBJETIVO

3.1 Objetivos generales: Obtener Bioplstico mediante un proceso de descomposicin de residuos con la intervencin de microorganismos. Demostrar que los Bioplstico son biodegradables

3.2 Objetivos especficos: Evaluar la produccin de polihidroxialcanoatos (PHAs) empleando sustratos no convencionales. Caracterizar estructural y termo-mecnicamente el biopolmero obtenido. Concientizar a las personas e incentivar a disminuir la produccin de plsticos derivados del petrleo que afectan considerablemente al medio ambiente Dar una optima utilizacin de los residuos orgnicos que consideramos inservibles.

Analizar el impacto ambiental en la produccin de Bioplstico. MARCO REFERENCIAL

4.1 ANTECEDENTES Sus orgenes se remontan a 1926, cuando cientficos del Instituto Pasteur de Francia lograron producir polister a partir de la bacteria Bacillus megaterium. Sin embargo, el auge de la produccin de productos derivados del petrleo releg al olvido a estos materiales, y no fue hasta 1973, en plena crisis petrolera, cuando se volvi a recuperar la idea de sustitutos plsticos que no dependieran del "oro negro" y que fueran ms ecolgicos. Hoy en da casi todo los productos que compramos, vienen envasados o envueltos en plstico. Estos plsticos generalmente son sintticos, fabricados por polimerizacin de compuestos derivados del petrleo, y no son biodegradables. El plstico convencional cuando se desecha permanece en el ambiente durante dcadas y en muchos casos es imposible recogerlo. Obstruyendo alcantarillas y drenajes, matando animales en la tierra, ros y ocanos, y desfigurando calles, playas y paisajes. Entre las prcticas actuales para el manejo de los desechos plsticos incluyen la incineracin, el uso como rellenos sanitarios y el reciclaje. Sin embargo la capacidad de los incineradores es insuficiente la emisin de gases generada en su prctica es altamente contaminante y se est gestando una crisis sanitaria por la saturacin de los depsitos. El reciclaje, aunque juega un papel importante en el manejo de los desechos, nunca alcanzar a manejar todos los desperdicios de plstico que se producen y adems requiere de un manejo adicional de los desechos el cual incrementa el costo en un alto porcentaje.

4.2 MARCO TEORICO 4.2.1 Plsticos biodegradables o Bioplstico

Los bioplsticos son plsticos biodegradables obtenidos a partir de materias primas renovables. La mayora presentan mejor biocompatibilidad, y todos son biodegradables por microorganismos como bacterias, hongos, algas. Los bioplasticos se pueden fabricar de materiales as como el almidn de maz, yuca o papa, a partir del acido polilcticos (PLA) que son producidos a partir de cido lctico polimerizado; a partir de los polihidroxialcanoatos (PHAs). Dependiendo de la humedad y temperatura del lugar que se encuentren ser su tiempo de degradacin pero su tiempo aproximado es un ao. 4.2.2 Polihidroxialcanoatos (PHAs)

Los PHA son polmeros de HA, que pueden ser sintetizados por una gran variedad de microorganismos (bacterias, hongos y cepas recombinadas); como reserva de carbono y energa, usualmente bajo condiciones limitantes de nutrientes esenciales como N, P, O, S, Mg, y en presencia de una fuente de carbono en exceso. Sin embargo, algunas bacterias son capaces de producirlos incluso sin estar sujetas a cualquier tipo de contraste nutricional. Microorganismos productores de PHAs

La sntesis bacterial de Polihidroxialcanoatos (PHAs) en diversas especies, ms de 300 en total, permite acumular intracelularmente grandes cantidades de polmero (aproximadamente 90% del peso celular) debido al metabolismo y a los requerimientos energticos empleados por stas bacterias.

Bacterias que acumulan PHAs

Bacteria Ralstonia eutropha Ralstonia eutropha ATCC 17699 Rhodobacter Azospirillum Azotobacter Methylocystis Leptothrix Pseudomonas Baggiatoa Rhizobium

% peso seco 96 80-90 80 75 73 70 67 57 57

Ralstonia eutropha ATCC 17699:

h La bacteria Ralstonia eutropha ATCC 17699 es la ms estudiada para la produccin de PHAs, debido a su excelente capacidad para acumular una gran cantidad de polmero como el cido Polihidroxibutirato (PHB) a partir de fuentes de carbono simples como fructosa, glucosa, cido actico y fuentes de carbono no convencionales como almidones, melazas y suero de leche.

Azotobacter vinelandii

Su capacidad para producir PHA utilizando sustratos de bajo costo, como son algunos desechos agroindustriales: melazas de caa, de remolacha, peptona de pescado y desechos de la crianza de cerdos.

Alcaligenes lactus

Los PHA se les encuentran haciendo parte de la membrana citoplasmtica y el citoplasma de bacterias, levaduras, plantas y animales, cumpliendo funciones tales como, proteccin de macromolculas, transporte de ADN entre otras. Poseen propiedades similares a varios termoplsticos sintticos como el polipropileno y, en principio, pueden utilizarse en su lugar. Los factores que afectan el contenido de monmeros incluyen: el tipo de microorganismos (Gram positivos o Gram negativos), los ingredientes del medio de cultivo, las condiciones de fermentacin, los tipos de fermentacin (por lotes, continuos, retroalimentados) y la recuperacin de los mismos. En algunas plantas se ha inducido la produccin de PHA mediante modificaciones genticas. El descubrimiento de la acumulacin de PHB en el citoplasma de las clulas de Arabidopsis thaliana, fue el inicio de la aplicacin de esta tcnica, que se ha venido aplicando desde el ao de 1992. Desde entonces, se sintetizaron varios tipos de PHA en varias especies como Nicotiana tabacum y Brassica napus, mediante la creacin de rutas metablicas en el citoplasma y en los plstidos o peroxisomas.

Los PHA son completamente biodegradables hasta dixido de carbono (CO2) y agua (H2O) bajo condiciones aerbicas, y hasta metano (CH4) bajo condiciones anaerbicas, por microorganismos que se encuentran en el suelo, mar, lagos, aguas residuales, etc. Tambin pueden ser sujetos a degradacin trmica e hidrlisis enzimtica. En sistemas biolgicos pueden ser degradados usando dipolimerasas microbianas as como por las hidrlisis enzimticas y no enzimticas en tejidos anmales. Fig 1. Ciclo de vida de los PHA Produccin De Pha

La produccin de PHA se realiza mediante procesos biotecnolgicos tales como: produccin in vitro empleando enzimas aisladas, procesos fermentativos usando microorganismos nativos y modificados genticamente, o a travs de plantas transgnicas. Produccin de PHA mediante fermentacin microbiana La produccin de PHA mediante procesos fermentativos con microorganismos, se puede efectuar con un microorganismo (cultivo puro) o un consorcio de microorganismos (cultivos mixtos). Estos procesos se pueden realizar por lotes, por lotes alimentados o en continuo. En cualquier caso, se requiere establecer los valores ptimos para cada uno de los parmetros operacionales involucrados en el proceso fermentativo. Los de mayor incidencia son: la temperatura, pH y el tiempo de fermentacin.

METODOLOGIA

El tipo de investigacin empleada en este trabajo es el mtodo hipottico deductivo ya que este trabajo se basa en otros estudios para poder producir un material plstico utilizando materia prima que ser totalmente biodegradable y al trmino de su vida til ser parte de la tierra, lo cual reduce de manera considerada los efectos por contaminacin ambiental. 5.1 CEPAS BACTERIANAS En la investigacin se evaluaron tres cepas bacterianas nativas:

Figura. Morfologa macro y microscpica de las colonias de cepas: A) Bacillus megaterium y B) Bacillus sp.: aisladas de suelos contaminados con jugo de fique, por la estudiante Silvia Alexandra Snchez Moreno en el marco de su tesis de maestra Produccin de polihidroxialcanoatos a partir de residuos orgnicos agroindustriales. 1 y 2. Caractersticas macroscpicas de las colonias, 3. Microscopa deFluorescencia a 450 nm con azul de Nilo 4. Coloracin de Gram. (Sanchez et al., 2007)

C) Lactococcus lactis, aislada de muestras de lactosuero, por la estudiante Ana Carolina Cardona, en el marco de su trabajo de grado de pregrado en Ingeniera Biologica Estn aisladas a partir de diferentes residuos industriales, y seleccionadas, con base en pruebas bioqumicas, moleculares y analticas, por su capacidad para producir PHA

5.2 CONDICIONES DE CRECIMIENTO MICROBIANO Para evaluar el crecimiento bacteriano en los diferentes sustratos propuestos como fuente de carbono, se llevaron a cabo experimentos a escala de laboratorio, bajo agitacin orbital y temperatura controlada. En todos los casos se utilizaron erlenmeyers de 250 mL, con un volumen de trabajo de 50 mL, en el que se consider un 10% v/v para el inoculo. A continuacin se describen las condiciones operacionales especficas de cada sistema bacteria: sustrato evaluado.

5.3 MEDIOS DE CULTIVOS Para la evaluacin de los microorganismos (B. megaterium, Bacillus sp., L. lactis), se prepararon medios de cultivos suplementados con fuentes de carbono de distinta naturaleza y origen (aceites de Jatropha, ricino, frituras, lactosuero, glicerol, y glicerol residual)

5.4 PHA EN EL SISTEMA BACTERIA: sustrato. Para establecer, a escala de laboratorio, las mejores condiciones de operacin del sistema bacteria: sustrato, se realiz un diseo experimental factorial mediante anlisis de superficies de respuesta con serie de tres repeticiones. Las variables respuesta del sistema 54 fueron: produccin de biomasa seca por unidad de volumen, concentracin de PHA por unidad de volumen y rendimiento Yp/s. Las constantes fueron: el tiempo de reaccin (48 h), la velocidad de agitacin (200 rpm) y el volumen del medio de cultivo (50mL), mediante la opcin crear diseo y tomando en cuenta valores de referencia mnimos y mximos 5.5 CONDICIONES DE CRECIMIENTO MICROBIANO

Para evaluar el crecimiento bacteriano en los diferentes sustratos propuestos como fuente de carbono, se llevaron a cabo experimentos a escala de laboratorio, bajo agitacin orbital y temperatura controlada. En todos los casos se utilizaron erlenmeyers de 250 mL, con un volumen de trabajo de 50 mL, en el que se consider un 10% v/v para el inoculo. Acontinuacin se describen las condiciones operacionales especficas de cada sistema bacteria: sustrato evaluado. 5.5.1 Fermentaciones con lactosuero como fuente de carbono.

Las fermentaciones de los tres sistemas bacteria:sustrato resultantes de combinar el lactosuero con: B megaterium, Bacillus sp., y L. lactis. se realizaron a 30C y 150 rpm (Salazar et al., 2011). Las variables que se analizaron para realizar la seleccin del sistema bacteria-sustrato ms promisorio fueron: la biomasa seca y la presencia de PHA, producidos bajo las mismas condiciones operacionales (T 30C, pH 7.0, 150 rpm), El seguimiento del crecimiento bacteriano se monitore durante 72 h, tomando muestras a diferentes tiempos, cada punto de la curva de crecimiento se evalu por triplicado. Para la identificacin qumica (GC/MSD) del PHA, se realizaron extracciones de muestras compuestas de biomasa, obtenidas para cada cepa, con la biomasa producida en los triplicados de cada punto muestreado a lo largo de los procesos fermentativos. As se obtuvieron tres extractos, correspondientes a los sistemas B. megaterium: lactosuero, Bacillus sp., y L. lactis.

5.5.2 Fermentaciones con aceites (Jatropha ricino, frituras) y glicerol (GGR), como fuentes de Carbono. Para escoger el mejor sistema bacteria-sustrato, se desarroll un diseo experimental factorial 4x3; con cuatro factores (cuatro fuentes de carbono: (S1) aceites de ricino, (S2) Jatropha, (S3) fritura y (S4) GGR) y 3 niveles (3 microorganismos: (Mo1) B. megaterium, (Mo2) Bacillus sp., (Mo3) L. lactis); con serie de tres repeticiones, manteniendo constantes el tiempo de reaccin (48 h), la temperatura ( 30 C), el pH 7.0, la velocidad de agitacin (200 rpm), la concentracin de sustrato (20 g/L) y el volumen de medio de cultivo (50 mL). Las variables respuestas fueron: la cantidad de biomasa (g/L) y la acumulacin de PHA (g/L).

5.5.3 Fermentaciones con glicerol residual (GRSB) como fuente de Carbono. Los ensayos con GRSB se realizaron siguiendo el protocolo descrito para el GGR, pero con un tiempo de fermentacin de 72 horas, tomando muestras (por triplicado) para determinacin de biomasa a las 0, 8, 12, 24, 36 y 72 h.

5.6 DISEO METODOLOGICO

Se realizara por las siguientes razones ya que su nico objetivo es dar a conocer las especies bacterianas que han sido probadas para la produccin comercial de los PHA. Los estudios sobre la produccin de PHA en fermentador muestran la gran influencia del tipo y concentracin de la fuente de carbono y de los niveles de aeracin sobre el xito productivo. Como material base para la fermentacin se utilizan carbohidratos como glucosa, sacarosa y fructosa, as como aceites vegetales y glicerina derivada de la produccin de biodiesel. Existen investigaciones paralelas para desarrollar plantas (maz y soja) transgnicas que sinteticen PHA en sus tejidos. Otro aspecto a considerar es el nivel de fsforo en el medio de cultivo, pues al reducir el nivel de este en el medio casi se alcanza una duplicacin de los rendimientos producto/biomasa, lo cual indica una mejor respuesta fisiolgica. Esto es aplicable tambin para el nitrgeno. La estrategia actual es la de realizar cultivos fed-batch (batch incremental) de forma de alcanzar altas densidades celulares en una primera etapa, evitando as adems la posible inhibicin por el sustrato. En una segunda etapa se reducen los niveles de suministro de oxgeno (o se fuerza otra condicin de estrs apropiada) para alcanzar la acumulacin del producto. Los polisteres, depositados en forma de granos en las clulas, se extraen por medios solventes apropiados segn mtodos patentados. El porcentaje en peso del polmero puede superar el 70% del peso seco del organismo. Para la seleccin del mejor sistema bacteria:sustrato, se hizo seguimiento microbiano (biomasa seca) y qumico (concentracin de PHA) siguiendo las metodologas presentadas a continuacin: 5.6.1 Determinacin de biomasa seca Los medios de cultivo fueron centrifugados a 8000 rpm a 20 C, durante un periodo de 5 min, en una centrifuga refrigerada Marca JOUAN Modelo MR22. Los centrifugados se resuspendieron en buffer TRIS-HCl pH 7.0 y se congelaron a -70C, para su posterior liofilizacin (-50C y 0.05 mBar). Los liofilizados se pesaron para determinacin de biomasa. Para los medios con aceite, se requiri una centrifugacin previa con nhexano (8000 rpm, 20 C, 5 min) para separar la biomasa del medio oleaginoso. 5.6.2 Extraccin y caracterizacin qumica mediante GC/MSD de los PHA Los PHA fueron extrados de la biomasa bacteriana usando dispersiones de cloroformo (99% v/v) e hipoclorito de sodio (5% p/v) (Jacquel et al., 2008). Se adicion 1mL de cada reactivo por cada 20 mg de biomasa seca. Las muestras se agitaron a 30 C y 200 rpm durante 1h y se centrifugaron (5 min, 8000 rpm) para separar la fase

orgnica, enriquecida con el PHA. A la fase orgnica, se le adicion metanol (95% v/v), gota a gota, hasta ver precipitacin. Seguidamente se dej en reposo a 4C, transcurridas 12 h se descart el 57 sobrenadante y el precipitado se lav varias veces con metanol. Finalmente el polmero se someti a secado (60C) y se pes. La caracterizacin del biopolmero se realiz en el Laboratorio de Cromatografa de la UIS, mediante cromatografa de gases con detector selectivo de masas, operado en el modo de Monitoreo de Ion Selectivo (GC-MS/SIM). Para la cuantificacin se aplic la norma ISO 5509 (2000), la cual requiere la derivatizacion del biopolmero hasta los metilsteres correspondientes. La columna empleada en el anlisis fue DB-WAX [60 m x 0.25 mm x 0.25 m]. La inyeccin se realiz en modo splitless (Viny = 1 L). Se utiliz PHB (19.6 g) como material de referencia y cido benzoico como estndar interno. En el Anexo B se detallan los datos de calibracin suministrados por el Laboratorio.

CONCLUSIONES

Este trabajo nos mostro cual es el problema ecolgico, que surge del carcter recalcitrante a la degradacin de la mayora de los polmeros sintticos. La necesidad de producir polmeros novedosos que posean propiedades fsicas inusuales predeterminadas, y que no se pueden obtener por sntesis qumica.

Por otra parte, nos sirvi para conocer que Los PHA son termoplsticos y, dependiendo de su composicin, dctiles y elsticos. Varan sus propiedades de acuerdo con su composicin qumica (homo o co-polister).

Los PHA son polisteres de reserva producidos por bacterias sometidas a condiciones de estrs, las cuales los sintetizan en varias formas qumicas, entre los cuales el polihidroxibutirato (PHB) es el polister de cadena ms corta en esa familia. Dependiendo de la longitud de la cadena lateral de sus unidades monomricas (una propiedad que puede ser ajustada modificando la composicin del medio de cultivo o manipulando genticamente a la bacteria productora), se pueden obtener PHA de diferentes puntos de fusin,

cristalizacin, flexibilidad, resistencia a la traccin, biocompatibilidad y velocidad de biodegradacin.

El campo de los bioplsticos est empezando a ser visto y explotado por las empresas transnacionales por lo que su desarrollo a nivel de los pases en vas de desarrollo es lento Se comprueba que la produccin de bioplsticos cumple estndares medio-ambientales, adems es un producto que contamina al trmino de su ciclo de vida. con los no

Mientras ms demanda en el mercado tenga los bioplsticos, cada vez sern ms baratos, son una buena alternativa ante el impacto ambiental y si pueden sustituir a los polmeros convencionales en toda el rea de produccin, a grandes rasgos los bioplsticos son mejores que los plsticos convencionales.